本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：納米材料指粒子的三維空間尺寸至少有一維處于納米級(jí)(通常為0.1-100nm)的材料。磁性納米材料是一類重要的納米材料，具有以下特點(diǎn)：(1)材料尺寸小，可自由滲透血管；(2)能隨外磁場(chǎng)的變化產(chǎn)生相應(yīng)的熱效應(yīng)；(3)可根據(jù)使用目的功能化，增強(qiáng)其生物相容性及靶向性；(4)材料展現(xiàn)出量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)及良好的生物相容性等特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，可作為磁性載體用于藥物傳輸?shù)?。近年?lái)，磁性納米材料已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞磁性分離、靶向載藥、腫瘤熱磁療等，在疾病診療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。DNA作為編碼、存儲(chǔ)和傳遞遺傳信息的生物大分子，控制著生物體的遺傳和性狀。由于其具有功能序列的可設(shè)計(jì)性和響應(yīng)性等特點(diǎn)，可程序化組裝為二維或三維結(jié)構(gòu)。目前，人們已將DNA作為一種組裝材料建立了DNA自組裝技術(shù)，進(jìn)行微納米結(jié)構(gòu)的組裝和分子器件的構(gòu)建。DNA水凝膠是由DNA單體通過(guò)化學(xué)或物理方法交聯(lián)形成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。可通過(guò)設(shè)計(jì)DNA序列及序列長(zhǎng)度精確控制DNA水凝膠的組裝過(guò)程，反應(yīng)快速，且條件溫和，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前尚無(wú)磁性DNA超分子水凝膠的制備并將其用于藥物載體和ATP檢測(cè)體系構(gòu)建的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服上述不足，本發(fā)明提供了一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，并將其應(yīng)用于載藥體系和ATP檢測(cè)體系的構(gòu)建。本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法。實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，首先分別利用三條單鏈(Y1、Y2、Y3)構(gòu)建Y型DNA單體(Y-DNA)、兩條單鏈(L1、L2)構(gòu)建連接體DNA單體(L-DNA)；同時(shí)，利用氧化石墨烯與氨基磁珠間發(fā)生酰胺反應(yīng)，制備磁性氧化石墨烯。利用Y-DNA和L-DNA粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝形成DNA超分子水凝膠，基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將DNA水凝膠通過(guò)外部裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面，制備得到磁性DNA超分子水凝膠。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種磁性DNA超分子水凝膠，包括：摻雜有磁性氧化石墨烯的DNA超分子水凝膠；其中，所述DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面。磁性氧化石墨烯具有較大的比表面積，可負(fù)載大量的DNA水凝膠。將其用于載藥體系，可實(shí)現(xiàn)較高的載藥效能；將其用于ATP的檢測(cè)，則顯著提高檢測(cè)靈敏度。另外，利用DNA水凝膠裸露在外的粘性末端與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用形成磁性DNA超分子水凝膠，和傳統(tǒng)的靜電吸附相比，具有較強(qiáng)的結(jié)合力和穩(wěn)定性，且克服了采用共價(jià)修飾方法合成時(shí)步驟繁瑣、成本較高的缺點(diǎn)。優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA和L-DNA的粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝而成，其中，Y-DNA為三條DNA單鏈(Y1、Y2、Y3)構(gòu)建的Y型DNA單體；L-DNA為兩條DNA單鏈(L1、L2)構(gòu)建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2。更優(yōu)選的，所述Y-DNA的寡核苷酸鏈序列為：Y1：5'-CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2：5'-CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3：5'-CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA的寡核苷酸鏈序列為：L1：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3'；L2：5'-AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC-3'。本發(fā)明通過(guò)上述設(shè)計(jì)的DNA序列即可精確控制DNA水凝膠的自組裝過(guò)程，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，易于實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明首先提供了一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，將磁性氧化石墨烯、Y-DNA、L-DNA分散于緩沖溶液中，混合均勻，恒溫反應(yīng)，即得。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，易于操作。本發(fā)明利用DNA水凝膠裸露在外的粘性末端與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用形成磁性DNA超分子水凝膠，反應(yīng)快速，條件溫和，且具有較強(qiáng)的結(jié)合力和穩(wěn)定性。而一般納米粒子作為藥物載體時(shí)，多采用共價(jià)合成或靜電吸附的方法。其中，共價(jià)合成雖具有較好的穩(wěn)定性，但操作步驟復(fù)雜，反應(yīng)條件苛刻；靜電吸附雖合成步驟簡(jiǎn)單，但結(jié)合力和穩(wěn)定性較差。