專利名稱：?；囊葝u素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可溶的具有持久作用的新人胰島素衍生物，制備這種衍生物的方法，含有它們的藥物組合物，和這種胰島素衍生物在糖尿病治療中的應(yīng)用。
許多糖尿病患者每天注射多次胰島素進(jìn)行治療，注射方案是每天注射一到兩次長效胰島素以滿足基礎(chǔ)需求，再補(bǔ)充注射速效胰島素以滿足與進(jìn)餐有關(guān)的需要。
長效胰島素組合物在本領(lǐng)域中是已知的。例如，一種主要類型的長效胰島素組合物包含胰島素結(jié)晶或無定形胰島素的可注射水懸液。在這些組合物中常用的胰島素化合物是魚精蛋白胰島素、鋅胰島素或魚精蛋白鋅胰島素。
使用胰島素懸液有一些缺點(diǎn)。例如，為了保證精確給藥，在從小瓶吸取或從藥筒中排出定量體積的懸液前必須輕輕搖動(dòng)使胰島素顆粒均勻懸浮。而且，為了避免形成團(tuán)塊或凝聚，胰島素懸液的貯存溫度范圍要比胰島素溶液更窄。
雖然早期相信魚精蛋白是非免疫原性的，但現(xiàn)已證明魚精蛋白在人體中可以是免疫原性的，其用于醫(yī)藥目的時(shí)可導(dǎo)致抗體形成(Samuel等，Studies on the immunogenecity of protamines in hu-mans and experimental animals by means of a micro-complementfixation text，Clin.Exp.Immunol.33，pp 252-260(1978))。
另外，已發(fā)現(xiàn)魚精蛋白-胰島素復(fù)合物本身為免疫原性的證據(jù)(Kurtz等，Circulating IgG antibody to Protamine in pat，entstreated with protamine-insulins.Diabetologica 25，pp.322-324(1983))。所以對某些病人必須避免使用含魚精蛋白的長效胰島素組合物。
另一類長效胰島素組合物是PH低于生理PH的溶液，當(dāng)注射此溶液時(shí)由于PH升高胰島素將從溶液中沉淀。這些溶液的一個(gè)缺點(diǎn)是注射時(shí)在組織中形成的沉淀的顆粒大小分布(因而給藥時(shí)間)取決于注射位點(diǎn)的血流和其他有些不可預(yù)測的參數(shù)。另一缺點(diǎn)是胰島素固體顆?？勺鳛榫植看碳の镆鹱⑸湮稽c(diǎn)組織的炎癥。
WO 91/12817(Novo Nordisk A/S)公開了一種含胰島素鈷(III)配合物的長效可溶性胰島素組合物。這些配合物的長效作用只是中等的，而生物利用度降低了。
人胰島素有三個(gè)伯氨基基團(tuán)A-鏈和B-鏈的N-末端基團(tuán)和LysB29的ε-氨基。本領(lǐng)域中已知幾種在一個(gè)或多個(gè)這種基團(tuán)上取代的胰島素衍生物。例如，美國專利3,528,960(Eli Lilly)涉及N-羧基芳酰基胰島素，其中胰島素分子的一、二或三個(gè)伯氨基上具有羧基芳?；?。沒有公開具體的NεB29取代的胰島素。
根據(jù)英國專利1,492,997(Nat.Res.Dev.Corp.)，發(fā)現(xiàn)在NεB29位有氨基甲?；〈囊葝u素其降血糖作用提高。
日本專利申請公開1-254699(Kodama Co.，Ltd)公開了一種胰島素，其中脂肪酸與PheB1的氨基或與LysB29的ε-氨基或與兩者結(jié)合。所表述的衍生化目的是獲得藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定的胰島素制劑。
日本專利申請公開57-067548(Shionogi)中描述了一種胰島素，在其B30位有一含至少5個(gè)碳原子的氨基酸，這一氨基酸不一定能由核苷酸三鏈體編碼。據(jù)稱該胰島素類似物可用于治療糖尿病，尤其是在由于產(chǎn)生牛或豬胰島素抗體而對胰島素耐受的病人中。
本文所用“胰島素衍生物”指具有與人胰島素相似的分子結(jié)構(gòu)并具有胰島素活性的化合物，其中包括CysA7和CysB7之間和CysA20和CysB19之間的二硫橋和CysA6和CysA11間的內(nèi)二硫橋。
但是，仍需要一種長效可注射胰島素組合物，其為溶液并含有胰島素，注射后胰島素仍保持在溶液中，并具有最小的炎性和免疫原性特征。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種作用持久并在生理PH值下可溶的人胰島素衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有本發(fā)明人胰島素衍生物的藥物組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種制備本發(fā)明人胰島素衍生物的方法。
令人驚異地證明在LysB29的ε-氨基上有親脂取代基的一些人胰島素衍生物具有持久作用并在生理PH值下可溶。
因此，本發(fā)明范圍最寬的一面涉及具有以下序列的胰島素衍生物和其任何Zn2+配合物 B-鏈(續(xù))Phe-Tyr-Thr-Pro—Lys-Xaa(SEQ ID NO2)25 26 27 28 29 30其中A21和B3位的Xaa獨(dú)立地為除Lys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基；B1位的Xaa是Phe或缺失；B30位的Xaa是(a)含10—24個(gè)碳原子的非編碼親脂氨基酸，此時(shí)最多5個(gè)碳原子的羧酸酰基與LysB29的ε-氨基連結(jié)，(b)除Lys、Arg和Cys外的可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基，此時(shí)LysB29的ε-氨基具有親脂取代基或(c)缺失，此時(shí)LysB29的ε-氨基具有親脂取代基；條件是當(dāng)B30位的Xaa為Thr或Ala，A21和B3位的Xaa均為Asn，B1位的Xaa為Phe時(shí)，該胰島素衍生物是Zn2+配合物。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種人胰島素衍生物，其中B30氨基酸殘基缺失或?yàn)槌齃ys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基；A21和B3氨基酸殘基獨(dú)立地為除Lys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基；PheB1可缺失；LysB29的ε-氨基上有至少含6個(gè)碳原子的親脂取代基；及每個(gè)胰島素六聚體可結(jié)合2—4個(gè)Zn2+離子，條件是當(dāng)B30為Thr或Ala，A21和B3均為Asn，PheB1不缺失時(shí)，胰島素衍生物的每一六聚體結(jié)合2—4個(gè)Zn2+離子。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種人胰島素衍生物，其中B30氨基酸殘基缺失或?yàn)槌齃ys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基；A21和B3氨基酸殘基獨(dú)立地為除Lys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基，條件是如果B30氨基酸殘基為Ala或Thr時(shí)，A21和B3至少一個(gè)殘基不是Asn；PheB1可缺失；LysB29的ε-氨基上具有含至少6個(gè)碳原子的親脂取代基。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種人胰島素衍生物，其中B30氨基酸殘基缺失或?yàn)槌齃ys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基；A21和B3氨基酸殘基獨(dú)立地為除Lys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基，PheB1可缺失；LysB29的ε-氨基上具有含至少6個(gè)碳原子的親脂取代基；及每個(gè)胰島素六聚體結(jié)合2—4個(gè)Zn2+離子。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基缺失的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是Asp的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是Glu的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是Thr的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是含有至少10個(gè)碳原子的親脂氨基酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是含有10至24個(gè)碳原子的親脂α-氨基酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是含有10至24個(gè)碳原子的直鏈、飽和、脂肪α-氨基酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是D-或L-Nε-十二?；嚢彼岬娜艘葝u素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是α-氨基癸酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是α-氨基十一烷酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是α-氨基十二烷酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是α-氨基十三烷酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是α-氨基十四烷酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是α-氨基十五烷酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是α-氨基十六烷酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B30氨基酸殘基是一個(gè)α-氨基酸的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中A21氨基酸殘基是Ala的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中A21氨基酸殘基是Gln的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中A21氨基酸殘基是Gly的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中A21氨基酸殘基是Ser的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B3氨基酸殘基是Asp的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B3氨基酸殘基是Gln的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中B3氨基酸殘基是Thr的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基的人胰島素衍生物，該親脂取代基是含有至少6個(gè)碳原子的羧酸相應(yīng)的?；?br> 在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基的人胰島素衍生物，該親脂取代基是含有8—24個(gè)碳原子的羧酸相應(yīng)的分支或不分支的?；?。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基的人胰島素衍生物，該親脂取代基是含有至少6個(gè)碳原子的脂肪酸相應(yīng)的?；?。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基的人胰島素衍生物，該親脂取代基是含有6至24個(gè)碳原子線性、飽和羧酸相應(yīng)的?；?br> 在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基的人胰島素衍生物，該親脂取代基是含有8至12個(gè)碳原子的線性、飽和羧酸相應(yīng)的?；?。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基的人胰島素衍生物，該親脂取代基是含有10至16個(gè)碳原子的線性、飽和羧酸相應(yīng)的?；?。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基的人胰島素衍生物，該親脂取代基是一個(gè)含有最多10個(gè)(優(yōu)選最多5個(gè))氧乙烯單位的低聚氧乙烯基團(tuán)。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基的人胰島素衍生物，該親脂取代基是一個(gè)含有最多10個(gè)(優(yōu)選最多5個(gè))氧丙烯單位的低聚氧丙烯基團(tuán)。