本發(fā)明涉及保健品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，惡性腫瘤已成為威脅人類健康的主要疾病，其治療也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一。傳統(tǒng)的化療和放療在治療的同時(shí)，也產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。腫瘤的生物治療是繼傳統(tǒng)療法的第四種治療手段，目前的研究已證實(shí)，生物治療在腫瘤的治療中發(fā)揮著愈來愈大的作用，并有望成為攻克腫瘤的療法。
多肽從二十世紀(jì)初才開始受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)它區(qū)別于蛋白質(zhì)區(qū)別于氨基酸，具有藥物的作用。到了上個(gè)世紀(jì)九十年代才有了長足發(fā)展，在不斷更新的技術(shù)指導(dǎo)下，多肽的應(yīng)用范圍越來越廣，作用也越來越大，這才邁進(jìn)了我們的生活，在我們生活中占據(jù)的份額越來越大，多肽類藥物高效低毒特異性強(qiáng)具有區(qū)別于其他藥物的特有優(yōu)勢，正不斷影響著我們的生活。而且多肽潛力巨大，是生物科學(xué)發(fā)展的又一大突破和發(fā)展方向。
天然存在的海洋活性多肽由于在生物體中含量低，而且提取困難，難以實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)供給所需，化學(xué)人工合成多肽成本昂貴。所以，人們更多地把目光投向開發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物獲得活性多肽這條途徑上來。由于海洋生物生存的環(huán)境與陸地生物完全不同，如高壓、低溫、高溫和高鹽等極端環(huán)境，為了適應(yīng)這些極端的海洋生物環(huán)境，海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，同時(shí)，海洋生物蛋白資源無論在種類和數(shù)量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陸地蛋白資源，并且未得到很好的開發(fā)。種類繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的氨基酸序列，用特異的蛋白酶水解，就釋放出有活性的肽段。海洋生物蛋白資源是21世紀(jì)人類重要的蛋白類食物及生物活性物質(zhì)的重要來源。我國目前的海洋生物蛋白資源總量在世界各國名列前茅，但我國目前的蛋白類水產(chǎn)品中，除一部分直接食用外，大部分通過簡單的加工技術(shù)制成食品進(jìn)入市場，加工技術(shù)落后，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，產(chǎn)品的附加值低，使得產(chǎn)品在國際市場上的競爭力較差。因此，我國急需對海洋生物蛋白資源進(jìn)行優(yōu)化利用和高值化加工。
現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn103333940b的中國發(fā)明專利，公開了一種利用帶魚制備二肽基肽酶iv抑制肽的方法，步驟包括：將帶魚加水絞碎成均勻的魚肉漿；魚肉漿放入酶解罐中，添加內(nèi)切蛋白酶，攪拌水解4～12h，得水解液；升溫至95～100℃，保持10～15分鐘滅酶；將水解液冷至40～60℃，添加外切蛋白酶，攪拌水解2～8h；升溫至95～100℃，保持10～15分鐘滅酶；內(nèi)切蛋白酶為木瓜蛋白酶、neutrase中性蛋白酶、alcalase堿性蛋白酶中的一種。外切蛋白酶為flavourzyme風(fēng)味蛋白酶。將上述所得滅酶后的水解液離心取上清液；將上清液加入到超濾膜分離器中，調(diào)節(jié)超濾膜的壓力為0.05～0.1mpa，超濾膜的截留分子量為3000da，收集超濾膜透過液；采用親和層析方法分離純化dpp-iv抑制肽。海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，上述方法采用陸地上提取的蛋白酶對海洋生物進(jìn)行酶解，酶解效率低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種采用從海洋生物中提取的蛋白酶酶解金槍魚蛋白，從而得到具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚提取物的制備方法，制備得到的金槍魚提取物能有效抑制癌細(xì)胞dna的復(fù)制，使癌細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂間期。
本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚提取物的制備方法，包括復(fù)合酶酶解、等電點(diǎn)沉淀、超濾和納濾、hplc洗脫和冷凍干燥；復(fù)合酶酶解步驟為采用海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶酶解金槍魚魚肉勻漿液，并采用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶同時(shí)對金槍魚蛋白進(jìn)行酶解，可得到大量有活性的肽段。
作為優(yōu)選，金槍魚提取物中含有氨基酸序列為hshacasyycrclvlhpcvncycrcsr的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌細(xì)胞dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，從而抑制癌細(xì)胞dna的復(fù)制，使癌細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂間期；并且能促進(jìn)e-鈣黏蛋白的分泌，降低癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而降低其轉(zhuǎn)移的速度。
作為優(yōu)選，復(fù)合酶酶解步驟中海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的加入量為1~2wt%，酶解溫度為25~35℃，ph為7.0~9.0，酶解時(shí)間為50~70min。海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，金槍魚蛋白上有大量海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的酶切位點(diǎn)，酶解后可得到大量長短不同的肽鏈，酶解效率高。
