專利名稱：人源化抗白介素3受體α鏈抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及抗白介素3受體α鏈抗體和其用途。
背景技術(shù)：
功能性白介素3受體是包含特定α鏈(IL-3Ra ;OT123)和與粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落刺激因子(GM-CSF)和白介素5(IL-5)共享“共同” IL-3受體β鏈(KD131)的雜二聚體。IL-3R α是含有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(參與IL_3結(jié)合)、跨膜結(jié)構(gòu)域和約50個(gè)氨基酸的短細(xì)胞質(zhì)尾部的推導(dǎo)分子量為約41kDa的I型跨膜蛋白。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)區(qū)構(gòu)成約100個(gè)氨基酸的N端區(qū)，其序列顯示與GM-CSF和IL-5受體α鏈的等同區(qū)類似；以及接近跨膜結(jié)構(gòu)域的區(qū)，其含有四個(gè)保守半胱氨酸殘基和此細(xì)胞因子受體家族的其它成員所共有的WSXWS基元。IL-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含由兩個(gè)Ig樣折疊結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的約200個(gè)氨基酸殘基的細(xì)胞因子受體基元(CRM)。IL-3Ra的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域高度糖基化，具有配體結(jié)合和受體信號(hào)傳導(dǎo)所必需的N-糖基化。IL-3RQ在整個(gè)造血系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，包括造血祖細(xì)胞、肥大細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和CD5+B淋巴細(xì)胞。非造血細(xì)胞(如漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(PDC)、萊氏細(xì)胞(Leydig cell)、內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞)也表達(dá)IL-3Ra。IL-3Ra也由某些疾病病況中所涉及的細(xì)胞表達(dá)，所述疾病病況包括骨髓發(fā)育不良綜合癥、髓細(xì)胞性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))、惡性淋巴增殖性病癥(如淋巴瘤)、過敏癥和自體免疫性疾病(如狼瘡、休格倫氏綜合癥(Sjdgrerfs syndrome)或硬皮病)。因此，需要抗IL-3Ra抗體用于治療性應(yīng)用。發(fā)明概述本公開是基于發(fā)明人制造了特異性結(jié)合IL-3RCI的人源化抗體。人源化后，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗體對(duì)IL-3Ra的親和力降低。因此，發(fā)明人進(jìn)行了親和力成熟以提高抗體對(duì)IL-3Ra的親和力。未預(yù)料到的是，親和力成熟的抗體在重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(Vl)的框架區(qū)(FR)以及輕鏈的⑶Rl中包括突變。發(fā)明人還制造了這種抗體的能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)水平 的效應(yīng)功能的形式。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)效應(yīng)功能增強(qiáng)的特定修飾產(chǎn)生另一合意特性，即向哺乳動(dòng)物施用修飾的抗體后，哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量最初降低，然而接著擴(kuò)增至高于施用前的水平。發(fā)明人還證實(shí)，在NK細(xì)胞數(shù)量與靶細(xì)胞(例如白血病細(xì)胞)的溶解之間存在相關(guān)性。本公開大體涉及能夠特異性結(jié)合IL-3RCI鏈的基于鼠類抗體的免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開提供分離的或重組免疫球蛋白，其特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含含有SEQ ID N0:8中所示的序列的'的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)和SEQ ID N0:9中所示的Vh的CDR。本公開另外或替代地提供分離的或重組抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含含有SEQID N0:8中所示的序列的'的⑶R和SEQ ID NO:9中所示的Vh的CDR0本公開另外或替代地提供分離的或重組人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段能夠特異性結(jié)合IL-3R α鏈且包含含有SEQ ID NO:8中所示的序列的'的 CDR和SEQ ID NO: 9中所示的Vh的CDR。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開提供分離的或重組免疫球蛋白，其特異性結(jié)合IL_3Ra鏈且分別包含SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。本公開另外或替代地提供分離的或重組抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含SEQ IDN0:2_7的氨基酸序列。本公開另外或替代地提供分離的或重組人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段能夠特異性結(jié)合IL-3Rα鏈且包含SEQ ID NO:2_7的氨基酸序列。
例如，免疫球蛋白或抗體包含
⑴包含分別如SEQ ID N0:2、3和4中所示的CDRU2和3的輕鏈可變區(qū)(Vl);和(ii)包含分別如SEQ ID N0:5、6和7中所示的CDRU2和3的重鏈可變區(qū)(Vh)。例如，免疫球蛋白或抗體包含
⑴包含以下的
a)包含SEQ ID NO:2中所示的序列
CDRl ；
CDR2 ;和
CDR3 ;和
CDRl ；
CDR2 ;和
CDR3。本公開另外或替代地提供分離的或重組人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含含有根據(jù)SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或由SEQ ID NO: 20中所示的序列編碼)的\和/或含有根據(jù)SEQ ID NO:9的氨基酸序
b)包含SEQID NO:3中所示的序列
c)包含SEQID NO:4中所示的序列
( )包含以下的Vh:
d)包含SEQID NO:5中所示的序列
e)包含SEQID NO:6中所示的序列
f)包含SEQID NO:7中所示的序列
(或由SEQIDNO: 14中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 15中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 16中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 17中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 18中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 19中所示的序列編碼)的列(或由SEQID NO:21中所示的序列編碼)的VH。本公開另外或替代地提供分離的或重組人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含含有根據(jù)SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或由SEQ ID NO: 20中所示的序列編碼)的'和含有根據(jù)SEQ ID NO: 9的氨基酸序列(或由SEQ IDNO: 21中所示的序列編碼)的VH。本公開所涵蓋的示例性抗原結(jié)合片段包括⑴結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)；(ii)Fv ；·(iii) scFv或其穩(wěn)定形式(例如二硫鍵穩(wěn)定的scFv)；(iv) 二聚scFv或其穩(wěn)定形式；(V)雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體或更高級(jí)多聚體；(vi)Fab 片段；(vii)Fab’ 片段；(viii)F(ab’ )片段；(ix)F(ab’)2 片段；(X)與抗體的Fe區(qū)融合的(i)-(ix)中的任一個(gè)；(xi)與結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗體或其抗原結(jié)合片段融合的(i)-(ix)中的任一個(gè)。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體去除或至少部分消除其所結(jié)合的細(xì)胞，例如白血病細(xì)胞和/或嗜堿性粒細(xì)胞和/或PDC。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本文的公開內(nèi)容將顯而易見，示例性免疫球蛋白或抗體能夠在不與毒性化合物綴合的情況下去除或至少部分消除其所結(jié)合的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體能夠誘導(dǎo)效應(yīng)功能,例如導(dǎo)致殺死所述免疫球蛋白或抗體所結(jié)合的細(xì)胞的效應(yīng)功能。示例性效應(yīng)功能包括ADCC、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體能夠誘導(dǎo)ADCC。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體包含能夠誘導(dǎo)效應(yīng)功能的抗體Fe區(qū)。例如，效應(yīng)功能是Fe介導(dǎo)的效應(yīng)功能。在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)e區(qū)是IgGlFc區(qū)或IgG3Fc區(qū)或雜交的 IgGl/IgG2Fc 區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體能夠誘導(dǎo)與野生型人IgGl和/或人IgG3Fc區(qū)類似(例如沒有顯著不同或在約10%以內(nèi))或相同水平的效應(yīng)功能。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)水平的效應(yīng)功能。在一個(gè)實(shí)施例中，由免疫球蛋白或抗體誘導(dǎo)的效應(yīng)功能的水平相對(duì)于包含野生型IgGlFc區(qū)時(shí)的免疫球蛋白或抗體的水平得到增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是無巖藻糖基化的或包含無巖藻糖基化的Fe區(qū)。在另一實(shí)施例中，與人或未改造以降低蛋白質(zhì)的巖藻糖基化水平的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫球蛋白或抗體相比，免疫球蛋白或抗體具有較低水平的巖藻糖基化。根據(jù)此實(shí)施例，較低水平的巖藻糖基化應(yīng)理解為意思是在包含免疫球蛋白或抗體的組合物中，巖藻糖基化免疫球蛋白(例如連接至抗體的Asn297的糖基包含巖藻糖)的百分比低于由人或未改造以降低蛋白質(zhì)的巖藻糖基化水平的CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的水平。例如，免疫球蛋白或抗體是包含含有SEQ ID N0:8中所示的序列(或由SEQ IDNO: 20中所示的序列編碼)的八和含有SEQ ID NO:9中所示的序列(或由SEQ ID NO: 21中所示的序列編碼)的Vh的無巖藻糖基化人源化抗體。例如，免疫球蛋白或抗體是包含含有SEQ ID NO: 13中所示的序列(或由SEQ ID NO:23中所示的序列編碼)的輕鏈和含有SEQID NO: 10中所示的序列(或由SEQ ID NO:22中所示的序列編碼)的重鏈的無巖藻糖基化人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是由不表達(dá)可檢測(cè)到的水平的(或表達(dá)較低水平的)α -1, 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)表達(dá)的包含含有SEQ ID NO: 13中所示的序列(或由SEQ ID NO:23中所示的序列編碼)的輕鏈和含有SEQ ID NO: 10中所示的序列(或由SEQ ID NO:22中所示的序列編碼)的重鏈的人源化抗 體。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體包含含有一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)由免疫球蛋白誘導(dǎo)的效應(yīng)功能的氨基酸序列取代的Fe區(qū)。例如，一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列取代使Fe區(qū)對(duì)Fe Y受體(FcyR)的親和力相比于不包含所述取代的Fe區(qū)增加。例如，一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列取代使Fe區(qū)對(duì)選自由Fe Y R1、Fc Y RIIa,Fe y RIIc和Fe y RIIIa組成的組的Fe Y R的親和力相比于不包含所述取代的Fe區(qū)增強(qiáng)增加。在一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列取代是⑴根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的S239D、A330L和I332E ;或(ii)根據(jù) Kabat 的 EU 編號(hào)系統(tǒng)的 S239D 和 I332E。例如，免疫球蛋白或抗體是包含含有SEQ ID N0:8中所示的序列(或由SEQ IDNO:20中所示的序列編碼)的Vl和含有SEQ ID N0:9中所示的序列(或由SEQ ID N0:21中所示的序列編碼)的Vh的人源化抗體，其中所述抗體包含含有一個(gè)或多個(gè)選自由以下組成的組的氨基酸序列取代的Fe區(qū)⑴根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的S239D、A330L和I332E ;和(ii)根據(jù) Kabat 的 EU 編號(hào)系統(tǒng)的 S239D 和 I332E。在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)e區(qū)包含SEQ ID NO: 11的殘基234-450之間所示的序列(包含根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的S239D和I332E取代)。在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)e區(qū)包含SEQ ID NO: 12的殘基234-450之間所示的序列(包含根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的S239D、A330L和I332E取代)。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是選自由以下組成的組(i)包含含有SEQ ID NO: 13中所示的序列的輕鏈和含有SEQ ID NO: 11中所示的序列的重鏈的抗體；(ii)包含包含含有SEQ ID NO: 13中所示的序列的輕鏈和含有SEQ ID NO: 12中所示的序列的重鏈的抗體；如上文所述，發(fā)明人已確定，在施用本文所述的抗體后，哺乳動(dòng)物體內(nèi)循環(huán)中NK細(xì)胞的數(shù)量與施用前哺乳動(dòng)物體內(nèi)循環(huán)中NK細(xì)胞的數(shù)量相比最初降低且接著增加。發(fā)明人還證實(shí)，使NK細(xì)胞相對(duì)于靶細(xì)胞增加得到增強(qiáng)的功效，即殺死更多數(shù)量的靶細(xì)胞。此作用是由包含含有根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸取代S239D和I332E的恒定區(qū)或Fe區(qū)的抗體誘導(dǎo)。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本公開提供分離的或重組抗體，其能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含⑴包含分別如SEQ ID N0:2、3和4中所示的CDRU2和3的輕鏈可變區(qū)(Vl)；(ii)包含分別如SEQ ID N0:5、6和7中所示的CDRU2和3的重鏈可變區(qū)(Vh)；和(iii)包含根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸取代S239D和I332E的重鏈恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開提供分離的或重組人源化抗體，所述抗體能夠特異性結(jié)·合IL-3Ra鏈且包含
CDRl ；CDR2 ;和CDR3 ；
CDRl ；
CDR2 ;和CDR3 ;和區(qū)。
⑴包含以下的
a)包含SEQID NO:2中所示的序列(或由SEQ ID NO: 14中所示的序列編碼)的
b)包含SEQID NO:3中所示的序列
c)包含SEQID NO:4中所示的序列
(ii)包含以下的Vh:
d)包含SEQID NO:5中所示的序列
e)包含SEQID NO:6中所示的序列
f)包含SEQID NO:7中所示的序列
(或由SEQIDNO: 15中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 16中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 17中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 18中所示的序列編碼)的
(或由SEQIDNO: 19中所示的序列編碼)的
(iii)包含根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸取代S239D和I332E的重鏈恒定
在一個(gè)實(shí)施例中，重鏈恒定區(qū)是人IgGl和人IgG2恒定區(qū)的雜交體。
在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 11的殘基121-450之間(包括殘基121-450)所示的序列。本公開另外或替代地提供分離的或重組人源化抗體，所述抗體能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含⑴包含根據(jù)SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或由SEQ ID N0:20中所示的序列編碼)的八和/或包含根據(jù)SEQ ID N0:9的氨基酸序列(或由SEQ ID N0:21中所示的序列編碼)的Vh ;和(ii)包含根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸取代S239D和I332E的重鏈恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中，重鏈恒定區(qū)是人IgGl和人IgG2恒定區(qū)的雜交體。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 11的殘基121-450之間(包括殘基121-450)所示的序列。
