本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化、結(jié)晶領(lǐng)域，涉及一種抑制力學(xué)感知蛋白pdlim3在純化過(guò)程中降解的方法。

背景技術(shù)：

pdlim3蛋白主要在心肌和骨骼肌中表達(dá)，可以和α輔肌動(dòng)蛋白結(jié)合，增強(qiáng)α輔肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白纖維的交聯(lián)。pdlim3蛋白在肌肉力學(xué)感知及信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。pdlim3蛋白的突變將會(huì)引起肌肉萎縮癥、心肌癥、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良等與肌肉相關(guān)的疾病。

通常，蛋白質(zhì)分子是不穩(wěn)定的，易受外部環(huán)境因素影響，在純化濃縮過(guò)程中易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解或變形，用于后續(xù)結(jié)晶的高濃度蛋白極難獲得。文獻(xiàn)1：“purification,characterization,andcrystallizationofmembraneboundescherichiacoli,tyrosinekinase[j].proteinexpression&purification,2016,125:34-42.”報(bào)道在制備和純化過(guò)程中，蛋白質(zhì)很容易出現(xiàn)降解、凝聚的傾向，導(dǎo)致獲得的樣品濃度降低、活性較差，在后續(xù)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中很難獲得蛋白質(zhì)晶體。文獻(xiàn)2：“towardthecrystallizationofphotosystemiicorecomplexfrompisumsativuml.[j].crystalgrowth&design,2010,10(8):3391-3396.”報(bào)道來(lái)自豌豆的光合系統(tǒng)ii核心復(fù)合物容易被氧化，使活性蛋白質(zhì)純度降低，進(jìn)而無(wú)法得到蛋白質(zhì)晶體。文獻(xiàn)3：“purificationandcharacterizationofanovelcoldshockprotein-likebacteriocinsynthesizedbybacillusthuringiensis[j].scirep,2017,6:35560.”報(bào)道蘇云金桿菌合成的冷休克蛋白質(zhì)無(wú)法承受高溫，在高溫下會(huì)部分發(fā)生降解，也難以得到蛋白質(zhì)晶體。

對(duì)于蛋白質(zhì)的純化，為獲得高濃度蛋白質(zhì)溶液，即使是較大分子量的蛋白質(zhì)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍會(huì)采用小截流孔徑的濃縮管來(lái)濃縮蛋白質(zhì)。文獻(xiàn)4：“ultrafiltrationbehaviorofanfc-fusionprotein:filtratefluxdataandmodeling[j].journalofmembranescience,2017,528:171-177.”報(bào)道采用10kda孔徑的超濾膜來(lái)超濾94kda的目標(biāo)蛋白，仍取得較高純度的樣品。文獻(xiàn)5：“food-gradesingle-cellproteinproduction,characterizationandultrafiltrationrecoveryofresidualfermentedwheyproteinsfromwhey[j].food&bioproductsprocessing,2016,99:156-165.”報(bào)道在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中，對(duì)于涉及的蛋白質(zhì)分子即使是選擇比蛋白質(zhì)分子量小很多倍的盡可能小孔徑的濃縮管，也會(huì)達(dá)到很好的濃縮效果，獲得的蛋白質(zhì)具有很好的活性。因而行業(yè)內(nèi)默認(rèn)選擇10kda孔徑的超濾膜來(lái)濃縮分子量大于10kda目標(biāo)蛋白樣品。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在濃縮過(guò)程中出現(xiàn)降解，常添加酶抑制劑等抑制蛋白質(zhì)降解，很少會(huì)從蛋白質(zhì)性質(zhì)入手解決降解問(wèn)題。由于力學(xué)感知蛋白pdlim3具有力學(xué)感知功能，因此對(duì)受力比較敏感，用10kda的超濾膜獲得的樣品，在純化濃縮過(guò)程中常用的10kda的超濾膜，由于截留小孔徑，導(dǎo)致蛋白pdlim3長(zhǎng)時(shí)間受力作用，降解嚴(yán)重，活性很低，純度很低，顯然這種常規(guī)的選擇方法并不能適用于力學(xué)感知蛋白pdlim3的純化方法。由于x射線衍射技術(shù)需要蛋白質(zhì)晶體來(lái)獲取蛋白質(zhì)衍射圖譜，高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體需要在高純度蛋白質(zhì)溶液中生長(zhǎng)。所以，獲得高質(zhì)量、高純度、高活性的力學(xué)感知蛋白pdlim3濃縮液具有極其重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種抑制力學(xué)感知蛋白pdlim3降解的純化方法，在純化后的濃縮過(guò)程中，盡可能減少力學(xué)感知蛋白pdlim3受力的大小和受力的時(shí)間，改善其力學(xué)環(huán)境，最終達(dá)到顯著抑制力學(xué)感知蛋白pdlim3降解的目的。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟：