優(yōu)選的，所述恒溫反應(yīng)的條件為35～37℃下，反應(yīng)3～3.5h；優(yōu)選的，所述磁性氧化石墨烯的具體制備方法如下：配制氧化石墨烯分散液、活化，與氨基磁珠反應(yīng)，即得；優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA和L-DNA的粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝而成；其中，Y-DNA為三條DNA單鏈(Y1、Y2、Y3)構(gòu)建的Y型DNA單體；L-DNA為兩條DNA單鏈(L1、L2)構(gòu)建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2；更優(yōu)選的，所述Y-DNA的寡核苷酸鏈序列為：Y1：5'-CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2：5'-CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3：5'-CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA的寡核苷酸鏈序列為：L1：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3'；L2：5'-AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC-3'。本發(fā)明還提供了一種較優(yōu)的磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，具體的制備方法如下：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000～6500rpm離心10～15min制得終濃度為1～1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600～650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600～650μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(EDC)，35～37℃振蕩活化1～1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300～320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35～37℃振蕩反應(yīng)12～14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用PBS緩沖液清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4～5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉鹽)；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，4℃保存?zhèn)溆谩?.磁性DNA超分子水凝膠的制備取等量上述制備的Y-DNA和L-DNA于微量離心管中，然后向混合體系中加入磁性氧化石墨烯溶液，最后加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯的終濃度分別為6～12μM、18～36μM、0.02～0.04μM。將混合體系于35～37℃反應(yīng)3～4h制得磁性DNA超分子水凝膠。本發(fā)明的第二個(gè)方面，基于上述制備的磁性DNA超分子水凝膠，提供了一種將該磁性DNA超分子水凝膠作為藥物載體的技術(shù)應(yīng)用。原理如圖2所示，基于Y-DNA與L-DNA的交聯(lián)作用自組裝形成DNA超分子水凝膠，結(jié)合磁性氧化石墨烯對(duì)單鏈DNA的吸附作用，通過(guò)DNA水凝膠裸露在外的粘性末端將DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面制備得到磁性DNA超分子水凝膠，即本專利的第一個(gè)方面中所制備的磁性DNA超分子水凝膠。進(jìn)一步，利用抗腫瘤藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)可嵌插到DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中的性質(zhì)，將抗腫瘤藥物DOX嵌合到磁性DNA超分子水凝膠的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中，制備得到負(fù)載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠藥物載體。由于脫氧核糖核酸酶I(DeoxyribonucleaseI，簡(jiǎn)稱DNaseI)在中性環(huán)境且有Mg2+存在時(shí)，可非特異性地水解雙鏈DNA，生成5′磷酸末端和3′羥基末端的寡核苷酸。因此，當(dāng)向體系中加入DNaseI后，DNaseI將負(fù)載DOX的DNA超分子水凝膠水解為DNA片段，從而釋放出所負(fù)載的抗腫瘤藥物DOX，實(shí)現(xiàn)藥物釋放。該方法將抗腫瘤藥物與生物相容性和水溶性良好的DNA納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合，克服了藥物自身水溶性差、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)；同時(shí)該方法結(jié)合磁性氧化石墨烯在DNA載藥納米結(jié)構(gòu)制備過(guò)程中易于分離和純化的優(yōu)點(diǎn)，為構(gòu)建高度有序和精確控制的核酸藥物載體提供了良好的應(yīng)用平臺(tái)，具有廣闊的發(fā)展前景。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種負(fù)載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠，包括：摻雜有磁性氧化石墨烯的DNA超分子水凝膠；負(fù)載在所述磁性DNA超分子水凝膠上的抗腫瘤藥物；其中，所述負(fù)載抗腫瘤藥物的DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面。利用DNA自組裝技術(shù)制備得到網(wǎng)狀DNA水凝膠，該結(jié)構(gòu)中含有大量DNA堿基對(duì)。由于一些抗腫瘤藥物，如阿霉素(DOX)、表柔比星(E-ADM)、吡柔比星(THP)可嵌插到DNA雙鏈中，因此用DNA超分子水凝膠作為藥物載體可極大地增加載藥量。此外，利用DNaseI可非特異性水解雙鏈DNA的特性，從而達(dá)到藥物緩釋的目的。本發(fā)明網(wǎng)狀DNA水凝膠與一般的納米結(jié)構(gòu)相比，載藥量高。