本公開另外或替代地提供分離的或重組人源化抗體，所述抗體能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含含有根據(jù)SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或由SEQ ID N0:20中所示的序列編碼)的\、含有根據(jù)SEQ ID N0:9的氨基酸序列(或由SEQ ID N0:21中所示的序列編碼)的Vh和含有根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸取代S239D和I332E的重鏈恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中，重鏈恒定區(qū)是人IgGl和人IgG2恒定區(qū)的雜交體。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 11的殘基121-450之間(包括殘基121-450)所示的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開提供分離的或重組人源化抗體，所述抗體能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含含有SEQ ID NO: 13中所示的序列的輕鏈和含有SEQ ID NO: 11中所示的序列的重鏈。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體或其抗原結(jié)合片段中和IL-3信號(hào) 傳導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體是裸免疫球蛋白或者本公開的抗體或其抗原結(jié)合片段是裸抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體是全長抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體結(jié)合IL_3Ra鏈的平衡解離常數(shù)(Kd)是IX IO-8M或更低，如5X KT9M或更低，例如3X 1(Γ9Μ或更低，如2. 5X 1(Γ9Μ或更低。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體結(jié)合IL-3Ra鏈的Kd為約2. 2X KT9M或更低。在一個(gè)實(shí)施例中，Kd在約I X KT9M與約2. 5X 10_9M之間，例如為約2. 2Χ1(Γ9Μ。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體結(jié)合IL-3Ra鏈的Kd為約9X ΙΟ,Μ或更低，例如約8 X KTkiM或更低。在一個(gè)實(shí)施例中，Kd在約5 X IO-10M與約9Χ 10_1QM之間，例如為約7. 8 X IO-10Mo本公開還包括本公開的免疫球蛋白或抗體的片段、變體和衍生物。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體在施用至哺乳動(dòng)物(例如非人靈長類動(dòng)物，如食蟹獼猴)時(shí)能夠減少NK細(xì)胞的數(shù)量。例如，免疫球蛋白或抗體當(dāng)施用至哺乳動(dòng)物時(shí)能夠使NK細(xì)胞的數(shù)量在施用12小時(shí)或10小時(shí)或8小時(shí)內(nèi)減少至少約20%，如至少約30%或40%。例如，免疫球蛋白或抗體在施用至哺乳動(dòng)物時(shí)能夠使NK細(xì)胞的數(shù)量在施用6小時(shí)內(nèi)減少至少約50%。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體在以O(shè). 0001mg/kg與50mg/kg之間，如約O. 0005mg/kg與約40mg/kg之間，例如約O. 001mg/kg與約30mg/kg之間，如約0. 005mg/kg和約20mg/kg,如約0. 01mg/kg和約10mg/kg的劑量施用時(shí)能夠減少NK細(xì)胞的數(shù)量。例如，免疫球蛋白或抗體當(dāng)施用至哺乳動(dòng)物時(shí)在以約0. 01mg/kg或0. lmg/kg或Img/kg或10mg/kg的劑量施用時(shí)能夠使NK細(xì)胞的數(shù)量在施用6小時(shí)內(nèi)減少至少約50%。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量為約0. O lmg/kg或0. lmg/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量在施用免疫球蛋白或抗體后約7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或22或29或57天與施用免疫球蛋白或抗體前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量相比增加。例如，NK細(xì)胞的數(shù)量在施用后至少約8或11或17或22或29天增加。例如，哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量與施用免疫球蛋白或抗體前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量相比增加約10%或20%或30%或50%或60%或70%或80%。例如，哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量在以約O. 00lmg/kg與約O. lmg/kg之間的劑量施用抗體或免疫球蛋白后至少8天與施用免疫球蛋白或抗體前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量相比增加約20%。例如，哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量在以約O. 00lmg/kg與約O. lmg/kg之間的劑量施用抗體或免疫球蛋白后至少11、17、22或29天與施用免疫球蛋白或抗體前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量相比增加約50%。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體或免疫球蛋白是以O(shè). 01mg/kg與O. lmg/kg之間的劑量施用。例如,免疫球蛋白或抗體是以O(shè). Olmg/kg或O. lmg/kg的劑量施用。基于本文的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見，本公開提供當(dāng)施用至哺乳動(dòng)物時(shí)引起哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量增加的免疫球蛋白或抗體。例如，免疫球蛋白或抗體當(dāng)施用至哺乳動(dòng)物時(shí)引起哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量減少，接著NK細(xì)胞的數(shù)量增加。在一個(gè)實(shí)施例中，NK細(xì)胞的數(shù)量與施用免疫球蛋白或抗體前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量相比增加或減少。 在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體在以約O. 01mg/kg或O. lmg/kg的劑量施用時(shí)能夠使哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量在施用6小時(shí)內(nèi)減少至少約50%并且哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量在以約O. 00lmg/kg與O. lmg/kg之間的劑量施用抗體或免疫球蛋白后至少8天與施用免疫球蛋白或抗體前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量相比增加約20%。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開提供包含本公開的免疫球蛋白或抗體和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。本公開還提供編碼本公開的免疫球蛋白或抗體的分離的核酸。核酸的示例性序列論述于編碼本公開的抗體或免疫球蛋白的上下文中并且應(yīng)了解為在作了必要的修改的情況下適用于本公開的當(dāng)前實(shí)施例。本公開還提供能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與本公開的核酸雜交的核酸。本公開還包括本公開的分離的核酸的片段、同源物和衍生物。本公開還提供包含本公開的分離的核酸和一個(gè)或多個(gè)其它核苷酸序列(如可操作地連接于核酸的啟動(dòng)子)的基因構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施例中，基因構(gòu)建體是包含表達(dá)載體和本公開的分離的核酸的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述分離的核酸可操作地連接于所述表達(dá)載體中的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)性核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的基因構(gòu)建體包含可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼多肽(例如包含Vh)的核酸和可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼另一多肽(例如包含')的核酸。在另一實(shí)施例中，基因構(gòu)建體是雙順反子基因構(gòu)建體，例如按5’至3’順序包含以下可操作地連接的組分⑴啟動(dòng)子；(ii)編碼第一多肽的核酸；(iii)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；和(iv)編碼第二多肽的核酸。例如，第一多肽包含Vh且第二多肽包含\或第一多肽包含\且第二多肽包含VH。本公開還涵蓋單獨(dú)的基因構(gòu)建體，其中之一編碼第一多肽(例如包含Vh)且其中另一個(gè)編碼第二多肽(例如包含')。例如，本公開還提供包含以下的組合物(i)第一表達(dá)構(gòu)建體，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼多肽(例如包含Vh)的核酸；和(ii)第二表達(dá)構(gòu)建體，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼多肽(例如包含')的核酸。本公開還提供包含本公開的基因構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開提供表達(dá)本公開的免疫球蛋白或抗體或抗原結(jié)合片段的分離的細(xì)胞或經(jīng)過遺傳修飾以表達(dá)免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的重組細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞包含本公開的基因構(gòu)建體或(i)第一基因構(gòu)建體，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼多肽(例如包含Vh)的核酸；和
(ii)第二基因構(gòu)建體，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼多肽(例如包含')的核酸，其中第一和第二多肽形成本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段?；驑?gòu)建體可整合至細(xì)胞中或保持游離形式。本公開細(xì)胞的實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本公開另外提供用于制造本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的方法，所述方法包括將本公開的基因構(gòu)建體維持在足以產(chǎn)生免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的條件下。在一個(gè)實(shí)施例中，用于制造本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的方法包括在足以產(chǎn)生和任選地分泌免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的條件下培養(yǎng)本公開的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，用于制造本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的方法另外包括分離所述免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段。本公開另外提供用于制造本公開的重組免疫球蛋白或抗體的方法，所述方法包括以下步驟(i)培養(yǎng)含有本公開的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞使得重組免疫球蛋白或抗體在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)；和(ii)分離所述重組免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，用于制造本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的方法另外包括用藥學(xué)上可接受的載體配制所述免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段。本公開還提供用于預(yù)防性或治療性治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的方法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用本公開的免疫球蛋白或抗體，由此治療或預(yù)防所述疾病或病癥的步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物為人。 在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物需要治療或預(yù)防。在一個(gè)實(shí)施例中，有需要的哺乳動(dòng)物罹患疾病或病癥。在一個(gè)實(shí)施例中，有需要的哺乳動(dòng)物處于發(fā)展疾病或病癥或復(fù)發(fā)所述疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。本公開還提供本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段或本公開的組合物在藥劑中的用途。
本公開另外或替代地提供本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段用于制造用于治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的藥劑的用途。本公開還提供用于治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施例中，疾病或病癥是IL-3Ra介導(dǎo)的疾病或病癥。在一個(gè)實(shí)施例中，疾病或病癥是骨髓發(fā)育不良綜合癥。在一個(gè)實(shí)施例中，疾病或病癥是癌癥，如血液癌癥，例如白血病，如急性白血病(例如急性骨髓性白血病)或慢性白血病(例如慢性髓單核細(xì)胞性白血病)。在一個(gè)實(shí)施例中，疾病或病癥是IL-3R α相關(guān)性癌癥，例如白血病，即癌癥(或白血病)的特征在于癌癥(或白血病)細(xì)胞表達(dá)IL-3Ra。
在另一實(shí)施例中，癌癥是惡性淋巴增值性病癥，如淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，疾病或病癥是自體免疫性病癥或炎癥性病癥。例如，病癥是狼瘡(例如全身性紅斑狼瘡)、休格倫氏綜合癥或硬皮病(例如全身性硬皮病)。在一個(gè)實(shí)施例中，方法包括施用有效量的免疫球蛋白，如治療有效量的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施例中，方法包括向哺乳動(dòng)物施用約O. 000lmg/kg與50mg/kg之間的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段。例如，方法包括施用約O. 0005mg/kg至約40mg/kg之間。例如，方法包括施用約O. 0005mg/kg至約30mg/kg之間。例如，方法包括施用約O. OOlmg/kg至約20mg/kg之間。例如,方法包括施用約O. 00lmg/kg至約10mg/kg之間。例如,方法包括施用約O. O lmg/kg至約5mg/kg之間。例如,方法包括施用約O. 00 lmg/kg至約lmg/kg之間。在一個(gè)實(shí)施例中，方法包括施用約O. lmg/kg至約10mg/kg之間的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段。例如，方法包括施用約O. lmg/kg至約5mg/kg之間。例如，方法包括施用約O. lmg/kg至約lmg/kg之間。在一個(gè)實(shí)施例中，方法包括施用約10mg/kg至約30mg/kg之間的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段。例如，方法包括施用約20mg/kg至約30mg/kg之間。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段是以O(shè). O lmg/kg的劑量施用。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段是以O(shè). lmg/kg的劑量施用。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段是以lmg/kg的劑量施用。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段是以10mg/kg的劑量施用。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段是以30mg/kg的劑量施用。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體向哺乳動(dòng)物施用多次。在一個(gè)實(shí)施例中，施用之間的時(shí)期為至少約7天，如至少約8天,例如至少約9天或10天。在一個(gè)實(shí)施例中，施用之間的時(shí)期為至少約11天。在另一實(shí)施例中，施用之間的時(shí)期為至少約15天，如至少約16天，例如至少約18天或20天。在一個(gè)實(shí)施例中，施用之間的時(shí)期為至少約22天。在另一實(shí)施例中，施用之間的時(shí)期為至少約25天,如至少約30天,例如至少約40天或45天。在一個(gè)實(shí)施例中，施用之間的時(shí)期為至少約57天或60天。例如,免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以O(shè). 000lmg/kg與5mg/kg之間，如O. 0005mg/kg與5mg/kg之間，例如O. 00lmg/kg與5mg/kg之間的劑量施用，且施用之間的時(shí)期為至少約7天或8天或9天或10天或11天或14天或17天或21天或22天或28天或29天或30天或I個(gè)歷月。例如，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以O(shè). O lmg/kg與5mg/kg之間的劑量施用，且施用之間的時(shí)期為至少約7天或8天或9天或10天或11天或14天。例如,免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以0.01mg/kg與2mg/kg之間的劑量施用，且施用之間的時(shí)期為至少約7天或8天或9天或10天或11天或14天。例如，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以O(shè). 01mg/kg與lmg/kg之間的劑量施用，且施用之間的時(shí)期為至少約7天或8天或9天或10天或11天或14天。在一些實(shí)施例中，施用之間的時(shí)期為至少約7天且少于約22天，如至少約11天或15天且少于約20天，例如至少約13天且少于約18天。