本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及石莼活性多肽的制備方法。

背景技術(shù)：

石莼屬綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、石莼屬，其藻體呈黃綠色，有兩層細(xì)胞組成的膜狀體，邊緣寬可達(dá)厘米左右。石莼多生長在中、低潮帶的巖石上或石沼中，南方種類顏色偏黃，北方種類顏色偏綠，藻體含有多種維生素、麥角固醇，以及酸及丙、丁、戊、十四、十六酸有機(jī)酸等。石莼是一種大型海藻，廣泛分布于西太平洋沿海。其適溫范圍0-35℃，適鹽范圍15-35%，具有很強(qiáng)的生命力和再生力，生長極潑辣，在水質(zhì)肥沃的內(nèi)灣生長更為旺盛，是我國野生藻類中資源極為豐富的一種。它不僅藻體鮮艷、味道鮮美，而且富含許多營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。但其在海藻加工工業(yè)中的利用價值遠(yuǎn)不如褐藻和紅藻，因而通常作為天然垃圾廢棄堆積，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。

干石莼經(jīng)過化學(xué)分析表明，主要成分有粗纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)及灰分，并含有少量脂肪，石莼中還含有k、na、ca、mg、ni、zn、mo、cu等多種微量元素。蛋白質(zhì)含量較高，一般含量在17～26%之間，不同產(chǎn)地的石莼蛋白質(zhì)含量不盡相同、另外季節(jié)等因素也會對孔石莼中的蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生一定的影響作用，石莼蛋白質(zhì)中含有豐富的氨基酸，其中有8種為人體必需氨基酸。石莼功用始載于《本草拾遺》，日“石莼生南海，附石而生，似紫菜，色青”，主“味甘無毒，入水，利小便”，《本草綱目》中記載謂“出閩、浙者，大葉似菜”，故也名海青菜，有軟堅散結(jié)、清熱解毒、利水降脂等功效。藥理研究表明，石莼在降血脂、降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化以及克生作用等多方面都顯現(xiàn)出了較強(qiáng)的生物活性。石莼可作海菜食用，有清口、解毒、消炎等功效，也可以用于防治中暑、消腫，治喉痛、腸胃炎，除口臭等。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為cn102851345b的中國發(fā)明專利，公開了小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，首先采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎機(jī)提取小球藻蛋白，再用胰蛋白酶水解小球藻蛋白，超濾離心管過濾，獲得分子量大小范圍為0-3kd、3-5kd、5-10kd以及大于10kd的小球藻多肽。該方法制備的小球藻多肽對人肝癌細(xì)胞hepg2體外生長具有一定的抑制作用，有利于抗腫瘤保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)利用，但是制備周期長，小球藻多肽得率低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種活性蛋白肽制備效率高、得率高、純度高、能耗低、對環(huán)境友好的石莼活性多肽的制備方法。

本發(fā)明針對上述技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：石莼活性多肽的制備方法，包括細(xì)胞破碎、鹽析、透析、蛋白酶解、超濾，具體包括以下步驟：

細(xì)胞破碎：將石莼粉按1:14-16料液比加水混勻，放入溫度4-6℃、流速18-21ml/min、壓力110-130mpa、循環(huán)2-3次的細(xì)胞破碎儀內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞破碎，過濾，將濾液在溫度為40-50℃、功率為200-300w的超聲波處理25-35min，然后經(jīng)3-5℃、7000-9000rpm的低溫離心機(jī)離心18-22min，即得蛋白提取液，該步驟結(jié)合細(xì)胞破碎儀與超聲波進(jìn)行細(xì)胞破壁，不影響蛋白質(zhì)的活性，能夠大大縮短細(xì)胞破壁的時間，提高工作效果，可大批量化破碎藻細(xì)胞，適用于工業(yè)化生產(chǎn)；

鹽析：向蛋白提取液中加入(nh4)2so4至20-25%飽和度，靜止15-20min，繼續(xù)加入(nh4)2so4至50-55%飽和度，靜止15-20min，然后在3-5℃、4000-6000rpm下離心20-25min，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗，且采用不同濃度的硫酸銨溶液，可縮短沉淀時間，效果良好；

透析：將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，在ddh2o中透析，更換ddh2o4-6次，袋內(nèi)溶液冷凍干燥，即得石莼蛋白，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到除去(nh4)2so4小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

