專利名稱：一種沙門菌熒光定量pcr檢測和分型的引物、探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及沙門菌分子診斷的熒光定量PCR檢測試劑和檢測方法。此發(fā)明有效擴(kuò)增所有株的沙門菌(沙門菌ニ個種、腸道沙門菌的6個亞種)。此外，高分辨率熔解曲線技術(shù)方便地把沙門菌分成3組:i)重要的致病菌腸道亞種(熔解溫度69.5°C)，ii)豪頓亞種(64.20C )和雙亞利桑拉亞種(63.8°C), iii)邦戈?duì)柹抽T菌(54.8°C )、英迪加亞種(57°C )、薩拉姆亞種(55.5°C)、亞利桑那亞種(54.50O0
背景技術(shù)：
沙門菌(Salmonella spp.)能引起人和動物多種不同臨床表現(xiàn)的沙門菌病，也是人類食物中毒的主要病因之一，對醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)均十分重要。沙門菌屬分為腸道沙門菌(S.enterica)和邦戈?duì)柹抽T菌(S.bongori)。腸道沙門菌又分為6個亞種:腸道亞種(S.enterica enterica簡寫為S.enterica),薩拉姆亞種(S.salamae),亞利桑那亞種(S.arizonae)，雙亞利桑那亞種(S.diarizonae)，豪頓亞種(S.houtanae)以及英迪加亞種(S.1ndica)。沙門菌感染的診斷主要依賴于細(xì)菌培養(yǎng)、血清凝集試驗(yàn)以及分子診斷技木。但是，沒有単一的診斷方法可以方便地檢測和區(qū)分所有株的沙門菌(沙門菌ニ個種、腸道沙門菌的6個亞種)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適合臨床使用的檢測所有株沙門菌的定量PCR檢測技木。同時基于高靈敏度熔解曲線技術(shù)方便的區(qū)分邦戈?duì)柹抽T菌和腸道沙門菌的 不同亞種。本發(fā)明的原理和核心是科學(xué)地設(shè)計(jì)擴(kuò)增和檢測沙門菌的特異、高效的引物和探針。在保證設(shè)計(jì)的引物高效擴(kuò)增沙門菌、設(shè)計(jì)的探針特異檢測沙門菌的同吋，確保此引物和探針不擴(kuò)增和檢測其它類似的細(xì)菌。此外，設(shè)計(jì)的探針同沙門菌的堿基序列吻合程度不同；因此，高分辨率熔點(diǎn)曲線技術(shù)會顯示沙門菌的不同熔解溫度，這可以方便的用于基因分型。從GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取如下沙門菌(種和亞種的代表株)以及相關(guān)細(xì)菌的ttrRSBCA的序列后,用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法對所有序列進(jìn)行對齊:邦戈?duì)柹抽T菌，基因序列號，AY578066;腸道沙門菌薩拉姆亞種，基因序列號，AY578070;腸道沙門菌亞利桑那亞種，基因序列號，CP000880;腸道沙門菌雙亞利桑那亞種，基因序列號，AY578069.1;腸道沙門菌豪頓亞種，基因序列號，AY578068;腸道沙門菌英迪加亞種，基因序列號，AY578065);腸道沙門菌腸道亞種的代表株:S.Gallinarum,基因序列號，AM933173; S.Enteritidis,基因序列號，AM933172;S.Weltevreden,基因序列號,FR775221;S.Paratyphi,基因序列號，CP000857; S.Typhi LT2,基因序列號，AF282268; S.Dublin,基因序列號，CPOO1144。圖1、圖2、圖3、圖4顯示設(shè)計(jì)的引物和探針如下:上游引物:5’-GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3’ (SEQ ID N0.1)下游引物:5’-CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3’ (SEQ ID N0.2)探針-1:5，-ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3，(SEQID N0.3)探針-2:5，-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3’(SEQ ID N0.4)本發(fā)明還公開了沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型試劑盒，包括包括5倍定量PCR反應(yīng)液22 μ l，以及22 μl的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5uM的上游引物、5 μ M下游引物、1 μ M的探針-1、1 μ M的探針-2。