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以O(shè). 01mg/kg的劑量施用且施用之間的時(shí)期為6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以O(shè). lmg/kg的劑量施用且施用之間的時(shí)期為6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天。 在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是以lmg/kg的劑量施用且施用之間的時(shí)期為6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天或20天或21天或22天。例如，免疫球蛋白或抗體是以6mg/kg與50mg/kg之間的劑量施用且施用之間的時(shí)期為至少約15天。例如,免疫球蛋白或抗體是以10mg/kg與30mg/kg之間的劑量施用且施用之間的時(shí)期為至少約14或15天。例如，免疫球蛋白或抗體是以20mg/kg與30mg/kg之間的劑量施用且施用之間的時(shí)期為至少約14或15天。在一些實(shí)施例中，施用之間的時(shí)期為至少約20天且少于約70天，如至少約21或22天且少于約65天，例如至少約25天且少于約57天。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是以10mg/kg的劑量施用且施用之間的時(shí)期為14天或15天或21天或22天或30天或48天或50天或56天或57天或60天。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是以30mg/kg的劑量施用且施用之間的時(shí)期為14天或15天或21天或22天或30天或48天或50天或56天或57天或60天。如上所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在施用本公開的免疫球蛋白或抗體后，NK細(xì)胞的數(shù)量在約8天內(nèi)增加高于施用前存在的數(shù)量。發(fā)明人還證實(shí)，NK細(xì)胞數(shù)量增加使得本公開的抗體或免疫球蛋白誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡的功效增強(qiáng)。因此，一旦NK細(xì)胞的數(shù)量增加，即可施用另一劑量的抗體或免疫球蛋白以誘導(dǎo)治療/預(yù)防作用。例如，本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段以約0. 00lmg/kg與約lmg/kg之間的劑量施用多次，其中施用之間的時(shí)期為至少約7天,如至少約8天,例如至少約11天,如至少約14天,例如至少約17天,如至少約21天,例如至少約22天，例如28天或29天或一個(gè)歷月或56或57或60天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約7天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約8天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約11天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約14天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約17天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約21天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約22天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約28天。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量之間的時(shí)期為約29天。劑量在約0. O lmg/kg與約0. lmg/kg之間，如劑量為約0. Olmg/kg 或 0. lmg/kg。附圖簡(jiǎn)要說明0172]

圖1A是示出在施用抗體CSL362X2后的不同時(shí)間點(diǎn)(如所示)來自非人靈長類動(dòng)物受試者的樣品中NK細(xì)胞的數(shù)量的圖示。細(xì)胞數(shù)量表示為施用抗體前細(xì)胞數(shù)量的百分比。指出抗體的劑量。
0173]圖1B是示出在施用抗體CSL362B后的不同時(shí)間點(diǎn)(如所示)來自非人靈長類動(dòng)物受試者的樣品中NK細(xì)胞的數(shù)量的圖示。細(xì)胞數(shù)量表示為施用抗體前細(xì)胞數(shù)量的百分比。指出抗體的劑量。
0174]圖1C是示出在施用包含人IgGl恒定結(jié)構(gòu)域和抗體7G3的可變區(qū)的嵌合抗體(命名為CSL360)后的不同時(shí)間點(diǎn)(如所示)來自非人靈長類動(dòng)物受試者的樣品中NK細(xì)胞的數(shù)量的圖示。細(xì)胞數(shù)量表示為施用抗體前細(xì)胞數(shù)量的百分比。指出抗體的劑量。
0175]圖2A是示出在指定細(xì)胞群體和不同濃度(如X軸上所示)的抗體CSL362X1存在下所溶解的TF-1細(xì)胞的百分比的圖示。
0176]圖2B是示出在不同數(shù)量的NK細(xì)胞和抗體CSL362X1存在下AML細(xì)胞的百分比的圖示。效應(yīng)細(xì)胞(NK細(xì)胞；E)與靶細(xì)胞(白血病細(xì)胞；T)的比率在X軸上示出。描繪使用來自兩位患者的細(xì)胞所產(chǎn)生的結(jié)果。
發(fā)明詳述
序列表關(guān)鍵詞
SEQIDN0:1-IL-3Ra鏈的氨基丨酸序列
SEQIDN0:2-人源化抗IL_3Ra鏈抗體CSL362和其修飾形式的LCDRl的氨基酸序列
SEQIDN0:3-人源化抗IL_3Ra鏈抗體CSL362和其修飾形式的LCDR2的氨基酸序列
SEQIDN0:4-人源化抗IL_3Ra鏈抗體CSL362和其修飾形式的LCDR3的氨基酸序列
SEQIDN0:5-人源化抗IL_3Ra鏈抗體CSL362和其修飾形式的HCDRl的氨基酸序列
SEQIDN0:6-人源化抗IL_3Ra鏈抗體CSL362和其修飾形式的HCDR2的氨基酸序列
SEQIDN0:7-人源化抗IL_3Ra鏈抗體CSL362和其修飾形式的HCDR3的氨基酸序列
SEQIDN0:8-人源化抗IL_3Ra鏈抗體CSL362和其修飾形式的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列
SEQIDN0:9-人源化抗IL_3Ra鏈抗體CSL362和其修飾形式的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列
SEQIDN0:10_人源化抗1L-3Ra[鏈抗體CSL362和CSL362B的重鏈的氨基酸序列
SEQIDN0:11_人源化抗IL_3R(i鏈抗體CSL362X1的重鏈的氨基酸序列
SEQIDN0:12_人源化抗IL-3R(i鏈抗體CSL362X2的重鏈的氨基酸序列
SEQIDN0:13_人源化抗1L-3Ra鏈抗體〔3し362和其修飾形式的輕鏈的氨基酸序列
SEQIDN0:14-編碼人源化抗IL-3R a鏈抗體CSL362和其修飾形式的LOTRl的核苷酸序列SEQID NO: 15-編碼人源化抗IL-3R α鏈抗體CSL362和其修飾形式的LCDR2的核苷酸序列SEQID NO: 16-編碼人源化抗IL-3R α鏈抗體CSL362和其修飾形式的LCDR3的核苷酸序列SEQID NO: 17-編碼人源化抗IL-3R α鏈抗體CSL362和其修飾形式的HCDRl的核苷酸序列SEQID NO: 18-編碼人源化抗IL-3R α鏈抗體CSL362和其修飾形式的HCDR2的核苷酸序列·SEQID NO: 19-編碼人源化抗IL-3R α鏈抗體CSL362和其修飾形式的HCDR3的核苷酸序列SEQID NO: 20-編碼人源化抗IL-3R α鏈抗體CSL362和其修飾形式的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列SEQID勵(lì):21-編碼人源化抗11^-31^鏈抗體CSL362和其修飾形式的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列
序列
酸序列
SEQ ID勵(lì):22-編碼人源化抗11^-31^鏈抗體CSL362和CSL362B的重鏈的核苷酸
SEQ ID勵(lì):23-編碼人源化抗11^-31^鏈抗體CSL362和其修飾形式的輕鏈的核苷
總則
在本說明書中，除非另外明確陳述或上下文另外要求，否則提及單一步驟、物質(zhì)組合物、步驟組或物質(zhì)組合物組應(yīng)理解為涵蓋一個(gè)和多個(gè)(即一個(gè)或多個(gè))這些步驟、物質(zhì)組合物、步驟組或物質(zhì)組合物組。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，本公開易于進(jìn)行除明確描述的以外的變化和修改。應(yīng)了解，本公開包括所有這些變化和修改。本公開還包括本說明書中個(gè)別地或總體提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征的任何和所有組合或任何兩個(gè)或更多個(gè)。本公開的范圍不受本文描述的特定實(shí)施例限制，所述實(shí)施例僅欲出于示例的目的。功能上等同的產(chǎn)物、組合物和方法明顯在本公開的范圍內(nèi)。本文本公開的任何實(shí)施例應(yīng)理解為在作了必要修改的情況下適用于本公開的任何其它實(shí)施例，除非另外明確陳述。除非另外明確定義，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語應(yīng)理解為具有與本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)中)。除非另外說明，否則本公開中所用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)程序。所述技術(shù)描述和說明于以下業(yè)內(nèi)文獻(xiàn)中，如J.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons(1984)；J. Sambrook 等 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989) ；T. A. Brown (編著),Essential Molecular Biology: APractical Approach,卷 I 和卷 2，IRL Press (1991) ;D. Μ· Glover 和 B. D. Hames (編著)，DNACloning:A Practical Approach,卷 1-4，IRL Press (1995 和 1996)；和 F.M. Ausubel等(編著)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates andWiley-1nterscience (1988,包括迄今為止的所有更新);編著Harlow和David Lane (編著)Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)；和J.E· Coligan 等(編著)Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons (包括迄今為止的所有更新)。本文中的可變區(qū)和其部分、免疫球蛋白、抗體和其片段的描述和定義可通過Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. , 1987和1991中的論述得到進(jìn)一步澄清。術(shù)語“和/或”(例如“X和/或Y” )應(yīng)理解成意思是“X和Y”或“X或Y”，且應(yīng)理解為提供對(duì)兩種含義或任一含義的明確支持。在本說明書中，用語“包含(comprise) ”或變體(如“comprises”或“comprising”)·應(yīng)理解為意指包括所述要素、整體或步驟或者要素、整體或步驟的組，而不排除任何其它要素、整體或步驟或者要素、整體或步驟的組。如本文所用，術(shù)語“來源于”應(yīng)理解為表示指定整體可以從特定來源獲得，不過不必直接從所述來源獲得。所選定義如本文所用，術(shù)語“免疫球蛋白”包括免疫球蛋白基因復(fù)合物的任何抗原結(jié)合蛋白產(chǎn)物，包括免疫球蛋白同種型IgA、IgD、IgM、IgG和IgE以及其抗原結(jié)合片段。示例性免疫球蛋白為抗體。示例性免疫球蛋白為單克隆免疫球蛋白。術(shù)語“免疫球蛋白”中包括經(jīng)過適當(dāng)去免疫化由此減少或消除哺乳動(dòng)物對(duì)已施用至所述哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白的免疫反應(yīng)的任何免疫球蛋白。在治療人的情況下，適合免疫球蛋白包括嵌合、人源化或人免疫球蛋白。術(shù)語“免疫球蛋白”中還包括無論是天然存在的或是通過人工介入(例如通過重組DNA技術(shù))產(chǎn)生的，包含經(jīng)過改造或變異型氨基酸殘基、序列或糖基化的修飾、誘變、嵌合和/或人源化免疫球蛋白。示例性蛋白質(zhì)包括Fe受體結(jié)合部分。例如，由術(shù)語“免疫球蛋白”涵蓋的蛋白質(zhì)包括結(jié)構(gòu)域抗體、駱駝化抗體和來自軟骨魚的抗體(即，免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR))。一般來說，駱駝抗體和IgNAR包含VH，然而缺乏\且通常稱為重鏈免疫球蛋白。其它“免疫球蛋白”包括T細(xì)胞受體和能夠結(jié)合抗原(例如借助于包含可變區(qū)的抗原結(jié)合位點(diǎn))的其它含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，“抗體”通常視為包含由多個(gè)多肽鏈(例如包含\的多肽和包含Vh的多肽)構(gòu)成的可變區(qū)的蛋白質(zhì)。抗體通常也包含恒定結(jié)構(gòu)域，其中一些可排列成恒定區(qū)或恒定片段或可結(jié)晶片段(Fe)。Vh與'相互作用形成包含能夠特異性結(jié)合一個(gè)或數(shù)個(gè)密切相關(guān)的抗原的抗原結(jié)合區(qū)的Fv。一般來說，來自哺乳動(dòng)物的輕鏈為K輕鏈或入輕鏈，且來自哺乳動(dòng)物的重鏈為α、δ、ε、Y或μ?？贵w可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、類別(例如 IgG1' IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和 IgA2)或子類。術(shù)語“抗體”涵蓋人源化抗體。術(shù)語“人源化抗體”應(yīng)理解為表示包含人樣可變區(qū)的抗體，包括來自非人物種(例如小鼠)的抗體的CDR移植到來自人抗體的FR上或插入所述FR中(這種類型的抗體也稱為“CDR移植抗體”)。人源化抗體還包括人抗體的一個(gè)或多個(gè)殘基通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代而被修飾和/或人蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)FR殘基被置換為相應(yīng)非人殘基的抗體。如本文所例示，人源化抗體也可包含在人抗體或非人抗體中都沒有發(fā)現(xiàn)的殘基?？贵w的任何其它區(qū)(例如Fe區(qū))通常為人的。人源化可以使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行，例如US5225539、US6054297、US7566771或US5585089。術(shù)語“人源化抗體”還涵蓋超人源化蛋白質(zhì)，例如像US7732578 中所述。術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”或“完全抗體”可互換使用，表示呈大致上完整形式的抗體，與抗體的抗原結(jié)合片段不同。具體地說，完全抗體包括具有重鏈和輕鏈(包括Fe區(qū))的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是野生型序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人野生型序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。在一些情況下，完整抗體能夠誘導(dǎo)一種或多種效應(yīng)功能。術(shù)語“裸抗體”是指未綴合任何化合物(例如毒性化合物或放射性標(biāo)記)的抗體?？贵w的“抗原結(jié)合片段”包含完整抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或可變區(qū)?？贵w片 段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。在本公開的上下文中，“效應(yīng)功能”是指由結(jié)合于導(dǎo)致殺死細(xì)胞的抗體的Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))的細(xì)胞或蛋白質(zhì)介導(dǎo)的那些生物活性。由抗體或免疫球蛋白誘導(dǎo)的效應(yīng)功能的實(shí)例包括補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(ADCP);和B細(xì)胞活化。在本公開的上下文中，術(shù)語或“由抗體誘導(dǎo)的效應(yīng)功能”或類似術(shù)語可與“免疫球蛋白的效應(yīng)功能”或“抗體的效應(yīng)功能”或類似術(shù)語互換使用且各自提供對(duì)彼此的文獻(xiàn)支持?！翱贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或“ADCC”是指一種形式的細(xì)胞毒性，其中結(jié)合于存在于某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺手(“NK”)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上的Fe受體(“FcR”)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合帶有抗原的靶細(xì)胞并隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞。為評(píng)估目標(biāo)分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC分析。適用于所述分析的效應(yīng)細(xì)胞包括周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞(“PBMC”)和NK細(xì)胞。如本文所用，“可變區(qū)”是指如本文所定義的輕鏈和/或重鏈中能夠特異性結(jié)合抗原的部分，且例如包括⑶R的氨基酸序列；即⑶R1、⑶R2和⑶R3，和框架區(qū)(FR)。例如，可變區(qū)包含三個(gè)或四個(gè)FR(例如FRl、FR2、FR3和任選地FR4)以及三個(gè)⑶R。Vh是指重鏈的可變區(qū)。'是指輕鏈的可變區(qū)。如本文所用，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”(同義詞⑶R ；BP⑶R1、⑶R2和⑶R3)是指抗體可變區(qū)的氨基酸殘基，其存在是特異性抗原結(jié)合的主要貢獻(xiàn)因素。各可變區(qū)通常具有三個(gè)⑶R區(qū)，標(biāo)識(shí)為⑶Rl、⑶R2和⑶R3。在一個(gè)實(shí)施例中，分配給⑶R和FR的氨基酸位置是根據(jù)以下進(jìn)行定義Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. , 1987 和 1991 (在本文中也稱為 “Kabat 編號(hào)系統(tǒng)”。根據(jù) Kabat 編號(hào)系統(tǒng)，Vh FR 和 CDR 如下定位殘基 1-30 (FRl) ,31-35 (CDRl)、36-49 (FR2)、50-65 (CDR2)、66_94(FR3)、95_102 (CDR3)和 103-113 (FR4)。根據(jù) Kabat 編號(hào)系統(tǒng)，VlFR和 CDR 如下定位殘基 1-23 (FRl)、24-34 (CDRl)、35-49 (FR2)、50-56 (CDR2)、57-88 (FR3)、89-97 (CDR3)和 98-107(FR4)。“框架區(qū)”(下文FR)是除⑶R殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。
