專利名稱：磁性納米微粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及磁性納米微粒。
背景技術(shù)：
生物可相容性的和/或可降解的磁性納米微粒在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)里有著廣闊的應(yīng)用。尤其是，考慮到生物樣本和組織有著固有的低磁化感受性，磁性納米微?？梢詾楦叨冗x擇性檢測提供一種有效的對比機(jī)制。舉例來說，磁性納米微?？捎糜趹?yīng)用范圍包括但不限于生物分離，藥物傳遞，和基因?qū)搿?br>
發(fā)明內(nèi)容
本公開涉及磁性納米微粒以及它們的合成方法和使用。每個(gè)磁性納米微粒包括一個(gè)磁芯和一個(gè)生物相容性的外殼,這種外殼既保護(hù)磁芯不受氧化且增強(qiáng)納米微粒的磁性。增強(qiáng)的磁性可包括增加磁化強(qiáng)度和減少磁芯的矯頑力，這使得高靈敏度檢測和減弱納米微粒的非特異性聚集成為可能。通過形成具有增強(qiáng)磁特性的生物可相容性納米微粒，特定靶分子的檢測，例如蛋白質(zhì)和單細(xì)胞，可以得到提高。一般來說，本說明書所描述主體的一方面可以體現(xiàn)在包括一個(gè)鐵磁芯和一個(gè)包被磁芯的超順磁外殼的納米微粒。在某些實(shí)施方案中，納米微粒的直徑大于或等于2nm。在某些例子中，鐵磁內(nèi)芯的內(nèi)徑在大約Inm到15nm的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施例中，超順磁性外殼的厚度大于或等于O. lnm。鐵磁芯可包括Fe, Co, Ni, FePt或SmCo。在某些實(shí)施方案中，超順磁性外殼包括一種磁性材料的氧化物。在某些情況下，超順磁性外殼包括一種摻雜劑。摻雜劑可包括選擇于一組包含Mn，Co, Ni, Zn和ZnMn的一種金屬。在某些實(shí)施方案中，納米微粒包括超順磁性外殼上的一層涂層，其中形成涂層以增加納米微粒的水溶性。涂層可包括2，3-二巰基琥珀酸(DMSA)。在某些情況下，納米微粒包括超順磁性外殼上的一層涂層，其中形成涂層使納米微粒與IE分子結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，納米微粒包括超順磁性外殼上的葡聚糖聚合物涂層。在某些實(shí)施方案中，超順磁外殼包括鐵氧化物。
另一方面，構(gòu)建納米微粒的方法，該方法包括構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒核心；和在每個(gè)一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒核心上構(gòu)成一個(gè)超順磁外殼。構(gòu)建鐵磁性納米微粒包括在第一種溶液中合并一種金屬復(fù)合物和表面活性劑，并且熱處理第一種溶液以熱降解金屬復(fù)合物從而在第一種溶液中形成一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒核心。在某些實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒核心上構(gòu)建超順磁外殼包括，在熱處理第一種溶液后，將一種或多種金屬油酸酯復(fù)合物與第一種溶液結(jié)合以形成第二種溶液，并且熱處理第二種溶液以在一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒外殼上形成超順磁外殼。另一方面，檢測個(gè)體中目標(biāo)分子存在的方法包括給個(gè)體攝入納米微粒，其中納米微粒包括一個(gè)鐵磁芯，一個(gè)超順磁外殼，以及超順磁性外殼上一個(gè)與目標(biāo)分子特異結(jié)合的靶向部分，為納米微粒結(jié)合靶分子提供充分的時(shí)間，并且產(chǎn)生個(gè)體的核磁共振成像，其中成像中的信號(hào)表不存在目標(biāo)分子。另一方面，一種治療的方法包括給個(gè)體攝入納米微粒，其中納米微粒包括一個(gè)鐵磁芯，一個(gè)超順磁外殼，以及超順磁性外殼上一個(gè)與個(gè)體中靶細(xì)胞結(jié)合的涂層，提供充分的 時(shí)間使納米微粒結(jié)合靶細(xì)胞，并且給個(gè)體形成一個(gè)交替的電磁場來處理靶細(xì)胞。交聯(lián)聚合物是指一聚合物鏈上和/或支鏈上的功能基團(tuán)與另一聚合物上的功能基團(tuán)反應(yīng)而形成的聚合物網(wǎng)。非交聯(lián)聚合物是指很少或沒有單獨(dú)的聚合物鏈與另一聚合物鏈的功能基團(tuán)反應(yīng)以形成一種相互聯(lián)系的聚合物網(wǎng)。磁矩是指磁體趨向磁場的趨勢。磁矯頑力是指鐵磁性材料對消磁的抗力。磁化率是指物質(zhì)應(yīng)答外加磁場的磁化程度。超順磁性指的是材料在沒有外加磁場的情況下不能展現(xiàn)出磁性，但在有磁場的情況下表現(xiàn)出與磁體相似。本發(fā)明提供了多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，在某些實(shí)施方案中，磁性納米微粒的外殼可防止納米微粒核心的逐步氧化，轉(zhuǎn)而防止納米微粒整個(gè)磁化的減少。