此類基因，以由抗體生成細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)。見(jiàn)，例如，Larrick和 Fry[Methods, 2:106-10(1991)]〇
[0087] 抗SYNJ2市場(chǎng)上可買到?？谷薙YNJ2單克隆抗體的供應(yīng)商實(shí)例包括但 不限于 Amsbio、Atlas Antibodies、AbD Serotec、United States Biological、 antibodies-online. com、Genway、Proteintech Group 等。致使本發(fā)明的抗體為非免疫原 性，以供治療應(yīng)用。
[0088] 非人（例如，鼠）抗體的人源化形式為含有源自非人類免疫球蛋白的最小序列 的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（例如Fv、Fab、Fab'、F(ab'）. sub. 2或抗體的其 它抗原結(jié)合子序列）的嵌合分子。人源化抗體包括人免疫球蛋白（受者抗體），其中形成 受者互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的殘基由形成非人類物種（供體抗體），例如小鼠、大鼠或兔的具 有所需特異性、親和力和容量的CDR的殘基置換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨 架殘基由相應(yīng)的非人類殘基置換。人源化抗體可能還包含在受者抗體或?qū)氲腃DR或骨 架序列中都不存在的殘基。一般而言，人源化抗體將大體上包含至少一個(gè)并且通常兩個(gè) 可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中所有或大體上所有的CDR區(qū)與非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)相對(duì) 應(yīng)并且所有或大體上所有的FR區(qū)為人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體最好 還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)（Fc)，通常為人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分[Jones等， Nature, 321:522-525 (1986) ;Riechmann 等，Nature, 332:323-329 (1988);和 Presta，Curr. Op.Struct. Biol. , 2:593-596(1992) ]〇
[0089] 人源化非人抗體的方法在本領(lǐng)域眾所周知。通常，人源化抗體具有一個(gè)或 多個(gè)從非人類來(lái)源引入其中的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常常稱為導(dǎo)入殘 基，其通常從導(dǎo)入可變結(jié)構(gòu)域獲得?；旧峡砂凑誛inter和同事的方法[Jones等， Nature, 321:522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature 332:323-327(1988) ;Verhoeyen 等， Science, 239:1534-1536 (1988)]，通過(guò)用嚙齒動(dòng)物CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列 進(jìn)行人源化。相應(yīng)地，此類人源化抗體為嵌合抗體（美國(guó)專利第4, 816, 567號(hào)），其中已經(jīng) 用來(lái)自非人類物種的相應(yīng)序列取代了大體上不大完整的人可變結(jié)構(gòu)域。在實(shí)踐中，人源化 抗體通常是其中一些CDR殘基和可能一些FR殘基由來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體中類似位點(diǎn)的殘基 取代的人抗體。
[0090] 也可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)，包括噬菌體展示庫(kù)生成人抗體[Hoogenboom 和 Winter，J.Mol.Biol. ,227:381 (1991) ;Marks 等，J.Mol.Biol. ,222:581 (1991)]。 Cole等和Boerner等的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體（Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, 第 77 頁(yè)(1985)和 Boerner 等， J. Immunol.，147(1) :86-95(1991)]。類似地，可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全滅活的小鼠體內(nèi)，制成人抗體。