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中每個(gè)胰島素六聚體結(jié)合兩個(gè)Zn2+的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中每個(gè)胰島素六聚體結(jié)合三個(gè)Zn2+的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及其中每個(gè)胰島素六聚體結(jié)合四個(gè)Zn2+的人胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人胰島素衍生物在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及一種用于在需要這種治療的患者中治療糖尿病的藥物組合物，其包括治療有效量的本發(fā)明人胰島素衍生物和藥學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及一種用于在需要這種治療的患者中治療糖尿病的藥物組合物，其包括治療有效量的本發(fā)明人胰島素衍生物、與其混合的速效胰島素或胰島素類似物和藥學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及一種含有在生理PH值下可溶的本發(fā)明人胰島素衍生物的藥物組合物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及一種含有在約6.5至約8.5間的PH值下可溶的本發(fā)明胰島素衍生物的藥物組合物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明人胰島素衍生物的長效藥物組合物。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，它是一種含有約120nmol/ml至約1200nmol/ml，優(yōu)選約600nmol/ml本發(fā)明人胰島素衍生物的溶液。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及一種在需要這種治療的患者中治療糖尿病的方法，包括給予該患者治療有效量的本發(fā)明胰島素衍生物以及藥學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及一種在需要這種治療的患者中治療糖尿病的方法，包括給予該患者治療有效量的本發(fā)明胰島素衍生物、與其混合的速效胰島素或胰島素類似物以及藥學(xué)上可接受的載體。
其中沒有結(jié)合Zn2+離子的本發(fā)明人胰島素衍生物的優(yōu)選實(shí)例如下NεB29-十三酰基des(B30)人胰島素，NεB29-十四酰基des(B30)人胰島素，NεB29-癸酰基des(B30)人胰島素，NεB29-十二酰基des(B30)人胰島素，NεB29-十三酰基GlyA21des(B30)人胰島素，NεB29-十四?；鵊lyA21des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21des(B30)人胰島素，NεB29-十二酰基GlyA21des(B30)人胰島素，NεB29-十三酰基GlyA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十四酰基GlyA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十二?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十三?；鵄laA21des(B30)人胰島素，NεB29-十四?；鵄laA21des(B30)人胰島素，NεB29-癸酰基AlaA21des(B30)人胰島素，NεB29-十二?；鵄laA21des(B30)人胰島素，NεB29-十三酰基AlaA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十三?；鵊lnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十四?；鵊lnB3des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵊lnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十二?；鵊lnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十三酰基GlyA21人胰島素，NεB29-十四?；鵊lyA21人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21人胰島素，NεB29-十二酰基GlyA21人胰島素，NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3人胰島素，NεB29-十四?；鵊lyA21GlnB3人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3人胰島素，NεB29-十二?；鵊lyA21GlnB3人胰島素，NεB29-十三?；鵄laA21人胰島素，NεB29-十四?；鵄laA21人胰島素，NεB29-癸酰基AlaA21人胰島素，NεB29-十二酰基AlaA21人胰島素，NεB29-十三?；鵄laA21GlnB3人胰島素，NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3人胰島素，NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3人胰島素，NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3人胰島素，NεB29-十三?；鵊lnB3人胰島素，NεB29-十四?；鵊lnB3人胰島素，NεB29-癸?；鵊lnB3人胰島素，NεB29-十二?；鵊lnB3人胰島素，NεB29-十三?；鵊luB30人胰島素，NεB29-十四?；鵊luB30人胰島素，NεB29-癸?；鵊luB30人胰島素，NεB29-十二?；鵊luB30人胰島素，NεB29-十三?；鵊lyA21GluB30人胰島素，NεB29-十四?；鵊lyA21GluB30人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21GluB30人胰島素，NεB29-十二?；鵊lyA21GluB30人胰島素，NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十四?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十二?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十三?；鵄laA21GluB30人胰島素，NεB29-十四?；鵄laA21GluB30人胰島素，NεB29-癸酰基AlaA21GluB30人胰島素，NεB29-十二酰基AlaA21GluB30人胰島素，NεB29-十三?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十三?；鵊lnB3GluB30人胰島素，NεB29-十四酰基GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-癸?；鵊lnB3GluB30人胰島素，和NεB29-十二?；鵊lnB3GluB30人胰島素。
其中每個(gè)胰島素六聚體結(jié)合2個(gè)Zn2+的本發(fā)明人胰島素衍生物的優(yōu)選實(shí)例如下(NεB29-十三酰基des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四酰基des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵧es(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵧es(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸酰基GlyA21des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二酰基GlyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四酰基AlaA21des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二酰基AlaA21des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三酰基GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四酰基GlnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；艘葝u素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；艘葝u素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；艘葝u素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；艘葝u素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四酰基AlaA21GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三酰基GlnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lnB3人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三酰基GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四酰基GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊luB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二酰基GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二酰基GlyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21GlnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十三酰基GlnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+，和(NεB29-十二?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，2Zn2+。
其中每個(gè)胰島素六聚體結(jié)合3個(gè)Zn2+的本發(fā)明人胰島素衍生物的優(yōu)選實(shí)例如下(NεB29-十三?；鵧es(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；鵧es(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵧es(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵧es(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二酰基AlaA21des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；艘葝u素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；艘葝u素)6，3Zn2+，(NεB29-癸酰基人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；艘葝u素)6，3Zn2+，(NεB29-十三酰基GlyA21人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lyA21人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二酰基GlyA21人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基AlaA21人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二酰基AlaA21人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸酰基AlaA21GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二酰基AlaA21GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三酰基GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基GlnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lnB3人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵊luB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊luB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵊luB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸酰基GlyA21GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二酰基GlyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基AlaA21GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-十四酰基GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+，和(NεB29-十二酰基GlnB3GluB30人胰島素)6，3Zn2+。