作為優(yōu)選，等電點(diǎn)沉淀步驟為調(diào)節(jié)酶解液的ph為6.0~6.5，靜置后離心取沉淀。在上述ph值條件下，目的活性短肽呈電中性，在水中的溶解度快速下降，同時(shí)其活性未被破壞。
作為優(yōu)選，超濾和納濾步驟為用純水將等電點(diǎn)沉淀得到的沉淀溶解，先用2-4kda的超濾膜加壓超濾，再用納濾膜納濾去鹽，濃縮濾液。通過超濾，對目的活性短肽進(jìn)一步純化。
作為優(yōu)選，hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用1~3%三氟乙酸和98~99%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min；5~15min，用5~7%三氟乙酸和93~95%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min；15~30min，用8~12%三氟乙酸和88~92%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min。根據(jù)活性短肽的極性設(shè)計(jì)洗脫液組分及洗脫操作，將對癌細(xì)胞有抑制作用的活性短肽與其他物質(zhì)分離開來，對產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步純化。
作為優(yōu)選，hplc洗脫步驟中洗脫結(jié)束后收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮?；钚远屉脑?50nm處有較強(qiáng)吸收，可根據(jù)這個(gè)特性收集并富集活性短肽。
作為優(yōu)選，冷凍干燥步驟為：預(yù)凍：-35~-45℃預(yù)凍3~5h；冷凍干燥：-45~-35℃，0~4pa冷凍干燥5~7h，-10~-5℃，6~14pa冷凍干燥1~2h；升華干燥：13~20℃，50~60pa升華干燥2~3h；解析干燥：5~10℃，3~5pa解析干燥2~4h，得到金槍魚提取物。凍干整個(gè)過程都在程序的控制下，操作簡單，工序簡潔，自動(dòng)化程度高，減少了人力、物力。低溫下干燥能更好地保留活性短肽的活性；低壓下干燥，活性短肽不易氧化，療效更好；凍結(jié)時(shí)活性短肽形成“骨架”，干燥后保存原形，為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變，產(chǎn)品外觀更加優(yōu)良；復(fù)水性好，凍干活性短肽能迅速吸水還原成凍干前狀態(tài)，使用方便；脫水徹底，活性短肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于長途運(yùn)輸和長期保存。
作為優(yōu)選，冷凍干燥前加入40~50wt%輔料，輔料為甘露醇。上述輔料有利于產(chǎn)品成型，即防止在抽真空時(shí)藥物與水蒸氣一起飛散或成型時(shí)收縮。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1）海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，金槍魚蛋白上有大量海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的酶切位點(diǎn)，酶解后可得到大量長短不同的肽鏈，酶解效率高；2）制備方法簡單，所需設(shè)備量少，制備成本低廉，且每一步操作都有準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，重現(xiàn)性好，適合大規(guī)模生產(chǎn)；3）制備得到的活性短肽的純度高，活性短肽可有效抑制癌細(xì)胞dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，從而抑制癌細(xì)胞dna的復(fù)制，使癌細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂間期；并且能促進(jìn)e-鈣黏蛋白的分泌，降低癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而降低其轉(zhuǎn)移的速度。
具體實(shí)施例
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：
實(shí)施例1：
具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚提取物的制備方法，包括復(fù)合酶酶解、等電點(diǎn)沉淀、超濾和納濾、hplc洗脫和冷凍干燥；復(fù)合酶酶解步驟為采用海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶酶解金槍魚魚肉勻漿液，并采用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶同時(shí)對金槍魚蛋白進(jìn)行酶解，可得到大量有活性的肽段。
金槍魚提取物中含有氨基酸序列為hshacasyycrclvlhpcvncycrcsr的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌細(xì)胞dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，從而抑制癌細(xì)胞dna的復(fù)制，使癌細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂間期；并且能促進(jìn)e-鈣黏蛋白的分泌，降低癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而降低其轉(zhuǎn)移的速度。
復(fù)合酶酶解步驟中海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的加入量為1.5wt%，酶解溫度為30℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為60min。海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，金槍魚蛋白上有大量海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的酶切位點(diǎn)，酶解后可得到大量長短不同的肽鏈，酶解效率高。
等電點(diǎn)沉淀步驟為調(diào)節(jié)酶解液的ph為6.2，靜置后離心取沉淀。在上述ph值條件下，目的活性短肽呈電中性，在水中的溶解度快速下降，同時(shí)其活性未被破壞。
超濾和納濾步驟為用純水將等電點(diǎn)沉淀得到的沉淀溶解，先用2-4kda的超濾膜加壓超濾，再用納濾膜納濾去鹽，濃縮濾液。通過超濾，對目的活性短肽進(jìn)一步純化。