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了沙門菌分型方法，該方法包括以下步驟:(1)用上述引物和探針PCR擴(kuò)增待測樣本，擴(kuò)增出210bp的條帶，且熒光檢測在640nm波長增強(qiáng)的為沙門菌陽性樣本；(2) PCR完成后，對步驟(1)沙門菌陽性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解溫度對沙門菌進(jìn)行分型，分型標(biāo)準(zhǔn)是:i)重要的致病菌腸道亞種(熔解溫度69.5°C), ii)豪頓亞種(熔解溫度64.2°C)和雙亞利桑拉亞種(熔解溫度63.8°C)，iii)邦戈?duì)柹抽T菌(熔解溫度54.8 ℃ )、英迪加亞種(熔解溫度57 ℃ )、薩拉姆亞種(熔解溫度55.5℃、亞利桑那亞種(熔解溫度54.5℃沙門菌PCR特異性的確定:本發(fā)明的PCR技術(shù)特異性從三個方面得到保證。i)由Intergrated DNA Technology公司合成如下6個沙門菌的代表株,此序列涵蓋PCR的擴(kuò)增區(qū)域:邦戈?duì)柹抽T菌，腸道沙門菌薩拉姆亞種，腸道沙門菌亞利桑那亞種，腸道沙門菌雙亞利桑那亞種，腸道沙門菌豪頓亞種，腸道沙門菌英迪加亞種，腸道沙門菌腸道亞種的代表株傷寒沙門菌。用設(shè)計(jì)的PCR系統(tǒng)(上游引物、下游引物、探針-1、探針-2)對合成的沙門菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增；ii)對15株沙門菌陽性株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；iii)對陰性對照和其它類似的格蘭氏陰性細(xì)菌的核酸(Escherichia coli, Pasteurella multocida andPseudomonas aeruginosa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；iv)觀察以上擴(kuò)增對象在PCR過程中突光強(qiáng)度(640nm)的變化，以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。熒光在640nm波長出現(xiàn)或增強(qiáng)，顯示陽性；沙門菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳顯示預(yù)期的210bp的條帶；
iii)對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行測序，測序的結(jié)果和GenBank的序列進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的沙門菌PCR特異的擴(kuò)增沙門菌的不同種和亞種，而不擴(kuò)增其他類似的細(xì)菌。沙門菌PCR的靈敏度的確定:由Intergrated DNA Technology合成沙門菌及相關(guān)細(xì)菌的ttrRSBCA的序列。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技木，計(jì)算合成物所含的ttrRSBCA的基因拷貝的絕對數(shù)目。隨后，對合成物進(jìn)行稀釋，制備每10 u l合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的ttrRSBCA。用上述的PCR系統(tǒng)擴(kuò)增含不同濃度ttrRSBCA的沙門菌，依此確定本發(fā)明檢測沙門菌的靈敏度。結(jié)果顯示，此發(fā)明可以擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)10拷貝的沙門菌ttrRSBCA。分型鑒別:PCR完成后，對沙門菌的不同種和亞種的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，觀察不同株沙門菌的熔解溫度。由于設(shè)計(jì)的引物特異地?cái)U(kuò)增所有株的沙門菌，而設(shè)計(jì)的探針和不同種和亞種沙門菌有不同程度的差異(圖3、圖4)，這樣不同株的沙門菌會顯示不同的熔解溫度，而方便的用于基因分型。