其中每個(gè)胰島素六聚體結(jié)合4個(gè)Zn2+的本發(fā)明人胰島素衍生物的優(yōu)選實(shí)例如下(NεB29-十三?；鵧es(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四酰基des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵧es(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵧es(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三酰基GlyA21des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lyA21des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三酰基GlyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸酰基AlaA21des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二酰基AlaA21des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四酰基GlnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lnB3des(B30)人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三酰基人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；艘葝u素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；艘葝u素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；艘葝u素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二酰基GlyA21GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三酰基AlaA21人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸酰基AlaA21人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵄laA21GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸酰基AlaA21GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸酰基GlnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lnB3人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵊luB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵊luB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊luB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵊luB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四酰基GlyA21GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四酰基AlaA21GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四酰基AlaA21GlnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十二?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十三?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-十四?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，(NεB29-癸?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+，和(NεB29-十二?；鵊lnB3GluB30人胰島素)6，4Zn2+。
附圖的簡要說明參照附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明，其中

圖1表示質(zhì)粒pEA5.3.2的構(gòu)建；圖2表示質(zhì)粒pEA108的構(gòu)建；及圖3表示質(zhì)粒pEA113的構(gòu)建。
本發(fā)明的詳細(xì)描述術(shù)語本文所用氨基酸三字代碼和單字代碼如J.Biol.Chem.243，p.3558(1968)中所述。
在DNA序列中，A為腺嘌呤，C為胞嘧啶，G為鳥嘌呤，T為胸腺嘧啶。
使用了下列縮寫DMSO代表二甲基亞砜，DMF為二甲基甲酰胺，Boc為叔丁氧羰基，RP-HPLC為反相高效液相色譜，X-OSu為N-羥基琥珀酰亞胺酯，X為?；?，及TFA為三氟乙酸。親脂性胰島素衍生物的制備可按如下所述方法制備本發(fā)明的胰島素衍生物1.B30位氨基酸殘基為可被遺傳密碼編碼的氨基酸如蘇氨酸(人胰島素)或丙氨酸(豬胰島素)的胰島素衍生物。
1.1從人胰島素開始人胰島素用Boc試劑(如二碳酸二叔丁基酯)處理，形成(A1，B1)-二-Boc人胰島素，即，兩條鏈的N-末端均被Boc基團(tuán)保護(hù)的人胰島素。在任選的純化(如經(jīng)HPLC)后，讓產(chǎn)物與式X-OSu(其中X為待引入的?；?的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)在LysB29的ε氨基上引入?；?。最后一步，用TFA除去Boc基團(tuán)，并分離產(chǎn)物，NεB29-X人胰島素。
1.2從單鏈胰島素前體開始一種單鏈胰島素前體，在B1位有一延伸物(Ext)延伸，其與B1通過精氨酸殘基連接，且其中B30到A1間的橋?yàn)橐痪彼釟埢?，即通式Ext-Arg-B(1—30)-Arg-A(1—21)的化合物可用作起始物。用其中X為酰基的式X-OSu的N-羥基琥珀酰亞胺酯?；撈鹗嘉?，在LysB29的ε-氨基上和該前體的N-末端氨基上引入?；鵛。在水和適當(dāng)?shù)乃苄杂袡C(jī)溶劑如DMF、DMSO、或低級醇的混合物中，用胰蛋白酶處理式(NεB29-X)，X-Ext-Arg-B(1—30)-Arg-A(1—21)的?；绑w時(shí)，獲得式(NεB29-X)，ArgB31胰島素表示的中間體。用羧肽酶B處理該中間體生成目標(biāo)產(chǎn)物(NεB29-X)胰島素。
2.在B30位無氨基酸殘基的胰島素衍生物，即des(B30)胰島素。
2.1從人胰島素或豬胰島素開始在銨緩沖液中用羧肽酶A處理，人胰島素和豬胰島素均生成des(B30)胰島素。在任選的純化步驟后，des(B30)胰島素用Boc試劑(如二碳酸二叔丁基酯)處理，形成(A1，B1)-二-Boc-des(30)胰島素，即其中兩鏈N-末端均由Boc基團(tuán)保護(hù)的des(B30)胰島素。在任選的純化后(如經(jīng)HPLC)，讓產(chǎn)物與式X-Osu(其中X為待引入的?；?的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，在LysB29的ε-氨基上引入?；?。最后一步用TFA除去Boc基團(tuán)，分離產(chǎn)物(NεB29-X)des(B30)胰島素。
2.2從單鏈人胰島素前體開始一種單鏈人胰島素前體可用作起始物，其在B1位有一延伸物(Ext)延伸，延伸物與B1通過精氨酸殘基連結(jié)，從B30到A1間有一橋。優(yōu)選該橋?yàn)槭結(jié)n-Arg的肽，其中Y為除賴氨酸和精氨酸外的可編碼氨基酸，n為零或1—35的整數(shù)。當(dāng)n＞1時(shí)，這些Y可代表不同的氨基酸。B30到A1間橋的優(yōu)選實(shí)例是AlaAlaArg，SerArg，SerAspAspAlaArg和Arg(歐洲專利163529)。用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶如Achromobacter Lyticus蛋白酶處理通式Ext-Arg-B(1—30)-Yn-Arg-A(1—21)的這種前體，生成Ext-Arg-B(1—29)Thr-Yn-Arg-A(1—21)des(B30)胰島素。該中間體用通式X-OSu(其中X為?；?的N-羥基琥珀酰亞胺酯?；贚ysB29的ε-氨基上及A-鏈和B-鏈N-末端氨基上引入?；鵛，生成(NεB29-X)X-Ext-Arg-B(1—29)X-Thr-Yn-Arg-A(1—21)des(B30)胰島素。在水和適當(dāng)有機(jī)溶劑如DMF、DMSO或低級醇的混合物中用胰蛋白酶處理該中間體，得目標(biāo)衍生物，(NεB29-X)des(B30)人胰島素。
關(guān)于NεB29修飾的胰島素的資料。關(guān)于NεB29修飾的胰島素的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表1中。
胰島素衍生物相對人胰島素的親脂性K’rel是在LiChrosorbRP18(5μM，250×4mm)HPLC柱上測定的，用A)含10％乙腈的pH7.3的0.1M磷酸鈉緩沖液，和B)50％乙腈水溶液的混合物作為洗脫液于40℃等度洗脫。以214nm處洗脫液的紫外吸收度監(jiān)視洗脫過程。通過注入0.1mM硝酸鈉測定空時(shí)間t0。通過A和B溶液間的比例變化將人胰島素的保留時(shí)間tλ調(diào)至至少2t0。Krel’＝(t衍生物-t0)/(tλ—t0)。
在兔中研究降血糖效果的長效程度。在一天延緩試驗(yàn)中，給六只兔每只皮下注射每種胰島素衍生物12nmol進(jìn)行測試。在注射前和注射后1，2，4和6天采取血樣以進(jìn)行血糖分析。測得的葡萄糖值以原始值的百分比表示。長效指數(shù)從血糖值計(jì)算而得，是標(biāo)度化的長效指數(shù)，見Markussen等Protein Engineering 1(1987)205-213，P211。將所述算式標(biāo)度化使超長效牛胰島素的值為100而Actrapid胰島素(Novo Nordisk A/S，2800 Bagsvaerd，丹麥)的值為0。
表1中所列胰島素衍生物以含3Zn2+/胰島素六聚體的溶液給藥，除非特別指明不合Zn。
對于非常長效的類似物，該兔模型是不夠的，因?yàn)檠菑脑贾迪陆档锰贌o法估測長效指數(shù)。這種類似物的長效作用最好用在豬中的消除速率表征。T50％是用γ-計(jì)數(shù)器在外部測得50％的A14Tyr(125I)類似物從注射位點(diǎn)消失時(shí)的時(shí)間(Man.InM.serrano—Rios和P.J.Lefebre(編)Diabetes 1985；Proceedings of the 12thCongress of the Internatianal Diabetes Federation，Madrid，Spain，1985(Excerpta Medica，Amsterdam，(1986)891—96)中的Ribel，U等，The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption一文)。
表2中給出了一系列特別長效胰島素類似物的T50％值。這些類似物均以含有3Zn2+/胰島素六聚體的溶液給藥。
表1<
p><p>表2
溶解性表1中所提及的所有NεB29修飾的胰島素(每胰島素六聚體含3個(gè)Zn2+)在中性(pH7.5)水性藥物制劑中的溶解度均大于600nmol/ml，所述藥物制劑中還含有0.3％苯酚作為防腐劑和1.6％甘油以達(dá)到等滲。600mmol/ml是臨床常用的100IU/ml組合物的人胰島素濃度。