如本文所用的術(shù)語“恒定區(qū)”是指抗體的重鏈和輕鏈中除可變區(qū)以外的部分。在重鏈中，恒定區(qū)通常包含多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，例如IgG恒定區(qū)包含以下連接的組分恒定重鏈(Ch)1、連接子、(^和^^。在重鏈中，恒定區(qū)包含F(xiàn)e。在輕鏈中，恒定區(qū)通常包含一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(a ClI)。術(shù)語“可結(jié)晶的片段”或“Fe”或“Fe區(qū)”或“Fe部分”(它們?cè)诒疚闹锌苫Q使用)是指抗體中包含至少一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域且一般(但不一定)糖基化且能夠結(jié)合一種或多種Fe受體和/或補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的組分的區(qū)。重鏈恒定區(qū)可選自以下五種同種型中的任一種α、δ、ε、Y或μ。此外，各種子類(如重鏈的IgG子類)的重鏈負(fù)責(zé)不同效應(yīng)功能，且因此通過選擇所需重鏈恒定區(qū)，可制造具有所需效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)。示例性重鏈恒定區(qū)是Y I (IgGl)、Y2(IgG2)和 Y3(IgG3)，或其雜交體?！昂愣ńY(jié)構(gòu)域”是抗體中序列與抗體/相同類型抗體(例如IgG或IgM或IgE)中的序列高度類似的結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)通常包含多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，例如Υ、α或δ重鏈的恒定區(qū)包含兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。 如本文所用，術(shù)語“特異性結(jié)合”應(yīng)理解成意思是免疫球蛋白或抗體，其意思是免疫球蛋白或抗體與IL-3RCI鏈之間的結(jié)合相互作用依賴于由免疫球蛋白或抗體所結(jié)合的IL-3RQ鏈的抗原決定子或表位的存在。因此，免疫球蛋白或抗體優(yōu)先結(jié)合或識(shí)別IL-3Ra鏈抗原決定子或表位，甚至在存在于其它分子或生物體的混合物中。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體與其與替代抗原或細(xì)胞的反應(yīng)或締合相比，更經(jīng)常地、更快速地、以更長持續(xù)時(shí)間和/或以更高親和力與IL-3Ra或表達(dá)IL_3Ra的細(xì)胞反應(yīng)或締合。通過閱讀此定義還應(yīng)了解，特異性結(jié)合IL-3Ra的免疫球蛋白或抗體可能或可能不特異性結(jié)合第二抗原。因此，“特異性結(jié)合”不必要求排他性結(jié)合或與另一抗原的結(jié)合不可檢測(cè)。術(shù)語“特異性結(jié)合”與“選擇性結(jié)合”在本文中可互換使用。一般來說，本文中提及的結(jié)合意思是特異性結(jié)合，且各術(shù)語應(yīng)理解為提供對(duì)其它術(shù)語的明確支持?！?在一個(gè)實(shí)施例中，與IL_3Ra或表達(dá)IL-3Ra的細(xì)胞“特異性結(jié)合”意思是免疫球蛋白或抗體結(jié)合IL-3Rα或表達(dá)IL_3Ra的細(xì)胞的平衡常數(shù)(Kd)為IOOnM或更低，如50nM或更低，例如20nM或更低，如InM或更低，例如O. 8nM或更低。術(shù)語“Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)”應(yīng)理解成意思是抗體重鏈的編號(hào)是根據(jù)Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，United StatesPublic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda 中所教導(dǎo)的EU索引。EU索引是基于人IgGlEU抗體的殘基編號(hào)。如本文所用，術(shù)語“IL-3Ra介導(dǎo)的病癥”應(yīng)理解成意思是與過度IL_3R α表達(dá)和/或哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)IL_3Ra的細(xì)胞(如癌細(xì)胞(例如白血病細(xì)胞)和/或免疫細(xì)胞(例如漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞))數(shù)量過高相關(guān)或由其引起的病癥。 如本文所用，術(shù)語“骨髓發(fā)育不良綜合癥”或“MDS”應(yīng)理解為表示涉及骨髓類血液細(xì)胞的產(chǎn)生低效(或發(fā)育不良)的血液醫(yī)學(xué)病癥的不同集合?；加蠱DS的受試者通常發(fā)生嚴(yán)重貧血且可能需要頻繁輸血。在許多情況下，隨著MDS發(fā)展，受試者因進(jìn)行性骨髓衰竭而發(fā)生血細(xì)胞減少癥(低血球計(jì)數(shù))。在約三分之一的MDS患者中，疾病轉(zhuǎn)化為急性骨髓性白血病(AML)。MDS可以診斷或歸類為各種系統(tǒng),包括French-American-British分類系統(tǒng)(Bennett 等,Br. J. Haematol. 33:451 - 458, 1976)、國際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)(InternationalPrognostic Scoring System) (Greenberg 等，Blood89:2079-88，1997)或世界衛(wèi)生組織所公布的系統(tǒng)。如本文所用，術(shù)語“治療”是指設(shè)計(jì)用來在臨床病理學(xué)過程中改變所治療的個(gè)體或細(xì)胞的自然過程的臨床介入。治療的合意效果包括降低疾病發(fā)展速率、改善或緩解疾病病況和緩和或預(yù)后改良。例如當(dāng)與疾病相關(guān)的一種或多種癥狀得到減輕或消除時(shí)，個(gè)體得到成功“治療”。如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”包括關(guān)于個(gè)體的疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)提供預(yù)防。個(gè)體可能容易發(fā)生疾病或疾病復(fù)發(fā)或具有發(fā)生疾病或疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，但尚未診斷出疾病或復(fù)發(fā)。如本文所用，具有發(fā)生疾病或病癥或復(fù)發(fā)疾病或病癥或復(fù)發(fā)的“風(fēng)險(xiǎn)”的哺乳動(dòng)物在根據(jù)本公開治療之前可能具有或可能不具有可檢測(cè)到的疾病或疾病癥狀，并且可能已顯示或可能未顯示可檢測(cè)到的疾病或疾病癥狀?！熬哂酗L(fēng)險(xiǎn)”表示哺乳動(dòng)物具有一個(gè)或多個(gè) 風(fēng)險(xiǎn)因素，其是如本領(lǐng)域中所已知和/或本文所述與疾病或病癥的發(fā)展有關(guān)的可測(cè)量的參數(shù)?！坝行Я俊笔侵冈诒匦鑴┝肯虑页掷m(xù)必需的時(shí)期，至少有效實(shí)現(xiàn)所需治療或預(yù)防結(jié)果的量。有效量可以在一次或多次施用中提供。在本公開的一些實(shí)施例中，術(shù)語“有效量”意思是實(shí)現(xiàn)如前文所述的疾病或病癥的治療所必需的量。有效量可以根據(jù)所欲治療的疾病或病癥并且也可以根據(jù)與所治療的哺乳動(dòng)物有關(guān)的體重、年齡、種族背景、性別、健康狀況和/或身體狀況和其它因素而變化。通常，有效量將處于可以通過醫(yī)學(xué)從業(yè)者的常規(guī)試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)來確定的相對(duì)廣泛的范圍(例如“劑量”范圍)內(nèi)。有效量可以在單次劑量或在治療期內(nèi)在重復(fù)一次或若干次的劑量中施用?！爸委熡行Я俊笔菍?shí)現(xiàn)特定病癥(例如SLE)的可測(cè)量的改良所需要的至少最低濃度。本文中的治療有效量可以根據(jù)以下因素而變化，如患者的疾病病況、年齡、性別和體重以及免疫球蛋白或抗體在個(gè)體體內(nèi)弓I發(fā)所需反應(yīng)的能力。治療有效量還是治療有益效果勝過免疫球蛋白或抗體的任何毒性或有害作用的量?！邦A(yù)防有效量”是指在必需劑量下且持續(xù)必需的時(shí)期，有效實(shí)現(xiàn)所需預(yù)防結(jié)果的量。通常但不一定，因?yàn)轭A(yù)防劑量是在疾病前或疾病在早期階段用于哺乳動(dòng)物，所以預(yù)防有效量可以小于治療有效量。本文提及“哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量”應(yīng)理解為包括來自哺乳動(dòng)物的樣品中NK細(xì)胞的數(shù)量并且不需要測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的總數(shù)。此數(shù)量可表示為例如每mL或dL的細(xì)胞數(shù)或在一定時(shí)間內(nèi)的不同點(diǎn)從哺乳動(dòng)物所取的樣品中細(xì)胞數(shù)的百分比。僅出于系統(tǒng)命名的目的且不加限制，IL-3RCI鏈的氨基酸序列教導(dǎo)于基因ID保藏編號(hào)3563和/或SEQ ID NO:1中。根據(jù)本公開治療的“哺乳動(dòng)物”可以是如非人靈長類動(dòng)物或人等哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物為人。術(shù)語“序列同一性”在本文中以其最廣泛意義使用，包括使用標(biāo)準(zhǔn)算法考慮到適當(dāng)比對(duì)、考慮到在比較窗口上序列相同的程度時(shí)確切核苷酸或氨基酸匹配的數(shù)目。序列同一性可以通過使用算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施來比對(duì)比較序列(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin 遺傳學(xué)軟件包 7. O 版中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics ComputerGroup, 575Science Drive Madison, WI, USA, incorporated herein by reference)或通過各種所選方法中任一個(gè)所產(chǎn)生的檢驗(yàn)和最佳比對(duì)(即，在比較窗口上產(chǎn)生最高同源性百分比)來確定。也可參考BLAST程序族，例如像Altschul等，1997，Nucl. Acids Res. 253389所公開。序列分析的詳細(xì)論述可見于Ausubel等編著的CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY (John ffiley&Sons Inc NY，1995-1999)的第 19. 3 單元中。本公開還提供本公開的抗IL_3Ra免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的衍生物。如本文所用，“衍生物”蛋白質(zhì)例如已通過本領(lǐng)域中所了解的翻譯后修飾(例如磷酸化、乙酰化等)、糖基化修飾(例如添加、除去或改變糖基化)和/或納入其它氨基酸序列得到改變。如本文所用的術(shù)語“核酸”表示能夠編碼本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段或其多肽組分的單鏈或雙鏈DNA和RNA。DNA包括基因組DNA和cDNA。RNA包括mRNA和cRNA。核酸還可以是DNA-RNA雜交體。核酸包含通常包括包含A、G、C、T或U堿基的核苷 酸的核苷酸序列。然而，核苷酸序列可以包括其它堿基，如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿核苷，不過不限于此?！半s交”在本文中用于表示至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列配對(duì)以產(chǎn)生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA雜交體。包含互補(bǔ)核苷酸序列的雜交序列通過互補(bǔ)嘌呤與嘧啶之間的堿基配對(duì)而發(fā)生，如本領(lǐng)域中所熟知。在此方面，應(yīng)了解，經(jīng)過修飾的嘌呤(例如肌苷、甲基肌苷和甲基腺苷)和經(jīng)過修飾的嘧啶(例如硫尿核苷和甲基胞嘧啶)也可以在堿基配對(duì)中接合。如本文所用的“嚴(yán)謹(jǐn)性”是指雜交期間的溫度和離子強(qiáng)度以及某些有機(jī)溶劑和/或清潔劑的存在或不存在。嚴(yán)謹(jǐn)性越高，則雜交的核苷酸序列之間所需的互補(bǔ)性程度也越聞?！案邍?yán)謹(jǐn)性條件”表示僅具有高互補(bǔ)堿基頻率的核酸可以雜交的那些條件。本文提及高嚴(yán)謹(jǐn)性條件包括且涵蓋_(i)至少約31%v/v至至少約50%v/v甲酰胺和至少約0. OlM至至少約0. 15M鹽用于在42°C下雜交，以及至少約0. OlM至至少約0. 15M鹽用于在42°C下洗滌；(ii) l%BSAUmM EDTA、0. 5M NaHPO4(ρΗ7· 2)、7%SDS 用于在 65 °C 下雜交，且(a)0. 1XSSC、0. 1%SDS ;或(b)0. 5%BSA、ImMEDTA、40mM NaHPO4(pH7. 2)、1%SDS 用于在超過65°C的溫度下洗滌約一小時(shí)；和(iii)0. 2XSSC、0. 1%SDS 用于在 68°C或超過 68°C下洗滌約 20 分鐘。一般來說，洗滌在Tm=69. 3+0. 41 (G+C) % _12°C下進(jìn)行。通常，失配堿基數(shù)量每增加I %，雙鏈體DNA的Tm降低約IV。盡管如上所述，但嚴(yán)謹(jǐn)條件在本領(lǐng)域中是已知的，如Ausubel等，⑶RRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY John ffiley&Sons, Inc. 1995-2009 的第 2. 9 和 2. 10 章中所述?！氨磉_(dá)載體”可以是自我復(fù)制型的染色體外載體(如質(zhì)粒)或整合至宿主基因組中的載體。免疫球蛋白適當(dāng)?shù)?本公開的免疫球蛋白或抗體選擇性結(jié)合IL_3Ra鏈,這意思是免疫球蛋白或抗體與IL_3Ra鏈之間的結(jié)合相互作用是依賴于免疫球蛋白所結(jié)合的IL_3Ra鏈的抗原決定子或表位的存在。因此，免疫球蛋白或抗體優(yōu)先結(jié)合或識(shí)別IL-3RCI鏈抗原決定子或表位，甚至在存在于其它分子或生物體的混合物中。杭體在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)任何實(shí)施例的本文所述的免疫球蛋白是抗體，例如包含本文所述的CDR和/或一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的抗體。適當(dāng)?shù)?，免疫球蛋白是包含分別根據(jù)SEQ ID NO: 2-7的輕鏈和重鏈⑶R1、2和3氨基酸序列的人源化、嵌合或人抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體包含SEQ ID N0:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ IDNO: 8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體包含SEQIDNO:10,SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12的重鏈氨基酸序列和SEQID NO: 13的輕鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體是重組抗體。制造包含本文所述的⑶R和/或可變區(qū)的抗體的方法基于本文的公開內(nèi)容和/或本文提及的文獻(xiàn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯 而易見的。 在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的抗體包含含有本文所示的⑶R和來自人抗體的FR的Vh和/或\。任選地，F(xiàn)R包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，例如2個(gè)或更多個(gè)，或3個(gè)或更多個(gè)，或4個(gè)或更多個(gè)，或5個(gè)或更多個(gè)，或10個(gè)或更多個(gè)，或15個(gè)或更多個(gè)。在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)R包含與人FR相比不超過30個(gè)氨基酸取代，例如不超過20個(gè)氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的抗體包含含有本文所示的CDR和來自非人靈長類動(dòng)物抗體的FR的Vh和/或\，即抗體是共人源化抗體，例如像W02007/019620中所述。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的抗體是復(fù)合抗體，例如像W02006/082406中所述。本公開的一種示例性抗體是人源化抗體，例如像本文所定義。示例性人源化抗體在本文中描述。在一個(gè)實(shí)施例中，人源化抗體已經(jīng)過親和力成熟。在一個(gè)實(shí)施例中，人源化抗體包含
⑴包含以下的
a)包含SEQ ID NO:2中所示的序列
(或由SEQ ID NO: 14中所示的序列編碼)的
c)包含SEQ ID NO:4中所示的序列(或由SEQ ID NO: 16中所示的序列編碼)的
CDRl ；b)包含SEQ ID NO:3中所示的序列(或由SEQ ID NO: 15中所示的序列編碼)的CDR2 ;和
CDR3 ;和
CDRl ；
CDR2 ;和
CDR3。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本公開的免疫球蛋白或抗體可以包括引入人體內(nèi)未天然發(fā)現(xiàn)的序列例如以增強(qiáng)親和力或效應(yīng)功能的修飾。
(ii)包含以下的Vh:
d)包含SEQ ID NO:5中所示的序列
(或由SEQ ID NO: 17中所示的序列編碼)的
e)包含SEQ ID NO:6中所示的序列(或由SEQ ID NO: 18中所示的序列編碼)的
f)包含SEQ ID NO:7中所示的序列(或由SEQ ID NO: 19中所示的序列編碼)的
本公開還提供本公開的免疫球蛋白或抗體的變體。適當(dāng)?shù)兀凅w與SEQ IDNO: 2-13中所示的任何氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。例如，在本領(lǐng)域中了解，一些氨基酸可以取代或缺失而不會(huì)不利地或顯著地影響免疫球蛋白或抗體的IL-3Ra特異性和/或效應(yīng)功能(例如保守性取代)。本公開所涵蓋的抗體或免疫球蛋白的衍生物包括但不限于氨基酸側(cè)鏈的修飾、在肽或多肽合成期間并入非天然氨基酸和/或其衍生物和使用交聯(lián)劑。本公開的不例性抗體和其抗原結(jié)合片段描述于表I中。表1:示例性抗體和其抗原結(jié)合片段