在某些情況下，在磁性納米微粒的外殼中摻入金屬可提高納米微粒的整體磁化。磁性納米微粒有著穩(wěn)定的外殼的優(yōu)勢，因?yàn)橥鈿さ暮穸入S著時(shí)間的推移總體上是恒定的。在特定的實(shí)施方案中，磁性納米微粒的外殼提供了靶分子或其他結(jié)合基團(tuán)可以附著上的生物可相容性表層。由于磁性納米微粒的高度磁化，它們可以用于對此類靶分子和/或基團(tuán)高靈敏檢測。此外，由于超順磁外殼，磁性納米微粒核心在低磁場幾乎沒有矯頑力。因此，在沒有外加磁場的存在時(shí)多個(gè)磁性納米微粒的非特異性聚集可以避免。相反的，當(dāng)加入一個(gè)超過閾值的外部磁場時(shí)，可誘導(dǎo)磁性納米微粒特異聚集。這種誘導(dǎo)性聚集可用于收集和/或分離附著于磁性納米微粒的特定靶分子。除非另外定義，這里用到的所有技術(shù)和科學(xué)用語有著如通常為本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員所知的相同意思。盡管與那些描述于此的相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡捎糜诒景l(fā)明的實(shí)踐或測試，合適的方法和材料描述如下。所有這里提到的發(fā)表的論文，專利說明書，專利和其他參考文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到全文。萬一存在矛盾，以本說明書包括定義為準(zhǔn)。另外，材料，方法和實(shí)例只是說明性的而不作為限定。其他的特點(diǎn)和優(yōu)勢可以在以下詳細(xì)的描述、圖表和權(quán)利要求中顯而易見。


圖1A和IB是示范性的磁性納米微粒橫截面。圖2是描繪制備一個(gè)磁性納米微粒典型的進(jìn)程的流程圖。圖3A到3D是用金屬復(fù)合物表面活性劑溶液制備的納米微粒核心的圖像，每種都包括不同的金屬復(fù)合物對表面活性劑摩爾比。圖4A到4F是在不同的反應(yīng)溫度下從金屬復(fù)合物表面活性劑溶液制作的納米微粒核心的圖像。圖4G是納米微粒直徑對應(yīng)反應(yīng)溫度的圖表。 圖5是FeOMFe2O4 (M=Fe, Co, Mn)磁性納米微粒(MNPs)標(biāo)準(zhǔn)化的磁化強(qiáng)度對應(yīng)溫度的圖表。圖6a_6b 是 FeOFeO MNPs 和 FeOMFe2O4 (M=Fe, Co, Mn)磁性納米微粒的磁化曲線。圖7是不同磁性納米微粒的橫向弛豫值(r2)的比較圖表。圖8是FeOMnFe2O4磁性納米微粒在涂上二巰基琥珀酸(DMSA)之前和之后以結(jié)合靶基團(tuán)的示意圖。圖9是幾種類型的納米微粒的標(biāo)準(zhǔn)化Λ Τ2與親和素濃度的關(guān)系圖。圖1OA是幾種類型的磁性納米微粒弛豫率相對細(xì)胞濃度的圖。圖1OB是顯示FeOMnFe2O4MNPs的標(biāo)準(zhǔn)化Λ Τ2與細(xì)胞濃度的關(guān)系圖。圖1lA到IlD是不同磁性納米微粒的MRI成像圖。
具體實(shí)施例方式更好的，磁性納米微粒有著一個(gè)高的磁矩為檢測提高了納米微粒的選擇性。盡管增大納米微粒的大小可導(dǎo)致更高的磁矩，但是過大的納米微粒難以用于檢測小分子和細(xì)胞。此外，在某些情況下，磁性微粒易于氧化，而隨時(shí)間減少磁化。而且，由于微粒的磁力特性，自發(fā)聚集可發(fā)生，使得納米微粒難以應(yīng)用以及使得分子與納米微粒難以選擇性結(jié)合。本公開涉及磁性納米微粒以及它們的合成和使用的方法。每個(gè)磁性納米微粒包括一個(gè)磁芯和一個(gè)生物相容性外殼,這種外殼既保護(hù)磁芯不受氧化且增強(qiáng)納米微粒的磁性。增強(qiáng)的磁性可包括增加磁化強(qiáng)度和減少磁芯的矯頑力，達(dá)到高敏感度檢測并減弱納米微粒的非特異性聚集。通過有增強(qiáng)的磁性的成型的生物可相容性納米微粒，特定靶分子的檢測，例如蛋白質(zhì)和單細(xì)胞，可以得到提聞。磁性納米微粒圖1A表示一個(gè)典型的磁性納米微粒2的橫截面。磁性納米微粒2包括一個(gè)由外殼6包被的納米微粒核心4。盡管顯示為一個(gè)圓截面(三維球體)，但磁性納米微粒2可以有各種形狀。例如，磁性納米微粒2可以形成類似棒狀/圓柱體，電線，或晶須。納米微粒也可有其它的形狀。磁性納米微粒2也可有不同的規(guī)格。在某些實(shí)施例中，磁性納米微?？捎腥魏我粋€(gè)范圍在Inm到20nm之間的平均最大尺寸，包括,例如，大約2nm, 5nm, IOnm, 15nm,或 16nm。在某些實(shí)施方案中，納米微粒核心4由結(jié)構(gòu)為晶體、多晶的或非結(jié)晶的鐵磁性材料構(gòu)成。例如，納米微粒核心4可包括材料比如但不限于，F(xiàn)e, Co, Ni, FeOFe2O3, NiOFe2O3, CuOFe2O3, MgOFe2O3, MnBi, MnSb, MnOFe2O3, Y3Fe5012, CrO2, MnAs, SmCo, FePt,或者它們的組合。納米微粒核心4可以與整個(gè)磁性納米微粒2形狀一樣。例如，納米微粒核心4可以形狀類似棒狀/圓柱體、電線、或晶須。納米微粒核心4也可有其它形狀。納米微粒核心4的平均最大尺寸可從Inm到20nm不等包括例如大約2nm, 5nm, IOnm,或15nm。