ε-B29氨基可以是酰胺鍵、磺酰胺鍵、脲、硫脲、或氨基甲酸酯的一部分。ε-B29氨基所帶的親脂取代基還可以是烷基。
含有本發(fā)明人胰島素衍生物的藥物組合物可經(jīng)非胃腸道給予需要這種治療的患者?？捎靡蛔⑸淦?任選為筆式注射器)經(jīng)皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行非胃腸道給藥?；蛘撸捎靡还嘧⒈眠M(jìn)行非胃腸道給藥。還有一種選擇是用可為粉末或液態(tài)的組合物以對鼻噴霧形式投送人胰島素衍生物。
用藥品工業(yè)中，常規(guī)技術(shù)制備本發(fā)明的可注射人胰島素組合物，包括溶解和混合適當(dāng)成分形成目標(biāo)終產(chǎn)物。
例如，一種操作方法是將人胰島素衍生物溶于稍少于所制備組合物終體積的水中，加入所需的等滲劑、防腐劑和緩沖液，必要時(shí)用酸如鹽酸或堿如氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)溶液的PH值。最后用水調(diào)節(jié)溶液的體積達(dá)到各成份的目的濃度。
等滲劑的例子有氯化鈉、甘露糖醇和甘油。
防腐劑的例子有苯酚、間甲苯酚、對羥基苯甲酸甲酯和苯甲醇。
適當(dāng)緩沖劑的例子有醋酸鈉和磷酸鈉。
本發(fā)明胰島素衍生物的經(jīng)鼻給藥組合物例如可如歐洲專利272097(Novo Nordisk A/S)所述進(jìn)行制備。
本發(fā)明的胰島素組合物可用于治療糖尿病。對任何患者的最佳劑量水平將隨著許多因素變化，包括所用具體人胰島素衍生物的效力，患者的年齡、體重、體力活動(dòng)、和飲食，還有聯(lián)合用藥，及糖尿病的嚴(yán)重性。最好由本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員按已知胰島素組合物的相似方法確定對每個(gè)具體患者的本發(fā)明人胰島素衍生物的日劑量。
方便時(shí)本發(fā)明的人胰島素衍生物可與其他類型胰島素如較快發(fā)揮作用的人胰島素或豬胰島素或胰島素類似物混合使用。歐洲專利申請EP 214826(Novo Nordisk A/S)、EP 375437(Novo NordiskA/S)和EP 383472(Eli Lilly&amp;Co.)中描述了這種胰島素的實(shí)例。
下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但無意限制保護(hù)范圍。在以上的描述和以下的實(shí)施例中公開的特征可單獨(dú)或結(jié)合起來作為從不同角度理解本發(fā)明的材料。
實(shí)施例質(zhì)粒和DNA材料所有表達(dá)質(zhì)粒均為cPOT型。歐洲專利申請171142中描述了這種質(zhì)粒，其特征是含有用于質(zhì)粒篩選和穩(wěn)定化的pombe裂殖酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(POT)。含POT基因的質(zhì)?？蓮谋２氐拇竽c桿菌菌株(ATCC 39685)中得到。這種質(zhì)粒還含有釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動(dòng)子和終止子(PTPI和TTPI)。除EcoRI—XbaI限制位點(diǎn)所限定的區(qū)域(包括信號/前導(dǎo)區(qū)/產(chǎn)物的編碼區(qū))外，它們與pMT742一致(Egel—Mitani，M.等，Gene 73(1988)113—120)(見圖1)。
合成的DNA片段是在自動(dòng)DNA合成儀(Applied Biosystemsmodel 380A)上用氨基亞磷酸酯化學(xué)和市售試劑進(jìn)行合成的(Beaucage，S.L.和Caruthers，M.H.，Tetrahedron Letters 22(1981)1859—1869)。
使用的所有其他方法和材料都是本領(lǐng)域中公知的(見，例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cod Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，(1989))。
分析所制備胰島素的分子量用MS(質(zhì)譜)法測得，可以用Bio—Ion20儀(Bio—Ion Nordic AB，Uppsala，瑞典)進(jìn)行PDMS(等離子體吸收質(zhì)譜)或用API III生物分子量分析儀(Perkin—Elmer SciexInstruments，Thornhill，加拿大)進(jìn)行ESMS(電子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例1用LaC 212 spx3信號/前導(dǎo)區(qū)從酵母菌株yEA002合成AlaA21AspB3人胰島素前體合成了下列寡核苷酸#985′-TGGCTAAGAGATTCGTTGACCAACACTTGTGCGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3′ (AspB3)(SEQ ID NO3)#128 5′-CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAAGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCGTCAGACTTTGG-3′ (AlaA21) (SEQ ID NO4)#126 5′-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTG-3′ (AspB3)(SEQ ID NO5)#165′-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3′(SEQ ID NO6)
用基因擴(kuò)增(Gene Amp)PCR試劑盒(Perkin Elmer，761 MainAvewalk，CT 06859，USA)按制造商的說明進(jìn)行下列聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。每種PCR混合物均用100μl礦物油(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)覆蓋。2.5μl寡核苷酸#98(2.5pmol)2.5μl寡核苷酸#128(2.5pmol)10μl×PCR緩沖液16μl dNTP混合物0.5μl Taq酶58.5μl水進(jìn)行一循環(huán)94℃ 45秒，49℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘。
然后加入5μl寡核苷酸#16和#126進(jìn)行15個(gè)循環(huán)94℃ 45秒，45℃1分鐘，72℃，1.5分鐘。將PCR混合物上樣于2.5％瓊脂糖凝膠上，按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行電泳(Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。將形成的DNA片段從瓊脂糖凝膠上切下，用基因純化(Gene Clean)試劑盒(Bio 101Inc.，PO BOX 2284，La Jolla，CA 920238，USA)按制造商的說明進(jìn)行分離。將純化的PCR DNA片段溶于10μl水和限制性內(nèi)切酶緩沖液中，并按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用限制性內(nèi)切酶NcoI和XbaI酶切，在2.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并如上所述用基因純化試劑盒純化。
質(zhì)粒pAK 188的組成是在載體(噬菌粒)pBLUESCRIPT IISK(+/-)(Stratagene，USA)的EcoRI/XbaI片段中插入一412bp的由EcoRI/NcoI片段組成的DNA序列和其后的NcoI/XbaI合成片段，其中EcoRI/NcoI片段編碼合成的酵母信號/前導(dǎo)區(qū)基因LaC212 spx3(如WO 89/02463的實(shí)施例3中所述)，NcoI/XbaI合成片段編碼胰島素前體MI5，該前體中有一連接B29和Al氨基酸殘基的Ser Asp Asp Ala Lys橋(見SEQ ID NO.14，15和16)。質(zhì)粒pAK 188示于圖1中。
也用限制性內(nèi)切酶NcoI和XbaI酶切質(zhì)粒pAK188，并分離3139bp的載體片段。用T4 DNA連接酶和標(biāo)準(zhǔn)條件(Sambrook等，Moleculur Cloning，Cold Spring Harbour Laboratory Press，1989)將這兩個(gè)DNA片段連接在一起。用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌株(R-，M+)，然后用氨芐青霉素抗性篩選。用標(biāo)準(zhǔn)的DNA小量制備技術(shù)(Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)從形成的大腸桿菌菌落分離質(zhì)粒，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(即EcoRI，XbaI，NcoI和HpaI)檢驗(yàn)。DNA測序分析(測序酶，U.S.Biochemical Corp.)表明選出的質(zhì)粒含有AlaA21，AspB3人胰島素前體的正確序列，并稱為pEA5.3。
質(zhì)粒pKFN1627是一種大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體，除單一XbaI位點(diǎn)上游的短DNA序列外與歐洲專利375718中所述質(zhì)粒pKFN1003相同。在pKFN1003中，這一序列是編碼與酵母交配因子α-1信號-前導(dǎo)序列符合讀框融合的合成抑蛋白酶肽基因的1278bp的片段。在pKFN1627中，相應(yīng)的184bp序列編碼與交配因子α-1序列符合讀框融合的胰島素前體MI5(GluB1，GluB28)(即B(1—29，GluB1，GluB28)-Ser AsPAspAlaLys-A(1—21))(見SEQID NO.17、18和19)。載體pKFN1627示于圖1中。
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切pEA5.3并分離形成的412bp的DNA片段。酶母表達(dá)載體pKFN 1627用限制性內(nèi)切酶NcoI和XbaI再用NcoI和EcoRI酶切，從第一次消化后分離9273bp的DNA片段，第二次消化后分離1644bp的DNA片段。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將此412bp EcoRI/XbaI片段與其他兩個(gè)片段(即9273bpNcoI/XbaI片段和1644bp NcoI/EcoRI片段)連接。
如上所述用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從形成的大腸桿菌中分離質(zhì)粒，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(即EcoRI，XbaI，NcoI，HpaI)檢驗(yàn)。DNA序列分析(按制造商的說明，使用測序酶試劑盒，U.S.Biochemical)表明選出的質(zhì)粒含有AlaA21AspB3人胰島素前體DNA的正確序列，并被插入在編碼LaC212 spx 3信號/前導(dǎo)DNA的DNA之后。該質(zhì)粒命名為pEA 5.3.2，示于圖1中。編碼LaC212spx3信號/前導(dǎo)區(qū)/AlaA21AspB3人胰島素前體復(fù)合體的DNA序列和其氨基酸序列為SEQ ID NO.20、21和22。如歐洲專利申請214826所述將質(zhì)粒pEA5.3.2轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株MT663中，形成的菌株稱為yEA002。
實(shí)施例2用LaC212 spx3信號/前導(dǎo)區(qū)從酵母菌株yEA005合成AlaA21ThrB3人胰島素前體合成了下列寡核苷酸#101 5′-TGGCTAAGAGATTCGTTACTCAACACTTGTGCGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3′ (ThrB3) (SEQ ID NO7)#128 5′-CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAAGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCGTCAGACTTTGG-3′ (AlaA21) (SEQ ID NO4)#15 5′-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTA-3′ (ThrB3) (SEQ IDNO8)#16 5′-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3′(SEQ ID NO6)按實(shí)施例1中描述的構(gòu)建編碼AlaA21AspB3人胰島素前體DNA的相同方法，構(gòu)建了編碼AlaA21ThrB3人胰島素前體的DNA。編碼LaC212 spx3信號/前導(dǎo)區(qū)/AlaA21ThrB3人胰島素前體復(fù)合物的DNA序列和其氨基酸序列為SEQ ID NO.23、24和25。已顯示質(zhì)粒pEA8.1.1含有目的序列，如實(shí)施例1中所述轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株MT663中，形成的菌株稱為yEA005。
