預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥治療和預(yù)后及鑒定為推定轉(zhuǎn)移抑制劑的試劑的方法
【專利說明】預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥治療和預(yù)后及鑒定為推定轉(zhuǎn)移抑制劑 的試劑的方法
[0001] 摶術(shù)領(lǐng)域和發(fā)背景
[0002] 本發(fā)明，在其一些實施方案中，涉及預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥治療和預(yù)后及鑒定為推定 轉(zhuǎn)移抑制劑的試劑的方法。
[0003] 細(xì)胞運動性支持包括腫瘤轉(zhuǎn)移在內(nèi)的各種生理和病理過程（Ridley，2011)。迀 移的開始由肌動蛋白聚合和促使板狀偽足和絲狀偽足形成的Rho家族GTP酶驅(qū)動。越來 越多的證據(jù)使得另一類肌動蛋白驅(qū)動的突出，稱為侵襲偽足牽連于基質(zhì)降解中（Murphy和 C〇urtneidge，2011)。為進(jìn)行轉(zhuǎn)移，乳腺癌游走細(xì)胞形成侵襲偽足并滲入附近血管中。旨在 表征與乳腺癌細(xì)胞向肺部（Minn等，2005)和腦部（Bos等，2009)轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)特征 的研宄鑒定了成為定點轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)的多組基因。有趣的是，兩組均包括表皮生長因子（EGF) 家族的成員，表明通過共用受體EGFR發(fā)信號支持轉(zhuǎn)移性傳播。
[0004] 胞內(nèi)運輸作為細(xì)胞迀移和腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵特征出現(xiàn)（Mosesson等，2008)。例如， 已經(jīng)證實突變體P53通過增強型整聯(lián)蛋白和取決于Rab偶聯(lián)蛋白（RCP)的EGFR運輸促進(jìn) 轉(zhuǎn)移（Muller等，2010)。隨同Rab蛋白一起，磷酸肌醇通過確定囊泡同一"性在細(xì)胞區(qū)域化 中起關(guān)鍵作用（Yuan和Cantley，2008)。例如，在PI (4, 5) P2 (磷脂酰肌醇-4, 5二磷酸）的 D3位置通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)的磷酸化生成侵襲偽足形成所必需的PI (3, 4, 5) P3(Yamaguchi等，2011)。類似地，PI (4, 5)己調(diào)節(jié)控制胞吞作用和肌動蛋白動力學(xué)特性的 多種蛋白質(zhì)（Saarikangas等，2010)，但是其水平受另外兩類酶嚴(yán)格控制：磷脂酶C(PLCy) 促進(jìn)PI (4, 5)P2水解，這樣激活絲切蛋白（Cofilin)(-種肌動蛋白切割蛋白）并且驅(qū)動乳 腺細(xì)胞迀移（van Rheenen等，2007)。同樣，肌醇多磷酸5-磷酸酶，例如突觸囊泡磷酸酶 2 (SYNJ2)，為肌醇環(huán)的D5位置脫去磷酸并且控制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移（Chuang等，2004 ; Malecz等，2000)。另外在某些前列腺癌樣品中鑒定出純合突變，Rossi等Cancer Genet Cytogenet. 2005 年 9 月；161(2):97-103。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一方面，提供了一種預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，條件是所 述腫瘤不是神經(jīng)膠質(zhì)瘤，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的突觸囊泡磷酸 酶2 (SYNJ2)抑制劑，從而預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一方面，提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括 向有需要的受試者施用治療有效量的突觸囊泡磷酸酶2 (SYNJ2)抑制劑和與癌癥發(fā)作或進(jìn) 展相關(guān)的細(xì)胞表面受體的抑制劑，從而治療癌癥。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一方面，提供了一種用于預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的突觸囊泡磷 酸酶2 (SYNJ2)抑制劑，條件是所述腫瘤不是神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一方面，提供了一種用于治療癌癥的突觸囊泡磷酸酶 2 (SYNJ2)抑制劑和一種用于治療癌癥與癌癥發(fā)作或進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞表面受體的抑制劑。