激發(fā)后， 觀察到人抗體生成，這在各個(gè)方面，包括基因重排、裝配和抗體譜，這都非常類似于在人類 中所見(jiàn)。例如，在美國(guó)專利第 5, 545, 807、5, 545, 806、5, 569, 825、5, 625, 126、5, 633, 425、 5,661,016 號(hào)和下列科技出版物：Marks 等，Bio/Technology 10, ：779-783(1992); Lonberg 等，Nature 368:856-859(1994) ;Morrison，Nature 368 812-13(1994) ;Fishwild 等，Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996) ;Neuberger，Nature Biotechnology 14:826 (1996);和 Lonberg 和 Huszar，Intern. Rev. Tmmunol. 13, 65-93 (1995).中描述了這 種方法。
[0091] 也可通過(guò)RNA沉默實(shí)現(xiàn)SYNJ2的下調(diào)。如本文所使用，短語(yǔ)"RNA沉默"指由導(dǎo)致 相應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)抑制或"沉默"的RNA分子介導(dǎo)的一組調(diào)控機(jī)制[例如，RNA 干擾（RNAi)、轉(zhuǎn)錄基因沉默（TGS)、轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS)、壓制、共抑制和翻譯阻遏]。已 經(jīng)在許多類型的生物，包括植物、動(dòng)物和真菌中觀察到RNA沉默。
[0092] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"RNA沉默劑"指能夠特異性抑制或"沉默"靶基因的表達(dá)的 RNA。在某些實(shí)施方案中，RNA沉默劑能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制防止mRNA分子完全加工（例 如，全部翻譯和/或表達(dá)）。RNA沉默劑包括非編碼RNA分子，例如包含配對(duì)鏈的RNA雙鏈 體，以及可由其生成如此小的非編碼RNA的前體RNA。示例性RNA沉默劑包括dsRNA例如 siRNA、miRNA和shRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA沉默劑能夠誘導(dǎo)RNA干擾。在另一實(shí)施方 案中，RNA沉默劑能夠介導(dǎo)翻譯阻遏。
[0093] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，RNA沉默劑對(duì)靶RNA(例如，SYNJ2)有特異性并不 交叉抑制或沉默與靶基因表現(xiàn)出99%或更低總體同源性，例如與靶基因表現(xiàn)出低于98%、 97 %,96 %,95 %,94 %,93 %,92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %, 82 %、81 %總體同源性的基因或剪接變體。
[0094] RNA干擾指動(dòng)物中由短干擾RNA(SiRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程。 植物中的相應(yīng)過(guò)程通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNA沉默并且在真菌中也稱為壓制。轉(zhuǎn)錄后 基因沉默的過(guò)程被認(rèn)為是用于防止外源基因表達(dá)的進(jìn)化上保守的細(xì)胞防御機(jī)制并且通常 由不同區(qū)系和門共用?？赡芤呀?jīng)響應(yīng)于經(jīng)由特異性破壞同源單鏈RNA或病毒基因組RNA的 細(xì)胞反應(yīng)，源自病毒感染或轉(zhuǎn)座子元件向宿主基因組的隨機(jī)整合的雙鏈RNA(dsRNA)生成， 進(jìn)化出這種對(duì)外源基因表達(dá)的防護(hù)。
[0095] 細(xì)胞中長(zhǎng)dsRNA的存在刺激稱為dicer的核糖核酸酶III的活性。在將dsRNA加 工成稱為短干擾RNA(siRNA)的dsRNA短片段中涉及到dicer。源自dicer活性的短干擾 RNA通常長(zhǎng)度為約21至約23個(gè)核苷酸并且包含約19個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體。RNAi反應(yīng)也是 通常稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC)的核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的特征，所述復(fù)合物介導(dǎo)具有與 siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈RNA裂解。在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的區(qū) 域中間發(fā)生靶RNA裂解。