磁性納米微粒2的外殼6部分或全部圍繞納米核心4。在某些實(shí)施方案中，外殼6是由結(jié)構(gòu)為結(jié)晶的、多晶的或非結(jié)晶的超順磁材料構(gòu)成。在某些實(shí)施方案中，通常構(gòu)成外殼的材料是生物可相容性的，也就是，外殼材料在有機(jī)體中幾乎不會(huì)引起不利的生物/免疫反應(yīng)和/或?qū)?xì)胞和器官無毒?？捎糜谕鈿?的典型材料包括但不限于，金屬氧化物，例如，鐵氧體(Fe3O4)、Fe0、Fe203、CoFe204、MnFe204、NiFe204、ZnMnFe204，或者它們的組合物。外殼6可以有范圍從大約O. 5nm到3nm,包括,例如，大約lnm、1. 5nm、2nm、或2. 5nm的厚度。磁性納米微粒2的外殼6可以提供多種功能。例如，當(dāng)沒有外殼的孤立的納米微粒核心暴露在一種氧化劑(如空氣中的氧氣)時(shí)，全部或部分的核心材料可被氧化導(dǎo)致納米 微粒的磁特性退化。此外，形成的氧化物可能有相對于核心材料弱磁性。在核心4上形成外殼6，可以防止不受歡迎的核心材料的氧化因此保護(hù)核心4的磁性能。另外，在某些實(shí)施方案中，外殼6提高了納米微粒核心4的磁性能。例如，有外殼6的磁性納米微?？娠@示出與僅僅由外殼材料組成的納米微粒核心大約10倍，100倍或1000倍的磁矩。磁性納米微粒2的磁化強(qiáng)度(每單位微粒體積的磁矩)在某種程度上依賴核心4的平均最大尺寸，外殼6的厚度，以及核心4和外殼6各自的磁化強(qiáng)度。例如，F(xiàn)eiFe3O4微?？偟拇呕瘡?qiáng)度(Mtl)由Fe核心和鐵氧體外殼分別貢獻(xiàn)，給出體積-加權(quán)平均值如下，M0=--~·MFe + -^~·Mrmte,
Fe FerriteFe Feirire其中MFe和MFOTite是磁化強(qiáng)度，VFe and Nferrite分別是核心與外殼的體積。在某些情況下，外殼材料相當(dāng)于核心材料的氧化物，其中氧化物是在一個(gè)有控制的程序中包被在納米微粒核心4表面上的，沒有使核心4進(jìn)一步氧化，而不是由核心材料自己形成。這種可控的外殼形成過程可隨時(shí)間產(chǎn)生一個(gè)有固定厚度的外殼(也就是，外殼厚度幾乎不增加)而且有著強(qiáng)的磁性能。此外，通過在納米微粒核心4的表面形成外殼6，納米微粒核心的大小也不會(huì)減小。由于外殼6的超順磁特性，當(dāng)沒有外加磁場施加于納米微粒2時(shí)，磁性納米微粒2幾乎不顯示出磁特性。相反，當(dāng)閾值之上的外加磁場施加于納米微粒2時(shí)，納米微粒顯示出上述增大的磁矩。換言之,外殼6改變了納米微粒2的磁特性以至于整個(gè)納米微粒2表現(xiàn)出超順磁的。顯示出增大的磁矩的閾值是基于外殼6的材料和結(jié)構(gòu)。在無外加磁場存在下，磁矩的減弱和/或缺失在某些實(shí)施方案中能減少和/或阻止成群的納米微粒2由于它們的磁特性而發(fā)生的非特異性/自發(fā)的聚集。相反，通過施加一個(gè)外部磁場給多個(gè)上述有核心/外殼結(jié)構(gòu)的納米微粒，在某些實(shí)施方案中，很可能會(huì)引起納米微粒的聚集。這種引起的聚集在試圖檢測結(jié)合到磁性納米微粒的分析物或其它分子時(shí)是有用的。在某些實(shí)施方案中，納米微粒2的磁矩通過包含摻雜劑進(jìn)外殼材料甚至可進(jìn)一步增大。例如，外殼6可以參雜金屬包括但不限于，Mn、Co、N1、Zn、ZnMn，以及它們的組合。納米微粒外殼6中摻雜物的存在也可以在有一個(gè)外加磁場存在時(shí)影響納米微粒2顯示出磁特性的臨界點(diǎn)。磁性納米微粒在摻雜劑離子組成為鐵水平的一半，例如MnFe204，CoFe204, NiFe204, ZnFe204, ZnMnFe204時(shí)可有最高的磁矩。在某些實(shí)施方案中，納米微粒2也包括表面涂層。例如，圖1B展示的是納米微粒2其中在超順磁外殼6的表面加工形成一層表面涂層8。表面涂層8完全或部分包被外殼6。涂層8的至少一個(gè)目的是提供一個(gè)生物相容性表面可以容易地使靶分子，結(jié)合基團(tuán)等等功能化。在某些情況下，表面涂層8使磁性納米微粒實(shí)質(zhì)上親水或者疏水。表面涂層可由聚合物加工形成，包括但不限于，合成聚合物比如聚乙二醇或硅烷，天然聚合物，合成或天然聚合物的衍生物，以及它們的組合。天然聚合物是當(dāng)純聚合物比如多聚糖通過微生物、植物或動(dòng)物合成并且提純而獲得。合成聚合物是由非生物合成，通過采用標(biāo)準(zhǔn)的為領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所知的高分子化學(xué)技術(shù)將單體融合成聚合物而獲得。聚合物可以是同聚物，即由單一類型的單體合成，或者是共聚物，即由兩種或多種單體合成。聚合物可以使交聯(lián)或非交聯(lián)的。交聯(lián)聚合物是以熱穩(wěn)定和在生物系統(tǒng)中抗分解為特征的。交聯(lián)聚合物分子量顯著高于原始聚合物。