第一步，表達(dá)力學(xué)感知蛋白pdlim3，將表達(dá)菌株接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600值為0.4～0.8時(shí)，加入摩爾濃度為1miptg的母液至iptg的終摩爾濃度為0.2～0.8mm，繼續(xù)培養(yǎng)3～8h；在0～4℃溫度下，1000～4000rpm離心菌液10～30min，棄掉上清液，收集菌體；

第二步，配置摩爾濃度為50mmtris-hcl、50mmnacl、ph8.0的裂解液，用裂解液重懸菌體，菌體與裂解液的質(zhì)量比為1:5～20；然后加入edta終摩爾濃度0.5～1.5mm、pmsf終摩爾濃度0.3～0.7mm、β-巰基乙醇終摩爾濃度5～15mm、lysozyme終濃度0.5-1.5mg/ml和甘油終體積濃度3～7％；將溶液混合均勻后，在0～4℃溫度下超聲破碎細(xì)胞0.5～1.5小時(shí)，最后在0～4℃下，10000～15000rpm離心10～60min，收集上清液；

第三步，用孔徑0.22μm的濾膜過(guò)濾上清液，然后向?yàn)V出物中加入edta終摩爾濃度0.5～1.5mm、pmsf終摩爾濃度0.3～0.7mm、β-巰基乙醇終摩爾濃度5～15mm、甘油終體積濃度3～7％和咪唑終摩爾濃度5～15mm；混合均勻后，加入nisepharose^tm6fastflow填料，濾出物與nisepharose^tm6fastflow填料體積比為50～200：1，在0-4℃下旋轉(zhuǎn)混勻1-6h，使目的蛋白與填料充分結(jié)合；采用重力流色譜柱和摩爾濃度為80-500mm的咪唑溶液對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；

第四步，使用截留分子量25-30kda超濾膜的超濾管過(guò)濾洗脫液，濃縮目的蛋白。

本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明在純化濃縮過(guò)程中顯著抑制力學(xué)感知蛋白pdlim3的降解，行業(yè)內(nèi)默認(rèn)選擇10kda孔徑的超濾膜來(lái)濃縮分子量大于10kda目標(biāo)蛋白樣品，力學(xué)感知蛋白pdlim3會(huì)出現(xiàn)大量降解，而采用本發(fā)明可以顯著抑制力學(xué)感知蛋白pdlim3的降解。

2)本發(fā)明大大縮短了力學(xué)感知蛋白pdlim3的濃縮時(shí)間，顯著提高其濃縮效率，行業(yè)內(nèi)默認(rèn)選擇10kda孔徑的超濾膜濃縮樣品，濃縮效率極低，本發(fā)明降低時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本。

3)本發(fā)明成功獲得具有較高的生物活性的力學(xué)感知蛋白pdlim3，可用于后續(xù)蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)及蛋白質(zhì)功能等研究，以及后續(xù)治療肌肉萎縮等理性藥物的開發(fā)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明截留分子量10kda的示意圖，其中，m：蛋白markerd530a；泳道1：濃縮樣品1(1h)；泳道2：濃縮樣品2(0.5h)；泳道3：初始樣品(箭頭指目的蛋白)；