優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA與磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物的摩爾比為300～600：900～1800：1～2：3×104～6×104；優(yōu)選的，所述抗腫瘤藥物為DOX、E-ADM、THP；優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA和L-DNA的粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝而成，其中，Y-DNA為三條DNA單鏈(Y1、Y2、Y3)構(gòu)建的Y型DNA單體；L-DNA為兩條DNA單鏈(L1、L2)構(gòu)建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2。更優(yōu)選的，所述Y-DNA的寡核苷酸鏈序列為：Y1：5'-CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2：5'-CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3：5'-CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA的寡核苷酸鏈序列為：L1：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3'；L2：5'-AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC-3'。本發(fā)明還提供了一種負(fù)載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，包括：將磁性氧化石墨烯、Y-DNA、L-DNA、抗腫瘤藥物分散于緩沖溶液中，混合均勻，恒溫反應(yīng)，磁性分離，即得負(fù)載抗腫瘤藥物的磁性DNA超分子水凝膠。優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物的摩爾比為300～600：900～1800：1～2：3×104～6×104；優(yōu)選的，所述抗腫瘤藥物為DOX、E-ADM、THP；優(yōu)選的，所述恒溫反應(yīng)的條件為35～37℃下，反應(yīng)3～3.5h；優(yōu)選的，所述磁性氧化石墨烯的具體制備方法如下：配制氧化石墨烯分散液、活化，與氨基磁珠反應(yīng)，即得；優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA和L-DNA的粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝而成；其中，Y-DNA為三條DNA單鏈(Y1、Y2、Y3)構(gòu)建的Y型DNA單體；L-DNA為兩條DNA單鏈(L1、L2)構(gòu)建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA、L-DNA和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2；更優(yōu)選的，所述Y-DNA的寡核苷酸鏈序列為：Y1：5'-CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2：5'-CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3：5'-CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA的寡核苷酸鏈序列為：L1：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3'；L2：5'-AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC-3'。本發(fā)明還提供了一種較優(yōu)的負(fù)載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000～6500rpm離心10～15min制得終濃度為1～1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600～650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600～650μLEDC，35～37℃振蕩活化1～1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300～320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35～37℃振蕩反應(yīng)12～14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4～5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.負(fù)載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠的制備向DOX溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入杜氏緩沖液，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物DOX的終濃度分別為6～12μM、18～36μM、0.02～0.04μM、600～1200μM?；旌象w系于35～37℃反應(yīng)7～8.5h，磁性分離，除去過(guò)量的DOX，制得負(fù)載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠。將制備得到的負(fù)載DOX的磁性DNA超分子水凝膠分散于杜氏磷酸緩沖液中，4～5℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的第三個(gè)方面，基于磁性DNA超分子水凝膠的制備，提供了一種包覆辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠，實(shí)現(xiàn)對(duì)三磷酸腺苷(ATP)的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)的應(yīng)用體系。原理如圖5所示，將L-DNA中L1的部分序列設(shè)計(jì)為ATP適體，并以此改變其他DNA序列，制備得到兩種DNA單體(Y-DNA'和L-DNA')。利用Y-DNA'和L-DNA'的交聯(lián)作用形成DNA水凝膠，同時(shí)將HRP包覆于DNA水凝膠中。進(jìn)一步基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將包覆HRP的DNA水凝膠通過(guò)裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面，制備得到包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠?；诤怂徇m體與目標(biāo)物的特異性識(shí)別作用，當(dāng)有ATP存在時(shí)，ATP與其適體鏈特異性結(jié)合生成ATP-適體復(fù)合物，從而破壞DNA水凝膠結(jié)構(gòu)，釋放出所包覆的HRP。磁性分離，向上清液中加入反應(yīng)底物TMB/H2O2，反應(yīng)完成后采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的高靈敏、高特異性定量分析。此外，采用本方法制備包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠，通過(guò)改變不同的適體序列可實(shí)現(xiàn)對(duì)其它目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，具有廣泛適用性。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下方案：一種包覆辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠，包括：摻雜有磁性氧化石墨烯的DNA超分子水凝膠；包覆在所述DNA超分子水凝膠中的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)；其中，構(gòu)成所述DNA超分子水凝膠的L-DNA'單體中，與Y-DNA連接的單鏈DNA含有ATP適體序列；所述包覆HRP的DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面。磁性氧化石墨烯具有較大的比表面積，可負(fù)載大量的DNA水凝膠。將其用于ATP的檢測(cè)，可顯著提高檢測(cè)靈敏度。優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA'和L-DNA'的粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝而成，其中，Y-DNA'為三條DNA單鏈(Y1'、Y2'、Y3')構(gòu)建的Y-DNA'單體；L-DNA'為兩條DNA單鏈(L1'、L2')構(gòu)建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的摩爾比為300～600：900～1800：1～2：1250～2500。更優(yōu)選的，所述Y-DNA'的寡核苷酸鏈序列為：Y1'：5'-TTGGACCCTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2'：5'-TTGGACCCCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3'：5'-TTGGACCCAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA'的寡核苷酸鏈序列為：L1'：5'-GGGTCCAAGTGAAGAGTCTATTGAAGAATTCCAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'；L2'：5'-GGAATTCTTCAATAGACTCTTCAC-3'。本發(fā)明還提供了一種包覆辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，包括：將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、磁性氧化石墨烯、形成DNA超分子水凝膠的Y-DNA'、L-DNA'分散于緩沖溶液中，混合均勻，恒溫反應(yīng)，即得。優(yōu)選的，所述Y-DNA'、L-DNA'、與磁性氧化石墨烯、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的摩爾比為300～600：900～1800：1～2：1250～2500；優(yōu)選的，所述恒溫反應(yīng)的條件為35～37℃，反應(yīng)3～3.5h；優(yōu)選的，所述磁性氧化石墨烯的具體制備方法如下：配制氧化石墨烯分散液、活化，與氨基磁珠反應(yīng)，即得；優(yōu)選的，所述DNA超分子水凝膠由Y-DNA'和L-DNA'的粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝而成，其中，Y-DNA'為Y型DNA單體；L-DNA'為兩條單鏈(L1'、L2')構(gòu)建的連接體DNA單體；更優(yōu)選的，所述Y-DNA'、L-DNA'和磁性氧化石墨烯的摩爾比為300～600：900～1800：1～2。更優(yōu)選的，所述Y-DNA'的寡核苷酸鏈序列為：Y1'：5'-TTGGACCCTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATG-3'；Y2'：5'-TTGGACCCCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCT-3'；Y3'：5'-TTGGACCCAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCA-3'；所述L-DNA'的寡核苷酸鏈序列為：L1'：5'-GGGTCCAAGTGAAGAGTCTATTGAAGAATTCCAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'；L2'：5'-GGAATTCTTCAATAGACTCTTCAC-3'。本發(fā)明還提供了一種較優(yōu)的包覆辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，具體包括如下步驟：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000～6500rpm離心10～15min制得終濃度為1～1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600～650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600～650μLEDC，35～37℃振蕩活化1～1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300～320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35～37℃振蕩反應(yīng)12～14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4～5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA'和L-DNA'的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1'、Y2'、Y3'(濃度比Y1'：Y2'：Y3'＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1'、L2'(濃度比L1'：L2'＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA'和L-DNA'，備用。