在某些實(shí)施方案中，表面涂層8不是包圍納米微粒2的連續(xù)膜，而是依附于并且圍繞磁性納米微粒2的擴(kuò)展的聚合物鏈形成的“網(wǎng)狀物”或“云狀物”。典型的高聚物包括但不限于多糖及衍生物，比如葡聚糖、pullanan、羧基右旋糖苷、羧甲基右旋糖苷、和/或還原羧甲基右旋糖苷、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚乙烯醇聚合物。在某些實(shí)施方案中，這些聚合物涂層提供了比外殼材料更容易讓靶向部分和/或結(jié)合基團(tuán)結(jié)合的表面。例如，可以制備葡聚糖包被的納米微粒并與表氯醇交聯(lián)。添加氨與環(huán)氧基反應(yīng)以形成氨基。這種材料被認(rèn)為是交聯(lián)氧化鐵或“CLIO”并且當(dāng)被氨基功能化后被稱為氨基-CLIO或NH2-CLIO15羧基修飾的納米微?？梢酝ㄟ^用水溶性的碳化二亞胺和二元胺如乙二胺或己烷二胺轉(zhuǎn)換成氨基-功能化的磁性微粒。抗生物素(Avidin)或鏈霉親和素(streptavidin)可以附著于納米微粒以供生物素化的結(jié)合基團(tuán)，比如寡核苷酸或多肽使用。同樣的，生物素可以附著于納米微粒以供抗生物素示蹤的結(jié)合基團(tuán)使用。在某些實(shí)施方案中，納米微粒與非聚合物功能基團(tuán)組合在一起。已知合成穩(wěn)定的、功能化的無聚合物的納米微粒的方法，也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。該方法描述于例如 Halbreich et al.，Biochimie, 80(5—6):379—90，1998 和 Caroline R. A. Valois etal. , Biomaterials, 31(2):366-374。一般而言，結(jié)合基團(tuán)是指能特異性地結(jié)合或者鏈接，舉例來說，共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合或雜交到一個(gè)靶分子或其它結(jié)合基團(tuán)(或者在特定的實(shí)施方案中，聚合誘導(dǎo)分子)上的合成的或天然的分子。例如，結(jié)合基團(tuán)可以是合成的寡核苷酸以雜交一個(gè)特定互補(bǔ)的靶核酸。結(jié)合基團(tuán)也可以是針對抗原或者任何蛋白-蛋白間的相互作用的抗體。此外，結(jié)合基團(tuán)可以是結(jié)合對應(yīng)靶標(biāo)的多糖。在特定的實(shí)施方案中，結(jié)合基團(tuán)在結(jié)合到另一結(jié)合基團(tuán)時(shí)，可以設(shè)計(jì)或挑選以適合靶分子比如溶液中的酶的底物。結(jié)合基團(tuán)包括，例如，寡核苷酸結(jié)合基團(tuán)、多肽結(jié)合基團(tuán)、抗體結(jié)合基團(tuán)以及多糖結(jié)合基團(tuán)。磁件納米微的合成圖2表示描述制備磁性納米微粒典型過程的流程圖。如圖2所示，磁性納米微粒的制備始于納米微粒核心的形成(步驟200)。為了制備納米核心，金屬復(fù)合物在包含表面活性劑的溶液中加熱分解。在某些情況下，熱分解發(fā)生在無氧環(huán)境中(例如，在真空或氮?dú)猸h(huán)境下)以避免反應(yīng)中發(fā)生納米微粒核心的氧化。在一個(gè)例子中，1-十八烯(ODE)和油酰胺(OY)表面活性劑的溶液加熱到250° C。當(dāng)溶液的溫度穩(wěn)定時(shí)，金屬復(fù)合物比如Fe (CO) 5加入溶液并攪拌。Fe磁性納米微粒(Fe MNP)核心形成并從溶液中析出。然后溶液冷卻到室溫。其他金屬復(fù)合物的例子包括但不限于Fe (acac)2 (acac是乙酰丙酮化合物)、Fe (acac)3、鈷絡(luò)合物、鎳絡(luò)合物，其它表面活性劑的例子包括但不限于油胺、十八烯酸和其它包括胺或羧酸化學(xué)官能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)。納米微粒核心大小在某種程度上取決于金屬源和表面活性劑的摩爾比率。在某些實(shí)施方案中，降低表面活性劑相對于金屬源的水平可導(dǎo)致微粒大小增加。例如，圖3顯示從包含OY和鐵金屬復(fù)合物的溶液制備的鐵納米微粒核心圖像，其中摩爾比率([Fe] :
)在一個(gè)固定溫度下從5:1到35:1不等。當(dāng)比率從5:1變?yōu)?2:1時(shí)，微粒直徑才增加約2nm。一旦比率超過12:1，微粒大小穩(wěn)定在2nm。納米微粒核心大小也取決于納米微粒核心形成期間的溫度。在某些實(shí)施方案中， 提高反應(yīng)發(fā)生時(shí)的溫度導(dǎo)致微粒的大小的增加。例如，圖4A到4F顯示從包含OY和鐵金屬復(fù)合物的溶液制備的鐵納米微粒核心圖像，其中納米微粒核心形成期間的反應(yīng)溫度在固定摩爾比率([Fe]:
)下從140° C到260° C變化。當(dāng)反應(yīng)溫度逐步從140° C升到260° C時(shí)，納米微粒核心的直徑從4. 4nm增大到14. 5nm。在如圖3和圖4所示的每一個(gè)示范納米微粒核心的圖像中都可見到，隨后可見納米微粒核心材料暴露于空氣中而后氧化而形成的天然非晶形的鐵酸鹽外殼(FeO)。天然非晶形外殼有弱的或沒有磁性并且可隨著時(shí)間逐步加厚以至于將鐵核心改變?yōu)榉蔷窝趸?。前面提到的典型納米微粒的直徑通過調(diào)整鐵酸鹽外殼體積而估算。圖4G表示的是有自然生成氧化物外殼的納米微粒核心直徑和估算的沒有自然生成氧化物外殼的納米微粒核心直徑相對于反應(yīng)溫度。再次參考圖2，隨著納米微粒核心的制備，合成的外殼在核心微粒的表面形成(步驟202)。為了制備外殼，包含金屬復(fù)合物的獨(dú)立的溶液需制備并且加入到包含磁性納米微粒核心的溶液中。為防止天然非晶形鐵酸鹽外殼先于合成外殼的形成，包含納米微粒核的溶液可以保持在一個(gè)無氧的環(huán)境中(例如，在真空或主要為氮?dú)獾沫h(huán)境下)。然后合并的混合物可退火以在納米微粒核心的表面形成納米微粒外殼。在一個(gè)例子中，鐵-油酸鹽復(fù)合物的溶液由上述包含F(xiàn)e MNP核的溶液單獨(dú)制備。特別是，包含F(xiàn)e(CO)5、十八烯酸(OA)、和ODE的溶液最好在無氧環(huán)境下制備和退火。冷卻后，新的溶液轉(zhuǎn)移到包含F(xiàn)e MNP核心的溶液中。然后包含F(xiàn)e MNP核心和金屬復(fù)合物的混合物溫度升高以在Fe MNP核心周圍形成合成外殼。特別是，反應(yīng)溫度須緩緩加熱到一個(gè)最佳的退火溫度(如300° C)以形成具有鐵核心和合成的多晶鐵酸鹽外殼的Fe MNPs，其中合成外殼展現(xiàn)出超順磁性。合成外殼起著屏障的作用以防止核心的氧化并且通常是穩(wěn)定的，表現(xiàn)出厚度不隨時(shí)間變化。混合物冷卻后,通過離心收集包含超順磁外殼的磁性納米微粒。在某些實(shí)施方案中，磁性納米微粒的合成外殼的形成步驟包括加入更多不同的金屬復(fù)合物到包含MNP核心的溶液中。所添加的不同金屬復(fù)合物可提供一種或多種摻雜劑到隨后形成的磁性納米微粒的合成外殼中，其中摻雜劑可提高M(jìn)NPs的磁性(例如磁矩)。不同金屬復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)的組合(如，Ni (CO)4, Co2 (CO)8)可添加到溶液中以在合成外殼中形成一個(gè)或多個(gè)摻雜物。在一個(gè)例子中，在加熱混合物之前，Mn2 (CO)ltl添加到上述包含F(xiàn)eMNP核心和鐵金屬復(fù)合物的混合物中。如前一樣，反應(yīng)溫度須緩緩加熱到一個(gè)最佳的退火溫度(如300° C)以形成具有鐵核和合成的摻雜Mn的多晶鐵酸鹽(Fe2O4)外殼(FeOMnFe2O4)的 Fe MNPs0在某些實(shí)施方案中，MNPs可以進(jìn)一步加工在合成外殼上形成一層表面涂層(步驟204)，其中表面涂層包括功能團(tuán)以連接MNP到結(jié)合配基。如前所述，表面涂層可包括一個(gè)功能性的聚合或非聚合涂層。在某些情況下，涂層可以提高或降低MNP的潤濕性。聚合的或非聚合的涂層可以提供一個(gè)暴露的官能團(tuán)用以結(jié)合特異或非特異配基。例如，官能團(tuán)可包括氨基、羧基、或其它結(jié)合特異或非特異配基的反應(yīng)基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，配基可以包括具有末端氨基、巰基、或磷酸基等等能結(jié)合氨基或羧基的寡核苷酸?；蛘哒f，結(jié)合配基可以通過形成于合成MNP外殼上的功能性聚合物附著于磁性納米微粒上。合成功能化涂層的納米微粒方法的各種非限制性例子描述如下。在一個(gè)例子中，非聚合物的DMSA涂層可以在合成的外殼的表面形成(例見Albrecht et al.，Biochimie, 80 (5-6) : 379-90，1998)。DMSA 偶聯(lián)到人工合成的鐵酸鹽外 殼，提供一個(gè)暴露的官能團(tuán)。在另一個(gè)例子中，羧基功能化表面涂層可以根據(jù)Gorman的方法合成于MNP之上(見W000/61191)。該方法中，還原的羧甲基(CM)葡聚糖由商用葡聚糖合成。CM-葡聚糖和鐵鹽混合在一起然后用氫氧化銨中和。最終的羧基功能化的納米微?？捎糜谂悸?lián)氨基功能化的寡核苷酸。在另一個(gè)例子中，羧基功能化的MNPs也可以用多糖包被的MNPs通過與溴或氯乙酸在強(qiáng)堿中反應(yīng)以結(jié)合羧基來制成。此外，羧基功能化微?？捎砂被δ芑腗NPs用諸如琥珀酐或順丁烯二酸酐等試劑將氨基轉(zhuǎn)換為羧基來制備。在另一個(gè)例子中，可以制備葡聚糖涂層的MNPs并與表氯醇交聯(lián)。添加胺與環(huán)氧基反應(yīng)而形成氨基(例見 U. S. Patent App. Pub. No. 20030124194and U. S. PatentApp.Pub.20030092029，incorporated herein by reference,HogemannjD.，etal. , “Improvement of MRI probes to allow efficient detection ofgene expression, Biocon jug. Chem. 2000. 11 (6) : 941-6, and Josephson etal.，Hi gh_ef f i c i ency in trace I Iu I ar magnetic labeling with novelsuperparamagnetic-Tat peptide conjugates, Bioconjug. Chem.，1999，10(2) : 186-91)。