hplc洗脫步驟中洗脫步驟為洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮。根據(jù)活性短肽的極性設(shè)計(jì)洗脫液組分及洗脫操作，將對癌細(xì)胞有抑制作用的活性短肽與其他物質(zhì)分離開來，對產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步純化。
hplc洗脫步驟中洗脫結(jié)束后收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮。活性短肽在250nm處有較強(qiáng)吸收，可根據(jù)這個(gè)特性收集并富集活性短肽。
冷凍干燥步驟為：預(yù)凍：-40℃預(yù)凍4h；冷凍干燥：-40℃，2pa冷凍干燥6h，-7℃，10pa冷凍干燥1.4h；升華干燥：16℃，56pa升華干燥2.4h；解析干燥：8℃，4pa解析干燥3h，得到金槍魚提取物。凍干整個(gè)過程都在程序的控制下，操作簡單，工序簡潔，自動(dòng)化程度高，減少了人力、物力。低溫下干燥能更好地保留活性短肽的活性；低壓下干燥，活性短肽不易氧化，療效更好；凍結(jié)時(shí)活性短肽形成“骨架”，干燥后保存原形，為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變，產(chǎn)品外觀更加優(yōu)良；復(fù)水性好，凍干活性短肽能迅速吸水還原成凍干前狀態(tài)，使用方便；脫水徹底，活性短肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于長途運(yùn)輸和長期保存。
冷凍干燥前加入40wt%輔料，輔料為甘露醇。上述輔料有利于產(chǎn)品成型，即防止在抽真空時(shí)藥物與水蒸氣一起飛散或成型時(shí)收縮。
實(shí)施例2：
具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚提取物的制備方法，包括以下步驟：
1）復(fù)合酶酶解：采用海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶酶解金槍魚魚肉勻漿液，并采用28khz的超聲波輔助酶解。海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的加入量為1.9wt%，酶解溫度為32℃，ph為7.8，酶解時(shí)間為65min；
2）等電點(diǎn)沉淀：用1mol/l的稀鹽酸調(diào)節(jié)酶解液的ph為6.2，靜置2h后離心取沉淀；
3）超濾和納濾：用2倍體積的純水將等電點(diǎn)沉淀得到的沉淀溶解，先用3kda的超濾膜加壓超濾，再用納濾膜納濾去鹽，濃縮濾液；
4）hplc洗脫：洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮；
5）冷凍干燥：預(yù)凍：-40℃預(yù)凍4h；冷凍干燥：-40℃，2pa冷凍干燥6h，-7℃，10pa冷凍干燥1.4h；升華干燥：16℃，56pa升華干燥2.4h；解析干燥：8℃，4pa解析干燥3h，得到金槍魚提取物。冷凍干燥前加入45wt%輔料，輔料為甘露醇。金槍魚提取物中含有氨基酸序列為hshacasyycrclvlhpcvncycrcsr的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌細(xì)胞dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，從而抑制癌細(xì)胞dna的復(fù)制，使癌細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂間期；并且能促進(jìn)e-鈣黏蛋白的分泌，降低癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而降低其轉(zhuǎn)移的速度。
實(shí)施例3：
具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚提取物的制備方法，包括以下步驟：
1）復(fù)合酶酶解：采用海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶酶解金槍魚魚肉勻漿液，并采用26khz的超聲波輔助酶解。海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的加入量為1.8wt%，海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的質(zhì)量比為1:2，酶解溫度為30℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為55min；
2）等電點(diǎn)沉淀：用1mol/l的稀鹽酸調(diào)節(jié)酶解液的ph為6.2，靜置2h后離心取沉淀；
3）超濾和納濾：用2倍體積的純水將等電點(diǎn)沉淀得到的沉淀溶解，先用3kda的超濾膜加壓超濾，再用納濾膜納濾去鹽，濃縮濾液；
4）hplc洗脫：洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮；
5）冷凍干燥：預(yù)凍：-40℃預(yù)凍4h；冷凍干燥：-40℃，2pa冷凍干燥6h，-7℃，10pa冷凍干燥1.4h；升華干燥：16℃，56pa升華干燥2.4h；解析干燥：8℃，4pa解析干燥3h，得到金槍魚提取物。冷凍干燥前加入45wt%輔料，輔料為甘露醇。金槍魚提取物中含有氨基酸序列為hshacasyycrclvlhpcvncycrcsr的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌細(xì)胞dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，從而抑制癌細(xì)胞dna的復(fù)制，使癌細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂間期；并且能促進(jìn)e-鈣黏蛋白的分泌，降低癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而降低其轉(zhuǎn)移的速度。
本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。
以上所述的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
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<110>浦江縣泰如食品科技有限公司
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