3.包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠的制備向HRP溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、辣根過(guò)氧化物酶的終濃度分別為6～12μM、18～36μM、0.02～0.04μM、25～50μM。混合體系于35～37℃反應(yīng)3～3.2h，制得包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明提供了一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法。利用Y-DNA和L-DNA粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝形成DNA超分子水凝膠，基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將DNA水凝膠通過(guò)外部裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面，制備得到磁性DNA超分子水凝膠。(2)本發(fā)明提供了一種將該磁性DNA超分子水凝膠作為藥物載體的技術(shù)應(yīng)用。該方法將抗腫瘤藥物與生物相容性和水溶性良好的DNA納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合，克服了藥物自身水溶性差、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)；同時(shí)該方法結(jié)合磁性氧化石墨烯在DNA載藥納米結(jié)構(gòu)制備過(guò)程中易于分離和純化的優(yōu)點(diǎn)，為構(gòu)建高度有序和精確控制的核酸藥物載體提供了良好的應(yīng)用平臺(tái)，具有廣闊的發(fā)展前景。(3)本發(fā)明提供了一種包覆辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠，實(shí)現(xiàn)對(duì)三磷酸腺苷(ATP)的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)的應(yīng)用體系。采用本方法制備包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠，通過(guò)改變適體序列可實(shí)現(xiàn)對(duì)其它目標(biāo)物的檢測(cè)，具有廣泛適用性。(4)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、實(shí)用性強(qiáng)，易于推廣。附圖說(shuō)明圖1磁性DNA超分子水凝膠制備原理圖。圖2磁性DNA水凝膠用于藥物載體原理圖。圖3向負(fù)載DOX磁性DNA超分子水凝膠中加入不同濃度DNaseI，反應(yīng)完成后，磁性分離得到上清液溶液照片。DNaseI濃度(從左向右)：0、0.002U/μL、0.004U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL。圖4向負(fù)載DOX磁性DNA超分子水凝膠中加入不同濃度DNaseI，反應(yīng)完成后，磁性分離得到上清液溶液紫外-可見(jiàn)光譜圖。DNaseI濃度(從下向上，以波峰處計(jì))：0、0.002U/μL、0.004U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL。圖5包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠用于ATP檢測(cè)原理圖。圖6向包覆HRP的磁性DNA水凝膠體系中加入不同濃度ATP，與TMB/H2O2反應(yīng)完成后，溶液顏色照片。ATP濃度(從左向右)：0，2μM，4μM，6μM，8μM，10μM。圖7向包覆HRP的磁性DNA水凝膠體系中加入不同濃度ATP，與TMB/H2O2反應(yīng)完成后，溶液體系的紫外-可見(jiàn)光譜圖。ATP濃度(從下向上，以波峰處計(jì))：0，2μM，4μM，6μM，8μM，10μM。圖8向包覆HRP的磁性DNA水凝膠體系中加入PBS緩沖液(即空白)、ATP類似物、以及ATP(濃度均為8μM)，與TMB/H2O2反應(yīng)完成后，溶液體系在450nm處的紫外-可見(jiàn)吸光度的比較。具體實(shí)施方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明特征及其它相關(guān)特征作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，以便于同行業(yè)技術(shù)人員的理解：實(shí)施例1一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法。實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，首先分別利用三條單鏈(Y1、Y2、Y3)構(gòu)建Y型DNA單體(Y-DNA)、兩條單鏈(L1、L2)構(gòu)建連接體DNA單體(L-DNA)；同時(shí)，利用氧化石墨烯與氨基磁珠間發(fā)生酰胺反應(yīng)，制備磁性氧化石墨烯。利用Y-DNA和L-DNA粘性末端互補(bǔ)雜交自組裝形成DNA超分子水凝膠，基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將DNA水凝膠通過(guò)外部裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面，制備得到磁性DNA超分子水凝膠。具體的制備方法如下：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000rpm離心10min制得終濃度為1mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600μLEDC，37℃振蕩活化1h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)(注意：氨基磁珠使用前用咪唑-鹽酸緩沖液(1M，pH6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用)清洗干凈)，37℃振蕩反應(yīng)12h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.磁性DNA超分子水凝膠的制備取等量上述制備的Y-DNA和L-DNA于微量離心管中，然后向混合體系中加入磁性氧化石墨烯溶液，最后加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯的終濃度分別為6μM、18μM、0.02μM。