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，與癌癥發(fā)作或進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞表面受體為受體酪氨 酸激酶。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述受體酪氨酸激酶為ErbB受體。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述ErbB受體為表皮生長因子受體（EGFR)。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一方面，提供了一種鑒定腫瘤轉(zhuǎn)移的推定抑制劑的方 法，所述方法包括在試驗試劑的存在下，分析SYNJ2介導(dǎo)的PI (3, 4, 5) ?3向PI (3, 4) P 2的加 工，其中在試驗試劑的存在下PI (3, 4, 5)?3向PI (3, 4)P2的加工與試驗試劑不存在時相比減 少，表明為腫瘤轉(zhuǎn)移的推定抑制劑。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述分析SYNJ2介導(dǎo)的PI (3, 4, 5) ?3向PI (3, 4) P 2的 加工通過競爭測定法進(jìn)行。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述競爭測定法測定PI (3, 4)P2結(jié)合結(jié)構(gòu)域從包含 與PI (3, 4)P2結(jié)合的PI (3, 4)P 2結(jié)合結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物的位移。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述競爭測定法為熒光偏振競爭測定法。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一方面，提供了一種在有需要的受試者中癌癥預(yù)后的 方法，所述方法包括測定受試者癌細(xì)胞中SYNJ2的水平或活性，其中在受試者癌細(xì)胞中所 述SYNJ2的活性水平與在未受影響的對照樣品的細(xì)胞中相比上調(diào)，表明預(yù)后不良。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述方法還包括使用金標(biāo)法增進(jìn)預(yù)后。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述金標(biāo)法包括標(biāo)記的檢測。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述標(biāo)記選自HER-2和雌激素受體（ER)。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述轉(zhuǎn)移為EGF依賴型。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述癌癥為乳腺癌。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述SYNJ2抑制劑選自小分子、抗體、肽和核酸沉默 劑。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述小分子選自表2中所列的分子。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一方面，提供了一種用于治療癌癥或預(yù)防癌轉(zhuǎn)移的制 品，其包括包裝SYNJ2抑制劑和與癌癥發(fā)作或進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞表面受體的抑制劑的包裝材 料。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，與所述癌癥發(fā)作或進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞表面受體的抑制 劑為抗體。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，與所述癌癥發(fā)作或進(jìn)展相關(guān)的所述細(xì)胞表面受體的 所述抑制劑為小分子抑制劑。