該材料被認(rèn)為是交聯(lián)氧化鐵或“CLIO”并且當(dāng)用氨基功能化時(shí)被稱為氨基-CLIO或NH2-CLIOo在另一個(gè)例子中，羧基功能化MNPs可以通過水溶性碳化二亞胺和二元胺如乙二胺或己二胺轉(zhuǎn)化成氨基功能化磁性微粒。在某些實(shí)施方案中，親和素或鏈親和素可以連接到納米微粒以供與生物素化的結(jié)合配基如寡核苷酸或多肽使用(例見.，Shen etal.，“Magnetically labeled secretin retains receptor affinity to pancreas acinarcells, ”Biocojug. Chem.，1996，7 (3) :311-6)。同樣的，生物素也可連接到納米微粒以供與親和素標(biāo)記的結(jié)合配基使用。MNPs 的特件MNPs的特性可通過多種技術(shù)來鑒定。例如，MNPs磁特性可以通過測定零場冷卻或場冷卻磁化曲線評(píng)估。在一個(gè)例子中，制備FeiMnFe2O4MNPs并用擴(kuò)展的Stoner-Wohlfarth磁化模型評(píng)估。該模型被開發(fā)來解釋一組均一的單疇納米微粒的整體磁性行為，而這些納米微粒隨機(jī)排列并且彼此互不影響。我們已經(jīng)進(jìn)一步擴(kuò)展了該模型以反映實(shí)際的FeOMFe2O4微粒物理系統(tǒng)總結(jié)如下。 為適應(yīng)鐵和鐵酸鹽的立方磁晶各向異性，我們采用Joffe和Heuberger建立的架構(gòu)。·包括磁化的熱激活影響，通過允許磁矩的熱激活逆轉(zhuǎn)?！の覀冇肨EM分析獲得的粒徑分布函數(shù)來說明微粒系綜里的大小差異。使用該方法，已經(jīng)確定合成外殼遵循典型的超順磁曲線而納米微粒核心具有非零矯頑力(Ηε=3500θ)呈現(xiàn)一個(gè)穩(wěn)定的單疇特性。然而，MNP的總磁化強(qiáng)度(也就是核心和外殼磁化強(qiáng)度的體積加權(quán)平均數(shù))相比于納米微粒核心有一個(gè)相當(dāng)小的矯頑力(Hc=^Oe)。在這個(gè)例子中，合成外殼超順磁的貢獻(xiàn)在低磁場下飽和而超過相對較慢的納米微粒核心磁化。相反的，核心對磁化的貢獻(xiàn)在高磁場下在增加MNP總的磁化強(qiáng)度成為主導(dǎo) 。其他技術(shù)，比如微磁學(xué)模擬和核磁弛豫色散可用于進(jìn)一步測定MNP特征。MNPs 的用涂磁性納米微?？捎糜诟鞣N應(yīng)用中，包括醫(yī)藥如生物兼容的和環(huán)境敏感的傳感器和/或分子顯像劑。例如，MNPs可被用做基于磁共振傳感器，其中MNPs用來做探測水溶性(即含水)樣品中各種分析物的遙感器以及用于對水溶性樣品中分析物水平變化的持續(xù)監(jiān)控。MNPs可以懸浮于水相中，并有一個(gè)或多個(gè)配基以共價(jià)或非共價(jià)連接或者固定其上，此配基能夠根據(jù)溶液中分析物的存在和濃度而改變MNPs聚集狀態(tài)(例見美國專利申請公開號(hào)20060269965,以引用的方式并入此).在另一個(gè)例子中，MNPs可用于聚集形成試驗(yàn)以檢測靶分子(例見美國專利申請公開號(hào)20030092029，通過引用合并于此)。在聚集形成試驗(yàn)中，一種綴合體(或?qū)?yīng)一種靶分子或一類型靶分子的兩種或多種帶不同結(jié)合配基的綴合體混合物)加到樣品溶液。每個(gè)綴合體包括一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配基(例如，寡核苷酸，核酸，多肽，或多糖)，例如，共價(jià)或非共價(jià)地連接到一種磁性例如超順磁納米微粒。結(jié)合配基與IE分子(或在某些實(shí)施方案中，引起聚集的分子如親和素)發(fā)生特異性相互作用。結(jié)合配基特異地結(jié)合選擇的靶分子，可以是例如核酸、多肽或多糖。因此，綴合體的分散狀態(tài)轉(zhuǎn)換到聚合狀態(tài)，從而減少了水相溶液中相鄰水質(zhì)子的自旋-自旋弛豫時(shí)間(Τ2)。在某些情況下，MNPs可用于靶分子如蛋白的磁力分離。在另一個(gè)例子中，MNPs可在聚集色散分析中用于檢測靶分子(例見美國專利申請公開號(hào)20030092029，通過引用合并于此)。在聚集色散分析中，綴合體用來制備小的聚集物，然后聚集物加到樣品溶液中。在該分析系統(tǒng)中，設(shè)計(jì)結(jié)合配基使它們能互相結(jié)合(或結(jié)合引起聚合的分子如親和素)以形成所述聚集物，成為(或形成相互間結(jié)合或結(jié)合到引起聚集的分子上)特異性靶向分子裂解的底物。如果樣品溶液含有靶分子，結(jié)合配基形成的底物則裂解，導(dǎo)致聚集物的分散。該分析系統(tǒng)中的聚集物可以在體外例如小瓶或列陣?yán)锶?-D或3-D列陣，也可在體內(nèi)例如攝入綴合體或聚集物后的磁共振成像觀察和探測。在某些例子中，MNPs可用于成像而不要求多個(gè)納米微粒的聚集。前述用途的進(jìn)一步說明例見美國專利號(hào) 6，818，199，6，203，778，和 5，766，572，Jae-Hyun Lee et al. , NatureMedicine13:95-99;Daniel L J. Thorek Annals of Biomedical Engineering2006, 23-38.
