本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種賀蘭山紫蘑菇中提取的大黃素甲醚抗菌和抗氧化實驗方法。

背景技術(shù)：

賀蘭山紫蘑菇(cortinariusrufo-olivaceus)是一種以絲膜菌為主的純天然野生菌，其氣味醇香、肉質(zhì)鮮嫩，含有豐富的粗纖維、總糖、蛋白質(zhì)及17種游離氨基酸，被稱之為“賀蘭山珍”。前期實驗發(fā)現(xiàn)，賀蘭山紫蘑菇的粗提物有良好的抑菌性和抗氧化性。通過柱層析、制備薄層層析和重結(jié)晶方法等分離純化，從賀蘭山紫蘑菇石油醚提取物中分離得到大黃素甲醚針狀晶體。大黃素甲醚屬于蒽醌類化合物，別名朱砂蓮乙素；1,8-二羥基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌，分子式是c16h12o5。因此實驗以大黃素甲醚為研究材料進行抗菌和抗氧化研究，為以后對賀蘭山紫蘑菇的進一步研究開發(fā)打下基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種賀蘭山紫蘑菇中提取的大黃素甲醚抗菌和抗氧化實驗方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明包括原料：分離自賀蘭山紫蘑菇石油醚提取物的大黃素甲醚晶體、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑根霉、黑曲霉；

試劑：二甲基亞砜、dpph、標準vc、硫酸亞鐵、30％雙氧水、水楊酸、鹽酸、tris粉、鄰苯三酚、無水乙醇；

主要實驗儀器：ar224cn型電子天平、yxq-ls-100a型立式壓力蒸汽滅菌器、vs-1300型潔凈工作臺、uv-1100型紫外可見分光光度計；s.c.101型鼓風電熱恒溫干燥箱、dk-s24型電熱恒溫水浴鍋；

實驗步驟：

(1)配制溶液：用二倍稀釋法將大黃素甲醚和標準vc濃度配制為512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml進行抗菌和抗氧化實驗；

(2)用牛津杯法進行定性實驗；用二倍稀釋法進行最小抑菌濃度測定；用梯度稀釋法計算抑菌率；

(3)抗氧化檢測所需溶液配制：

1)dpph·的清除實驗：用無水乙醇配制濃度為0.08mmol/l的dpph溶液，避光保存，備用；

2)超氧陰離子自由基(o2－·)的清除實驗：配制濃度為0.05mmol/ml的tris-hcl緩沖液，0.025mmol/ml的鄰苯三酚溶液，8mol/l的hcl溶液，備用；

3)羥自由基(·oh)的清除實驗：配制濃度為0.009mmol/ml的feso4·7h2o溶液，0.009mmol/ml的水楊酸-乙醇溶液，0.03％的h2o2溶液，備用；

抗氧化檢測：

樣品制備：將大黃素甲醚晶體溶于dmso溶劑中，并于30℃水浴鍋中保溫使其完全溶解，用二倍稀釋法將樣品配成有濃度梯度的待檢測樣品溶液編號備用，同樣將抗壞血酸配成相同濃度梯度的待檢測溶液編號備用；

抗氧化實驗：

樣品對dpph·的清除實驗：分別取2.0ml各個濃度梯度的待測樣品液到試管中，再加入2.0ml濃度為0.08mmol/l的新配制的dpph·溶液，然后混合均勻，使其反應(yīng)30min后，在波長為517nm處用分光光度計檢測其吸光度ai，同時測定樣品本底顏色的吸光度aj以及不加樣品液的空白對照的吸光度ao，并以下式計算其清除率：

dpph·清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

樣品對超氧陰離子自由基(o2－·)的清除實驗：用移液管精確取4.5mltris-hcl緩沖溶液，然后放入25℃水浴鍋中預(yù)熱20分鐘，然后分別加入l.0ml各個濃度梯度的待測樣品液和0.4ml濃度為0.025mmol/ml鄰苯三酚溶液混合均勻，然后放入25℃水浴鍋中反應(yīng)5min，再加入1.0ml的8mol/lhcl溶液來終止反應(yīng)，最后將溶液稀釋10倍后在波長299mn處用分光光度計測定吸光度ai，以蒸餾水代替樣品液作為空白對照，測定吸光度ao，同時用不加鄰苯三酚溶液測得的吸光度aj代表樣品的本底顏色，按下式計算清除率：

o2－·清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

樣品對羥自由基(·oh)的清除實驗：分別加入1.0ml各個濃度梯度的待測樣品溶液于試管中，加入1.0ml濃度為0.009mmol/ml的feso4·7h2o溶液和1.0ml0.03％h2o2溶液混勻，水浴鍋中37℃孵育10min，再加入1.0ml濃度為0.009mmol/ml的水楊酸-乙醇溶液，混勻后37℃水浴鍋中孵育30min，最后將溶液稀釋10倍后在波長510nm處用分光光度計測定樣品液的吸光度ai，以蒸餾水代替樣品液作為空白對照，測定吸光度ao，用不加顯色劑h2o2溶液測得的吸光度aj代表樣品的本底顏色，計算方法如下式：