[0027] 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普 通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然與本文所述相似或等效的方法和材料可用于本發(fā) 明實施方案的實踐或試驗中，但下面對示例性方法和/或材料進(jìn)行了描述。如有沖突，以包 括定義在內(nèi)的專利說明書為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實例僅為說明性而非旨在必定限制。
[0028] 附圖簡沐
[0029] 本文僅以舉例的方式，參考附圖描述本發(fā)明的一些實施方案?，F(xiàn)詳細(xì)地具體參考 附圖，應(yīng)強調(diào)的是所示細(xì)節(jié)是舉例而言并且是為了說明性討論本發(fā)明的實施方案。在這點 上，以附圖做出的描述使得本發(fā)明的實施方案可如何實踐對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見。
[0030] 圖中：
[0031] 圖IA-I顯示EGF促進(jìn)乳腺細(xì)胞的侵襲性生長并誘導(dǎo)了一組特定的基因。圖IA-在 生長因子不存在時接種MCFlOA細(xì)胞并使其形成細(xì)胞團。72h后，用指定生長因子（各IOng/ mL)處理細(xì)胞并在24h后拍攝相襯圖像（比例尺，50 μπι)。圖IB-按指示，在指定配體（IOng/ mL)的存在下，在迀移或侵襲小室內(nèi)接種MCFlOA細(xì)胞，并且在18h后，迀移到下部隔室的細(xì) 胞經(jīng)結(jié)晶紫染色（左圖）。示出了迀移和侵襲信號的量化，歸一化為EGF處理的效應(yīng)。數(shù)據(jù)表 示三份生物樣品來自重復(fù)兩次的代表性實驗的平均值土S.D.(右圖）。圖IC-在transwell 插件中將MCFlOA細(xì)胞接種于含EFG，沒有或有抑制劑AG-1478 (1 μ M)、U0126 (5 μ Μ)或渥曼 青霉素（Wortmannin) (200ηΜ)的培養(yǎng)基中，并使其迀移18h。數(shù)據(jù)表示三份樣品的平均值 土S. D.。實驗重復(fù)兩次。圖ID-人乳腺MCFlOA細(xì)胞中受EGF (而不是受血清（Amit等，2007)) 特異性誘導(dǎo)的一系列425個基因與在MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移的情況下上調(diào)的基因（1，597個 基因）交叉（Minn等，2005)。23個重疊基因中的一個編碼5'-磷脂酰肌醇脂質(zhì)磷酸酶突 觸囊泡磷酸酶-2(3￥即2)。圖巧-用編碼1^(^((^1'1)或5￥即2-6??(5￥即2-(?)的慢病毒粒 子感染MCFlOA細(xì)胞。通過免疫印跡法測定內(nèi)源SYNJ2和SYNJ2-GFP融合蛋白的表達(dá)水平， 并通過對微管蛋白的探測確認(rèn)蛋白質(zhì)負(fù)荷相等。圖IF-在EGF不存在（NT)或存在（IOng/ mL)時在迀移小室內(nèi)接種MCFlOA細(xì)胞的Ctrl和SYNJ2-0X克隆（5 X IO4個細(xì)胞/孔）并使 其迀移22h。到達(dá)濾器另一側(cè)的迀移細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色并拍攝圖像。圖IG-用SiRNA對照 (siCtrl)或針對SYNJ2的siRNA (siSYNJ2)轉(zhuǎn)染MCFlOA細(xì)胞，并且在36h后通過免疫印跡 法測定SYNJ2的蛋白質(zhì)水平。通過對Ras-GAP的免疫印跡確認(rèn)蛋白質(zhì)負(fù)荷相等。圖IH-在 EGF不存在（NT)或存在（10ng/mL)時在迀移小室內(nèi)接種G中提供的細(xì)胞（5X IO4個細(xì)胞/ 孔）并使其迀移22h。到達(dá)濾器下表面的迀移細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色并捕捉圖像。圖II-用指 定siRNA處理MCFlOA細(xì)胞的鋪滿培養(yǎng)物。一旦形成單層，就使其進(jìn)入監(jiān)測擦傷閉合速率的 自動化擦傷系統(tǒng)。
[0032] 圖2A-E顯示EGF對SYNJ2的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)促進(jìn)侵襲性生長。圖2A-用EGF (20ng/mL) 或血清（5% )刺激血清饑餓MCFlOA細(xì)胞，并且使用微陣列或RT-qPCR測定SYNJ2 mRNA表 達(dá)。圖2B-按指示用EGF刺激MCFlOA細(xì)胞，提取并做免疫印跡。圖2C-在EGF不存在或存 在時，培養(yǎng)感染了編碼GFP-SYNJ2(SYNJ2-0X)或作為對照（Ctrl)的LacZ的病毒的MCFlOA 細(xì)胞4天。使用鬼筆環(huán)肽和DAPI獲得相襯圖像（上，比例尺：100 μπι)和共聚焦圖像（下， 比例尺：20μπι)。圖2D-E-在EGF不存在（NT)或存在（10ng/mL)時在迀移或侵襲小室內(nèi)培 養(yǎng)MCFlOA細(xì)胞（5-6 X IO4個細(xì)胞/孔）22h。到達(dá)濾器底部的細(xì)胞染色并且量化濾器的覆 蓋范圍（平均值土S.D·)。