蛋白酶解：將石莼蛋白按1:4-6料液比加水混勻，條件ph至7-8，加1000-1200u/g的胰蛋白酶酶和600-800u/g的木瓜蛋白酶，在45-50℃下酶解6-8h，滅酶，冷卻，離心，上清液即為酶解液，該步驟采用雙酶酶解法制備石莼活性多肽，利用兩種蛋白酶作用的專一性，使原料蛋白質(zhì)充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，使蛋白質(zhì)盡可能的降解為活性多肽，且可使活性肽具有味道鮮美、營養(yǎng)豐富的優(yōu)點；

超濾：將酶解液用分子截留量為3-5kda的超濾膜超濾，超濾壓力為0.2-0.22mpa，即得石莼活性多肽，其氨基酸序列為hshsvcgyyvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，該活性多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，結(jié)合細(xì)胞代謝中的自由基及過氧化物，防止線粒體的脂質(zhì)過氧化等，保護(hù)細(xì)胞抵抗衰老，促進(jìn)uvb老化的hsf的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生的能力，能顯著促進(jìn)人成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的合成，強(qiáng)化結(jié)締組織，促進(jìn)細(xì)胞活性，從而提升其彈性，減少皺紋，增強(qiáng)光澤與透明度，具有抗皮膚光老化活性的活性，能夠延緩皮膚的衰老，可用于化妝品領(lǐng)域。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明提供的石莼活性多肽的制備方法，制備效率高、得率高、純度高、能耗低、對環(huán)境友好，工藝簡單有效，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量大，適合大規(guī)模制備石莼活性多肽；該制備方法采用的雙酶酶解法可利用兩種蛋白酶作用的專一性，使原料蛋白質(zhì)充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，使蛋白質(zhì)盡可能的降解為活性多肽；該提取方法得到的活性多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，結(jié)合細(xì)胞代謝中的自由基及過氧化物，防止線粒體的脂質(zhì)過氧化等，保護(hù)細(xì)胞抵抗衰老；該活性多肽能促進(jìn)uvb老化的hsf的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生的能力，能顯著促進(jìn)人成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的合成，強(qiáng)化結(jié)締組織，促進(jìn)細(xì)胞活性，從而提升其彈性，減少皺紋，增強(qiáng)光澤與透明度，具有抗皮膚光老化活性的活性，能夠延緩皮膚的衰老，可用于化妝品領(lǐng)域。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：

實施例1：

石莼活性多肽的制備方法，包括細(xì)胞破碎、鹽析、透析、蛋白酶解、超濾，具體包括以下步驟：

1）細(xì)胞破碎：將石莼粉按1:15料液比加水混勻，放入溫度4℃、流速18ml/min、壓力120mpa、循環(huán)3次的細(xì)胞破碎儀內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞破碎，過濾，將濾液在溫度為45℃、功率為200w的超聲波處理30min，然后經(jīng)4℃、8000rpm的低溫離心機(jī)離心20min，即得蛋白提取液，該步驟結(jié)合細(xì)胞破碎儀與超聲波進(jìn)行細(xì)胞破壁，不影響蛋白質(zhì)的活性，能夠大大縮短細(xì)胞破壁的時間，提高工作效果，可大批量化破碎藻細(xì)胞，適用于工業(yè)化生產(chǎn)；

2）鹽析：向蛋白提取液中加入(nh4)2so4至25%飽和度，靜止15min，繼續(xù)加入(nh4)2so4至55%飽和度，靜止20min，然后在4℃、5000rpm下離心25min，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗，且采用不同濃度的硫酸銨溶液，可縮短沉淀時間，效果良好；

3）透析：將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，在ddh2o中透析，更換ddh2o5次，袋內(nèi)溶液冷凍干燥，即得石莼蛋白，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到除去(nh4)2so4小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

4）蛋白酶解：將石莼蛋白按1:5料液比加水混勻，調(diào)節(jié)ph至7.5，加1200u/g的胰蛋白酶酶和700u/g的木瓜蛋白酶，在45℃下酶解8h，在100℃水浴滅酶16min，冷卻至室溫，在4℃、5000rpm下離心25min，上清液即為酶解液，該步驟采用雙酶酶解法制備石莼活性多肽，利用兩種蛋白酶作用的專一性，使原料蛋白質(zhì)充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，使蛋白質(zhì)盡可能的降解為活性多肽，且可使活性肽具有味道鮮美、營養(yǎng)豐富的優(yōu)點；