·oh清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

抗菌實驗：對紫蘑菇的石油醚提取物中得到的疑似大黃素甲醚的物質(zhì)分別進行核磁共振實驗、用掃描電鏡觀察，確定為大黃素甲醚，用dmso將大黃素甲醚溶解，采用牛津杯法進行抗菌的定性實驗，針對大腸桿菌測定最小抑菌濃度，并測定抑菌率，在電鏡下觀察處理后的細胞形態(tài)，分析其抗菌機理；

培養(yǎng)基的配置及分裝：

①稱量：按照培養(yǎng)基配方，正確稱取各種原料放于搪瓷杯中；

②溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，用玻棒攪勻，加熱溶解；

③在加瓊脂后調(diào)ph值，用1mol/l的naoh或1mol/l的hcl調(diào)ph，用ph試紙對照；

④加瓊脂溶化，在瓊脂溶化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，待完全溶化后，補足所失水分，一般數(shù)量少，時間短不必補水；

⑤分裝：在漏斗架上分裝，根據(jù)不同的需要進行分裝，一般制斜面的裝置為管高的1/5特別注意不要使培養(yǎng)基粘污在管口上以免浸濕棉塞，引起污染；

⑥包扎成捆、掛上標簽；培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，用防水紙包扎成捆掛上所配培養(yǎng)基名稱的標簽；

⑦滅菌備用；滅菌后如需制成斜面的，應(yīng)在下磅后取出，擺成斜面；培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，如確無菌生長、方可使用；

二種培養(yǎng)基的配方及具體配制方法

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基是一種天然培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌；其中，牛肉膏提供碳源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，nacl提供無機鹽；

以配置1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為例；

準確稱取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，加入到盛有1000ml蒸餾水的鍋中，充分攪拌使其溶解；再稱取瓊脂15.0-20.0g，剪成小段，加入到鍋中，不斷攪拌以防糊鍋；瓊脂充分溶解后，調(diào)節(jié)ph至7.4至7.6；用精密ph試紙測量，當ph偏小時，緩慢滴加濃度為1mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)，而當ph偏大的時候，則滴加濃度為1mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)來ph；最后加水至1000ml定容；將配好的培養(yǎng)基分裝，加塞包扎牢固，等待滅菌；

pda培養(yǎng)基：pda培養(yǎng)基的全程為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，即potatodextroseagar(medium)；pda培養(yǎng)基屬于半合成培養(yǎng)基；

以配置1000mlpda固體培養(yǎng)基為例；

新鮮土豆洗凈后去皮，稱取200.0g土豆，切成小塊狀，加入到盛有1000ml蒸餾水的鍋中，煮30分鐘左右，直至能用玻璃棒頭部戳進土豆內(nèi)，接下來用三層紗布過濾得到土豆汁，持續(xù)加熱，加入15.0g-20.0g瓊脂和葡萄糖20.0g；瓊脂條應(yīng)剪成小段以加速溶解；持續(xù)加熱、不斷攪拌，防止瓊脂糊鍋；煮的過程中應(yīng)該持續(xù)關(guān)注鍋內(nèi)沸騰額狀況，防止鍋內(nèi)液體溢出；

分裝要求：

將配置好的培養(yǎng)基用皮管和漏斗分裝到試管或者到錐形瓶中；分裝時，培養(yǎng)基的液面不能超過試管高度的五分之一，滅菌后擺成平面；分裝到錐形瓶中時，培養(yǎng)基的液面應(yīng)該在錐形瓶高度的三分之一左右；

在分裝過程中，應(yīng)該要注意避免培養(yǎng)基沾在試管口或錐形瓶口，以免引起污染；給試管和錐形瓶塞上棉塞，包好牛皮紙，用棉繩捆好扎牢，以防止被外界微生物污染；在分裝好的試管和錐形瓶外面要貼好標簽，寫清培養(yǎng)基的種類，配置日期等，以便識別；

滅菌：

在實驗室的操作中，滅菌一般分為干熱滅菌和濕熱滅菌；干熱滅菌法的滅菌溫度為160℃，滅菌時間為4小時；干熱滅菌法適用于耐高溫的玻璃和金屬制品；濕熱滅菌法的滅菌條件為，溫度為121℃時利用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20分鐘；由于水蒸氣的穿透性相對比較強，培養(yǎng)基的滅菌經(jīng)常采用濕熱滅菌法；