[0033] 圖3A-G顯示乳腺細(xì)胞迀移和侵襲伴有SYNJ2向前緣的誘導(dǎo)型易位。圖3A-用編碼 LacZ(Ctrl)或V5標(biāo)記的SYNJ2(SYNJ2-V5)的慢病毒粒子，連同對照shRNA (shCtrl)或針對 SYNJ2的shRNA(shSYNJ2) -起，感染MDA-MB-231細(xì)胞。通過免疫印跡法測定V5-SYNJ2和 內(nèi)源SYNJ2的蛋白質(zhì)水平。通過對AKT的免疫印跡確認(rèn)蛋白質(zhì)負(fù)荷相等。圖3B-穩(wěn)定過表 達(dá)SYNJ2或作為對照的LacZ的MDA-MB-231細(xì)胞的相位圖像（左圖）和侵襲圖像（右圖）。 使用侵襲測定法測定侵襲能力，一式三份，并且量化侵襲細(xì)胞并歸一化為對照（Ctrl)。比 例尺，50μπι。圖3C-用針對SYNJ2的siRNA寡聚核苷酸（或siCtrl)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì) 胞。36h后，通過免疫印跡法測定SYNJ2的蛋白質(zhì)水平。通過對Ras-GAP的免疫印跡確認(rèn)蛋 白質(zhì)負(fù)荷相等。圖3D-在迀移或侵襲小室內(nèi)接種來自C的細(xì)胞并培養(yǎng)18h。量化迀移和侵 襲信號并歸一化為經(jīng)EGF處理的siCtrl細(xì)胞。所示數(shù)據(jù)為三份樣品的平均值土 S. D.。圖 3E-將瞬時表達(dá)GFP-SYNJ2的MDA-MB-231細(xì)胞涂到蓋玻片上并用TGFa (lOng/mL)刺激。 (每IOs)拍攝延時顯微照片。倒置所示圖像，黑斑表示SYNJ2及其在板狀偽足基部的組件。 比例尺，10 μ m。圖3F-使用TRITC-鬼筆環(huán)肽對MDA-MB-231細(xì)胞的內(nèi)源SYNJ2和F-肌動 蛋白免疫染色。正方形區(qū)域放大。比例尺，10 μ m。圖3G-用EGF刺激MCFlOA細(xì)胞18h，然 后使用TRITC-鬼筆環(huán)肽對內(nèi)源SYNJ2免疫染色而F-肌動蛋白復(fù)染。比例尺，10 μ m。
[0034] 圖4A-F顯示SYNJ2的催化活性對于侵襲性生長必不可少。圖4A-B-在5 % Matrigel 中接種表達(dá) SYNJ2 (SYNJ2-0X)或針對 SYNJ2 的 shRNA (shSYNJ2)的 MDA-MB-231 細(xì) 胞以及對照細(xì)胞。6天后捕捉圖像，并量化侵襲性球體（平均值土S.D.)。比例尺，50μπι。 圖4C-D-用野生型SYNJ2(shSYNJ2+SYNJ2 WT)或用催化失能的突變體（shSYNJ2+SYNJ2GD)感 染表達(dá)shSYNJ2的MDA-MB-231細(xì)胞。按指示提取細(xì)胞并做免疫印跡，或使其在侵襲小室內(nèi) 侵襲18h。示出了侵襲細(xì)胞及其標(biāo)準(zhǔn)量化的圖像（平均值土S.D.)。圖4E-示出了在纖連 蛋白上生長的shCtrl和shSYNJ2細(xì)胞的掃描電子顯微照片。比例尺，2 μ m。圖4F-指定 MDA-MB-231細(xì)胞中經(jīng)鬼筆環(huán)肽和DAPI染色的F-肌動蛋白的圖像。示出了 Z軸部分（線） 和放大區(qū)域。箭頭標(biāo)記溶脹結(jié)構(gòu)。比例尺，10 ym。
[0035] 圖5Α-Η示出了 SYNJ2的亞細(xì)胞定位。圖5Α-用RFP-網(wǎng)格蛋白轉(zhuǎn)染表達(dá)GFP-SYNJ2 的MDA-MB-231細(xì)胞并接種于涂有纖連蛋白的板上。使用轉(zhuǎn)盤式顯微鏡術(shù)，每5s為細(xì)胞成 像。箭頭標(biāo)記新形成的前緣。比例尺，5 μ m。圖5B-描繪SYNJ2在前緣（上面兩行）和細(xì)胞 體下面裝配和分解的代表時幀。對于下面的行而言，細(xì)胞經(jīng)mCherry-lifeACT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并 接種于膠原上。之后，間隔Imin為細(xì)胞成像。插入箭頭以便參考。注意時間尺度的差異。 比例尺，1 μ m。圖5C-同時通過TIRF和落射熒光顯微鏡術(shù)為細(xì)胞成像并將信號轉(zhuǎn)換成波動 曲線（X軸）。箭頭標(biāo)記信號起始。比例尺，5μηι。圖5D-在用Dyng〇-4a(30yM;-種發(fā)動蛋 白-2抑制劑）處理前5min和處理后5min，使用轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡術(shù)為細(xì)胞成像。比例 尺，5 μ m。圖 5E-用 Dyng〇-4a (30 μ M ;30min)或用溶劑（DMSO)預(yù)培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá) GFP-SYNJ2 的MD