[0096] 相應(yīng)地，本發(fā)明的一些實(shí)施方案考慮到dsRNA下調(diào)由mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)的用途。
[0097] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，dsRNA大于30bp。由于相信雙鏈RNA的這些較長(zhǎng)區(qū)域?qū)?dǎo)致 誘導(dǎo)干擾素和PKR反應(yīng)，所以長(zhǎng)dsRNA (即大于30bp的dsRNA)的使用已經(jīng)非常受限。然而， 使用長(zhǎng)dsRNA可以提供許多優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞可以選擇減少試驗(yàn)許多siRNA的需要的最佳沉默序 列；長(zhǎng)dsRNA將允許沉默庫(kù)具有比對(duì)于siRNA而言所需更低的復(fù)雜性；并且，可能最重要的 是，長(zhǎng)dsRNA在用作治療劑時(shí)可防止病毒逃避突變。
[0098] 各種研宄證明長(zhǎng)dsRNA可用于沉默基因表達(dá)，不會(huì)誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)或產(chǎn)生顯著 的脫革E 效應(yīng)-見(jiàn)例如[Strat 等，Nucleic Acids Research，2006 年，第 34 卷，No. 13 3803 - 3810 ;Bhargava A 等，Brain Res. Protoc. 2004;13:115-125 ;Diallo M.等， Oligonucleotides. 2003 ;13:381_ 392 ;Paddison P.J.等，Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002 ;99:1443 - 1448 ;Tran N.等，F(xiàn)EBS Lett. 2004 ;573:127 - 134] 〇
[0099] 具體而言，本發(fā)明根據(jù)其一些實(shí)施方式考慮到在干擾素途徑未激活的細(xì)胞（例如 胚細(xì)胞和卵母細(xì)胞）中引入長(zhǎng)dsRNA(超過(guò)30個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）用于基因沉默，見(jiàn)例如 Billy 等，PNAS 2001，第 98 卷，第 14428-14433 頁(yè)和 Diallo 等，Oligonucleotides，2003 年 10 月 1 日，13(5):381-392. doi:10. 1089/154545703322617069。
[0100] 本發(fā)明根據(jù)其一些實(shí)施方式還考慮到引入特別設(shè)計(jì)為不誘導(dǎo)干擾素 和PKR途徑的長(zhǎng)dsRNA用于下調(diào)基因表達(dá)。例如，Shinagwa和Ishii [Genes&D ev. 17(11):1340-1345,2003]已經(jīng)研發(fā)出稱為pDECAP的載體，以從RNA聚合酶II (Pol II) 啟動(dòng)子表達(dá)長(zhǎng)雙鏈RNA。因?yàn)閬?lái)自pDECAP的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物缺乏促進(jìn)ds-RNA輸出到細(xì)胞質(zhì)的 5' -帽結(jié)構(gòu)和3' -聚（A)尾部，所以來(lái)自pDECAP的長(zhǎng)ds-RNA不誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)。
[0101] 在哺乳動(dòng)物體系中避開(kāi)干擾素和PKR途徑的另一種方法是經(jīng)由轉(zhuǎn)染或內(nèi)源性表 達(dá)引入小抑制性RNA(siRNA)。
[0102] 術(shù)語(yǔ)"siRNA"指誘導(dǎo)RNA干擾（RNAi)途徑的小抑制性RNA雙鏈體（通常介于 18-30個(gè)堿基對(duì)之間）。雖然最近已經(jīng)描述25-30個(gè)堿基長(zhǎng)度的化學(xué)合成RNA雙鏈體與相 同位置的21mer相比，效力增強(qiáng)可高達(dá)100倍，但是通常siRNA經(jīng)化學(xué)合成為21mer，具有中 間19bp雙鏈體區(qū)和末端的對(duì)稱2-堿基3' -突出。觀察到在引發(fā)RNAi中使用較長(zhǎng)RNA獲 得的更強(qiáng)效力經(jīng)推理是由于為Dicer提供底物（27mer)而非產(chǎn)物（21mer)產(chǎn)生并且這提高 了 siRNA雙鏈體進(jìn)入RISC的速率或效率。