移液槍頭、無菌水和準備好的培養(yǎng)基用報紙包好后，采用濕熱滅菌法，以121℃，20min高壓蒸汽滅菌，將牛津杯、培養(yǎng)皿用報紙包好后，采用干熱滅菌法以160℃，4h干熱空氣滅菌；將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右，將試管棉塞端擱在玻棒上擺放斜面；滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24-48h，以檢查滅菌是否徹底，滅菌徹底的培養(yǎng)基放于低溫處備用；除培養(yǎng)基外濕熱滅菌后的東西都要置于烘箱內(nèi)干燥，防治潮濕導(dǎo)致微生物滋生；

菌種活化：使用無菌操作臺前先要在無菌操作臺打開紫外燈殺菌30min，殺菌時一般將除菌種外實驗中會使用到的實驗材料如牛津杯、移液槍、培養(yǎng)皿、接種環(huán)等放在無菌操作臺上一起滅菌，用pda培養(yǎng)基斜面活化黑根霉、黑曲霉；用牛肉膏培養(yǎng)基活化大腸桿菌、金黃色葡萄球菌；黑曲霉28℃光照培養(yǎng)2天、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌37℃培養(yǎng)24h備用；霉菌操作完成必須嚴格殺菌后才能進行大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的操作；

以活化大腸桿菌為例；

第一步：取無菌培養(yǎng)基兩副，在培養(yǎng)皿底部做好標記；取已經(jīng)融化好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成平板；

第二步：帶平板冷卻凝固后，用接種環(huán)取大腸桿菌一環(huán)，進行活化；

菌種活化方法有二種：

連續(xù)劃線法：將挑取有大腸桿菌的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面作連續(xù)劃法，勿劃破培養(yǎng)基；劃線完畢后，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

平板涂布法：挑去適量大腸桿菌于無菌水中，輕輕震蕩混勻，制成菌懸液；用移液槍吸取100μl于培養(yǎng)基，用涂布棒涂抹均勻；

抑菌定性試驗操作：

取一定量的大黃素甲醚晶體溶解于二甲基亞砜，放置于超聲儀中超聲10分鐘以加速溶解，配置成濃度為256ug/ml的大黃素甲醚溶液；

將制好的培養(yǎng)基融化，無菌操作臺開紫外燈殺菌后，在無菌操作臺上到平板，待培養(yǎng)基凝固后用活化后的黑根霉、黑曲霉；用牛肉膏培養(yǎng)基活化大腸桿菌、金黃色葡萄球菌制成菌懸液，然后用移液槍將菌懸液移取100ul到培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻；在涂布好的平板上，放上已經(jīng)滅菌的牛津杯--每個培養(yǎng)皿放置2個，樣品溶液一個，另一個放dmso做空白對照，在牛津杯內(nèi)用移液槍移取200ul的實驗材料溶液，然后在對照組內(nèi)注入200ul的dmso，將完成的黑根霉、黑曲霉培養(yǎng)皿小心移入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿移至37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h，觀察實驗結(jié)果；

最小抑菌濃度測定的操作：

準備4個潔凈干燥的25ml容量瓶，采用二倍稀釋法配置得到系列濃度梯度的大黃素甲醚溶液；

4個容量瓶依次做好標記：256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，分別記為容量瓶1、容量瓶2、容量瓶3、容量瓶4；從容量瓶1中取出12.5ml濃度為256μg/ml大黃素甲醚溶液，加入到容量瓶2中，用dmso定容，混合均勻，得到濃度為128μg/ml的大黃素甲醚溶液；照此方法，依次得到濃度為64μg/ml、32μg/ml的大黃素甲醚溶液；

以濃度為256μg/ml的大黃素甲醚為實驗對象為例；

取3個已倒完培養(yǎng)基的平板進行平行實驗，避免出現(xiàn)實驗的偶然性，減小實驗誤差；在3個培養(yǎng)基中分別打入大黃素甲醚溶液200μl，加入少量菌液，用涂布棒涂抹均勻；涂布完畢后稍稍靜置，以免菌液流動；靜置完畢后用封口膜封住以免被染菌，倒置放于溫度為37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時后，觀察實驗結(jié)果；

照此方法，對濃度為128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml的大黃素甲醚溶液也分別進行實驗；