實(shí)施例3用LaC212 spx3信號/前導(dǎo)區(qū)從酵母菌株yEA007合成GlyA21AspB3人胰島素前體合成了下列寡核苷酸#98 5′-TGGCTAAGAGATTCGTTGACCAACACTTGTGCGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3′ (AspB3) (SEQ ID NO3)#1275′-CTGCGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAAGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCGTCAGACTTTGG-3′ (GlyA21) (SEQ ID NO9)#1265′-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTG-3′ (AspB3) (SEQ IDNO5)#16 5′-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3′ (SEQ ID NO6)按實(shí)施例1中描述的構(gòu)建編碼AlaA21AspB3人胰島素前體DNA的相同方法，構(gòu)建了編碼GlyA21AspB3人胰島素前體的DNA。編碼LaC212 spx3信號/前導(dǎo)區(qū)/GlyA21AspB3人胰島素前體復(fù)合物的DNA序列和其氨基酸序列為SEQ ID NO.26、27和28。已顯示質(zhì)粒pEA1.5.6含有目的序列，如實(shí)施例1中所述轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株MT663中，形成的菌株稱為yEA007。
實(shí)施例4用LaC212 spx3信號/前導(dǎo)區(qū)從酵母菌株yEA007合成GlyA21ThrB3人胰島素前體合成了下列寡核苷酸#101 5′-TGGCTAAGAGATTCGTTACTCAACACTTGTGCGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3′ (ThrB3) (SEQ ID NO7)#127 5′-CTGCGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAAGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCGTCAGACTTTGG-3′ (GlyA21) (SEQ ID NO9)#15 5′-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTA-3′ (ThrB3) (SEQ IDNO8)#16 5′-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3′ (SEQ ID NO6)按實(shí)施例1中描述的構(gòu)建編碼AlaA21AspB3人胰島素前體的DNA的相同方法，構(gòu)建了編碼GlyA21ThrB3人胰島素前體的DNA。編碼LaC212 spx3信號/前導(dǎo)區(qū)/GlyA21ThrB3人胰島素前體復(fù)合物的DNA序列和其氨基酸序列為SEQ ID NO.29、30和31。已顯示質(zhì)粒pEA4.4.11含有目的序列，如實(shí)施例1中所述轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株MT663中，形成的菌株稱為yEA006。
實(shí)施例5用α因子前導(dǎo)區(qū)從酵母菌株yEA113合成具有N-末端延伸物(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg)的ArgB-1ArgB31單鏈人胰島素前體A)合成了下列寡核苷酸#220 5′-ACGTACGTTCTAGAGCCTGCGGGCTGC-3′(SEQ ID NO10)#263 5′-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACTAGAGGTATCGTTGAA-3′ (SEQ ID NO11)#307 5′-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTAGATTCGTTAACCAACAC-3′ (SEQ ID NO12)用Gene Amp PCR試劑盒(Perkin Elmer，761 Main Avewalk，CT 06859，USA)按制造商的說明進(jìn)行下列聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。每種PCR混合物用100μl礦物油(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)覆蓋。質(zhì)粒pAK220(與pAK 188相同)的組成是在載體(噬菌粒)pBLUESCRIPT IIsk(+/-)(Stratagene，USA)中插入編碼合成的酵母信號/前導(dǎo)區(qū)LaC 212 spx3的412bp DNA序列(如WO 89/02463的實(shí)施例3中所述)和其后的胰島素前體MI5序列(見SEQ ID NO.14、15和16)。5μl寡核苷酸#220(100pmol)5μl寡核苷酸#263(100pmol)10μl 10X PCR緩沖液16μl dNTP混合物0.5μl Taq酶0.5μl pAK220質(zhì)粒(與pAK 188相同)作為模板(0.2μg DNA)63μl水共進(jìn)行16個(gè)循環(huán)，每個(gè)包括95℃ 1分鐘；40℃ 1分鐘；和72℃2分鐘。然后將PCR混合物上樣于2％瓊脂糖凝胺上按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行電泳。從凝膠上切下形成的片段并用基因純化試劑盒(Bio 101Inc.，PO BOX 2284，La Jolla，CA 92038，USA)按廠商說明進(jìn)行分離。將純化的PCR DNA片段溶于10μl水和限制性內(nèi)切酶緩沖液中，并按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用限制性酶HindIII和XbaI酶切。用所述基因純化試劑盒純化HindIII/XbaI DNA片段。
質(zhì)粒pAK406的組成是在載體cPOT中插入含來自pMT636(WO 90/10075中有述)的EcoRI/HindIII片段的520bp DNA序列(其編碼酵母α因子前導(dǎo)區(qū)和部分胰島素前體)和與之連接的來自pAK188的HindIII/XbaI片段(其編碼胰島素前體MI5的其余部分)(見SEQ ID NO.32、33和34)。載體pAK406示于圖2中。
質(zhì)粒pAK 233的組成是載體cPOT中插入編碼合成的酵母信號/前導(dǎo)區(qū)LaC212 spx3的412bp DNA序列(如WO 89/02463實(shí)施例3中所述)和其后的胰島素前體B(1—29)-Glu Lys Arg-A(1—21)(A21—Gly)的基因(見SEQ ID NO.35，36和37)。質(zhì)粒pAk233示于圖2中。
用限制性內(nèi)切酶NcoI和XbaI酶切質(zhì)粒pAK233并分離9273bp的載體片段。用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII酶切質(zhì)粒pAK406并分離2012bp的載體片段。將這兩個(gè)DNA片段用T4DNA連接酶和標(biāo)準(zhǔn)條件與HindIII/XbaI PCR片段連接在一起。然后連接混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌株(R-，M+)中，再用氨芐青霉素抗性篩選。用標(biāo)準(zhǔn)的DNA小量制備技術(shù)從形成的大腸桿菌菌落分離質(zhì)粒，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(即EcoRI，XbaI，NcoI，HindIII)檢驗(yàn)。DNA測序分析表明選出的質(zhì)粒含有ArgB31單鏈人胰島素前體DNA的正確序列，并被插入在編碼釀酒酵母α因子的DNA之后。該質(zhì)粒命名為pEA108并示于圖2中。編碼α因子前導(dǎo)區(qū)/ArgB31單鏈人胰島素前體復(fù)合體的DNA序列和其氨基酸序列為SEQ ID NO.38，39和40。如實(shí)施例1所述將質(zhì)粒pEA 108轉(zhuǎn)化至釀酒酵母MT663中，生成的菌株稱為yEA 108。B)用Gene Amp PCR試劑盒(Perkin Elmer，761 Main Avewalk，CT 06859，USA)按制造商的說明進(jìn)行下列聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。每種PCR混合物用100μl礦物油(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)覆蓋。5μl寡核苷酸#220(100pmol)5μl寡核苷酸#307(100pmol)10μl 10X PCR緩沖液16μl dNTP混合物0.5μl Taq酶0.2μl pAK108質(zhì)粒作為模板(0.1μg DNA)63μl水共進(jìn)行16個(gè)循環(huán)，每個(gè)包括95℃ 1分鐘；40℃ 1分鐘；和72℃2分鐘。然后將PCR混合物上樣于2％瓊脂糖凝膠上按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行電泳。從凝膠上切下形成的片段并用基因純化試劑盒(Bio 101Inc.，PO BOX 2284，La Jolla，CA 92038，USA)按廠商說明進(jìn)行分離。將純化的PCR DNA片段溶于10μl水和限制性內(nèi)切酶緩沖液中，并按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用限制性內(nèi)切NcoI和XbaI酶切。用所述基因純化試劑盒純化NcoI/XbaI DNA片段。
質(zhì)粒pAK401的組成是在載體(噬菌粒)pBLUESCRIPT IIsk(+/-)(Stratagene，USA)中插入編碼α因子前導(dǎo)區(qū)的由來自pMT636(如WO 90/10075中所述)(通過定點(diǎn)誘變在α-前導(dǎo)區(qū)的3’末端引入NcoI位點(diǎn)構(gòu)建)的EcoRI/NcoI片段組成的523bp DNA序列和其后的編碼胰島素前體MI5的來自pAK188的NcoI/XbaI片段。質(zhì)粒pAK401示于圖3中。
用限制性內(nèi)切酶NcoI和XbaI酶切質(zhì)粒pAK401，分離3254bpp的載體片段并與NcoI/XbaI PCR片段連接。連接混合物隨后轉(zhuǎn)化在感受態(tài)的大腸桿菌株中，用標(biāo)準(zhǔn)DNA小量制備技術(shù)從生成的大腸桿菌菌落分離質(zhì)粒并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(即EcoRI，XbaI，NcoI)檢驗(yàn)。選出的質(zhì)粒(稱為p113A，如圖3中所示)用EcoRI和XbaI酶切，分離535bp的片段。
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NcoI酶切質(zhì)粒pAK233并分離9273bp和1644bp的片段。將這兩個(gè)DNA片段用T4 DNA連接酶和標(biāo)準(zhǔn)條件與來自p113A的EcoRI/XbaI片段連接在一起。然后連接混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌株(R-，M+)中，再用氨芐青霉素抗性篩選。用標(biāo)準(zhǔn)的DNA小量制備技術(shù)從形成的大腸桿菌菌落分離質(zhì)粒，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(即EcoRI，XbaI，NcoI，HindIII)檢驗(yàn)。DNA測序分析表明選出的質(zhì)粒含有帶N-末端延伸物Glu GluAla Glu Ala Glu Ala Arg的ArgB-1ArgB31單鏈人胰島素前體DNA的正確序列，并被插入在編碼釀酒酵母α因子DNA的DNA之后。該質(zhì)粒命名為pEA113并示于圖3中。編碼α因子前導(dǎo)區(qū)/帶N-末端延伸物GluGluAlaGluAlaGluAlaArg的ArgB-1ArgB31單鏈人胰島素前體的DNA序列和其氨基酸序列為SEQ ID NO.44，45和46。如實(shí)施例1所述將質(zhì)粒pEA 113轉(zhuǎn)化至釀酒酵母MT663中，生成的菌株為yEA 113。