[0103] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3' -突出的位置影響siRNA的效力并且在反義鏈上具有3' -突出的非對(duì) 稱雙鏈體通常比在有義鏈上具有3'-突出的非對(duì)稱雙鏈體更有效（Rose等，2005)。因?yàn)樵?靶向反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時(shí)觀察到相反的功效模式，所以這可歸因于非對(duì)稱鏈載入RISC中。
[0104] 雙鏈干擾RNA(例如，siRNA)的鏈可連接形成發(fā)夾或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)（例如，shRNA)。 因此，正如提到的那樣，本發(fā)明一些實(shí)施方案的RNA沉默劑也可為短發(fā)夾RNA(shRNA)。
[0105] 可在Chuang等（同上）SJ2 - 1 (編碼區(qū) 1612 - 1633 ;5，AACGTGAACGGAGGAAAGCAG， SEQIDN0:3)、SJ2-2(3'非翻譯區(qū)內(nèi)的區(qū)域 5419 - 5440;5'CTCTTGCTGATACGCGATATT， SEQ ID NO:4);或傳授 SYNJ2 的編碼區(qū) 1612-1633 或 4925-4946 的 siRNA 的 Rusk 等[Curr Biol. 2003 年 4 月 15 日；13 (8) :659-63. Erratum in:Curr Biol. 2003 年 9 月 30 日； 13 (19) : 1746]中找到小干擾RNA分子的實(shí)例。
[0106] 成功下調(diào)SYNJ2 mRNA水平的siRNA序列的其它實(shí)例包括但不限于 GAAGAAACAUCCCUUUGAU(SEQ ID N0:5)和 GGACAGCACUGCAGGUGUU(SEQ ID N0:6)。
[0107] 術(shù)語(yǔ)"ShRNA"，如本文所使用，指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，包含互補(bǔ)序列的第一和第二 區(qū)域，所述區(qū)域的互補(bǔ)程度和定向足夠使得在所述區(qū)域之間發(fā)生堿基配對(duì)，第一和第二 區(qū)域通過(guò)環(huán)區(qū)連接，由于環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸（或核苷酸類似物）之間缺乏堿基配對(duì)而產(chǎn)生環(huán) 的RNA劑。環(huán)內(nèi)核苷酸的數(shù)量是介于并包括3-23或5-15或7-13或4-9或9-11的數(shù) 量。環(huán)內(nèi)一些核苷酸可涉及與環(huán)內(nèi)其它核苷酸的堿基-對(duì)相互作用。可用于形成環(huán)的寡 核苷酸的實(shí)例包括 5'-UUCAAGAGA-3' ?rummelkamp，T.R.等（2002)Science 296:550)和 5'-仰呢呢說(shuō)6-3'（038丨311〇?〇,0.等（2002)1?嫩8:1454)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到所 生成的單鏈寡核苷酸形成包含能夠與RNAi機(jī)制相互作用的雙鏈區(qū)的莖-環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
[0108] 成功下調(diào)SYNJ2 mRNA水平的shRNA序列的實(shí)例包括但不限于CCGGCCTACGATACAA GCGACAAATCTCGAAGATTTGTCGCTTGTATCGTAGGTTTTTG(SEQ ID NO:7) ；CCGGCGAGAGGAGATCATTC GGAAACTCGAGTTTCCGAATGATCTCCTCTCGTTTTTG(SEQ ID NO :8) ；CCGGCCGGAAGAACAGTTTGAGCAA CTCGAGTTGCTCAAACTGTTCTTCCGGTTTTTG(SEQ ID N0:9)〇
[0109] 適合與本發(fā)明的一些實(shí)施方案一起使用的RNA沉默劑的合成可如下實(shí)現(xiàn)。第一， 在AUG起始密碼子下游掃描SYNJ2 mRNA序列的AA二核苷酸序列。將每個(gè)AA和3 '相鄰的 19個(gè)核苷酸的出現(xiàn)記錄為潛在siRNA靶位點(diǎn)。優(yōu)選地，因?yàn)榉欠g區(qū)（UTR)更富含調(diào)節(jié)蛋 白結(jié)合位點(diǎn)，所以siRNA革巴位點(diǎn)選自開(kāi)放閱讀框。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可能 干擾siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。不過(guò)應(yīng)認(rèn)識(shí)到， 正如對(duì)于GAPDH所證明那樣，其中對(duì)準(zhǔn)5' UTR的siRN