抑菌率測定的操作：

以大腸桿菌為實驗菌種，實驗樣品為濃度為上一步驟中得到的最小抑菌濃度；

準備14支已滅菌的試管備用，分為實驗組和對照組；

用活化好的大腸桿菌制作菌懸液

實驗組：

取大黃素甲醚溶液0.5ml，菌液0.5ml，加入到裝有4.0ml無菌水的試管中，震蕩，得到稀釋10^-1的菌懸液；

另取裝有4.5ml無菌水的試管6支，用記號筆邊上10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；

從10^-1中取出0.5ml液體加入到10^-2中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10^-2菌液稀釋液；同法由10^-2的試管中吸取0.5ml稀釋液加入編號為10^-3的無菌水試管中，混勻后即為10^-3菌液稀釋液，依次連續(xù)稀釋至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7菌液稀釋液；

對照組：

取菌液0.5ml，加入到裝有4.5ml無菌水的試管中，震蕩，得到稀釋10^-1的菌懸液；

另取裝有4.5ml無菌水的試管6支，用記號筆邊上10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；

從10^-1中取出0.5ml液體加入到10^-2中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10^-2菌液稀釋液；同法由10^-2的試管中吸取0.5ml稀釋液加入編號為10^-3的無菌水試管中，混勻后即為10^-3菌液稀釋液，依次連續(xù)稀釋至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7菌液稀釋液；

抑菌率測定過程以實驗組操作為例：

取3個已倒完培養(yǎng)基的平板進行平行實驗，避免出現(xiàn)實驗的偶然性，減小實驗誤差；在3個培養(yǎng)基中分別打入實驗組10^-7菌液稀釋液200μl，用涂布棒涂抹均勻；涂布完畢后稍稍靜置，以免菌液流動；靜置完畢后用封口膜封住以免被染菌，倒置放于溫度為37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時后，觀察實驗結(jié)果；

電鏡實驗操作：

菌液的準備是將菌懸液和樣品一起放入液體培養(yǎng)基中，菌種是大腸桿菌，恒溫振蕩培養(yǎng)12h，37℃；菌液預(yù)處理如下：

將菌液以3000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清液；

注入2.5％戊二醛，靜置4h固定；

固定后離心，將細菌沉積，棄上清，以磷酸緩沖液pbs以1/15mol/l，ph＝7.2；配方：a2hpo4*12hpo4取23.876g+kh2po4取9.078g,分別溶于1l水中，然后將二者按照7:3的體積比混合,就可以了；重懸浮，重復(fù)3次，最后以pbs重懸。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種賀蘭山紫蘑菇中提取的大黃素甲醚抗菌和抗氧化實驗方法，本發(fā)明采用牛津杯法確定其抗菌性，用二倍稀釋法得到最小抑菌濃度，用梯度稀釋法計算其抑菌率；通過dpph法、羥自由基和超氧陰離子自由基清除法以標準vc作為陽性對照檢測大黃素甲醚的抗氧化性。得到大黃素甲醚有明顯的抗菌性，且大腸桿菌的抑菌率能達到75.78％；在三種自由基清除法中，大黃素甲醚對自由基清除率隨濃度的升高而升高，但其抗氧化性都低于標準vc，為以后對賀蘭山紫蘑菇的進一步研究開發(fā)打下基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的實驗流程圖；

圖2是本發(fā)明的大黃素甲醚對大腸桿菌的抑制結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明的大黃素甲醚對金葡的抑制結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明的大黃素甲醚對黑根霉的抑制結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明的大黃素甲醚對黑曲霉的抑制結(jié)果圖；

圖6是本發(fā)明的各濃度抑菌結(jié)果圖；

圖7是本發(fā)明的抑菌率對照組圖；

圖8是本發(fā)明的抑菌率實驗組圖；

圖9是本發(fā)明的大黃素甲醚和抗壞血酸對dpph·的清除率圖；

圖10是本發(fā)明的大黃素甲醚和抗壞血酸對o2－·的清除率圖；

圖11是本發(fā)明的大黃素甲醚和抗壞血酸對·oh的清除率圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：

本發(fā)明包括原料：分離自賀蘭山紫蘑菇石油醚提取物的大黃素甲醚晶體、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑根霉、黑曲霉；

試劑：二甲基亞砜、dpph、標準vc、硫酸亞鐵、30％雙氧水、水楊酸、鹽酸、tris粉、鄰苯三酚、無水乙醇；

主要實驗儀器：ar224cn型電子天平、yxq-ls-100a型立式壓力蒸汽滅菌器、vs-1300型潔凈工作臺、uv-1100型紫外可見分光光度計；s.c.101型鼓風電熱恒溫干燥箱、dk-s24型電熱恒溫水浴鍋；

實驗步驟：

(1)配制溶液：用二倍稀釋法將大黃素甲醚和標準vc濃度配制為512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml進行抗菌和抗氧化實驗；