實(shí)施例6用α因子前導(dǎo)區(qū)從酵母菌株yEA 136合成帶在N-末端延伸物(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg)的ArgB-1ArgB31單鏈人胰島素前體合成了下列寡核苷酸#3895′-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCGAAGCTGAAAGATTCGTTAACCAACAC-3′ (SEQ ID NO13)用Gene Amp PCR試劑盒進(jìn)行下列PCR5μl寡核苷酸#220(100pmol)5μl寡核苷酸#389(100pmol)10μl 10X PCR緩沖液16μl dNTP混合物0.5μl Taq酶2μl pEA113質(zhì)粒作為模板(0.5μg DNA)63μl水。
共進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，每個(gè)包括95℃ 1分鐘；37℃ l分鐘；72℃ 2分鐘。
按實(shí)施例5中所述構(gòu)建編碼α因子前導(dǎo)區(qū)/帶N-末端延伸物(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg)的ArgB-1ArgB31單鏈人胰島素前體的DNA的相同方法，構(gòu)建了編碼α因子引導(dǎo)物/帶N-末端延伸物(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg)的ArgB-1ArgB31單鏈人胰島素前體的DNA。該質(zhì)粒命名為pEA 136。編碼α因子前導(dǎo)區(qū)/帶N-末端延伸物(Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg)的ArgB-1ArgB31單鏈人胰島素前體的DNA序列和其氨基酸序列見SEQ ID NO.47，48和49。如實(shí)施例1中所述將質(zhì)粒pEA 136轉(zhuǎn)化至釀酒酵母株MT663中，生成的菌株稱為yEA 136。
實(shí)施例7(A1，B1)-二-BOC人胰島素的合成將5g不含Zn的人胰島素溶于41.3ml DMSO中。向此溶液中加入3.090ml乙酸。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，加入溶于5.650ml DMSO中的565mg二碳酸二叔丁酯引發(fā)反應(yīng)。讓反應(yīng)進(jìn)行5.5小時(shí)，加入250μl乙醇胺終止反應(yīng)。加入1500ml丙酮沉淀產(chǎn)物。離心分離沉淀并真空干燥。獲得6.85g粗產(chǎn)物。
按如下進(jìn)行反相HPLC純化(A1，B1)-二-BOC胰島素將粗產(chǎn)物溶于100ml 25％乙醇/水中，用HCl調(diào)PH至3.0，上樣于用十八烷基二甲基甲硅烷基取代的二氧化硅顆粒(平均粒徑15μm，孔徑100A)裝填的用洗脫緩沖液平衡的柱孔(直徑5cm，高30cm)。用乙醇和1mMHCl水溶、0.3MKCl的混合物以2升/小時(shí)流速進(jìn)行洗脫。乙醇含量從30％升至45％時(shí)胰島素被洗脫。將適當(dāng)?shù)牧鞣菹♂屩?0％乙醇，在PH4.8沉淀。離心分離沉淀物，真空干燥。這樣就得到純度為94.5％的1.701g(A1，B1)-二Boc人胰島素。
實(shí)施例8(NεB29-苯甲酰人胰島素)6，3Zn2+的合成將400mg(A1，B1)-二Boc人胰島素溶于2ml DMSO中。向此溶液中加入748μl N-甲基嗎啉和DMSO的混合物(1∶9，V/V)。反應(yīng)在15℃下進(jìn)行，加入溶于132μl DMF中的14.6mg苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯開始反應(yīng)。2小時(shí)后加入100ml丙酮終止反應(yīng)。離心分離沉淀物并真空干燥。收集到343mg物質(zhì)。
加入TFA消除Boc保護(hù)基團(tuán)。將溶解物保溫30分鐘并加入50ml丙酮進(jìn)行沉淀。離心分離沉淀并真空干燥。
如實(shí)施例7所述經(jīng)反相HPLC純化NεB29苯甲酰人胰島素，得230mg。在含6mM Zn2+和50mM檸檬酸的15％乙醇水溶液(PH5.5)中重結(jié)晶，得標(biāo)題化合物的晶體，離心分離并真空干燥，得190mg。分子量MS測定值5911，理論值5911。
實(shí)施例9(NεB29-石膽酰人胰島素)6，3Zn2+的合成將400mg(A1，B1)-二Boc人胰島素溶于2ml DMSO中。向此溶液中加入748μl N-甲基嗎啉和DMSO的混合物(1∶9，V/V)。反應(yīng)在15℃下進(jìn)行，加入溶于300μl DMF中的31.94mg石膽酸N-羥基琥珀酰亞胺酯開始反應(yīng)。2小時(shí)后加入100ml丙酮終止反應(yīng)。離心分離沉淀物并真空干燥。收集到331mg物質(zhì)。
加入4ml TFA消除Boc保護(hù)基團(tuán)。將溶解物保溫30分鐘并加入50ml丙酮進(jìn)行沉淀。離心分離沉淀并真空干燥。得376mg。
如實(shí)施例7所述經(jīng)反相HPLC純化B29-石膽酰胰島素，最后得67mg，純度為94％。在含6mM Zn2+和50mM檸檬酸的15％乙醇水溶液(PH5.5)中重結(jié)晶，得標(biāo)題化合物的晶體，離心分離并真空干燥，得49mg。分子量MS測定值6160，理論值6166。
實(shí)施例10(NεB29-癸酰人胰島素)6，3Zn2+的合成將400mg(A1，B1)-二Boc人胰島素溶于2ml DMSO中。向此溶液中加入748μl N-甲基嗎啉和DMSO的混合物(1∶9，V/V)。反應(yīng)在15℃下進(jìn)行，加入溶于132μl DMF中的18.0mg癸酸N-羥基琥珀酰亞胺酯開始反應(yīng)。60分鐘后加入100ml丙酮終止反應(yīng)。離心分離沉淀物并真空干燥。收集到420mg物質(zhì)。
加入4ml TFA消除Boc保護(hù)基團(tuán)。將溶解物保溫30分鐘并加入50ml丙酮進(jìn)行沉淀。離心分離沉淀并真空干燥。得420mg粗產(chǎn)物。
如實(shí)施例7所述經(jīng)反相HPLC純化粗產(chǎn)物，最后得254mg標(biāo)題化合物，純度為96.1％。在含6mM Zn2+和50mM檸檬酸的15％乙醇水溶液(PH5.5)中重結(jié)晶，得標(biāo)題化合物的晶體，離心分離并真空干燥，得217mg。分子量MS測定值5962，理論值5962。
實(shí)施例11des(B30)人胰島素的合成如Markussen所述合成des(30)人胰島素(Methods in diabetesresearch，Vol.I Laboratory methods，part B，404—410.EdJ.Larn-er和S.Phol，John Wiley&amp;Sons，1984)。將5g人胰島素溶于500ml水中，加入0.5M硫酸保持溶液的PH值為2.6。然后加入100g硫酸銨鹽析胰島素，離心分離沉淀。將沉淀溶于800ml 0.1M碳酸氫鈉中，用1M氨調(diào)PH至8.4。
將5mg牛羧肽酶A懸浮在25ml水中，離心分離。將結(jié)晶物懸浮在25ml水中，加入1M氨水直到最終PH10時(shí)得到一清澈溶液。向此羧肽酶溶液加至胰島素溶液中，反應(yīng)進(jìn)行24小時(shí)。反應(yīng)過程中加入幾滴甲苯作為防腐劑。
24小時(shí)后，攪拌下向溶液中連續(xù)加入80g氯化鈉使des(B30)人胰島素結(jié)晶。然后調(diào)pH至8.3，輕輕攪拌下進(jìn)行結(jié)晶20小時(shí)。在1.2μm濾膜上分離結(jié)晶，用250ml冰冷的異丙醇洗滌，最后真空干燥。
實(shí)施例12(A1，B1)-二Boc des(B30)人胰島素的合成用des(B30)豬胰島素作為起始物，按實(shí)施例7中所述相似方法合成了標(biāo)題化合物。用丙酮沉淀粗產(chǎn)物并真空干燥。如實(shí)施例7中所述用反相HPLC純化(A1，B1)-二Boc des(B30)人胰島素。
實(shí)施例13NεB29-癸酰des(B30)人胰島素按照實(shí)施例10中描述的步驟，用400mg(A1，B1)-二Boc des(B30)人胰島素作為起始物合成NεB29-癸?；鵧es(B30)人胰島素。用丙酮沉淀粗產(chǎn)物，真空干燥并用TFA脫保護(hù)。用丙酮沉淀產(chǎn)物并真空干燥。如實(shí)施例10中所述經(jīng)反相HPLC純化NεB29-癸酰des(B30)人胰島素。分子量MS測定值5856，理論值5861。
實(shí)施例14NεB29-十二酰des(B30)人胰島素的合成a.A.Lyticus蛋白酶的固定化將13mg A.Lyticus蛋白酶溶于5ml 0.2M NaHCO3緩沖液(pH9.4)中，與用相同緩沖液洗過的沉降MiniLeakMedium凝膠混合(MiniLeak是從哥本哈根KemEnTec得到的二乙烯基砜活化的Sepharose CL6B)。輕輕攪拌下保持凝膠于室溫下懸浮24小時(shí)。然后過濾分離凝膠，用水洗，再懸浮在20ml pH9.4的1M乙醇胺緩沖液中，于室溫下保持懸浮24小時(shí)。最后，用水、再用0.1M乙酸沖洗凝酸，并于4℃保存。濾液中的酶活性為原始溶液的13％，說明固定化反應(yīng)中產(chǎn)率為約87％。
b.豬胰蛋白酶的固定化利用上述A.Lyticus固定化的條件，將豬胰蛋白酶固定在MiniLeakLow上，達(dá)每ml凝膠1mg的取代程度。
c.用固定化A.Lyticus蛋白酶合成Glu(GluAla)3Arg-B(1—29)，Thr Arg-A(1—21)胰島素向溶于20ml pH9.0的0.1M NaHCO3緩沖液中的200mg Glu(GluAla)3Arg-B(1—29)-ThrArg-A(1—21)單鏈人胰島素前體中加入4ml帶固定化A.Lyticus蛋白酶的凝膠。凝膠在反應(yīng)混合物中室溫保持6小時(shí)后完成水解，生成Glu(GluAla)3Arg-B(1—29)，ThrArg-A(1—21)人胰島素(反應(yīng)后進(jìn)行反相HPLC)。水解后過濾除去凝膠。向?yàn)V液中加入5ml乙醇和15ml 1M.ZnCl2，用HCl調(diào)pH至5.0。在4℃并輕輕攪拌下放置過夜使產(chǎn)物沉淀完全。離心分離產(chǎn)物。用1ml冰冷的20％乙醇洗滌一次，真空干燥得190mg。
d.用十二烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯合成NαA1，NαB1，NεB29-三(十二酰)Glu(GluAla)3Arg-B(1—29)，Thr-Arg-A(1—21)人胰島素將190mg(30μmol)Glu(GluAla)3Arg-B(1—29)，ThrArg-A(1—21)胰島素溶于1ml DMSO和1.05ml N，N-二異丙基乙基胺的0.572M DMF溶液中。將此溶液冷卻至15℃，加入溶于0.6mlDMSO中的36mg(120μmol)十二烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。在24小時(shí)內(nèi)完成反應(yīng)。沒有分離該親脂性標(biāo)題化合物。
e.NεB29一十二酰des(B30)胰島素的合成將來自上步d的約2.65ml DMSO/DMF/N，N-二異丙基乙基胺中的產(chǎn)物用含20％乙醇的10.6ml 50mM甘氨酸緩沖液稀釋，并用NaOH調(diào)節(jié)pH至10。室溫放置1小時(shí)后加入每毫升凝膠含1mg固定化胰蛋白酶的1ml MiniLeak凝膠。室溫下輕輕攪拌反應(yīng)混合物48小時(shí)。為了分離目標(biāo)產(chǎn)物，將反應(yīng)混合物上樣于一反相HPLC柱上，該柱直徑5cm，高30cm，用十八烷基二甲基甲硅烷基取代的二氧化硅顆粒(平均粒徑15μm，孔徑100A)裝填。使用含40％遞增到44％(V/V)的乙醇的20mM Tris/HCl緩沖液(pH7.7)以2000ml/h的速度進(jìn)行洗脫。在約43—44％乙醇時(shí)洗脫的主峰中含標(biāo)題化合物。合并含主峰的流份，加入水使乙醇濃度降至20％(V/V)，調(diào)節(jié)pH值至5.5。將該溶液于-20℃放置過夜，產(chǎn)物沉淀。-8℃離心分離沉淀并真空干燥。得到90mg標(biāo)題化合物。分子量MS測定值5892，理論值5890。
實(shí)施例15NεB29-(N-肉豆蔻酰-α-谷氨酰)人胰島素的合成將500mg(A1，B1)-二Boc人胰島素溶于2.5mlDMSO中，加入428μl用2.5mlDMSO/DMF 1/1(V/V)稀釋的乙基二異丙基胺。將溫度調(diào)至15℃，加入溶于2.5ml DNSO/DMF 1/1(V/V)中的85mg N-肉豆寇酰-Glu(OBut)N-羥基琥珀酰亞胺酯。30分鐘后將反應(yīng)混合物傾入60ml水中，調(diào)節(jié)pH至5，離心分離沉淀，并真空干燥。將干燥的反應(yīng)混合物溶于25ml TFA中，將溶液于室溫放置30分鐘。真空蒸發(fā)除去TFA。將明膠狀殘余物溶于60ml水中并用濃氨水調(diào)pH至11.2。用6N HCl調(diào)此溶液的pH為8.5，使標(biāo)題化合物沉淀。離心分離產(chǎn)物，用10ml水洗一次，真空干燥，得356mg，HPLC純度為94％。