將混合體系于37℃反應(yīng)3h制得磁性DNA超分子水凝膠。實(shí)施例2一種將該磁性DNA超分子水凝膠作為藥物載體的技術(shù)應(yīng)用。原理如圖2所示，基于Y-DNA與L-DNA的交聯(lián)作用自組裝形成DNA超分子水凝膠，結(jié)合磁性氧化石墨烯對(duì)單鏈DNA的吸附作用，通過(guò)DNA水凝膠裸露在外的粘性末端將DNA超分子水凝膠吸附在磁性氧化石墨烯表面制備得到磁性DNA超分子水凝膠，此為本專利第一個(gè)方面中所制備的磁性DNA超分子水凝膠。進(jìn)一步，利用抗腫瘤藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)可嵌插到DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中的性質(zhì)，將抗腫瘤藥物DOX嵌合到磁性DNA超分子水凝膠的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中，制備得到負(fù)載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠藥物載體。由于脫氧核糖核酸酶I(DeoxyribonucleaseI，簡(jiǎn)稱DNaseI)在中性環(huán)境且有Mg2+存在時(shí)，可非特異性地水解雙鏈DNA，生成5′磷酸末端和3′羥基末端的寡核苷酸。因此，當(dāng)向體系中加入DNaseI后，DNaseI將負(fù)載DOX的DNA超分子水凝膠水解為DNA片段，從而釋放出所負(fù)載的抗腫瘤藥物DOX，實(shí)現(xiàn)藥物釋放。該方法將抗腫瘤藥物與生物相容性和水溶性良好的DNA納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合，克服了藥物自身水溶性差、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)；同時(shí)該方法結(jié)合磁性氧化石墨烯在DNA載藥納米結(jié)構(gòu)制備過(guò)程中易于分離和純化的優(yōu)點(diǎn)，為構(gòu)建高度有序和精確控制的核酸藥物載體提供了良好的應(yīng)用平臺(tái)，具有廣闊的發(fā)展前景。具體的制備方法如下:表1-1所用寡核苷酸鏈序列名稱序列(5'-3')Y1CACGGACTTGGATCCGCATAACCATTCGCCGTAATGY2CACGGACTCATTACGGCGAATGTACCGAATCAGCCTY3CACGGACTAGGCTGATTCGGTAGTTATGCGGATCCAL1AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGGTTGGTGTGGTTGGL2AGTCCGTGCCAACCACACCAACCAGTCACCCCAACCTGCCCTAC1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000rpm離心10min制得終濃度為1mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600μLEDC，37℃振蕩活化1h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)(注意：氨基磁珠使用前用咪唑-鹽酸緩沖液(1M，pH6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用)清洗干凈)，37℃振蕩反應(yīng)12h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.負(fù)載抗腫瘤藥物DOX磁性DNA超分子水凝膠的制備向DOX溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入杜氏緩沖液，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物DOX的終濃度分別為6μM、18μM、0.02μM、600μM?；旌象w系37℃反應(yīng)7h，磁性分離，除去過(guò)量的DOX，制得負(fù)載抗腫瘤藥物DOX的磁性DNA超分子水凝膠。將制備得到的負(fù)載DOX磁性DNA超分子水凝膠分散于杜氏磷酸緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩?.釋藥量的檢測(cè)分別取500μL上述制備的負(fù)載DOX磁性DNA超分子水凝膠于8個(gè)離心管中，向其中分別加入50μL濃度分別為0、0.002U/μL、0.004U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL的DNaseI，其中DNaseI分散于1×消化緩沖液(10mMTris溶液、0.5mMCa2+、2.5mMMg2+，pH7.4)中。加入杜氏磷酸緩沖液補(bǔ)充終體積至1mL，將該反應(yīng)體系于37℃反應(yīng)1h。反應(yīng)完成后，磁性分離，取等量上清液，加入杜氏磷酸緩沖液補(bǔ)充終體積至2mL，于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論將不同濃度DNaseI溶液(濃度依次為0、0.002U/μL、0.004U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL)加入到負(fù)載DOX磁性DNA超分子水凝膠中，于37℃反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離，取上層清液，加入杜氏磷酸緩沖液補(bǔ)充終體積至2mL后，觀察溶液顏色。如圖3所示，上清液呈桔紅色(即為DOX顏色)，且顏色隨著加入DNaseI濃度的增加逐漸加深，表明加入DNaseI后，DNA水凝膠雙鏈結(jié)構(gòu)被DNaseI水解為寡核苷酸片段，嵌插在DNA雙鏈中的DOX被釋放出來(lái)，且所釋放的DOX的濃度隨加入DNaseI量的增加而增大。進(jìn)一步，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)所得上清液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收檢測(cè)。如圖4所示，隨著加入DNaseI濃度的增大，其對(duì)應(yīng)的上清液在480nm處的紫外-可見(jiàn)吸光度依次升高，進(jìn)一步說(shuō)明釋放出來(lái)的DOX濃度與加入的DNaseI的量呈正相關(guān)，從而證實(shí)了將磁性DNA超分子水凝膠用于藥物載體的可行性。實(shí)施例3一種包覆辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠，實(shí)現(xiàn)對(duì)三磷酸腺苷(ATP)的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)的應(yīng)用體系。原理如圖5所示，將L-DNA中L1的部分序列設(shè)計(jì)為ATP適體，并以此改變其他DNA序列，制備得到兩種DNA單體(Y-DNA'和L-DNA')。