(2)用牛津杯法進行定性實驗；用二倍稀釋法進行最小抑菌濃度測定；用梯度稀釋法計算抑菌率；

(3)抗氧化檢測所需溶液配制：

1)dpph·的清除實驗：用無水乙醇配制濃度為0.08mmol/l的dpph溶液，避光保存，備用；

2)超氧陰離子自由基(o2－·)的清除實驗：配制濃度為0.05mmol/ml的tris-hcl緩沖液，0.025mmol/ml的鄰苯三酚溶液，8mol/l的hcl溶液，備用；

3)羥自由基(·oh)的清除實驗：配制濃度為0.009mmol/ml的feso4·7h2o溶液，0.009mmol/ml的水楊酸-乙醇溶液，0.03％的h2o2溶液，備用；

抗氧化檢測：

樣品制備：將大黃素甲醚晶體溶于dmso溶劑中，并于30℃水浴鍋中保溫使其完全溶解，用二倍稀釋法將樣品配成有濃度梯度的待檢測樣品溶液編號備用，同樣將抗壞血酸配成相同濃度梯度的待檢測溶液編號備用；

抗氧化實驗：

表1dpph·清除實驗溶液添加情況表

其中，ai＝2.0mldpph·溶液+2.0ml樣品液的吸光度，代表實驗組；

aj＝2.0ml的樣品液+2.0ml無水乙醇的吸光度，代表樣品的本底顏色組(樣品本身顯黃色)；

ao＝2.0ml的dpph·溶液+2.0ml的無水乙醇的吸光度，代表空白對照組。

樣品對dpph·的清除實驗：分別取2.0ml各個濃度梯度的待測樣品液到試管中，再加入2.0ml濃度為0.08mmol/l的新配制的dpph·溶液，然后混合均勻，使其反應(yīng)30min后，在波長為517nm處用分光光度計檢測其吸光度ai，同時測定樣品本底顏色的吸光度aj以及不加樣品液的空白對照的吸光度ao，并以下式計算其清除率：

dpph·清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

樣品對超氧陰離子自由基(o2－·)的清除實驗：

表2超氧陰離子自由基(o2－·)的清除實驗溶液添加情況表

其中，ai代表實驗組；

aj代表樣品的本底顏色組(樣品本身顯黃色)；

ao代表空白對照組。

用移液管精確取4.5mltris-hcl緩沖溶液，然后放入25℃水浴鍋中預(yù)熱20分鐘，然后分別加入l.0ml各個濃度梯度的待測樣品液和0.4ml濃度為0.025mmol/ml鄰苯三酚溶液混合均勻，然后放入25℃水浴鍋中反應(yīng)5min，再加入1ml的8mol/lhcl溶液來終止反應(yīng)，最后將溶液稀釋10倍后在波長299mn處用分光光度計測定吸光度ai，以蒸餾水代替樣品液作為空白對照，測定吸光度ao，同時用不加鄰苯三酚溶液測得的吸光度aj代表樣品的本底顏色，按下式計算清除率：

o2－·清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

樣品對羥自由基(·oh)的清除實驗：

表6羥自由基(·oh)的清除實驗溶液添加情況表

其中，ai代表實驗組；

aj代表樣品的本底顏色組(樣品本身顯黃色)；

ao代表空白對照組。

分別加入1.0ml各個濃度梯度的待測樣品溶液于試管中，加入1.0ml濃度為0.009mmol/ml的feso4·7h2o溶液和1.0ml0.03％h2o2溶液混勻，水浴鍋中37℃孵育10min，再加入1.0ml濃度為0.009mmol/ml的水楊酸-乙醇溶液，混勻后37℃水浴鍋中孵育30min，最后將溶液稀釋10倍后在波長510nm處用分光光度計測定樣品液的吸光度ai，以蒸餾水代替樣品液作為空白對照，測定吸光度ao，用不加顯色劑h2o2溶液測得的吸光度aj代表樣品的本底顏色，計算方法如下式：

·oh清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

抗菌實驗：

實驗材料

實驗原材料

大黃素甲醚(自賀蘭山紫蘑菇石油醚提取物中分離提純得到)

大腸桿菌(escherichiacoli，e.coli)

金黃色葡萄球菌(staphyloccocusaureus，s.aureus)

黑根霉(rhizopusnigricans)

黑曲霉(aspergullusniger,a.niger)

有機溶劑

二甲基亞砜(dmso)、70％乙醇(由無水乙醇和蒸餾水配制)

其他藥品：

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：

牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，瓊脂15-20g，蒸餾水1000ml，ph7.4-7.6。

pda固體培養(yǎng)基：

新鮮土豆20g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml，自然ph。

對紫蘑菇的石油醚提取物中得到的疑似大黃素甲醚的物質(zhì)分別進行核磁共振實驗、用掃描電鏡觀察，確定為大黃素甲醚，用dmso將大黃素甲醚溶解，采用牛津杯法進行抗菌的定性實驗，針對大腸桿菌測定最小抑菌濃度，并測定抑菌率，在電鏡下觀察處理后的細胞形態(tài)，分析其抗菌機理；如圖1所示為實驗流程圖。