該實(shí)例的產(chǎn)物是這樣的人胰島素，其中LysB29的ε-氨基上有下式取代基CH3(CH2)12CONHCH(CH2CH2COOH)CO-。分子量MS測定值6146，理論值6148。
實(shí)施例16NεB29-十一酰des(B30)人胰島素的合成如實(shí)施例14中所述類似于NεB29-十二酰des(B30)人胰島素的合成，用十一烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯代替十二烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯來合成標(biāo)題化合物。產(chǎn)物的分子量MS測定值5876，理論值5876。
實(shí)施例17NεB29-十三酰des(B30)人胰島素的合成如實(shí)施例14中所述類似于NεB29-十二酰des(B30)人胰島素的合成，用十三烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯代替十二烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯來合成標(biāo)題化合物。產(chǎn)物的分子量MS測定值5899，理論值5904。
實(shí)施例18NεB29-肉豆蔻酰des(B30)人胰島素的合成如實(shí)施例14中所述類似于NεB29-十二酰des(B30)人胰島素，用肉豆蔻酸N-羥基琥珀酰亞胺酯代替十二烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯來合成標(biāo)題化合物。產(chǎn)物的分子量MS測定值5923，理論值5918。
實(shí)施例19
NεB29-棕櫚酰des(B30)人胰島素的合成如實(shí)施例14中所述類似于NεB29-十二酰des(B30)人胰島素，用棕櫚酸N-羥基琥珀酰亞胺酯代替十二烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯來合成標(biāo)題化合物。產(chǎn)物的分子量MS測定值5944，理論值5946。
實(shí)施例20NεB29-辛二酰-D-甲狀腺素人胰島素的合成a.N-(琥珀酰亞胺基辛二酰)-D-甲狀腺素的制備將辛二酸二琥珀酰亞胺酯(1.0g，Pierce)溶于DMF(50ml)中，20℃及攪拌下加入D-甲狀腺素(2.0g，Aldrich)。甲狀腺素慢慢溶解，20小時(shí)后真空除去溶劑。油狀殘余物在異丙醇中結(jié)晶得到0.6gN-(琥珀酰亞胺基辛二酰)-D-甲狀腺素，m.p.128—133℃。
b.(A1，B1)-二Boc人胰島素與N-(琥珀酰亞胺基辛二酰)-D-甲狀腺素的反應(yīng)。
室溫下通過加入三乙胺(20μl)將(A1，B1)-二Boc人胰島素(200mg)溶于干燥DMF中。然后加入N-(琥珀酰亞胺基辛二酰)-D-甲狀腺素(80mg)。用反相HPLC監(jiān)視反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)完成約90％時(shí)真空除去溶劑。向殘余物中加入無水三氟乙酸(5ml)，室溫下保持1小時(shí)。真空除去三氟乙酸后，將殘余物溶于1M鹽酸(5ml)和乙腈(1.5ml)的混合物中，經(jīng)制備性反相HPLC純化，在PD-10柱上脫鹽，得50mg NεB29-辛二酰-D-甲狀腺素人胰島素。
本實(shí)例的產(chǎn)物是這樣的人胰島素，其中LysB29的ε-氨基具有下式取代基Thyrox-CO(CH2)6O-，其中Thyrox是甲狀腺素，它通過其α-氨基的酰胺鍵與辛二酸部分連結(jié)。產(chǎn)物的分子量MS測定值6724理論值6723。
實(shí)施例21NεB29-(2-琥珀酰氨基)肉豆蔻酸人胰島素的合成a.α-氨基肉豆蔻酸甲酯鹽酸鹽的制備劇烈攪拌下向-10℃甲醇(5ml，Merck)中滴加亞硫酰氯(0.2ml，Aldrich)。然后加入α-氨基肉豆蔻酸(0.7g，通過α-溴代酸與氨反應(yīng)制得)。室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后蒸發(fā)至干。粗產(chǎn)物(0.7g)直接用于b步中。
b.N-琥珀?；?α-氨基肉豆蔻酸甲酯的制備將α-氨基肉豆冠酸甲酯鹽酸鹽(0.7g)溶于氯仿(25ml，Merck)。加入三乙胺(0.35ml，F(xiàn)luka)，然后加入琥珀酸酐(0.3g，F(xiàn)luka)。室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)，濃縮至干，殘余物在乙酸乙酯/石油醚(1/1)中重結(jié)晶。得0.8g。
c.N-(琥珀酰亞胺基琥珀?；?-α-氨基肉豆蔻酸甲酯的制備將N-琥珀?；?α-氨基肉豆蔻酸甲酯(10.8g)溶于干燥的DMF中(10ml，Merck，用4A分子篩干燥)。加入干燥的吡啶(80μl，Merck)和碳酸二(N-琥珀酰亞胺基)酯(1.8g，F(xiàn)luka)，室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。在硅酸60(Merck)上快速層析將殘余物純化，在2-丙醇/石油醚(1/1)中重結(jié)晶，得0.13g N-(琥珀酰亞胺基琥珀?；?-α-氨基肉豆蔻酸甲酯，m.p.64—66℃。
d.(A1，B1)-二Boc人胰島素與N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-α-氨基肉豆蔻酸甲酯的反應(yīng)。
如實(shí)施例20b所述進(jìn)行反應(yīng)，但用N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-α-氨基肉豆蔻酸甲酯(16mg)代替N-(琥珀酰亞胺基辛二酰)-D-甲狀腺素。真空除去三氟乙酸后，在0℃用0.1M氫氧化鈉處理殘余物使甲酯皂化。當(dāng)用反相HPLC判定完全皂化時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為3，冷凍干燥此溶液。制備性反相HPLC上純化并在PD-10柱上脫鹽后，得39mg NεB29-(2-琥珀酰氨基)肉豆蔻酸人胰島素。
本實(shí)例中的產(chǎn)物是這樣的人胰島素，其中LysB29的ε-氨基上有下式取代基CH3(CH2)11CH(COOH)NHCOCH2CH2CO-。產(chǎn)物的分子量MS測定值6130，理論值6133。
實(shí)施例22NεB29-辛氧羰基人胰島素按實(shí)施例20b所述進(jìn)行合成，但用正辛氧羰基N-羥基琥珀酰亞胺(9mg，從氯甲酸正辛酯(Aldrich)和N-羥基琥珀酰亞胺制得)代替N-(琥珀酰亞胺基辛二酰)-D-甲狀腺素。得86mg NεB29-辛氧羰基人胰島素。
該實(shí)施例的產(chǎn)物是這樣的人胰島素，其中LysB29的ε-氨基有下式取代基CH3(CH2)7OCO-。產(chǎn)物的分子量，MS測定值5960，理論值5964。
實(shí)施例23NεB29-(2-琥珀酰氨基)棕櫚酸人胰島素的合成a.制備N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-α-氨基棕櫚酸甲酯按實(shí)施例21a-c中所述方法，用α-氨基棕櫚酸代替α-氨基肉豆蔻酸來制備該化合物。
b.(A1，B1)-二Boc人胰島素與N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-α-氨基棕櫚酸甲酯的反應(yīng)。
按實(shí)施例21d所述進(jìn)行該反應(yīng)，但用N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-α-氨基棕櫚酸甲酯代替N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-2-氨基棕櫚酸甲酯，得到NεB29-(2-琥珀酰氨基)棕櫚酸人胰島素。
本實(shí)施例的產(chǎn)物是這樣的人胰島素，其中LysB29的ε-氨基上有下式取代基CH3(CH2)13CH(COOH)NHCOCH2CH2CO-。
實(shí)施例24NεB29-(2-琥珀酰氨基乙氧基)棕櫚酸人胰島素的合成a。制備N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-2-氨基乙氧基棕櫚酸甲酯如實(shí)施例21a-c中所述方法制備該化合物，但用2-氨基乙氧基棕櫚酸(通過R.TenBrink，J.Org.Chem.52(1987)418—422中所述一般方法合成)代替α-氨基肉豆蔻酸。
b.(A1，B1)-二Boc人胰島素與N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-2-氨基乙氧基棕櫚酸甲酯反應(yīng)按實(shí)施例21d所述方法進(jìn)行該反應(yīng)，但用N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-2-氨基乙氧基棕櫚酸甲酯代替N-(琥珀酰亞胺基琥珀酰)-α-氨基肉豆蔻酸甲酯，得到NεB29-(2-琥珀酰氨基乙氧基)棕櫚酸人胰島素。
本實(shí)例的產(chǎn)物是這樣的人胰島素，其中LysB29的ε-氨基上有下式取代基CH3(CH2)13CH(COOH)NHCH2CH2OCOCH2CH2CO-。
實(shí)施例25NεB29-石膽酰-α-谷氨酰des(B30)人胰島素的合成用N-石膽酰-L-谷氨酸α-N-羥基琥珀酰亞胺酯，γ-叔丁基酯代替癸酸N-羥基琥珀酰亞胺酯，按實(shí)施例13中所述進(jìn)行合成。
本實(shí)例的產(chǎn)物是這樣的des(B30)人胰島素，其中LysB29的ε-氨基上有下式取代基石膽酰-NHCH(CH2CH2COOH)CO-。產(chǎn)物的分子量，MS測定值6194，理論值6193。
實(shí)施例26NεB29-3，3’，5，5’-四碘代甲腺乙酰人胰島素的合成用3，3’，5，5’-四碘代甲腺乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯代替癸酸N-羥基琥珀酰亞胺酯，按實(shí)施例10中所述方法進(jìn)行合成。產(chǎn)物的分子量MS測定值6536；理論值6538。
實(shí)施例27NεB29-L-甲狀腺素人胰島素用Boc-L-甲狀腺素N-羥基琥珀酰亞胺酯代替癸酸N-羥基琥珀酰亞胺酯，按實(shí)施例10所述進(jìn)行合成。產(chǎn)物分子量，MS測定值6572，理論值6567。
實(shí)施例28溶液中含600nmol/ml NεB29-癸酰des(B30)人胰島素·1/3 Zn2+的藥物組合物將NεB29-癸酰des(B30)人胰島素(1.2μmol)溶于水(0.8ml)中，加0.2M氫氧化鈉調(diào)PH值至7.5。加入0.01M醋酸鋅(60μl)和含0.75％苯酚和4％甘油的溶液(0.8ml)。用0.2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的PH值至7.5，用水調(diào)節(jié)溶液的體積至2ml。
將形成的溶液過濾滅菌，無菌條件下轉(zhuǎn)移到藥筒或小瓶中。
實(shí)施例29溶液中含600nmol/ml NεB29-癸酰人胰島素·1/2 Zn2+的藥物組合物將1.2μmol標(biāo)題化合物溶于水(0.8ml)中，加0.2M氫氧化鈉調(diào)PH值至7.5。加入含0.75％苯酚和1.75％氯化鈉的溶液(0.8ml)。用0.2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的PH值至7.5，用水調(diào)節(jié)溶液的體積至2ml。
將形成的溶液過濾滅菌，無菌條件下轉(zhuǎn)移到藥筒或小瓶中。
實(shí)施例30溶液中含600nmol/ml NεB29-石膽酰人胰島素的藥物組合物將1.2μmol標(biāo)題化合物溶于水(0.8ml)中，加0.2M氫氧化鈉調(diào)PH值至8.5。然后向溶液中加入0.8ml含0.75％甲苯酚和4％甘油的儲(chǔ)備水溶液。最后再調(diào)節(jié)溶液的PH值至8.5，用水調(diào)節(jié)溶液的體積至2ml。
將形成的溶液過濾滅菌，無菌條件下轉(zhuǎn)移到藥筒或小瓶中。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市DK—2880 Bagsvaerd(E)國家丹麥(G)電話+45 44448888(H)傳真+45 44490555(I)電傳37173(ii)發(fā)明名稱?；囊葝u素(iii)序列數(shù)目49(iv)通信地址(A)地址Novo Nordisk A/SCorporate Patents(B)街道Novo Alle(C)城市DK—2880 Bagsvaerd(E)國家丹麥(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申請的資料
(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)優(yōu)先申請的資料(A)申請?zhí)朌K 1044/93和US 08/190,829(B)申請日09—SEP—1993和02—FEB—1994(viii)律師/代理人信息(A)姓名Jrgensen，Dan等.