利用Y-DNA'和L-DNA'的交聯(lián)作用形成DNA水凝膠，同時(shí)將HRP包覆于DNA水凝膠中。進(jìn)一步基于單鏈DNA與磁性氧化石墨烯間的π-π堆疊作用，將包覆HRP的DNA水凝膠通過(guò)裸露的粘性末端吸附在磁性氧化石墨烯表面制備得到包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠?；诤怂徇m體與目標(biāo)物的特異性識(shí)別作用，當(dāng)有ATP存在時(shí)，ATP與其適體鏈特異性結(jié)合生成ATP-適體復(fù)合物，破壞DNA水凝膠結(jié)構(gòu)，從而釋放HRP。磁性分離，向上清液中加入反應(yīng)底物TMB/H2O2，反應(yīng)完成后采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的高靈敏、高特異性定量分析。此外，采用本方法制備包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠，通過(guò)改變不同的適體序列可實(shí)現(xiàn)對(duì)其它目標(biāo)物的檢測(cè)，具有廣泛適用性。具體的制備方法如下:表1-2所用寡核苷酸及適體鏈序列1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6000rpm離心10min制得終濃度為1mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取600μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入600μLEDC，37℃條件下振蕩活化1h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入300μL用咪唑-鹽酸緩沖液(1M，pH6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用)清洗后的氨基磁珠(粒徑約為100nm)，37℃振蕩反應(yīng)12h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA'和L-DNA'的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2，pH8.0)制備。將Y1'、Y2'、Y3'(濃度比Y1'：Y2'：Y3'＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1'、L2'(濃度比L1'：L2'＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA'和L-DNA'，備用。3.包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠的制備向HRP溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、辣根過(guò)氧化物酶的終濃度分別為6μM、18μM、0.02μM、25μM?；旌象w系于37℃反應(yīng)3h，制得包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。4.ATP檢測(cè)分別取100μL不同濃度三磷酸腺苷(ATP)標(biāo)準(zhǔn)液，加入到包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠體系中，25℃反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離，分別移取50μL上清液，向其中加入10μL0.5％TMB溶液、20μL30％H2O2溶液、920μL緩沖液(26.6mM檸檬酸，51.4mMNa2HPO4，15mMKCl,pH5.0)，反應(yīng)15min后，分別加入500μL2MH2SO4終止反應(yīng)，然后加入500μL緩沖液(pH5.0)補(bǔ)充終體積至2mL，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收檢測(cè)。5.特異性檢測(cè)分別將100μLPBS緩沖液、ATP類似物(三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)，濃度均為8μM)、目標(biāo)物ATP(濃度為8μM)加入到包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠體系中，25℃反應(yīng)1h后，磁性分離，分別移取50μL上清液，向其中加入10μL0.5％TMB溶液、20μL30％H2O2溶液、920μL緩沖液(26.6mM檸檬酸，51.4mMNa2HPO4，15mMKCl,pH5.0)，反應(yīng)15min后，分別加入500μL2MH2SO4終止反應(yīng)，然后加入500μL緩沖液(pH5.0)補(bǔ)充終體積至2mL，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收檢測(cè)。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論向HRP溶液中加入一定量Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、PBS緩沖液(pH7.0)，使混合體系于37℃反應(yīng)3h，制得包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。將不同濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度依次為0，2μM，4μM，6μM，8μM，10μM)加入到包覆HRP的磁性DNA水凝膠體系中，于25℃反應(yīng)1h后，磁性分離，取上清液。向上清液中加入TMB溶液和H2O2溶液，反應(yīng)15min后，加入硫酸終止反應(yīng)，加入緩沖液(pH5.0)補(bǔ)充終體積至2mL，觀察溶液體系顏色。如圖6所示，溶液呈黃色，且顏色隨著加入ATP濃度的增大逐漸加深，表明加入ATP后，包覆在DNA水凝膠中的HRP被釋放出來(lái)，且所釋放的HRP濃度隨加入ATP濃度的增大而增大。利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示，隨著加入ATP濃度的增大，上清液在450nm處的紫外-可見(jiàn)吸光度依次升高，進(jìn)一步說(shuō)明釋放出的HRP濃度與加入的ATP濃度呈正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的高靈敏定量檢測(cè)。為驗(yàn)證本體系對(duì)ATP檢測(cè)的特異性，向所制備的包覆HRP的磁性DNA水凝膠中分別加入等體積PBS緩沖液(即空白)、ATP類似物(UTP、CTP、GTP，濃度均為8μM)、目標(biāo)物ATP(濃度為8μM)，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收檢測(cè)。