培養(yǎng)基的配置及分裝：

①稱量：按照培養(yǎng)基配方，正確稱取各種原料放于搪瓷杯中；

②溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，用玻棒攪勻，加熱溶解；

③在加瓊脂后調(diào)ph值，用1mol/l的naoh或1mol/l的hcl調(diào)ph，用ph試紙對照；

④加瓊脂溶化，在瓊脂溶化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，待完全溶化后，補足所失水分，一般數(shù)量少，時間短不必補水；

⑤分裝：在漏斗架上分裝，根據(jù)不同的需要進行分裝，一般制斜面的裝置為管高的1/5特別注意不要使培養(yǎng)基粘污在管口上以免浸濕棉塞，引起污染；

⑥包扎成捆、掛上標簽；培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，用防水紙包扎成捆掛上所配培養(yǎng)基名稱的標簽；

⑦滅菌備用；滅菌后如需制成斜面的，應(yīng)在下磅后取出，擺成斜面；培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，如確無菌生長、方可使用；

二種培養(yǎng)基的配方及具體配制方法

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基是一種天然培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌；其中，牛肉膏提供碳源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，nacl提供無機鹽；

以配置1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為例；

準確稱取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，加入到盛有1000ml蒸餾水的鍋中，充分攪拌使其溶解；再稱取瓊脂15.0-20.0g，剪成小段，加入到鍋中，不斷攪拌以防糊鍋；瓊脂充分溶解后，調(diào)節(jié)ph至7.4至7.6；用精密ph試紙測量，當ph偏小時，緩慢滴加濃度為1mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)，而當ph偏大的時候，則滴加濃度為1mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)來ph；最后加水至1000ml定容；將配好的培養(yǎng)基分裝，加塞包扎牢固，等待滅菌；

pda培養(yǎng)基：pda培養(yǎng)基的全程為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，即potatodextroseagar(medium)；pda培養(yǎng)基屬于半合成培養(yǎng)基；

以配置1000mlpda固體培養(yǎng)基為例；

新鮮土豆洗凈后去皮，稱取200.0g土豆，切成小塊狀，加入到盛有1000ml蒸餾水的鍋中，煮30分鐘左右，直至能用玻璃棒頭部戳進土豆內(nèi)，接下來用三層紗布過濾得到土豆汁，持續(xù)加熱，加入15.0g-20.0g瓊脂和葡萄糖20.0g；瓊脂條應(yīng)剪成小段以加速溶解；持續(xù)加熱、不斷攪拌，防止瓊脂糊鍋；煮的過程中應(yīng)該持續(xù)關(guān)注鍋內(nèi)沸騰額狀況，防止鍋內(nèi)液體溢出；

分裝要求：

將配置好的培養(yǎng)基用皮管和漏斗分裝到試管或者到錐形瓶中；分裝時，培養(yǎng)基的液面不能超過試管高度的五分之一，滅菌后擺成平面；分裝到錐形瓶中時，培養(yǎng)基的液面應(yīng)該在錐形瓶高度的三分之一左右；

在分裝過程中，應(yīng)該要注意避免培養(yǎng)基沾在試管口或錐形瓶口，以免引起污染；給試管和錐形瓶塞上棉塞，包好牛皮紙，用棉繩捆好扎牢，以防止被外界微生物污染；在分裝好的試管和錐形瓶外面要貼好標簽，寫清培養(yǎng)基的種類，配置日期等，以便識別；

滅菌：

在實驗室的操作中，滅菌一般分為干熱滅菌和濕熱滅菌；干熱滅菌法的滅菌溫度為160℃，滅菌時間為4小時；干熱滅菌法適用于耐高溫的玻璃和金屬制品；濕熱滅菌法的滅菌條件為，溫度為121℃時利用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20分鐘；由于水蒸氣的穿透性相對比較強，培養(yǎng)基的滅菌經(jīng)常采用濕熱滅菌法；

移液槍頭、無菌水和準備好的培養(yǎng)基用報紙包好后，采用濕熱滅菌法，以121℃，20min高壓蒸汽滅菌，將牛津杯、培養(yǎng)皿用報紙包好后，采用干熱滅菌法以160℃，4h干熱空氣滅菌；將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右，將試管棉塞端擱在玻棒上擺放斜面；滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24-48h，以檢查滅菌是否徹底，滅菌徹底的培養(yǎng)基放于低溫處備用；除培養(yǎng)基外濕熱滅菌后的東西都要置于烘箱內(nèi)干燥，防治潮濕導(dǎo)致微生物滋生；