(B)參照號/卷號3985.204—WO，DJ(ix)通訊信息(A)電話+45 44448888(B)傳真+45 44493256(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Xaa20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa20 25 30(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度110個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO3TGGCTAAGAG ATTCGTTGAC CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA GCTTTGTACT 60TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT TTCTTCTACA CTCCAAAGTC TGACGACGCT110(2)SEQ ID N4的信息(i)序列特征(A)長度100個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CTGCGGGCTG CGTCTAAGCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG ATAGAAGTAC 60AACATTGTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG 100(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度25個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GTCGCCATGG CTAAGAGATT CGTTG 25(2)SEQ ID NO6的信息
(i)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6CTGCTCTAGA GCCTGCGGGC TGCGTCT 27(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度110個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO7TGGCTAAGAG ATTCGTTACT CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA GCTTTGTACT 60TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT TTCTTCTACA CTCCAAAGTC TGACGACGCT 110(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度25個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8GTCGCCATGG CTAAGAGATT CGTTA 25(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度100個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CTGCGGGCTG CGTCTAACCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG ATAGAAGTAC 60AACATTGTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG 100(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10ACGTACGTTC TAGAGCCTGC GGGCTGC 27(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度78個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11CACTTGGTTG AAGCTTTGTA CTTGGTTTGT GGTGAAAGAG GTTTCTTCTA CACTCCAAAG 60ACTAGAGGTA TCGTTGAA78(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度63個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO12GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAGAAGAA GCTGAAGCTG AAGCTAGATT CGTTAACCAA 60CAC63(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度65個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAGAAGAA GCTGAAGCGA AGCTGAAAGA TTCGTTAACC 60AACAC 65(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度415個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA
(xi)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置80..391(xi)序列描述SEQ ID NO14ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 60AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 112Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile1 5 10GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 160Gly Phe Cys Trp Ala Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu15 20 25ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 208Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn30 35 40GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC 256Val Ala Met Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His45 50 55TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC 304Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr60 65 70 75ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT 352Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr80 85 90TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT AAC TAGACGCAGC401Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn95 100CCGCAGGCTC TAGA 415(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度104個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO15Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala1 5 10 15Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser20 25 30Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Lys35 40 45Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu50 55 60Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp65 70 75 80Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu85 90 95Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn100(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度415個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO16TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG 60TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC 120GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA 180GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATTGGTTGT 240GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA 300GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC 360AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACATT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT 415(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度523個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置80..499(xi)序列描述SEQ ID NO17ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 60AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 112Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu1 5 10TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 160Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu15 20 25GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 208Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp30 35 40TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 256Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr45 50 55AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 304Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala60 65 70 75AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAG AGA GAA GTT AAC CAA CAC TTG 352Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Glu Val Asn Gln His Leu80 85 90TGC GGT TCT CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA 400Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg95 100 105GGT TTC TTC TAC ACT GAA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA 448Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu110 115 120CAA TGT TGT ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT 496Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys125 130 135AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA523Asn140(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征
(A)長度140個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO18Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Asp Lys Arg Glu Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu85 90 95Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr100 105 110Glu Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser115 120 125Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn130 135 140(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度523個(gè)堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO19TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG60TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAGCGTCG 120TAGGAGGCGT AATCGACGAG GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG 180CCGACTTCGA CAGTAGCCAA TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG 240TAAAAGGTTG TCGTGTTTAT TGCCCAATAA CAAATATTTA TGATGATAAC GGTCGTAACG 300ACGATTTCTT CTTCCCCATA GAAACCTATT CTCTCTTCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG 360AGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC ACCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGACTTTT 420CAGACTGCTG CGATTCCCAT AGCAACTTGT TACAACATGA AGATAGACAA GAAACATGGT 480TAACCTTTTG ATGACATTGA TCTGCGTCGG GCGTCCGAGA TCT 523(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度415個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置80..391(xi)序列描述SEQ ID NO20ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 60AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 112Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile1 5 10GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 160Gly Phe Cys Trp Ala Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu15 20 25ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 208Ile Pro Glu Glu Ser Leu lle Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn30 35 40GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT GAC CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC 256Val Ala Met Ala Lys Arg Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His45 50 55TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC 304Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr60 65 70 75ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT 352Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr80 85 90TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT GCT TAGACGCAGC401Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ala95 100CCGCAGGCTC TAGA 415(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度104個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO21Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala1 5 10 15Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser20 25 30Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Lys35 40 45Arg Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu50 55 60Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp65 70 75 80Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu85 90 95Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ala100(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度415個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO22TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG 60TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC 120GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA 180GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT 240GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA 300GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC 360AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACG AATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT 415(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度415個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置80..391(xi)序列描述SEQ ID NO23ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 60AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 112Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile1 5 10GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 160Gly Phe Cys Trp Ala Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu15 20 25ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 208Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn30 35 40GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT ACT CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC 256Val Ala Met Ala Lys Arg Phe Val Thr Gln His Leu Cys Gly Ser His45 50 55TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC 304Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr60 65 70 75ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT 352Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr80 85 90TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT GCT TAGACGCAGC401Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ala95 100CCGCAGGCTC TAGA 415(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度104個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala1 5 10 15Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser20 25 30Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Lys35 40 45Arg Phe Val Thr Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu50 55 60Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp65 70 75 80Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu85 90 95Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ala100(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度415個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO25TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG 60TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC120GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA180GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATGAGTTGT240GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA300GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC360AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACG AATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT 415(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度415個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置80..391(xi)序列描述SEQ ID NO26ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 60AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 112Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile1 5 10GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 160Gly Phe Cys Trp Ala Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu15 20 25ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 208Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn30 35 40GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT GAC CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC 256Val Ala Met Ala Lys Arg Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His45 50 55TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC 304Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr60 65 70 75ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT 352Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr80 85 90TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT GGT TAGACGCAGC401Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly95 100CCGCAGGCTC TAGA 415(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度104個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列描述SEQ ID NO27Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala1 5 10 15Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser20 25 30Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Lys35 40 45Arg Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu50 55 60Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp65 70 75 80Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu85 90 95Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly100(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度415個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO28TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG 60TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC 120GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA 180GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT 240GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA 300GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC 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40TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 256Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr45 50 55AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 304Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala60 65 70 75AAA GAA GAA GGG GTA TCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG 352Lys Glu Glu Gly Val Ser Met Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu80 85 90TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT GAA AGA 400Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg95 100 105GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG TCT GAC GAT GCT AAG GGT ATT GTC GAG 448Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu110 115 120CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC 496Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys125 130 135AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 523Asn140(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)長度140個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO42Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Met Ala Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu85 90 95Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr100 105 110Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser115 120 125Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn130 135 140(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長度523個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO43TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG 60TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAGCGTCG 120TAGGAGGCGT AATCGACGAG GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG 180CCGACTTCGA CAGTAGCCAA TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG 240TAAAAGGTTG TCGTGTTTAT TGCCCAATAA CAAATATTTA TGATGATAAC GGTCGTAACG 300ACGATTTCTT CTTCCCCATA GGTACCGATT CTCTAAGCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG 360GGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC GCCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGAGGATT 420CAGACTGCTA CGATTCCCAT AACAGCTCGT TACGACATGG AGGTAGACGA GGAACATGGT 480TAACCTTTTG ATGACGTTGA TCTGCGTCGG GCGTCCGAGA TCT523(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長度535個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置77..511(xi)序列描述SEQ ID NO44GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu1 5 10TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu15 20 25GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp30 35 40TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr45 50 55AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala60 65 70 75AAA GAA GAA GGG GTA TCC ATG GCT AAG AGA GAA GAA GCT GAA GCT GAA 349Lys Glu Glu Gly Val Ser Met Ala Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu80 85 90GCT AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA GCT 397Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala95 100 105TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCA AAG ACT 445Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr110 115 120AGA GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA 493Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln125 130 135TTG GAA AAC TAC TGC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 535Leu Glu Asn Tyr Cys Asn140 145(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長度145個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO45Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Met Ala Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg Phe Val Asn85 90 95Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys100 105 110Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu115 120 125Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys130 135 140Asn145(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)長度523個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO46CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA GTATGTGTTA 60TATTTGCTAA TTTTCTTACT CTAAAGGAAG TTAAAAATGA CGTCAAAATA AGCGTCGTAG 120GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG 180ACTTCGACAG TAGCCAATGA GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA 240AAGGTTGTCG TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG 300ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTTC GATCTAAGCA 360ATTGGTTGTG AACACGCCAA GGGTGAACCA ACTTCGAAAC ATGAACCAAA CACCACTTTC 420TCCAAAGAAG ATGTGAGGTT TCTGATCTCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC 480AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACGTT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT 535(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)長度538個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置77..514(xi)序列描述SEQ ID NO47GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA109Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu1 5 10TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu15 20 25GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp30 35 40TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr45 50 55AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala60 65 70 75AAA GAA GAA GGG GTA TCC ATG GCT AAG AGA GAA GAA GCT GAA GCT GAA 349Lys Glu Glu Gly Val Ser Met Ala Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu80 85 90GCT GAA AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA 397Ala Glu Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu95 100 105GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCA AAG 445Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys110 115 120ACT AGA GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC 493Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lle Cys Ser Leu Tyr125 130 135CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA538Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn140 145(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)長度146個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO48Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Met Ala Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg Phe Val85 90 95Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val100 105 110Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val115 120 125Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr130 135 140Cys Asn145(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)長度538個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO49CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA GTATGTGTTA 60TATTTGCTAA TTTTCTTACT CTAAAGGAAG TTAAAAATGA CGTCAAAATA AGCGTCGTAG120GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG180ACTTCGACAG TAGCCAATGA GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA240AAGGTTGTCG TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG300ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTTC GACTTTCTAA360GCAATTGGTT GTGAACACGC CAAGGGTGAA CCAACTTCGA AACATGAACC AAACACCACT420TTCTCCAAAG AAGATGTGAG GTTTCTGATC TCCATAGCAA CTTGTTACAA CATGAAGATA480GACAAGAAAC ATGGTTAACC TTTTGATGAC GTTGATCTGC GTCGGGCGTC CGAGATCT 538
權(quán)利要求
1.具有以下序列的胰島素衍生物和其任何Zn2+配合物 B-鏈(續(xù))Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Xaa (SEQ ID NO2)25 26 27 28 29 30其中A21和B3位的Xaa獨(dú)立地為除Lys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基；B1位的Xaa是Phe或缺失；B30位的Xaa是(a)含10-24個(gè)碳原子的非編碼親脂氨基酸，此時(shí)最多5個(gè)碳原子的羧酸?；cLysB29的ε-氨基連結(jié)，(b)除Lys、Arg和Cys外的可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基，此時(shí)LysB29的ε-氨基具有親脂取代基或(c)缺失，此時(shí)LysB29的ε-氨基具有親脂取代基；條件是當(dāng)B30位的Xaa為Thr或Ala，A21和B3位的Xaa均為Asn，B1位的Xaa為Phe時(shí)，該胰島素衍生物是Zn2+配合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中A21和B3位的Xaa獨(dú)立地為除Lys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基；B1位的Xaa是Phe或缺失；B30位的Xaa是一含10-24個(gè)碳原子的非編碼的親脂氨基酸，及LysB29的ε—氨基與酰基結(jié)合，其中該酰基是含最多4個(gè)碳原子的單羧酸的?；蚝疃?個(gè)碳原子的二元羧酸的?；?。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中A21和B3位的Xaa獨(dú)立地為除Lys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基；B1位的Xaa為Phe或缺失；B30位的Xaa缺失或?yàn)槌齃ys、Arg和Cys外可被遺傳密碼編碼的任何氨基酸殘基，及LysB29的ε-氨基具有含至少6個(gè)碳原子的親脂取代基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的胰島素衍生物，其中B30位的Xaa選自α-氨基癸酸、α-氨基十二烷酸、α-氨基十四烷酸和α-氨基十六烷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的胰島素衍生物，其中與LysB29的ε-氨基結(jié)合的酰基選自甲?；⒁阴；?、丙酰基和正丁?；?。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的胰島素衍生物，其中與LysB29的ε-氨基結(jié)合的?；晴晁岬孽；?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求3的胰島素衍生物，其中B30位的Xaa缺失。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的胰島素衍生物，其中B30位的Xaa是Asp、Glu或Thr。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的胰島素衍生物，其中與LysB29的ε-氨基結(jié)合的親脂取代基是衍生自含至少6個(gè)碳原子的羧酸的?；?。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的胰島素衍生物，其中?；蔀橹Щ?、包括8-24原子長的碳原子主鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的胰島素衍生物，其中?；呛辽?個(gè)碳原子的脂肪酸的?；?。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的胰島素衍生物，其中?；呛?-24個(gè)碳原子的線性、飽和羧酸的酰基。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的胰島素衍生物，其中?；x自十二烷酸、十三烷酸和十四烷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中A21位的Xaa是Ala、Gln、Gly或Ser。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中B3位的Xaa是Asp、Gln或Thr。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中B1位的Xaa缺失。
17.一種用于在需要這種治療的患者中治療糖尿病的藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
18.一種用于在需要這種治療的患者中治療糖尿病的藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物，與其混合的速效胰島素或胰島素類似物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
19.一種在需要這種治療的患者中治療糖尿病的方法，包括給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
20.一種在需要這種治療的患者中治療糖尿病的方法，包括給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物、與其混合的速效胰島素或胰島素似物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及長效人胰島素衍生物和其任何Zn
文檔編號A61K38/28GK1133598SQ9419385
公開日1996年10月16日 申請日期1994年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月17日
發(fā)明者S·哈夫侖德, J·B·哈斯塔姆, I·喬那森, A·S·安德森, J·馬庫森 申請人:諾沃挪第克公司