在另一個(gè)例子中，MNPs可以結(jié)合靶細(xì)胞，比如癌癥細(xì)胞，適用于磁熱療。特別是，綴合MNPs可用于癌細(xì)胞或組織，體外或體內(nèi)，其中綴合MNPs結(jié)合癌細(xì)胞/組織。在某些實(shí)施方案中，MNPs包含使MNPs結(jié)合特定癌細(xì)胞/組織或當(dāng)全身注射時(shí)引起MNPs轉(zhuǎn)移到個(gè)體的特定部位的祀向配基。例見 Maite Lewin et al. , Nature Biotechnologyl8:410-414;PCTNo. PCT/KR07/00961。然后，給結(jié)合的MNPs施加一個(gè)外加的交變磁場(如IOOkHz)以致MNPs在對外加磁場應(yīng)答中的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生增加的熱能來治療靶向細(xì)胞/組織。特別是，熱能的增加可導(dǎo)致癌癥細(xì)胞/組織的破壞。在另一個(gè)例子中，MNPs可用于磁轉(zhuǎn)染。在磁轉(zhuǎn)染中，綴合的MNPs結(jié)合到靶向分子比如核酸上，然后給結(jié)合MNPs的分子施加一個(gè)磁場以刻意地引進(jìn)和集中納米微粒到一個(gè)或多個(gè)靶向細(xì)胞中。而后核酸通過多種不同的機(jī)制被釋放到細(xì)胞質(zhì)中比如，例如1)由包被在MNPs的陽離子聚合物引起的質(zhì)子海綿效應(yīng)促進(jìn)胞內(nèi)體滲透膨脹，胞膜的破壞以及核酸的胞內(nèi)釋放；或2))由包被在MNPs的陽離子脂質(zhì)體引起胞內(nèi)體的不穩(wěn)定以通過細(xì)胞陰性脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)變和電荷中和釋放核酸到細(xì)胞。例見美國專利號(hào)7，635，734and Eric M Pridgenet al. , Nanomedicine2(5):669-680. 實(shí)施例本發(fā)明在以下實(shí)施例中做了進(jìn)一步描述，但不限制權(quán)利要求里所描述的本發(fā)明的范圍。例1:鐵磁芯/超順磁氧化鐵外殼納米微粒的合成與鑒定我們首先制備Fe MNPs核心。往250mL的3頸圓底玻璃燒瓶里加入20mL0DE和0. 3mL 0Y(0. 64mmol)。冷凝器和電熱偶連接到燒瓶不同的頸部?；旌衔镎婵障录訜岬?0° Cl小時(shí)，再充入氮?dú)鈴氐着懦鯕?。該步驟重復(fù)兩次。然后將混合物加熱到要求的溫度(例如，對于16nmFe MNPs核心260° C)。當(dāng)溫度穩(wěn)定時(shí),Fe (CO) 5 (1. 4mL, IOmmol)小心的加入反應(yīng)器中同時(shí)大力攪拌；隨著羰基分解溶液迅速變黑，納米微粒開始形成。溶液維持在這種高溫和氮?dú)庵蠭個(gè)小時(shí)，之后室溫冷卻。 當(dāng)FeMNPs核心成型時(shí)，分別制備錳和鐵-油酸復(fù)合物。Mn2 (CO) 10 (156mg, 0. 8mmol)，0A(2. 3mL，7. 26mmol)和IOmL ODE加到IOOmL的3頸圓底玻璃燒瓶里。真空下升溫到60° C —個(gè)小時(shí)，通入氮?dú)?，然后再重?fù)兩次。無氧溶液加熱到120° C后加入Fe(C0)5(0. 21mL，1.61mm0l)?；旌衔飻嚢?0min。期間溶液會(huì)變黃。但是由于溫度較低(120° C)而不會(huì)形成微粒。包含金屬-油酸鹽復(fù)合物的溶液室溫下冷卻，然后用雙向針管小心的轉(zhuǎn)移到僅含F(xiàn)eMNP核心的溶液中。僅含F(xiàn)eMNP核心和金屬-油酸鹽復(fù)合物的混合物室溫下攪拌30分鐘。然后反應(yīng)溫度以5° C/分鐘緩慢升高。我們監(jiān)測溫度上升期間納米微粒的結(jié)晶度，測定鐵酸鹽外殼形成的最佳熱處理溫度(300° C)。當(dāng)溫度穩(wěn)定后，混合物攪拌一小時(shí)以上。隨著反應(yīng)的完成，溶液在室溫下冷卻并加入150mL異丙醇溶液(0DE/異丙醇=0. 2v/v)。FeOMnFe2O4MNPs通過離心(3，OOOrpm, 15分鐘)收集再分散在IOmL己烷中。為了清洗微粒，加入50mL乙醇到微粒溶液中，離心分離混合物，再將微粒分散到IOmL己烷中。清洗步驟重復(fù)3次以確保除去多余的化學(xué)物質(zhì)。例2 :納米微粒核心/外殼的磁特件制備納米微粒的大小是用動(dòng)態(tài)光散射法(Zetasizer Nano-ZS, Malvern)鑒定的。形狀、結(jié)構(gòu)、組成進(jìn)一步分別用透射電子顯微鏡描述(TEM; JE0L2100，JOELUSA)、X射線粉末衍射儀(XRD; RU300, Rigaku)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES; Activa-S, HORIBA Jobin Yvon)鑒定。磁特性用震動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(EV-5，ADEMagnetics)和超導(dǎo)量子干涉(SQUID)磁強(qiáng)計(jì)(MPMS-5, Quantum Design)分析。我們鑒定了 FeOMFe2O4MNPs的磁特性。為了比較分析，我們也合成了不同大小和組成成分的鐵酸鹽MNPs。所有類型的微粒Fe核心(FeOFeO andFeiMFe204, M=Fe, Co, Mn)的Ms大于鐵酸鹽MNPs FeiMnFe2O4所假設(shè)的最大Ms。鐵酸鹽外殼與疏松物質(zhì)相比有低的磁化強(qiáng)度，可能由于他們的多晶特性。圖5表示FeOMFe2O4 (M=Fe, Co, Mn) MNPs的零場冷卻和場冷卻磁場強(qiáng)度，其中峰值在兩個(gè)不同的溫度(TBDTB2)出現(xiàn)。這兩個(gè)峰分別表示Fe核心(TBl)和鐵酸鹽外殼(TB2)中超順磁性的發(fā)生。