圖2是本發(fā)明截留分子量30kda的示意圖，其中，m：蛋白markerd532a；泳道1：濃縮樣品1(0.5h)；泳道2：濃縮樣品2(1h)；泳道3：初始樣品(箭頭指目的蛋白)；

圖3是抑制力學(xué)感知蛋白pdlim3降解的純化方法流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明包括但不僅限于下述實(shí)施例。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案步驟如下：

第一步，表達(dá)力學(xué)感知蛋白pdlim3；

將表達(dá)菌株接種于100-1000mllb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600值達(dá)到0.4-0.8時(shí)，加入摩爾濃度為1miptg母液至終摩爾濃度為0.2-0.8mm，繼續(xù)培養(yǎng)3-8h。在0-4℃溫度下，1000-4000rpm離心菌液10-30min，棄掉上清液，收集菌體。

第二步，菌體破碎，離心收集上清液；

配置摩爾濃度為50mmtris-hcl、50mmnacl、ph8.0的裂解液，用10-30ml裂解液重懸菌體。然后加入edta終摩爾濃度0.5-1.5mm、pmsf終摩爾濃度0.3-0.7mm、β-巰基乙醇終摩爾濃度5-15mm、lysozyme終濃度0.5-1.5mg/ml(質(zhì)量體積比)和甘油終濃度3-7％(體積比)。將溶液混合均勻后，在0-4℃溫度下超聲破碎細(xì)胞0.5-1.5小時(shí)，最后在0-4℃下，10000-15000rpm離心10-60min，收集上清液。

第三步，重力流ni凝膠親和層析；

用孔徑0.22μm濾膜過(guò)濾上清液，然后向?yàn)V出物加入edta終摩爾濃度0.5-1.5mm、pmsf終摩爾濃度0.3-0.7mm、β-巰基乙醇終摩爾濃度5-15mm、甘油終濃度3-7％(體積比)和咪唑終摩爾濃度5-15mm?；旌暇鶆蚝螅尤?-5ml的nisepharose^tm6fastflow填料，在0-4℃下旋轉(zhuǎn)混勻1-6h，使目的蛋白與填料充分結(jié)合。最后，用novagen公司生產(chǎn)的重力流色譜柱，用摩爾濃度為80-500mm30-60ml咪唑溶液對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫。

第四步，采用25-30kda截留量的超濾膜，達(dá)到抑制力學(xué)感知蛋白pdlim3降解的目的，最終獲得高濃度的目標(biāo)蛋白液；

使用截留分子量25-30kda超濾膜的超濾管濃縮目的蛋白，收集濃縮液。具體濃縮取樣方式：向截留分子量為25-30kda超濾管中加入2-10ml蛋白純化液，在0-4℃，5000-10000g下離心，依次隔0.5h、1h，分別從對(duì)應(yīng)的濃縮管中取出10-20μl濃縮樣。

第五步，sds-page跑膠，檢測(cè)純化濃縮結(jié)果。

取第四步中樣品，以及濃縮前樣品做sds-page電泳分析。未濃縮及濃縮液各取10-20μl，加入等體積的loadingbuffer，在95-99℃下，加熱4-6min后，離心，進(jìn)行sds-page電泳。

本發(fā)明的實(shí)施例提出在濃縮過(guò)程中，降低對(duì)力學(xué)感知蛋白pdlim3施加的環(huán)境外力的方法，即減小剪切力，從而抑制力學(xué)感知蛋白pdlim3的降解，提高濃度，并保持其活性。

本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下：

第一步：融合蛋白pdlim3的表達(dá)

將保存的表達(dá)菌株接種于500mllb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm條件下培養(yǎng)至od600值達(dá)到0.6時(shí)，加入1miptg母液至終濃度為0.5mm，繼續(xù)在37℃、220rpm條件下培養(yǎng)5h。在4℃溫度下，4000rpm離心菌液30min，棄掉上清液，收集菌體。