名稱重鏈 SEQ ID NO:輕鏈 SEQ ID NO:CSL362Fv9181CSL3621013CSL362BIO213CSL362X11113CSL362X212131僅可變區(qū)序列。2重鏈恒定區(qū)為無巖藻糖基化的?？贵w片段單結(jié)構(gòu)域抗體在一些實(shí)施例中，本公開的抗體的抗原結(jié)合片段是單結(jié)構(gòu)域抗體或包含單結(jié)構(gòu)域抗體(其與術(shù)語“結(jié)構(gòu)域抗體”或“dAb”可互換使用)。單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分的單一多肽鏈。雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體在一些實(shí)施例中，本公開的抗原結(jié)合片段是雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體或更高級(jí)蛋白質(zhì)復(fù)合物或包含雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體或更高級(jí)蛋白質(zhì)復(fù)合物，如W098/044001和/或W094/007921中所述的那些。例如，雙功能抗體是包含兩個(gè)締合多肽鏈的蛋白質(zhì)，各多肽鏈包含結(jié)構(gòu)Vl-X-Vh或VH-X-'，其中X是包含不足以允許單一多肽鏈中的V1^P'締合(或形成Fv)的殘基的連接子或不存在，且其中一個(gè)多肽鏈的Vh結(jié)合另一多肽鏈的\以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，即形成能夠特異性結(jié)合一個(gè)或多個(gè)抗原的Fv分子。各多肽鏈中的 '和Vh可以相同或者各多肽鏈中的 '和Vh可以不同以便形成雙特異性雙功能抗體(即，包含兩個(gè)具有不同特異性的Fv)。能夠誘導(dǎo)效應(yīng)活性的雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體等可以使用能夠結(jié)合IL-3Ra的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和能夠結(jié)合免疫細(xì)胞(例如T細(xì)胞，例如CD3)上的細(xì)胞表面分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域來制造。單鏈Fv(scFv)片段本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，scFv在單一多肽鏈中包含Vh和\區(qū)并且在Vh與八之間包含多肽連接子，所述連接子使得scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)(即，使得單一多肽鏈的Vh與\能夠彼此締合以形成Fv)。例如，連接子包含超過12個(gè)氨基酸殘基，其中(Gly4Ser)3為一個(gè)用于scFv的更有利連接子。本公開還涵蓋經(jīng)過二硫鍵穩(wěn)定的Fv (或diFv或dsFv)，其中在Vh的FR和\的FR中弓I入單個(gè)半胱氨酸殘基并且所述半胱氨酸殘基由二硫鍵連接以產(chǎn)生穩(wěn)定Fv。或者或另外，本公開涵蓋二聚scFv，即包含兩個(gè)由非共價(jià)或共價(jià)鍵聯(lián)(例如，通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(例如來源于Fos或Jun))連接的scFv分子的蛋白質(zhì)?；蛘?兩個(gè)scFv由長度足以允許這兩個(gè)scFv形成并且結(jié)合抗原的肽連接子連接，例如像US20060263367中所述。 本公開還涵蓋能夠誘導(dǎo)效應(yīng)活性的二聚scFv。例如，一個(gè)scFv結(jié)合IL_3Ra且包含本文所述的CDR和/或可變區(qū)并且另一 scFv結(jié)合免疫細(xì)胞(例如T細(xì)胞，例如CD3或CD19)上的細(xì)胞表面分子。在一個(gè)實(shí)施例中，二聚蛋白質(zhì)是dAb與scFv的組合。能夠誘導(dǎo)效應(yīng)功能的雙特異性抗體片段的實(shí)施例描述于例如US7235641中。其它抗體和抗體片段本公開還涵蓋其它抗體和抗體片段，如⑴“鑰孔(key and hole) ”雙特異性蛋白質(zhì)，如US5，731，168中所述；(ii)雜綴合蛋白質(zhì)，例如像US4，676，980中所述；(iii)使用化學(xué)交聯(lián)劑制造的雜綴合蛋白質(zhì)，例如像US4，676，980中所述；和(iv) Fab3 (例如像 EPl993O3O28M 中所述)。恒定區(qū)本公開涵蓋包含抗體的恒定區(qū)和/或抗體的Fe區(qū)的免疫球蛋白和抗體和抗原結(jié)合片段。適用于制造本公開的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的恒定區(qū)和/或Fe區(qū)的序列可以獲自多種不同來源。在一些實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的恒定區(qū)、Fe或其部分是來源于人抗體。恒定區(qū)、Fe或其部分可以來源于任何抗體類別，包括IgA、IgM、IgG、IgD、IgA和IgE,以及任何抗體同種型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe是人同種型IgGl或人同種型IgG2或人同種型IgG3或任何上述同種型的雜交體。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)能夠誘導(dǎo)效應(yīng)功能。例如，恒定區(qū)或Fe區(qū)是人IgGl或IgG3Fc區(qū)。在另一實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)是IgGl與IgG2恒定區(qū)或Fe區(qū)的雜交體或者IgGl與IgG3恒定區(qū)或Fe區(qū)的雜交體或者IgG2與IgG3恒定區(qū)或Fe區(qū)的雜交體。人IgGl與IgG2恒定區(qū)或Fe區(qū)的示例性雜交體描述于Chappel等，Proc. Natl Acad. Sc1.USA, 88:9036-9040，1991 中。確定Fe區(qū)可以抑或不可以誘導(dǎo)效應(yīng)功能的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見和/或在本文中描述。效應(yīng)功能
適當(dāng)?shù)兀竟_的抗IL-3Ra免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段具有或顯示有助于IL-3Ra +細(xì)胞或使得IL-3Ra +細(xì)胞能夠至少部分去除、大致上去除或消除的效應(yīng)功能。這種效應(yīng)功能可以是增強(qiáng)的與Fe受體的結(jié)合親和力、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本文的描述將顯而易見，本公開的一些實(shí)施例包括能夠誘導(dǎo)效應(yīng)功能的免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段。對(duì)于IgG類抗體，這些效應(yīng)功能受制于Fe區(qū)與表達(dá)于多種免疫細(xì)胞上的稱為Fe Y受體(Fe Y R)的受體家族和/或與補(bǔ)體(例如Clq)的接合。Fc/Fc Y R復(fù)合物的形成將這些細(xì)胞募集至所結(jié)合抗原的位點(diǎn)，通常引起信號(hào)傳導(dǎo)和后續(xù)免疫反應(yīng)。優(yōu)化Fe Y R對(duì)抗體Fe區(qū)的結(jié)合親和力以便增強(qiáng)效應(yīng)功能，特別是相對(duì)于“親本” Fe區(qū)改變ADCC和/或CDC活性的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。這些方法可以包括修飾抗體的Fe區(qū)以增強(qiáng)其與相關(guān)Fe受體的相互作用和增加其促進(jìn)ADCC和ADCP的潛力。也已描述在修飾與IgGl抗體的Fe區(qū)中的保守Asn297連接的寡糖后ADCC活性得到增強(qiáng)。 就這點(diǎn)來說，應(yīng)了解，在一些非限制性實(shí)施例中，增強(qiáng)效應(yīng)功能(如ADCC)可以通過修飾具有正常糖基化的野生型恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白或抗體(包括改變或除去糖基化(參見例如W000/61739)和/或氨基酸序列突變(參見例如W02008036688))來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段以使得其能夠誘導(dǎo)效應(yīng)功能(如ADCC)的方式結(jié)合IL-3Ra。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合IL-3Ra內(nèi)允許其誘導(dǎo)效應(yīng)功能(如ADCC)的表位。在另一實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞上的IL_3Ra，由此誘導(dǎo)效應(yīng)功能，如ADCC。例如，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段保持與細(xì)胞表面上的IL-3Ra結(jié)合維持足以誘導(dǎo)效應(yīng)功能(如ADCC)的時(shí)間。例如，免疫球蛋白或抗體不會(huì)內(nèi)化得太快，從而允許誘導(dǎo)ADCC。或者或另外，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段以允許免疫效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段中的恒定區(qū)或Fe區(qū)且誘導(dǎo)效應(yīng)功能(如ADCC)的方式與細(xì)胞表面上的IL-3Ra結(jié)合。例如，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的Fe區(qū)以使得當(dāng)免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段與IL-3R α結(jié)合時(shí)能夠與免疫效應(yīng)細(xì)胞上的Fe受體(例如Fe Y R)相互作用的方式暴露。在本公開的上下文中，術(shù)語“免疫效應(yīng)細(xì)胞”應(yīng)理解為意思是表達(dá)Fe受體且能夠通過ADCC或ADCP殺死其所結(jié)合的細(xì)胞的任何細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫效應(yīng)細(xì)胞是NK細(xì)胞。上述涉及免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段的各段落應(yīng)理解為在作了必要修改的情況下適用于誘導(dǎo)CDC。例如，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段以允許補(bǔ)體組分Clq結(jié)合免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段中的恒定區(qū)或Fe區(qū)且誘導(dǎo)CDC的方式與細(xì)胞表面上的IL-3Ra 結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)水平的效應(yīng)功倉泛。在一個(gè)實(shí)施例中，由恒定區(qū)或Fe區(qū)誘導(dǎo)的效應(yīng)功能的水平相對(duì)于野生型IgGl抗體恒定區(qū)或Fe區(qū)或野生型IgG3抗體恒定區(qū)或Fe區(qū)得到增強(qiáng)。在另一實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)經(jīng)過修飾以與沒有修飾的恒定區(qū)或Fe區(qū)相比增強(qiáng)其所能夠誘導(dǎo)的效應(yīng)功能的水平。所述修飾可以位于氨基酸層面和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)層面和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)層面和/或恒定區(qū)或Fe區(qū)的糖基化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，較高效應(yīng)功能可以多種方式中的任一種表現(xiàn)，例如表現(xiàn)為較高作用水平、更持續(xù)作用或較快作用速率。例如，抗IL-3RCI免疫球蛋白、抗體或抗原結(jié)合片段具有或顯示包括抗議依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)在內(nèi)的效應(yīng)功能。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)其誘導(dǎo)增強(qiáng)的效應(yīng)功能的能力的氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)以較高的親和力結(jié)合一個(gè)或多個(gè)Fe Y R0在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)對(duì)Fe Y R的親和力是野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)親和力·的I倍以上或野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)親和力的5倍以上或在野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)親和力的5倍與300倍之間。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)在選自由以下組成的組的位置包含至少一個(gè)氨基酸取代230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332和335，根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含選自由以下組成的組的至少一個(gè)氨基酸取代P230A、E233D、L234E、L234Y、L2341、L235D、L235S、L235Y、L2351、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V2401、V240M、F243L、V2641、V264T、V264Y、V2661、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V3021、E318R、S324D、S3241、S324V、N325T、K3261、K326T、L328M、L3281、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A3301、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R和T335Y，根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含選自由以下組成的組的氨基酸取代V2641、F243L/V2641、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V2401、V2661、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L2341、L235D、L235S、L235Y、L2351、S239T、V240M、V264Y、A3301、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、 S239E/V264I/A330Y/I332E、 S239D/A330Y/I332E、 S239N/A330Y/I332E、 S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、 S239D/V264I/I332E、 S239D/V264I/S298A/I332E、 S239D/V264I/A330L/I332E、S239D/I332E/A3301、P230A、P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V3021、E318R、S324D、S3241、S324V、K3261、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V2661、S239D/A330Y/I332E/L2341、S239D/A330Y/I332E/L235D、S239D/A330Y/I332E/V240I, S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/K326E和 S239D/A330Y/I332E/K326T，根據(jù) Kabat 的 EU 索引編號(hào)。在另一實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)結(jié)合Fe YRIIIa的效率高于Fe Y Rllb。例如，恒定區(qū)或Fe區(qū)在選自由以下組成的組的位置包含至少一個(gè)氨基酸取代234、235、239、240、264、296、330和1332，根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含選自由以下組成的組的至少一個(gè)氨基酸取代L234Y、L2341、L2351、S239D、S239E、S239N、S239Q、V240A、V240M、V2641、V264Y、Y296Q、A330L、A330Y、A3301、I332D 和 I332E，根據(jù) Kabat 的EU索引編號(hào)。例如，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含選自由以下組成的組的氨基酸取代I332E、V264I/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、Y296Q、A330L、A330Y、I332D、S239D、S239D/I332E、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234Y、L2341、L2351、V240A、V240M、V264Y、A3301、S239D/A330L/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E 和 S239D/V264I/A330L/I332E，根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào)。 在另一實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)誘導(dǎo)的ADCC的水平高于野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)介導(dǎo)的ADCC的水平。例如，恒定區(qū)或Fe區(qū)誘導(dǎo)的ADCC的水平是野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)誘導(dǎo)的ADCC的水平的5倍以上或在5倍與1000倍之間。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)在選自由以下組成的組的位置包含至少一個(gè)氨基酸取代230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332 和 335，根據(jù) Kabat 的 EU索引編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含選自由以下組成的組的至少一個(gè)氨基酸取代P230A、E233D、L234E、L234Y、L2341、L235D、L235S、L235Y、L2351、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V2401、V240M、F243L、V2641、V264T、V264Y、V2661、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V3021、E318R、S324D、S3241、S324V、N325T、K3261、K326T、L328M、L3281、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A3301、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R 和 T335Y，根據(jù) Kabat 的 EU 索引編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含選自由以下組成的組的氨基酸取代V2641、F243L/V2641、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V2401、V2661、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L2341、L235D、L235S、L235Y、L2351、S239T、V240M、V264Y、A3301、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、 S239Q/V264I/I332E、 S239E/V264I/A330Y/I332E、 S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、 S239D/S298A/I332E、 S239N/S298A/I332E、 S239D/V264I/I332E、 S239D/V264I/S298A/I332E、 S239D/V264I/A330L/I332E、 S239D/I332E/A3301、 P230A、 P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V3021、E318R、S324D、S3241、S324V、K3261、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V2661、S239D/A330Y/I332E/L2341、 S239D/A330Y/I332E/L235D、 S239D/A330Y/I332E/V2401、 S239D/A330Y/I332E/V264T、S239D/A330Y/I332E/K326E 和 S239D/A330Y/I332E/K326T，根據(jù) Kabat 的 EU索引編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含以下氨基酸取代S239D/I332E，根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào)。