結(jié)果如圖8所示，體系中加入ATP類似物(UTP、CTP、GTP)反應(yīng)后溶液在450nm處的紫外-可見(jiàn)吸光度與空白樣品相比，沒(méi)有明顯變化；當(dāng)加入目標(biāo)物ATP后，反應(yīng)后溶液在450nm處的紫外-可見(jiàn)吸光度明顯增大，表明該方法具有良好的特異性。實(shí)施例4一種磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，具體的制備方法如下：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6500rpm離心15min制得終濃度為1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入650μLEDC，35℃振蕩活化1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35℃振蕩反應(yīng)14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.磁性DNA超分子水凝膠的制備取等量上述制備的Y-DNA和L-DNA于微量離心管中，然后向混合體系中加入磁性氧化石墨烯溶液，最后加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯的終濃度分別為12μM、36μM、0.04μM。將混合體系于36℃反應(yīng)4h制得磁性DNA超分子水凝膠。實(shí)施例5一種較優(yōu)的負(fù)載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6500rpm離心15min制得終濃度為1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入650μLEDC，35℃振蕩活化1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35℃振蕩反應(yīng)14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.負(fù)載抗腫瘤藥物E-ADM磁性DNA超分子水凝膠的制備向E-ADM溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入杜氏緩沖液，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物E-ADM的終濃度分別為12μM、36μM、0.04μM、1200μM?；旌象w系37℃反應(yīng)6h，磁性分離，除去過(guò)量的抗腫瘤藥物，制得負(fù)載抗腫瘤藥物的磁性DNA超分子水凝膠。將制備得到的負(fù)載E-ADM磁性DNA超分子水凝膠分散于杜氏磷酸緩沖液，5℃保存?zhèn)溆?。?shí)施例6一種較優(yōu)的負(fù)載抗腫瘤藥物磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6500rpm離心15min制得終濃度為1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入650μLEDC，35℃振蕩活化1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35℃振蕩反應(yīng)14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA和L-DNA的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2pH8.0)制備。將Y1、Y2、Y3(濃度比Y1：Y2：Y3＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1、L2(濃度比L1：L2＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即緩慢冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA和L-DNA，備用。3.負(fù)載抗腫瘤藥物THP磁性DNA超分子水凝膠的制備向THP溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入杜氏緩沖液，使Y-DNA、L-DNA、磁性氧化石墨烯、抗腫瘤藥物THP的終濃度分別為12μM、36μM、0.04μM、1200μM?；旌象w系37℃反應(yīng)6h，磁性分離，除去過(guò)量的抗腫瘤藥物，制得負(fù)載抗腫瘤藥物的磁性DNA超分子水凝膠。將制備得到的負(fù)載THP磁性DNA超分子水凝膠分散于杜氏磷酸緩沖液，5℃保存?zhèn)溆?。?shí)施例7一種包覆辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的磁性DNA超分子水凝膠的制備方法，具體包括如下步驟：1.磁性氧化石墨烯的制備將一定量的氧化石墨烯片置于燒杯中，加入二次水超聲溶解得到棕色溶液，然后于6500rpm離心15min制得終濃度為1.5mgmL-1的氧化石墨烯懸浮液；取650μL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入650μLEDC，35℃振蕩活化1.2h；向活化好的氧化石墨烯溶液中加入320μL氨基磁珠(粒徑約為100nm)，35℃振蕩反應(yīng)14h；將制備好的磁性氧化石墨烯進(jìn)行磁性分離，用二次去離子水清洗三次，將清洗后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，5℃保存?zhèn)溆谩?.Y-DNA'和L-DNA'的制備實(shí)驗(yàn)中所用DNA均采用TE緩沖溶液(10mMTris-HCl緩沖液；1mMEDTA二鈉鹽；12.5mMMgCl2pH8.0)制備。將Y1'、Y2'、Y3'(濃度比Y1'：Y2'：Y3'＝1：1：1，每條DNA終濃度為50μM)和L1'、L2'(濃度比L1'：L2'＝1：1，每條DNA終濃度為50μM)分別進(jìn)行退火處理，即加熱至95℃5min，隨即冷卻至室溫穩(wěn)定2h，以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Y-DNA'和L-DNA'，備用。3.包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠的制備向HRP溶液中加入一定量上述制備的Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯，然后向混合體系中加入PBS緩沖液(pH7.0)，使Y-DNA'、L-DNA'、磁性氧化石墨烯、辣根過(guò)氧化物酶的終濃度分別為12μM、36μM、0.04μM、50μM?；旌象w系于36℃反應(yīng)3.2h，制得包覆HRP的磁性DNA超分子水凝膠。最后應(yīng)該說(shuō)明的是，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3