第二步：菌體破碎，離心收集上清

配置50mmtris-hcl，50mmnacl，ph8.0的裂解液，用20ml裂解液重懸菌體。然后加入edta終濃度1mm、pmsf終濃度0.5mm、β-巰基乙醇終濃度10mm、lysozyme終濃度1mg/ml和甘油終濃度5％(v/v)。將溶液混合均勻后，在4℃溫度下超聲破碎細(xì)胞，最后在4℃下，15000rpm離心30min，收集上清液，共40ml。

第三步：重力流ni凝膠親和層析

平衡buffer：tris-hcl50mm，nacl50mm，ph8.0，平衡柱子。

用孔徑0.22μm濾膜過(guò)濾收集的40ml上清液，然后加入edta終濃度1mm、pmsf終濃度0.5mm、β-巰基乙醇終濃度10mm、甘油終濃度5％(v/v)和咪唑終濃度10mm?；旌暇鶆蚝螅尤?.5ml的nisepharose^tm6fastflow填料，在4℃下旋轉(zhuǎn)混勻4h，使目的蛋白與填料充分結(jié)合。最后，用novagen公司生產(chǎn)的重力流色譜柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫。

首先，準(zhǔn)備洗脫液，先洗去柱子上的雜蛋白。

其次，洗脫目的蛋白。具體做法是：將與ni填料混合的上清倒入重力流色譜柱中，接取穿透液，然后，按咪唑濃度從小到大的順序依次洗脫ni填料，收集洗脫液。

第四步，分別使用截留分子量為10kda和30kda超濾膜的超濾管濃縮目的蛋白，收集濃縮液。具體濃縮取樣方式：(1)向2只截留分子量為10kda超濾管中分別加入4ml蛋白純化液，在4℃，5000g下離心，依次隔0.5h、1h，分別從對(duì)應(yīng)的濃縮管中取出20μl濃縮樣。(2)向2只截留分子量為30kda超濾管中分別加入4ml蛋白純化液，在4℃，5000g下離心，依次隔0.5h、1h，分別從對(duì)應(yīng)的濃縮管中取出20μl濃縮樣。備用做sds-page電泳分析。

第五步，sds-page跑膠，檢測(cè)結(jié)果。

取第四步中樣品，以及濃縮前樣品做sds-page電泳分析。未濃縮及濃縮液各取20μl，加入等體積的loadingbuffer，在99℃下，加熱5min后，6000rpm離心30s，進(jìn)行sds-page電泳，如圖1和圖2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

使用截留分子量10kda超濾膜的超濾管濃縮蛋白液。如圖1所示，樣品經(jīng)sds-page檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，濃縮0.5h樣品與初始樣品相比變化不大，濃縮1h樣品比初始樣品顯著減少，表明目的蛋白發(fā)生降解。對(duì)于截留分子量為30kda的超濾管(圖2)，濃縮1h的超濾溶液中目的蛋白含量對(duì)比濃縮0.5h的明顯增加，濃縮0.5h的超濾溶液中目的蛋白含量對(duì)比原始樣品含量明顯增加，濃縮1h的超濾溶液中目的蛋白含量對(duì)比原始樣品含量大大增加。對(duì)比截留分子量為10kda和30kda超濾管濃縮0.5h超濾溶液中目的蛋白含量發(fā)現(xiàn)，30kda超濾管中蛋白質(zhì)溶液濃度明顯高于10kda超濾管。因而截留分子量為30kda的超濾管可以避免力學(xué)感知蛋白pdlim3純化過(guò)程中受到較大剪切力作用，降解嚴(yán)重，活性很低，純度很低的情況，可獲得高質(zhì)量，高純度，高活性的力學(xué)感知蛋白pdlim3溶液。此外運(yùn)用這種純化方法可極大提高力學(xué)感知蛋白pdlim3濃縮效率。