此恒定區(qū)或Fe區(qū)對(duì)Fe Y RIIIa的親和力相比于野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)增加約14倍且誘導(dǎo)ADCC的能力相比于野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)增加約3. 3倍。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 11的殘基121-450之間(包括殘基121-450)所示的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 11的殘基234-450之間所示的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)包含以下氨基酸取代S239D/A330L/I332E，根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào)。此恒定區(qū)或Fe區(qū)對(duì)Fe Y RIIIa的親和力相比于野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)增加約138倍且誘導(dǎo)ADCC的能力相比于野生型恒定區(qū)或Fe區(qū)增加約323倍。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 12的殘基121-450之間(包括殘基121-450)所示的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 12的殘基234-450之間所示的序列。增強(qiáng)Fe區(qū)誘導(dǎo)效應(yīng)功能的能力的其它氨基酸取代在本領(lǐng)域中是已知的和/或描述于例如 US6737056 或 US7317091 中。在一個(gè)實(shí)施例中，改變恒定區(qū)或Fe區(qū)的糖基化以增強(qiáng)其誘導(dǎo)增強(qiáng)的效應(yīng)功能的能力。就這點(diǎn)來說，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡糖，所述寡糖通常由N型鍵聯(lián)連接至恒定區(qū)或Fe區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297。寡糖可包括各 種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及連接至雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)的“莖干”中的GlcNAc的巖藻糖。在一些實(shí)施例中，本公開的恒定區(qū)或Fe區(qū)包含缺乏連接(直接或間接)至Fe區(qū)的巖藻糖的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即Fe區(qū)是“無巖藻糖基化”的。所述變體可以具有提高的誘導(dǎo)ADCC的能力。制造無巖藻糖基化抗體的方法包括在不能表達(dá)α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)的細(xì)胞系中表達(dá)免疫球蛋白或抗體(例如像 Yumane-Ohnuki 等,Biotechnol.Bioengineer. , 87:614-622, 2004 中所述)、在表達(dá)針對(duì)FUT8的小干擾RNA的細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白或抗體(例如像Mori等，Biotechnol. Bioengineer. , 88:901-908, 2004 中所述)、在不能表達(dá)鳥苷二憐酸(⑶P)-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)的細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白或抗體(例如像Kanda等，J.Biotechnol.，130:300-310, 2007中所述)。本公開還涵蓋使用巖藻糖基化水平降低的免疫球蛋白，例如使用經(jīng)過修飾以表達(dá)β_(1，4)-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III (GnT-1II)的細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫球蛋白(例如像Umana等,Nat. Biotechnol. , 17:176-180，1999中所述)。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體是無巖藻糖基化的。例如，免疫球蛋白或抗體是在不表達(dá)FUT8的細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞)中產(chǎn)生。其它方法包括使用固有地產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)的Fe介導(dǎo)的效應(yīng)功能的抗體的細(xì)胞系(例如用于制造病毒疫苗的鴨胚來源的干細(xì)胞，W02008/129058 ;在禽類丨_:ΒΧ_·!〈細(xì)胞中制造重組蛋白，W02008/142124)。適用于本公開方法中的免疫球蛋白還包括具有等分寡糖者，例如其中連接于恒定區(qū)或Fe區(qū)的雙觸角寡糖由GIcNAc等分。所述免疫球蛋白可以具有減少的巖藻糖基化和/或提高的ADCC功能。所述免疫球蛋白的實(shí)例描述于例如US6602684和US20050123546中。還涵蓋在連接至恒定區(qū)或Fe區(qū)的寡糖中具有至少一個(gè)半乳糖殘基的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以具有提高的CDC功能。所述免疫球蛋白描述于例如W01997/30087和 W01999/22764 中。誘導(dǎo)增強(qiáng)水平的ADCC活性的免疫球蛋白的非限制性實(shí)例包括(i)包含含有SEQ ID NO: 11中所示的序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 13中所示的序列的輕鏈的抗體；(ii)包含含有SEQ ID NO: 12中所示的序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 13中所示的序列的輕鏈的抗體；和
(iii)包含含有SEQ ID NO: 10中所示的序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 13中所示的序列的輕鏈的抗體，其中重鏈恒定區(qū)是無巖藻糖基化的。本公開的誘導(dǎo)增強(qiáng)水平的ADCC活性的有利抗體包含含有SEQ ID NO: 11中所示的序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 13中所示的序列的輕鏈。如本文所論述，在將此抗體施用至哺乳動(dòng)物后(例如施用后至少7或8或11或17或22或29天)，哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量相比于以下的一個(gè)或多個(gè)增加⑴施用抗體前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量；(ii)施用包含含有SEQ ID NO: 10中所示的序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 13中所示的序列的輕鏈的抗體的哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量，其中重鏈恒定區(qū)是無巖藻糖基化的(例如，如在施用后的同一天所評(píng)估)；和(iii)施用特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且具有人IgGl恒定區(qū)的抗體的哺乳動(dòng)物體內(nèi)·NK細(xì)胞的數(shù)量(例如，如在施用后的同一天所評(píng)估)。用于測(cè)定免疫球蛋白或抗體誘導(dǎo)效應(yīng)功能的能力的方法在本領(lǐng)域中是已知的和/或在本文中更詳細(xì)描述。其它修飾本公開還涵蓋對(duì)免疫球蛋白的其它修飾。例如，免疫球蛋白或抗體包含一個(gè)或多個(gè)增加免疫球蛋白的半衰期的氨基酸修飾。例如，免疫球蛋白或抗體包含含有一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)恒定區(qū)或Fe區(qū)對(duì)新生」L Fe區(qū)(FcRn)的親和力的氨基酸取代的恒定區(qū)或Fe區(qū)。例如，恒定區(qū)或Fe區(qū)在較低pH(例如約pH6. O)下對(duì)FcRn的親和力增強(qiáng),從而有助于內(nèi)體中的Fc/FcRn結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施例中，恒定區(qū)或Fe區(qū)在約pH6下對(duì)FcRn的親和力與其在約ρΗ7· 4下的親和力相比增強(qiáng)，這有助于恒定區(qū)或Fe在細(xì)胞再循環(huán)后再釋放至血液中。這些氨基酸取代適用于通過降低血液清除率而延長免疫球蛋白的半衰期。示例性氨基酸取代包括T250Q和/或M428L，根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)。其它或替代氨基酸取代描述于例如US20070135620中。核酸本公開的另一實(shí)施例提供編碼本公開的免疫球蛋白或抗體(包括免疫球蛋白或抗體的片段、變體和衍生物)的分離的核酸。核酸的某些實(shí)例包含SEQ ID NO: 14-19中的一個(gè)或多個(gè)中所示的核苷酸序列，SEQID NO: 14-19分別編碼本公開的免疫球蛋白或抗體的⑶R1-6。核酸的其它實(shí)例包含SEQ ID NO:20-23中的一個(gè)或多個(gè)中所示的核苷酸序列。本公開還涵蓋編碼如上文所述的本公開的免疫球蛋白或抗體的變體的核酸同源物。示例性核酸同源物與編碼SEQ ID NO:2_13中任一個(gè)的分離的核酸共享至少80%或85%，如至少90%或95%或99%的核苷酸序列同一性。適當(dāng)?shù)兀怂嵬次锊痪幋a包含能夠特異性結(jié)合IL-3Ra的鼠類可變區(qū)的蛋白質(zhì)。核酸同源物可以在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與本公開的分離的核酸雜交。蛋白質(zhì)制造重組表汰
在一個(gè)實(shí)施例中，本文根據(jù)任何實(shí)施例描述的免疫球蛋白或抗體是重組的。僅舉例來說，本公開的重組免疫球蛋白或抗體可以通過包括以下步驟的方法來制造:(i)制備包含可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)性核苷酸序列(例如啟動(dòng)子)的本公開的分離的核酸的表達(dá)構(gòu)建體；(ii)用所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化適合宿主細(xì)胞；(iii)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)重組免疫球蛋白或抗體；和(iv)從所述宿主細(xì)胞分離所述重組免疫球蛋白或抗體。在重組免疫球蛋白的情況下，可將編碼其的核酸克隆至表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體接著轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎(HEK)細(xì)胞或本來不產(chǎn)生免疫球蛋白或抗體蛋白質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞。用于表達(dá)免疫球蛋白或抗體的示例性細(xì)胞為CHO細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或HEK細(xì)胞。細(xì)胞可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)有利于表達(dá)修飾的免疫球蛋白或抗體的突變和/或缺失。一個(gè)非限制性實(shí)例是編碼所表達(dá)免疫球蛋白或抗體的巖藻糖基化所需的酶的基因缺失。例如，所缺失的基因編碼FUT8。FUT8缺失CHO細(xì)胞的一個(gè)可商購獲得的來源是Biowa (PotelIigent 細(xì)胞)。例如，用于表達(dá)無巖藻糖基化免疫球蛋白或抗體細(xì)胞是FUT8缺失CHO細(xì)胞,如Biowa的Potelligent 細(xì)胞。用于實(shí)現(xiàn)這些目的的分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的且描述于以下文獻(xiàn)中，例如 Ausubel 等(編著)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-1nterscience (1988,包括迄今為止的所有更新)或 Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989) 0多種克隆和體外擴(kuò)增方法適用于構(gòu)建重組核酸。制造重組抗體的方法在本 領(lǐng)域中也是已知的。參見US4816567或US5530101。分離后，將核酸插入可操作地連接于基因構(gòu)建體或表達(dá)載體中的啟動(dòng)子以供進(jìn)一步克隆(擴(kuò)增DNA)或在無細(xì)胞系統(tǒng)或細(xì)胞中表達(dá)。因此，本公開的另一實(shí)施例提供包含本公開的分離的核酸和一個(gè)或多個(gè)其它核苷酸序列的基因構(gòu)建體。適當(dāng)?shù)?，基因?gòu)建體是呈質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母或細(xì)菌人工染色體的形式或包含這些形式的遺傳組分，如本領(lǐng)域中所熟知?；驑?gòu)建體可以適用于在細(xì)菌或其它宿主細(xì)胞中維持和增殖分離的核酸，以供通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行操作和/或表達(dá)本公開的核酸或所編碼的免疫球蛋白或抗體。出于宿主細(xì)胞表達(dá)的目的，基因構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體。適當(dāng)?shù)?，表達(dá)構(gòu)建體包含可操作地連接于表達(dá)載體中的一個(gè)或多個(gè)其它序列(如啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)性序列)的本公開核酸。通常，調(diào)節(jié)性核苷酸序列可以包括但不限于啟動(dòng)子序列、前導(dǎo)序列或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或活化因子序列。如本文所用，術(shù)語“啟動(dòng)子”應(yīng)以其最廣泛情形理解且包括基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA盒或起始因子元件,有或沒有改變核酸表達(dá)(例如回應(yīng)于發(fā)育和/或外部刺激物，或以組織特異性方式)的其它調(diào)節(jié)元件(例如上游活化序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子和沉默子)。在本公開的上下文中，術(shù)語“啟動(dòng)子”也用于描述重組、合成或融合核酸，或賦予、活化或增強(qiáng)其所可操作地連接的核酸的表達(dá)的衍生物。示例性啟動(dòng)子可以含有一個(gè)或多個(gè)特定調(diào)節(jié)元件的額外拷貝以進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)和/或改變所述核酸的空間表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)。如本文所用，術(shù)語“可操作地連接于”意思是相對(duì)于核酸定位啟動(dòng)子以使所述核酸的表達(dá)受所述啟動(dòng)子控制。多種用于在細(xì)胞中表達(dá)的載體可獲得。載體組分通常包括但不限于以下一個(gè)或多個(gè)信號(hào)序列、編碼免疫球蛋白或抗體的序列(例如由本文提供的信息得到)、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解適用于表達(dá)免疫球蛋白的序列。示例性信號(hào)序列包括原核分泌信號(hào)(例如pelB、堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定性腸毒素II)、酵母分泌信號(hào)(例如轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列)或哺乳動(dòng)物分泌信號(hào)(例如單純皰疹gD信號(hào))。在哺乳動(dòng)物中具有活性的示例性啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒極早期啟動(dòng)子(CMV-1E)、 人延伸因子1-α啟動(dòng)子(EFl)、小核RNA啟動(dòng)子(Ula和Ulb)、α肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子、猿病毒40啟動(dòng)子(SV40)、勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子(RSV)、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；包含CMV增強(qiáng)子/β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白或抗體啟動(dòng)子或其活性片段的雜交調(diào)節(jié)元件。適用宿主細(xì)胞系的實(shí)例為用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細(xì)胞系(C0S-7，ATCCCRL1651);人胚腎細(xì)胞系(293或亞克隆用于懸浮培養(yǎng)生長的293細(xì)胞)；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK, ATCC CCL10);或中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。適合在酵母細(xì)胞(如選自包含巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S. pombe))中表達(dá)的典型啟動(dòng)子包括但不限于ADHl啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、GAL4啟動(dòng)子、CUPl啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子、nmt啟動(dòng)子、RPRl啟動(dòng)子或TEFl啟動(dòng)子。