菌種活化：使用無菌操作臺前先要在無菌操作臺打開紫外燈殺菌30min，殺菌時一般將除菌種外實驗中會使用到的實驗材料如牛津杯、移液槍、培養(yǎng)皿、接種環(huán)等放在無菌操作臺上一起滅菌，用pda培養(yǎng)基斜面活化黑根霉、黑曲霉；用牛肉膏培養(yǎng)基活化大腸桿菌、金黃色葡萄球菌；黑曲霉28℃光照培養(yǎng)2天、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌37℃培養(yǎng)24h備用；霉菌操作完成必須嚴格殺菌后才能進行大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的操作；

以活化大腸桿菌為例；

第一步：取無菌培養(yǎng)基兩副，在培養(yǎng)皿底部做好標記；取已經(jīng)融化好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成平板；

第二步：帶平板冷卻凝固后，用接種環(huán)取大腸桿菌一環(huán)，進行活化；

菌種活化方法有二種：

連續(xù)劃線法：將挑取有大腸桿菌的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面作連續(xù)劃法，勿劃破培養(yǎng)基；劃線完畢后，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

平板涂布法：挑去適量大腸桿菌于無菌水中，輕輕震蕩混勻，制成菌懸液；用移液槍吸取100μl于培養(yǎng)基，用涂布棒涂抹均勻；

抑菌定性試驗操作：

取一定量的大黃素甲醚晶體溶解于二甲基亞砜，放置于超聲儀中超聲10分鐘以加速溶解，配置成濃度為256ug/ml的大黃素甲醚溶液；

將制好的培養(yǎng)基融化，無菌操作臺開紫外燈殺菌后，在無菌操作臺上到平板，待培養(yǎng)基凝固后用活化后的黑根霉、黑曲霉；用牛肉膏培養(yǎng)基活化大腸桿菌、金黃色葡萄球菌制成菌懸液，然后用移液槍將菌懸液移取100ul到培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻；在涂布好的平板上，放上已經(jīng)滅菌的牛津杯--每個培養(yǎng)皿放置2個，樣品溶液一個，另一個放dmso做空白對照，在牛津杯內(nèi)用移液槍移取200ul的實驗材料溶液，然后在對照組內(nèi)注入200ul的dmso，將完成的黑根霉、黑曲霉培養(yǎng)皿小心移入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿移至37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h，觀察實驗結(jié)果；

最小抑菌濃度測定的操作：

準備4個潔凈干燥的25ml容量瓶，采用二倍稀釋法配置得到系列濃度梯度的大黃素甲醚溶液；

4個容量瓶依次做好標記：256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，分別記為容量瓶1、容量瓶2、容量瓶3、容量瓶4；從容量瓶1中取出12.5ml濃度為256μg/ml大黃素甲醚溶液，加入到容量瓶2中，用dmso定容，混合均勻，得到濃度為128μg/ml的大黃素甲醚溶液；照此方法，依次得到濃度為64μg/ml、32μg/ml的大黃素甲醚溶液；

以濃度為256μg/ml的大黃素甲醚為實驗對象為例；

取3個已倒完培養(yǎng)基的平板進行平行實驗，避免出現(xiàn)實驗的偶然性，減小實驗誤差；在3個培養(yǎng)基中分別打入大黃素甲醚溶液200μl，加入少量菌液，用涂布棒涂抹均勻；涂布完畢后稍稍靜置，以免菌液流動；靜置完畢后用封口膜封住以免被染菌，倒置放于溫度為37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時后，觀察實驗結(jié)果；

照此方法，對濃度為128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml的大黃素甲醚溶液也分別進行實驗；

抑菌率測定的操作：

以大腸桿菌為實驗菌種，實驗樣品為濃度為上一步驟中得到的最小抑菌濃度；

準備14支已滅菌的試管備用，分為實驗組和對照組；

用活化好的大腸桿菌制作菌懸液

實驗組：

取大黃素甲醚溶液0.5ml，菌液0.5ml，加入到裝有4.0ml無菌水的試管中，震蕩，得到稀釋10^-1的菌懸液；

另取裝有4.5ml無菌水的試管6支，用記號筆邊上10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；

從10^-1中取出0.5ml液體加入到10^-2中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10^-2菌液稀釋液；同法由10^-2的試管中吸取0.5ml稀釋液加入編號為10^-3的無菌水試管中，混勻后即為10^-3菌液稀釋液，依次連續(xù)稀釋至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7菌液稀釋液；