5）超濾：將酶解液用分子截留量為3kda的超濾膜超濾，超濾壓力為0.2mpa，即得石莼活性多肽，其氨基酸序列為hshsvcgyyvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，該活性多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，結(jié)合細(xì)胞代謝中的自由基及過氧化物，防止線粒體的脂質(zhì)過氧化等，保護(hù)細(xì)胞抵抗衰老，促進(jìn)uvb老化的hsf的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生的能力，能顯著促進(jìn)人成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的合成，強(qiáng)化結(jié)締組織，促進(jìn)細(xì)胞活性，從而提升其彈性，減少皺紋，增強(qiáng)光澤與透明度，具有抗皮膚光老化活性的活性，能夠延緩皮膚的衰老，可用于化妝品領(lǐng)域。

實施例2：

石莼活性多肽的制備方法，包括細(xì)胞破碎、鹽析、透析、蛋白酶解、超濾，具體包括以下步驟：

1）將石莼粉按1:14料液比加水混勻，放入溫度4℃、流速21ml/min、壓力130mpa、循環(huán)2次的細(xì)胞破碎儀內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞破碎，過濾，將濾液在溫度為50℃、功率為200w的超聲波處理35min，然后經(jīng)低溫離心機(jī)離心即得蛋白提取液，該步驟結(jié)合細(xì)胞破碎儀與超聲波進(jìn)行細(xì)胞破壁，不影響蛋白質(zhì)的活性，能夠大大縮短細(xì)胞破壁的時間，提高工作效果，可大批量化破碎藻細(xì)胞，適用于工業(yè)化生產(chǎn)；

2）鹽析：向蛋白提取液中加入(nh4)2so4至22%飽和度，靜止18min，繼續(xù)加入(nh4)2so4至52%飽和度，靜止16min，離心，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗，且采用不同濃度的硫酸銨溶液，可縮短沉淀時間，效果良好；

3）透析：將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，在ddh2o中透析，更換ddh2o4次，袋內(nèi)溶液冷凍干燥，即得石莼蛋白，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到除去(nh4)2so4小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

4）蛋白酶解：將石莼蛋白按1:4料液比加水混勻，調(diào)節(jié)ph至7.8，加1100u/g的胰蛋白酶酶和800u/g的木瓜蛋白酶，在45℃下酶解8h，滅酶，冷卻，離心，上清液即為酶解液，該步驟采用雙酶酶解法制備石莼活性多肽，利用兩種蛋白酶作用的專一性，使原料蛋白質(zhì)充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，使蛋白質(zhì)盡可能的降解為活性多肽，且可使活性肽具有味道鮮美、營養(yǎng)豐富的優(yōu)點；

5）超濾：將酶解液用分子截留量為4kda的超濾膜超濾，超濾壓力為0.21mpa，即得石莼活性多肽，其氨基酸序列為hshsvcgyyvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，該活性多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，結(jié)合細(xì)胞代謝中的自由基及過氧化物，防止線粒體的脂質(zhì)過氧化等，保護(hù)細(xì)胞抵抗衰老，促進(jìn)uvb老化的hsf的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生的能力，能顯著促進(jìn)人成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的合成，強(qiáng)化結(jié)締組織，促進(jìn)細(xì)胞活性，從而提升其彈性，減少皺紋，增強(qiáng)光澤與透明度，具有抗皮膚光老化活性的活性，能夠延緩皮膚的衰老，可用于化妝品領(lǐng)域。

實施例3：

石莼活性多肽的制備方法：將石莼粉按1:16料液比加水混勻，放入溫度6℃、流速20ml/min、壓力110mpa、循環(huán)3次的細(xì)胞破碎儀內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞破碎，過濾，將濾液在溫度為48℃、功率為220w的超聲波處理30min，離心；向離心液中加入(nh4)2so4至25%飽和度，靜止18min，繼續(xù)加入(nh4)2so4至53%飽和度，靜止17min，離心，即得鹽析沉淀物；將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，在ddh2o中透析，更換ddh2o6次，袋內(nèi)溶液冷凍干燥，即得石莼蛋白；將石莼蛋白按1:4料液比加水混勻，調(diào)節(jié)ph至7.8，加1200u/g的胰蛋白酶酶和800u/g的木瓜蛋白酶，在50℃下酶解6h，滅酶，冷卻，離心；將上清液用分子截留量為5kda的超濾膜超濾，超濾壓力為0.2mpa，即得石莼活性多肽。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>舟山富晟食品科技有限公司

<120>石莼活性多肽的制備方法

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