用于將分離的核酸或包含所述核酸的表達(dá)構(gòu)建體引入細(xì)胞中以供表達(dá)的方式對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。用于指定細(xì)胞的技術(shù)取決于已知成功技術(shù)。用于將重組DNA引入細(xì)胞中的方式包括顯微注射、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體(如使用 lipofectamine (Gibco, MD, USA)和 / 或 cellfectin (Gibco, MD, USA))介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、PEG介導(dǎo)的DNA吸收、電穿孔和微粒轟擊(如使用涂有DNA的鶴粒子或金粒子(AgracetusInc. ,WI1USA)以及其它方式。用于產(chǎn)生免疫球蛋白或抗體的宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取決于所用細(xì)胞類型?？缮藤彨@得的培養(yǎng)基(如Ham’s FlO(Sigma)、最低必需培養(yǎng)基((MEM)，(Sigma))、RPMl-1640 (Sigma)和杜爾貝科氏改良依格培養(yǎng)基((Dulbecco's Modified Eagle’sMedium5DMEM), Sigma)適于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。用于培養(yǎng)本文所述的其它細(xì)胞類型的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是已知的。蛋白質(zhì)的分離用于純化免疫球蛋白或抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的和/或在本文中描述。當(dāng)免疫球蛋白或抗體是分泌至培養(yǎng)基中時(shí)，可首先使用可商購獲得的蛋白質(zhì)濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自所述表達(dá)系統(tǒng)的上清液?？稍谌魏吻笆霾襟E中納入蛋白酶抑制劑GnPMSF)以抑制蛋白水解并且可納入抗生素以防止外來污染物的生長?？梢允褂美珉x子交換、羥磷灰石色譜、疏水相互作用色譜、凝膠電泳、透析、親和色譜(例如蛋白質(zhì)A親和色譜或蛋白質(zhì)G色譜)或前述方法的任何組合來純化從細(xì)胞中制備的免疫球蛋白或抗體。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的并且例如描述于W099/57134或EdHarlow 和 David Lane (編著)Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory, (1988)中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將了解，可對(duì)免疫球蛋白或抗體進(jìn)行修飾以包括標(biāo)簽，以便促進(jìn)純化或檢測(cè)，例如聚組氨酸標(biāo)簽，例如六聚組氨酸標(biāo)簽，或流感病毒血球凝集素(HA)標(biāo)簽，或猿病毒5 (V5)標(biāo)簽，或FLAG標(biāo)簽，或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽。接著使用本領(lǐng)域中已知的方法(如親和純化)對(duì)所得免疫球蛋白或抗體進(jìn)行純化。例如，包含六聚組氨酸標(biāo)簽的免疫球蛋白或抗體可通過使包含免疫球蛋白或抗體的樣品與固定在固體或半固體支持物上的特異性結(jié)合六聚組氨酸標(biāo)簽的鎳-氮基三乙酸(N1-NTA)接觸，洗滌樣品以除去未結(jié)合的免疫球蛋白并隨后洗脫結(jié)合的免疫球蛋白來純化。或者或另外，在親和純化方法中使用結(jié)合標(biāo)簽的配體或抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體還具有蛋白酶裂解位點(diǎn)，如因子Xa或凝血酶 的蛋白酶裂解位點(diǎn)，其允許相關(guān)蛋白酶部分消化免疫球蛋白或抗體并由此使免疫球蛋白或抗體從標(biāo)簽釋放。接著可通過后續(xù)色譜分離使所釋放的抗體或免疫球蛋白與融合配偶體分離。分析免疫球蛋白的活性本公開的免疫球蛋白或抗體可以容易地針對(duì)生物活性進(jìn)行篩選，例如像下文所述。結(jié)合分析一種形式的所述分析是抗原結(jié)合分析，例如像Scopes (Proteinpurification !principles and practice,第三版，Springer Verlag, 1994)中所述。這種方法通常涉及標(biāo)記免疫球蛋白或抗體和使其與固定的抗原接觸。洗滌以除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)后，檢測(cè)標(biāo)記的量并由此檢測(cè)到所結(jié)合蛋白質(zhì)的量。當(dāng)然，可以固定免疫球蛋白或抗體并標(biāo)記抗原。也可以使用例如像本文所述或例示的淘選型分析。測(cè)定中和作用在本公開的一些實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體能夠中和IL-3信號(hào)傳導(dǎo)。用于評(píng)估免疫球蛋白中和配體通過受體進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的能力的各種分析在本領(lǐng)域中是已知的。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體減少或阻止IL-3與3Ra鏈和/或IL_3Ra鏈與IL-3Ri3鏈的雜二聚體的結(jié)合。這些分析可以使用標(biāo)記的IL-3和/或標(biāo)記的免疫球蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析來進(jìn)行。例如，接著使與抗體的Fe區(qū)融合的標(biāo)記IL-3Rα或其細(xì)胞外區(qū)或固定的表達(dá)IL-3R的細(xì)胞和標(biāo)記IL-3與固定的受體或細(xì)胞在測(cè)試免疫球蛋白或抗體存在或不存在下接觸并檢測(cè)結(jié)合標(biāo)記的量。在抗體或免疫球蛋白存在下結(jié)合的標(biāo)記的量與不存在蛋白質(zhì)下相比減少表明免疫球蛋白或抗體減少或阻止IL-3與IL-3R結(jié)合。通過測(cè)試免疫球蛋白或抗體的多種濃度來測(cè)定IC5Q，即減少結(jié)合IL-3R的IL-3的量的蛋白質(zhì)濃度，或者可測(cè)定EC5tl，即實(shí)現(xiàn)由免疫球蛋白或抗體實(shí)現(xiàn)的對(duì)IL-3與IL-3R結(jié)合的最大抑制作用的50%的蛋白質(zhì)濃度。在另一實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體減少或阻止IL-3介導(dǎo)的組胺從嗜堿性粒細(xì)胞的釋放。例如，將包含嗜堿性粒細(xì)胞的低密度白細(xì)胞與IgE、IL-3和各種濃度的免疫球蛋白或抗體一起孵育。對(duì)照細(xì)胞不包含免疫球蛋白(陽性對(duì)照)或IL_3(陰性對(duì)照)。接著使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如RIA)評(píng)估所釋放組胺的水平。減少組胺釋放水平至低于陽性對(duì)照的水平的免疫球蛋白或抗體視為中和IL-3信號(hào)傳導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施例中，減少水平與免疫球蛋白或抗體濃度相關(guān)。一種用于評(píng)估IL-3介導(dǎo)的組胺釋放的示例性方法描述于例如Lopez等，J. Cell. Physiol.，145:69，1990 中。在另一實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體減少或阻止IL-3介導(dǎo)的白血病細(xì)胞系TF-1的增殖。例如，將TF-1細(xì)胞在沒有IL-3或GM-CSF的情況下培養(yǎng)足以使其增殖停止的時(shí)間(例如24-48小時(shí))。接著在IL-3和各種濃度的免疫球蛋白或抗體存在下培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞不與免疫球蛋白或抗體(陽性對(duì)照)或IL-3(陰性對(duì)照)接觸。接著使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如3H-胸苷并入)評(píng)估細(xì)胞增殖。在IL-3存在下減少或阻止細(xì)胞增殖至低于陽性對(duì)照的水平的免疫球蛋白或抗體視為中和IL-3信號(hào)傳導(dǎo)。用于評(píng)估IL-3信號(hào)傳導(dǎo)中和作用的另一分析包括確定免疫球蛋白或抗體是否減 少或阻止IL-3介導(dǎo)的對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。例如，在IL-3(任選地，含IFN-Y)和各種濃度的免疫球蛋白或抗體存在下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。接著使用例如酶聯(lián)免疫吸附劑分析(ELISA)評(píng)估所分泌IL-6的量。對(duì)照培養(yǎng)物不包含免疫球蛋白或抗體(陽性對(duì)照)或IL-3 (陰性對(duì)照)。在IL-3存在下減少或阻止IL-6產(chǎn)生至低于陽性對(duì)照的水平的免疫球蛋白或抗體視為中和IL-3信號(hào)傳導(dǎo)。用于評(píng)估對(duì)IL-3的信號(hào)傳導(dǎo)的中和作用的其它方法由本公開所涵蓋。測(cè)定效應(yīng)功能用于評(píng)估ADCC活性的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在一個(gè)實(shí)施例中，使用51Cr釋放分析、銪釋放分析或35S釋放分析來評(píng)估ADCC活性的水平。在這些分析中的每一個(gè)中，將表達(dá)IL-3Ra的細(xì)胞與一種或多種所述化合物在足以使化合物被細(xì)胞吸收的條件下培養(yǎng)足以使化合物被細(xì)胞吸收的時(shí)間。在35S釋放分析的情況下，可以將表達(dá)IL-3R α的細(xì)胞與35S標(biāo)記甲硫氨酸和/或半胱氨酸一起培養(yǎng)足以使標(biāo)記氨基酸并入新合成的蛋白質(zhì)中的時(shí)間。接著在免疫球蛋白或抗體存在或不存在下且在免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)和/或NK細(xì)胞)存在下培養(yǎng)細(xì)胞。接著檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中51Cr、銪和/或35S的量，且與不存在免疫球蛋白下相比存在免疫球蛋白或抗體下的增加表明免疫球蛋白具有效應(yīng)功能。公開用于評(píng)估由免疫球蛋白誘導(dǎo)的ADCC的水平的示例性出版物包括 Hellstrom 等，Proc. Natl Acad. Sc1. USA83:7059-7063，1986 和Bruggemann 等,J. Exp. Med. 166:1351-1361，1987。用于評(píng)估由免疫球蛋白或抗體誘導(dǎo)的ADCC的水平的其它分析包括用于流式細(xì)胞術(shù)的ACTI 非放射性細(xì)胞毒性分析(CellTechnology，Inc. CA, USA)或CytoTox火)卻非放射性細(xì)胞毒性分析(Promega，WI，USA)?；蛘呋蛄硗猓ㄟ^測(cè)定免疫球蛋白或抗體對(duì)一種或多種Fe YR的親和力來評(píng)估免疫球蛋白或抗體的效應(yīng)功能，例如像US7317091中所述。還可以進(jìn)行Clq結(jié)合分析來證實(shí)免疫球蛋白或抗體能夠結(jié)合Clq并且可以誘導(dǎo)⑶C。為評(píng)估補(bǔ)體活化，可以進(jìn)行⑶C分析(參見例如Gazzano-Santoro等，J.1mmunol.Methods202:163， 1996。
測(cè)定NK細(xì)胞數(shù)暈如本文所述，本公開的免疫球蛋白和/或抗體可以影響哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量。用于評(píng)估哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見。在一個(gè)實(shí)施例中，在向哺乳動(dòng)物(例如非人哺乳動(dòng)物，如非人靈長類動(dòng)物，例如食蟹獼猴)施用本公開的免疫球蛋白或抗體后，獲得血液(或血清)的樣品并使用熒光活化細(xì)胞分選(FACS)評(píng)估NK細(xì)胞的數(shù)量?？梢曰贑D16和/或CD56的表達(dá)和/或CD20和/或⑶3表達(dá)的缺乏(或低水平表達(dá))來檢測(cè)NK細(xì)胞?？梢酝ㄟ^與較早(例如施用抗體或免疫球蛋白之前)獲得的樣品中NK細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行比較來測(cè)定NK細(xì)胞數(shù)量的變化百分比。測(cè)定親和力任選地，測(cè)定蛋白質(zhì)對(duì)于IL-3RCI或其表位的解離常數(shù)(Kd)或締合常數(shù)(Ka)或 平衡常數(shù)(Kd)。在一個(gè)實(shí)施例中，通過放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記的IL-3Ra結(jié)合分析來測(cè)量免疫球蛋白或抗體的這些常數(shù)。此分析在一系列滴定未標(biāo)記IL-3Ra存在下用最低濃度的標(biāo)記IL-3Ra (或其可溶性形式，例如包含融合于Fe區(qū)的IL-3Rα的細(xì)胞外區(qū))平衡蛋白質(zhì)。在洗滌以除去未結(jié)合IL_3Ra后，測(cè)定標(biāo)記的量。可以通過用于抗體反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法來測(cè)定親和力測(cè)量值，所述方法為例如免疫分析、表面等離子體激兀共振(SPR) (Rich 和 Myszka Curr. Opin. Biotechnolll: : 54, 2000 ；Englebienne Analyst. 123:1599，1998)、等溫滴定熱量測(cè)定(ITC)或本領(lǐng)域中已知的其它動(dòng)力學(xué)相互反應(yīng)分析。在一個(gè)實(shí)施例中，通過使用表面等離子體激元共振分析,例如使用BIAcore表面等離子體激元共振(BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)與固定的IL_3Ra或其區(qū)來測(cè)量常數(shù)。示例性SPR方法描述于US7229619中。評(píng)估治療功效體外分析多種體外分析可用于評(píng)估免疫球蛋白或抗體治療本文所述的疾病或病癥的能力。例如，使用本文所述的方法評(píng)估免疫球蛋白或抗體殺死細(xì)胞(例如癌細(xì)胞，如白血病細(xì)胞)的能力。在另一實(shí)施例中，將免疫細(xì)胞(例如pDC和/或嗜堿性粒細(xì)胞)或包含其的細(xì)胞群體(例如PBMC)在存在或不存在免疫球蛋白或抗體和疾病或病癥中存在的那些細(xì)胞的誘導(dǎo)物(例如CpG寡核苷酸和/或免疫復(fù)合物)下培養(yǎng)。接著通過例如使用ELISA測(cè)定分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中的IFNa的水平來評(píng)估免疫球蛋白或抗體在治療疾病或病癥中的功效?；蛘呋蛄硗?，評(píng)估組胺分泌或IL-4、IL-6和/或IL-13分泌的水平。任何這些細(xì)胞因子的水平與在免疫球蛋白或抗體不存在下(或在同種型對(duì)照免疫球蛋白或抗體存在下)相比降低都表明免疫球蛋白或抗體適于治療疾病或病癥。或者或另外，評(píng)估細(xì)胞死亡的水平。細(xì)胞死亡增加指示免疫球蛋白或抗體適于治療疾病或病癥。體內(nèi)分析在一個(gè)實(shí)施例中，使用體內(nèi)分析來評(píng)估免疫球蛋白治療疾病或病癥的功效。在一個(gè)實(shí)施例中，使用癌癥的異種移植模型來評(píng)估治療功效。例如,用輻射照射N0D/SCID小鼠并且任選地用抗⑶122抗體處理以去除NK細(xì)胞。向小鼠施用人白血病細(xì)胞(例如急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞)和小鼠或人骨髓干細(xì)胞。細(xì)胞移植后，向小鼠施用測(cè)試免疫球蛋白或抗體并且評(píng)估循環(huán)和/或骨髓和/或淋巴結(jié)中白血病細(xì)胞的水平。在抗體或免疫球蛋白存在下與抗體或免疫球蛋白不存在下相比循環(huán)和/或骨髓和/或淋巴結(jié)中白血病細(xì)胞的數(shù)量降低表明治療功效。在另一實(shí)施例中，向非人動(dòng)物(例如非人靈長類動(dòng)物)施用免疫球蛋白或抗體并且評(píng)估循環(huán)中免疫細(xì)胞(例如PDC和/或嗜堿性粒細(xì)胞)的數(shù)量/水平。使免疫細(xì)胞(例如pDC和/或嗜堿性粒細(xì)胞)的數(shù)量/水平與施用前和/或尚未施用免疫球蛋白或抗體的對(duì)照哺乳動(dòng)物體內(nèi)相比減少的免疫球蛋白或抗體視為適于治療疾病或病癥。在另一實(shí)施例中，例如使用ELISA檢測(cè)哺乳動(dòng)物循環(huán)中細(xì)胞因子(如IFNa )的水平。使細(xì)胞因子的水平與施用前和/或尚未施用免疫球蛋白或抗體的對(duì)照哺乳動(dòng)物體內(nèi)的水平相比降低的免疫球蛋白或抗體視為適于治療疾病或病癥。因?yàn)榭紤]細(xì)胞因子(如IFNa)在一些疾病/病癥(例如狼瘡)中起作用，因此減少IFNa產(chǎn)生的免疫球蛋白或抗 體視為適于治療所述病癥。組合物適當(dāng)?shù)?，在用于向哺乳?dòng)物施用抗IL_3Ra免疫球蛋白或抗體的組合物或方法中，免疫球蛋白是與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑組合，如本領(lǐng)域中所理解。因此，本公開的一個(gè)實(shí)施例提供包含本公開的免疫球蛋白或抗體與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑組合的藥物組合物。在另一實(shí)施例中，本公開提供包含適于在施用至哺乳動(dòng)物之前與免疫球蛋白或抗體組合或混合的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑的試劑盒。在此實(shí)施例中，試劑盒可進(jìn)一步包含使用說明書。一般來說，“載體、稀釋劑或賦形劑”意思是可以安全地施用至任何哺乳動(dòng)物(例如人)的固體或液體填充劑、粘合劑、稀釋劑、囊封物質(zhì)、乳化劑、濕潤劑、溶劑、懸浮劑、包衣或潤滑劑。根據(jù)特定施用途徑，可以使用本領(lǐng)域中已知的多種可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，例如像 Remington，s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991)中所述。僅舉例來說，載體、稀釋劑或賦形劑可以選自包括以下的組糖(例如蔗糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖)、淀粉、纖維素和其衍生物、麥芽、明膠、滑石粉、硫酸鈣、油類(包括植物油、合成油和合成單甘油酯或二甘油酯)、低級(jí)醇、多元醇、海藻酸、磷酸鹽緩沖溶液、潤滑劑(如硬脂酸鈉或硬脂酸鎂)、等滲鹽水和無熱原質(zhì)水。例如，載體、稀釋劑或賦形劑與腸胃外施用相容或適于腸胃外施用。腸胃外施用包括不經(jīng)過消化道的任何施用途徑。腸胃外施用的非限制性實(shí)例包括注射、輸注等。舉例來說，注射施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下注射。還涵蓋通過可以例如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下方式遞送的儲(chǔ)庫或緩慢釋放制劑進(jìn)行遞送。組合療法在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的免疫球蛋白或抗體是與適用于治療疾病或病癥的另一化合物或治療性處理。