對照組：

取菌液0.5ml，加入到裝有4.5ml無菌水的試管中，震蕩，得到稀釋10^-1的菌懸液；

另取裝有4.5ml無菌水的試管6支，用記號筆邊上10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；

從10^-1中取出0.5ml液體加入到10^-2中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10^-2菌液稀釋液；同法由10^-2的試管中吸取0.5ml稀釋液加入編號為10^-3的無菌水試管中，混勻后即為10^-3菌液稀釋液，依次連續(xù)稀釋至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7菌液稀釋液；

抑菌率測定過程以實驗組操作為例：

取3個已倒完培養(yǎng)基的平板進行平行實驗，避免出現(xiàn)實驗的偶然性，減小實驗誤差；在3個培養(yǎng)基中分別打入實驗組10^-7菌液稀釋液200μl，用涂布棒涂抹均勻；涂布完畢后稍稍靜置，以免菌液流動；靜置完畢后用封口膜封住以免被染菌，倒置放于溫度為37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時后，觀察實驗結(jié)果；

電鏡實驗操作：

菌液的準備是將菌懸液和樣品一起放入液體培養(yǎng)基中，菌種是大腸桿菌，恒溫振蕩培養(yǎng)12h，37℃；菌液預(yù)處理如下：

將菌液以3000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清液；

注入2.5％戊二醛，靜置4h固定；

固定后離心，將細菌沉積，棄上清，以磷酸緩沖液pbs以1/15mol/l，ph＝7.2；配方：a2hpo4*12hpo4取23.876g+kh2po4取9.078g,分別溶于1l水中，然后將二者按照7:3的體積比混合,就可以了；重懸浮，重復(fù)3次，最后以pbs重懸。

結(jié)果與分析：

抗菌性結(jié)果：

大黃素甲醚對兩種細菌的抑制作用

圖1中抑菌圈直徑(對照組：1.30cm實驗組：2.30cm)；圖2中抑菌圈直徑(對照組：1.20cm實驗組：1.80cm)

通過圖2和圖3可以看出，大黃素甲醚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有良好的抗菌性能，且對大腸桿菌的抗菌活性較金葡有更強的抗菌活性。

大黃素甲醚對兩種真菌的抑制作用

圖3中抑菌圈直徑(對照組:0.80cm實驗組:1.80cm)，圖4中抑菌圈直徑(對照組:0.80cm實驗組:2.00cm)

通過圖3和圖4可以看出，大黃素甲醚對黑根霉、黑曲霉都有良好的抗菌性能。

如圖6、圖7和圖8所示：大黃素甲醚對大腸桿菌的最小抑菌濃度

在本階段實驗中，發(fā)現(xiàn)濃度為256μg/ml的樣品有相對較為明顯的抑菌效果。所以在下階段的抑菌率測定中以濃度為256μg/ml的樣品作為實驗對象。

大黃素甲醚最小抑菌濃度的抑菌率

表4大黃素甲醚最小抑菌濃度的菌落數(shù)和抑菌率

抑菌率(％)＝(對照組-實驗組)/對照組*100％

抗氧化性結(jié)果：

大黃素甲醚對dpph·的清除率

表5不同濃度的大黃素甲醚溶液對dpph·的清除率

表6大黃素甲醚與標準vc對dpph·的清除率

圖9為大黃素甲醚和抗壞血酸對dpph·的清除率

大黃素甲醚對超氧陰離子自由基的清除率：

表7不同濃度的大黃素甲醚溶液對o2－·的清除率

表8大黃素甲醚與抗壞血酸對o2－·的清除率

圖10為大黃素甲醚和抗壞血酸對o2－·的清除率

大黃素甲醚對羥自由基的清除率：

表9不同濃度的大黃素甲醚溶液對·oh的清除率

表10大黃素甲醚與抗壞血酸對·oh的清除率

圖11為大黃素甲醚和抗壞血酸對·oh的清除率

結(jié)論：

抗菌性實驗：大黃素甲醚的dmso溶液有抗菌活性，它的抑菌效果對大腸桿菌最為明顯，并且在濃度為256μg/ml時表現(xiàn)出良好的抗菌性能，當實驗菌種為大腸桿菌時，抑菌率能達到75.78％?？寡趸瘜嶒灒?1)在dpph自由基清除法、羥基自由基清除法和超氧陰離子自由基清除法三種測定方法下，大黃素甲醚溶液溶度與自由基清除率成正相關(guān)，表現(xiàn)為大黃素甲醚對自由基清除率隨樣品濃度的升高而升高；(2)通過與抗壞血酸(標準vc)抗氧化效果相比較，結(jié)果顯示在三種不同的方法下大黃素甲醚的抗氧化效果均低于抗壞血酸(標準vc)，也就是說大黃素甲醚具有一定的抗氧化作用。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。