Fe核心的TBl 290° C，表現(xiàn)出室溫下核心的穩(wěn)定的，強(qiáng)磁特性。圖6a_6b 表示 FeOFeO MNPs 和 Fe@MFe204 (M=Fe, Co, Mn) MNPs 的磁化曲線。磁化曲線用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)在T=300K下獲得的。所有的測量都是在合成2小時(shí)后以MNPs的粉末形式進(jìn)行的。樣品中MNPs的數(shù)量用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICPAES)定量。首先，我們分析FeOFeO MNPs的磁特性(圖6a)。磁滯曲線證實(shí)了鐵核心直徑在Ilnm以上的微粒的超順磁特性?？偟膩碚f，觀測到的Ms在同比于Fe核心部分大的大微粒中增加得多。用僅有外殼的MNPs測得的FeO外殼的Ms相當(dāng)小(8emu/g[Fe])。在補(bǔ)償外殼的作用后，預(yù)計(jì)Fe核心的Ms為206emu/g[Fe](對于Ilnm的核心)，接近于疏松材料的Ms (210emu/g[Fe])。FeiMFe2O4 (M=Fe, Co, Mn)MNPs的磁化曲線每個(gè)都表現(xiàn)出異常的磁滯損失特點(diǎn)同時(shí)伴隨可忽略不計(jì)的剩磁(圖6b)。在同樣大小Fe核心的MNPs中，總磁化強(qiáng)度隨外殼材料的Ms排序(MnFe204>Fe304>COFe204)。該趨勢因此可驗(yàn)證我們的方法通過鐵酸鹽外殼的金屬摻雜來提高整個(gè)微粒的Ms。表I列出不同類型MNPs的總Ms、氧化物外殼的Ms、以及外殼對總Ms的貢獻(xiàn)。正如僅有鐵酸鹽的MNPs沒有核心/外殼結(jié)構(gòu)，對于這些納米微?？偟腗s和鐵氧化物的Ms沒有差異。每種類型的MNP的Ms是在溫度為300K外加磁場強(qiáng)度為Hext=IOkOe下測得。測得納米微粒的外直徑約為16nm。鐵酸鹽外殼估計(jì)的Ms小于那些僅有鐵酸鹽的MNPs，可能由于外殼的多疇性。表I
權(quán)利要求
1.納米微粒包括鐵磁芯；包圍磁芯的超順磁外殼。
2.權(quán)利要求1中所述納米微粒，其中所述納米微粒的直徑大于或等于2nm。
3.權(quán)利要求1所述納米微粒，其中所述鐵磁內(nèi)芯的直徑在約Inm到15nm的范圍內(nèi)。
4.權(quán)利要求1所述納米微粒，其中所述超順磁外殼的厚度大于或等于O.lnm。
5.權(quán)利要求1所述納米微粒，其中所述鐵磁芯包含F(xiàn)e、Co、N1、FePt或SmCo。
6.權(quán)利要求1所述納米微粒,其中所述超順磁外殼包含磁性材料的一種氧化物。
7.權(quán)利要求1所述納米微粒，其中所述超順磁外殼包含一種摻雜劑。
8.權(quán)利要求7所述納米微粒，其中摻雜劑包括選自Mn、Co、N1、Zn、和ZnMn的金屬。
9.權(quán)利要求1所述納米微粒，進(jìn)一步包括在所述超順磁外殼上的涂層，其中所述涂層設(shè)計(jì)成能增強(qiáng)納米微粒的水溶性。
10.權(quán)利要求9所述納米微粒，其中所述涂層包含2，3-二巰基琥珀酸(DMSA)。
11.權(quán)利要求1所述納米微粒，進(jìn)一步包括所述超順磁外殼上的涂層，其中所述涂層設(shè)計(jì)成能使納米微粒與IE分子結(jié)合。
12.權(quán)利要求1所述納米微粒，進(jìn)一步包括所述超順磁外殼上的葡聚糖高分子涂層。
13.制備納米微粒的方法，方法包括制備一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒核心；以及在所述一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒核心上形成超順磁外殼。
14.權(quán)利要求13所述方法，其中制備鐵磁性納米微粒包括在第一種溶液中合并一種金屬復(fù)合物和一種表面活性劑；以及熱處理所述第一種溶液以熱分解所述金屬復(fù)合物并且在所述第一種溶液中形成一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒核心。
15.權(quán)利要求14所述方法，其中所述在一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒核心上形成所述超順磁外殼包括在熱處理所述第一種溶液后，將一個(gè)或多個(gè)金屬-油酸鹽復(fù)合物與所述第一種溶液合并以形成第二種溶液；并且熱處理所述第二種溶液以在所述一個(gè)或多個(gè)鐵磁性納米微粒外殼上形成所述超順磁夕卜殼。
16.檢測個(gè)體中靶分子存在的方法，所述方法包括給個(gè)體攝入納米微粒，其中所述納米微粒包括鐵磁芯；超順磁外殼；以及所述超順磁外殼上與靶分子特異性結(jié)合的一個(gè)靶向配體；提供足夠的時(shí)間讓所述納米微粒結(jié)合所述靶分子；并且產(chǎn)生所述個(gè)體的磁共振成像，其中所述像中的信號(hào)表示所述靶分子的存在。
17.治療的方法，方法包括給個(gè)體攝入納米微粒，其中所述納米微粒包括鐵磁芯；超順磁外殼；以及所述超順磁外殼上與所述個(gè)體靶細(xì)胞結(jié)合的涂層；提供足夠的時(shí)間讓所述納米微粒結(jié)合所述靶細(xì)胞；并且給所述個(gè)體施加一個(gè)交替的電磁場以治療所述靶細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1所述納米微粒，其中所述超順磁外殼包含鐵氧化物。
全文摘要
磁性納米微粒包括一個(gè)磁芯和一個(gè)超順磁外殼，其中外殼提高納米微粒的磁性能。磁性納米微粒的增強(qiáng)了的磁性能容許高靈敏度檢測和降低的納米微粒非特異性聚集。
文檔編號(hào)A61K49/06GK103025314SQ201180036546
公開日2013年4月3日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者R.韋斯萊德, H.李, T-J.勇 申請人:通用醫(yī)療公司