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是在之前，例如輻射療法(例如用于治療癌癥，如血液癌癥，如白血病)之前一個(gè)月或兩周或一周施用。 在一個(gè)實(shí)施例中，其它化合物是化學(xué)療法化合物，如卡鉬(caboplatin)、順鉬(cisplatin)、環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide)、多西紫杉醇(docetaxal)、阿霉素(doxorubicin)、埃羅替尼(erlotinib)、依托泊苷(etoposide)、氟尿U密P定(f Iuorouracil)、伊立替康(irinotecan)、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、拓?fù)涮婵?topotecan)、長春新喊(vincristine)或長春喊(vinblastine)。在一個(gè)實(shí)施例中，化學(xué)療法化合物是選自由以下組成的組甲氨蝶呤、1-天冬酰胺酶、長春新堿、阿霉素、道諾霉素、阿糖胞苷、伊達(dá)比星、米托蒽醌、環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱、苯丁酸氮芥和其組合。在一個(gè)實(shí)施例中，其它化合物是用于治療急性白血病的化學(xué)療法化合物，如選自由以下組成的組的化合物甲氨蝶呤、1-天冬酰胺酶、長春新堿、阿霉素、道諾霉素、阿糖胞苷、伊達(dá)比星、米托蒽醌和其組合。在一個(gè)實(shí)施例中，其它化合物是用于治療急性成淋巴細(xì)胞性白血病的化學(xué)療法化合物，如選自由以下組成的組的化合物甲氨蝶呤、1-天冬酰胺酶、長春新堿、阿霉素、道諾 霉素和其組合。在另一實(shí)施例中，其它化合物是化學(xué)療法化合物，如阿扎胞苷。在一個(gè)實(shí)施例中，其它化合物是適用于治療癌癥的生物劑，例如利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、阿來組單抗(alemtuzumab)、帕尼單抗(panitumumab)或西妥昔單抗(cetuximab)。在一個(gè)實(shí)施例中，其它化合物是抗炎化合物?；蛘呋蛄硗?，其它化合物是免疫抑制劑?；蛘呋蛄硗?，其它化合物是皮質(zhì)類固醇，如潑尼松和/或潑尼松龍?；蛘呋蛄硗?，其它化合物是抗瘧化合物，如羥基氯喹或氯喹寧?；蛘呋蛄硗猓渌衔锸羌装钡?。或者或另外，其它化合物是硫唑嘌呤?；蛘呋蛄硗?，其它化合物是環(huán)磷酰胺?；蛘呋蛄硗?，其它化合物是麥考酚酸酯?；蛘呋蛄硗猓渌衔锸强笴D20抗體(例如利妥昔單抗或奧伐單抗(ofatumumab))?；蛘呋蛄硗猓渌衔锸强笴D22抗體(例如依帕珠單抗(epratuzumab))?；蛘呋蛄硗?其它化合物是抗TNF抗體(例如英夫利昔單抗或阿達(dá)木單抗或戈利木單抗)?；蛘呋蛄硗?，其它化合物是CTLA-4拮抗劑(例如阿巴西普(abatacept)、CTLA4-1g)?；蛘呋蛄硗猓渌衔锸强笽L-6抗體?；蛘呋蛄硗?，其它化合物是BLys拮抗劑，如抗BLys抗體(例如貝利木單抗(belimumab))。施用的劑量和時(shí)程為預(yù)防或治療疾病或病癥或其復(fù)發(fā)，活性劑(即本公開的免疫球蛋白或抗體)的適當(dāng)劑量將取決于所欲治療的疾病的類型、疾病的嚴(yán)重性和病程、所施用的免疫球蛋白或抗體是用于預(yù)防還是治療目的、先前療法、患者的臨床病史和對(duì)免疫球蛋白的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷。特定給藥方案(即劑量、時(shí)程和重復(fù))將取決于特定個(gè)體和所述個(gè)體的醫(yī)學(xué)病史，如醫(yī)師所評(píng)估。通常，臨床醫(yī)師將施用免疫球蛋白，直至達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果的劑量。本公開的方法適用于治療、改善或預(yù)防哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的癥狀，或用于改善哺乳動(dòng)物的預(yù)后。本公開的方法還適用于延遲具有發(fā)生狼瘡或其復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的狼瘡發(fā)生或預(yù)防所述個(gè)體的狼瘡。為施用本文所述的免疫球蛋白或抗體，正常劑量可在每天每公斤個(gè)體體重約IOng至約IOOmg或更高范圍內(nèi)變化。示例性劑量和其范圍在本文中描述。為在若干天或更長時(shí)間內(nèi)重復(fù)施用，根據(jù)所欲治療的疾病或病癥的嚴(yán)重性，可以持續(xù)治療直至實(shí)現(xiàn)所需癥狀抑制。在一些實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是以約lmg/kg至約30mg/kg之間，如約Im/gkg至約10mg/kg,或約2mg/kg或約3mg/kg或4mg/kg或5mg/kg的初始(或負(fù)載)劑量施用。免疫球蛋白或抗體可接著以約O. 000 lmg/kg至約lmg/kg之間，如約O. 0005mg/kg至約lmg/kg,例如約 O. 00 lmg/kg 至約 lmg/kg,如約 O. O lmg/kg 至約 lmg/kg,例如約 O. O lmg/kg至約 O. lmg/kg,如約 O. 02mg/kg 或 O. 03mg/kg 或 O. 04mg/kg 或 O. 05mg/kg 的維持劑量施用。維持劑量可施用每7-30天一次，如每10-15天一次，例如每10天或11天或12天或13天或14天或15天一次。在一些實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是以約O. 000 lmg/kg至約50mg/kg之間，如約O. 0005mg/kg 至約 50mg/kg 之間，例如約 O. 00lmg/kg 至約 40mg/kg 之間，例如約 O. 005mg/kg至約30mg/kg之間，如約O. 01mg/kg至約20mg/kg之間的劑量施用。例如,免疫球蛋白是以約 O. O lmg/kg 至約 10mg/kg 之間，如約 O. O lmg/kg 至約 lmg/kg,如約 O. 02mg/kg 或 O. 03mg/kg 或 O. 04mg/kg 或 O. 05mg/kg 或 O. 06mg/kg 或 O. 07mg/kg 或 O. 08mg/kg 或 O. 09mg/kg 或·
O.lmg/kg 或 O. 2mg/kg 或 O. 3mg/kg 或 O. 4mg/kg 或 O. 5mg/kg 或 O. 6mg/kg 或 O. 7mg/kg 或O. 8mg/kg或O. 9mg/kg的劑量(例如沒有更高負(fù)載體量)施用。在一些實(shí)施例中，多個(gè)劑量施用例如每7-30天一次，如每10-22天一次，例如每10-15天一次，例如每10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22天一次。例如，免疫球蛋白或抗體施用每7天一次或每14天一次或每21天一次。在一些實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體是以約lmg/kg至約30mg/kg之間，如約Img/kg 至約 10mg/kg,或約 2mg/kg 或約 3mg/kg 或 4mg/kg 或 5mg/kg,或如約 10mg/kg 至 30mg/kg,如約10mg/kg或15mg/kg或20mg/kg或25mg/kg的劑量(例如沒有更低維持劑量)施用。在一些實(shí)施例中，多個(gè)劑量施用例如每10-70天一次，如每14-70天一次，如每14-60天一次，例如每14-50天一次,如每14-40天一次,或每14-30天一次。例如,劑量施用每14或21或25或28或35或40或42或49或50或55或57或63或70天一次。例如，免疫球蛋白或抗體施用每21天或每28天或每35天或每42天或每49天或每56天一次。在一些實(shí)施例中，免疫球蛋白或抗體引起施用后例如施用約6小時(shí)內(nèi)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的NK細(xì)胞減少，或與所述減少相關(guān)。在一些實(shí)施例中，當(dāng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量返回至施用前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量的20%或10%或5%或1%以內(nèi)時(shí)，施用另一劑量的免疫球蛋白或抗體。在一些實(shí)施例中，當(dāng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量超過施用前哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量至少約5%或10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%時(shí)，施用另一劑量的免疫球蛋白或抗體?？稍u(píng)估哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量以確定何時(shí)施用另一劑量的免疫球蛋白或抗體。或者，通過預(yù)先分析群體或模型生物體(例如非人靈長類動(dòng)物，如食蟹獼猴)來確定施用另一劑量免疫球蛋白或抗體的時(shí)間。例如，另一劑量的免疫球蛋白在前一劑量后約7天或8天或14天或17天或21天或22天或28天或29天施用。在一些實(shí)施例中，在開始療法時(shí)，向哺乳動(dòng)物施用免疫球蛋白或抗體不超過連續(xù)7天或連續(xù)6天或連續(xù)5天或連續(xù)4天。在對(duì)治療的反應(yīng)不充分的哺乳動(dòng)物的情況下,可在一周內(nèi)施用多次劑量。或者或另外，可以施用增加的劑量。在另一實(shí)施例中，對(duì)于經(jīng)歷不良反應(yīng)的哺乳動(dòng)物，初始(或負(fù)載)劑量可以分成一周內(nèi)的多天或連續(xù)多天。用于特定免疫球蛋白或抗體的劑量可以在已給予一次或多次免疫球蛋白施用的哺乳動(dòng)物體內(nèi)憑經(jīng)驗(yàn)確定。為評(píng)估免疫球蛋白的功效，可以監(jiān)測(cè)疾病或病癥的臨床癥狀。根據(jù)例如接受者的生理狀況、施用目的是治療性的還是預(yù)防性的和熟練從業(yè)人員已知的其它因素，根據(jù)本公開的方法施用免疫球蛋白可以是連續(xù)的或間斷的。免疫球蛋白或抗體的施用可以在預(yù)先選擇的一段時(shí)期內(nèi)為基本上連續(xù)的，或者可以為一系列隔開的劑量，例如在病癥發(fā)展期間或之后。本公開包括以下非限制性實(shí)施例。非限制性實(shí)施例 實(shí)施例1 :人源化抗體制造充當(dāng)IL-3活性拮抗劑的特異性結(jié)合人IL-3Ra鏈的人源化抗體。根據(jù)Tan等(J Immunol. 169，1119-1125，2002)的程序通過將拮抗性鼠類抗體(7G3)的⑶R序列移植到基于供體和接受體CDR的經(jīng)典結(jié)構(gòu)選擇的人可變框架生殖系序列上來制造人源化抗體；有時(shí)稱為“超人源化”。這一工作是使用呈scFv格式的抗體來進(jìn)行。這一方法接著比較供體抗體的CDR殘基與可變框架生殖系接受體序列的CDR殘基，并選擇CDR殘基具有最聞相關(guān)性的序列作為接受體序列。然而，在本公開的情況下，選擇具有較低CDR相關(guān)性水平的重鏈接受體序列。所得人源化抗體由于人源化過程而具有完全人的可變框架序列，然而對(duì)IL-3Ra的親和力與親本鼠類抗體相比降低。使用利用呈scFv格式的抗體進(jìn)行的基于核糖體展示的誘變過程(Kops i das等，BMCBiotechnol. 7，18，2007)來進(jìn)行親和力優(yōu)化，以試圖增加人源化抗體的結(jié)合親和力。產(chǎn)生了當(dāng)轉(zhuǎn)化成IgG1格式時(shí)顯示與親本鼠類單克隆抗體的親和力相比稍有提高的IL-3Ra結(jié)合親和力的親和力優(yōu)化scFv。未預(yù)料到的是，親和力優(yōu)化過程在Vh和Vl的框架中以及在輕鏈的CDRl中產(chǎn)生突變。因此，人源化親和力優(yōu)化抗體的CDR序列集合不同于親本鼠類單克隆抗體的CDR序列集合。此處，親和力優(yōu)化抗體在本文中被稱為CSL362。通過在CHO-S細(xì)胞中表達(dá)適當(dāng)載體來制造人源化親和力優(yōu)化抗體的Fe工程改造衍生物，其包含所述抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)以及具有三個(gè)氨基酸取代S239D/A330L/I332E(在本文中稱為CSL362X2)或具有兩個(gè)氨基酸取代S239D/I332E(在本文中稱為CSL362X1)的雜交IgG/IgG〗恒定結(jié)構(gòu)域；鑒定出的突變的位置是基于EU編號(hào)系統(tǒng)。通過在來自Biowa的敲除了 FUT8的CHO細(xì)胞(Potelligent 細(xì)胞)中表達(dá)適當(dāng)載體來產(chǎn)生人源化親和力優(yōu)化抗體的具有人IgG1恒定結(jié)構(gòu)域的無巖藻糖基化型式(在本文稱為CSL362B)。實(shí)施例2 :結(jié)合親和力測(cè)定全長mAb動(dòng)力學(xué)為分析全長抗體，以捕捉格式進(jìn)行表面等離子體激元共振(Biacore)分析，其中化學(xué)固定的抗人或抗小鼠Fe特異性抗體(吸附的抗人山羊抗人IgGU)小鼠(Invitrogen,目錄號(hào) H10500)或抗小鼠 Fe 特異性抗體(Jackson Tmmuno Research Labsinc.目錄號(hào)515-005-071)是使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶合化學(xué)以化學(xué)方式固定于CM_5感應(yīng)器表面上)并且用于從溶液中捕捉mAb。接著在捕捉的抗體上注射各種濃度的可溶性人IL-3Ra。從來自不捕捉抗體，但其它處理相同的參考流動(dòng)池的反應(yīng)中減去反應(yīng)。接著從來自空白注射的反應(yīng)減去參考消減反應(yīng)。使用非線性回歸將最終校正的反應(yīng)擬合至描述1:1動(dòng)力學(xué)(包括質(zhì)量轉(zhuǎn)運(yùn)限制方面)的模型中。局部擬合Rmax值以考慮所捕捉抗體水平的輕微偏差。測(cè)定締合速率(ka)、解離速率(kd)和平衡解離常數(shù)(Kd)?？贵w是在O. 3 μ g/ml下捕捉180秒?？扇苄訧L-3R α注射10分鐘，并且監(jiān)測(cè)解離30分鐘。注射0,0. 62、1. 25,2. 5、5、10、20 和 40ηΜ 的可溶性 IL_3Ra，其中 2. 5 和 5nM 有兩·份重復(fù)。每次循環(huán)后通過注射IOOmM H3PO4持續(xù)90秒來進(jìn)行再生。所述分析在25°C下進(jìn)行。scFv 動(dòng)力學(xué)為分析scFv,使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶合化學(xué)將可溶性人IL_3Ra化學(xué)固定于CM_5感應(yīng)器表面上，并且注射各種濃度的scFv。從來自未固定IL_3Ra，但其它處理相同的參考流動(dòng)池的反應(yīng)中減去反應(yīng)。接著從來自空白注射的反應(yīng)減去參考消減反應(yīng)。使用非線性回歸將最終校正的反應(yīng)擬合至描述1:1動(dòng)力學(xué)(包括質(zhì)量轉(zhuǎn)運(yùn)限制方面)的模型中。全面擬合Rmax值，并且測(cè)定締合速率(ka)、解離速率(kd)和平衡解離常數(shù)(Kd)。scFv注射10分鐘，并且監(jiān)測(cè)解離20分鐘。注射0,0. 62、1. 25,2. 5、5、10、20 和 40nM 的 scFv，其中 IOnM 有兩份重復(fù)。 在每次循環(huán)后通過注射IOOmM H3PO4, IM NaCl持續(xù)30秒和注射50mM NaOH持續(xù)15秒來進(jìn)行再生。所述分析在25°C下進(jìn)行。抗體和scFv親和力在下表2中列出表2 :抗體和scFv的親和力解離常數(shù)
權(quán)利要求
1.分離的或重組的抗體，其能夠特異性結(jié)合白介素(IL)-3Ra鏈，其中所述抗體包含⑴包含分別如SEQ ID N0:2、3和4所示的CDRl、2和3的輕鏈可變區(qū)(Vl)；(ii)包含分別如SEQID N0:5、6和7所示的CDRl、2和3的重鏈可變區(qū)(Vh);和(iii)包含根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸取代S239D和I332E的重鏈恒定區(qū)。
2.分離的或重組的人源化抗體，所述抗體能夠特異性結(jié)合白介素(IL)-3Ra鏈且包含(i)包含根據(jù)SEQID NO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(\)和包含根據(jù)SEQ ID NO:9 的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(Vh);和(ii)包含根據(jù)Kabat的EU編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸取代S239D和I332E的重鏈恒定區(qū)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中所述重鏈恒定區(qū)恒定區(qū)包含SEQID N0:11的殘基121-450之間(包括殘基121和450)所示的序列。
4.分離的或重組的人源化抗體，所述抗體能夠特異性結(jié)合IL-3Ra鏈且包含含有SEQ ID NO: 13所示的序列的輕鏈和含有SEQ ID NO: 11所示的序列的重鏈。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的抗體，其為裸抗體。
6.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體、 稀釋劑或賦形劑。
7.核酸，其編碼如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的人源化抗體或者其重鏈或輕鏈。
8.基因構(gòu)建體，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述抗體的重鏈的核酸和可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述抗體的輕鏈的核酸。
9.表達(dá)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的人源化抗體的分離的細(xì)胞，或經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的人源化抗體的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7所述的核酸或權(quán)利要求8所述的基因構(gòu)建體。
11.用于治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的方法，所述方法包括給予有需要的哺乳動(dòng)物權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的抗體或權(quán)利要求6所述的組合物。
12.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗體或權(quán)利要求6所述的組合物在醫(yī)藥中的用途。
13.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗體在制備用于治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的藥物中的用途。
14.用于治療哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗體或權(quán)利要求6所述的組合物。
15.權(quán)利要求11所述的方法或權(quán)利要求12或13所述的用途或權(quán)利要求14所述的抗體或組合物，其中所述疾病或病癥是IL-3Ra介導(dǎo)的疾病或病癥。
16.如權(quán)利要求15所述的方法、用途、抗體或組合物，其中所述疾病或病癥是癌癥或者自體免疫性或炎癥性病癥。
全文摘要
本公開提供了結(jié)合白介素-3受體α鏈的抗體和其用途。
文檔編號(hào)A61K39/395GK103025761SQ201180036658
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者孔·帕諾塞斯 申請(qǐng)人:Csl 有限公司