高分辨率熔解曲線技術(shù)方便地把沙門菌分成3組(圖5):i)重要的致病菌腸道亞種(熔解溫度69.5°C), ii)豪頓亞種(熔解溫度64.2°C)和雙亞利桑拉亞種(熔解溫度63.8°C)，iii)邦戈?duì)柹抽T菌(熔解溫度54.8で)、英迪加亞種(熔解溫度57°C)、薩拉姆亞種(熔解溫度55.5°C)、亞利桑那亞種(熔解溫度54.50O0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異、靈敏地檢測所有株的沙門菌，而且方便地對沙門菌進(jìn)行基本分子定型。i)傳統(tǒng)的的沙門菌的培養(yǎng)和分離(增值培養(yǎng)、選擇和篩選培養(yǎng))、鑒定、生化試驗(yàn)等的流程需要2-4天，本發(fā)明僅需2-4個小時(包括DNA提取約90分鐘、PCR約60分鐘、高分辨率熔解曲線分析5分鐘、結(jié)果判定10分鐘)；ii)傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)檢測沙門菌法，需要活的、可繁殖的細(xì)菌，而此方法僅需要沙門菌的核酸，不需要活的細(xì)菌；可以凍存樣品用于本發(fā)明的沙門菌檢測，對采樣的要求降低，而易于本技術(shù)的推廣；iii)本發(fā)明是定量的技木，而傳統(tǒng)的沙門菌分離技術(shù)只給與陽性或者陰性的定性結(jié)果；
iv)現(xiàn)有的沙門菌的PCR診斷方法主要擴(kuò)增對象是腸道沙門菌腸道亞種，而本方法可以擴(kuò)增沙門菌的2個種和腸道沙門菌的6個亞種；更有臨床意義的是，本發(fā)明可以方便的把主要病原菌(腸道沙門菌腸道亞種)和邦戈?duì)柹抽T菌、腸道沙門菌的其它亞種區(qū)分開。本發(fā)明的技術(shù)相比，可以方便地廣泛的用于診斷人畜沙門菌的感染和細(xì)菌性食物中毒。


圖1:沙門菌熒光定量PCR的上游引物。上游引物的序列為:5’-GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3’，含 2 個 degenerate堿基設(shè)計(jì)(Y)，能有效地?cái)U(kuò)增邦戈?duì)柹抽T菌、腸道沙門菌的5個亞種(薩拉姆亞種，亞利桑那亞種，雙亞利桑那亞種，豪頓亞種，英迪加亞種)、腸道沙門菌腸道亞種的代表株(S.Gallinarum, S.Enteritidis, S.ffeltevreden, S.Paratyphi, S.Typhi LT2, S.Dublin)。

圖2:沙門菌熒光定量PCR的下游引物。下游游引物的序列為:5’-CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3’，含 I 個 degenerate 堿基設(shè)計(jì)(M)。引物和圖示的序列成反義關(guān)系。PCR擴(kuò)增、凝膠電泳等確認(rèn)，此序列能有效地?cái)U(kuò)增邦戈?duì)柹抽T菌、腸道沙門菌的5個亞種(薩拉姆亞種，亞利桑那亞種，雙亞利桑那亞種，豪頓亞種,英迪加亞種)、腸道沙門菌腸道亞種的代表株(S.Gallinarum, S.Enteritidis, S.ffeltevreden, S.Paratyphi, S.Typhi LT2, S.Dublin)。圖3:沙門菌熒光定量PCR的6-FAM探針。探針-1(6-FAM 探針)的序列為 5’ -ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3，，和不同株的沙門菌ttrRSBCA基因有1-3個堿基的不吻合。PCR擴(kuò)增、凝膠電泳等確認(rèn)，探針和PCR產(chǎn)物較小程度的不吻合，能夠有效地檢測PCR產(chǎn)物，而顯示不同的熔解溫度，用于分子定型。此探針和探針_2能有效地檢測邦戈?duì)柹抽T菌、腸道沙門菌的5個亞種(薩拉姆亞種，亞利桑那亞種，雙亞利桑那亞種，豪頓亞種，英迪加亞種)、腸道沙門菌腸道亞種的代表株(S.Gallinarum, S.Enteritidis, S.ffeltevreden, S.Paratyphi, S.Typhi LT2, S.Dublin)。
圖4:沙門菌熒光定量PCR的LCRed-640探針。探針-2 (LCred-640探針)的序列為
5，-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3，，含ー個 degenerate 堿基，和不同株的沙門菌ttrRSBCA基因有1-2個堿基的不吻合。PCR擴(kuò)增、凝膠電泳等確認(rèn)，探針和PCR產(chǎn)物較小程度的不吻合，能夠有效地檢測PCR產(chǎn)物，而顯示不同的熔解溫度，用于分子定型。此探針和探針-1能有效地檢測邦戈?duì)柹抽T菌、腸道沙門菌的5個亞種(薩拉姆亞種，亞利桑那亞種，雙亞利桑那亞種，豪頓亞種，英迪加亞種)、腸道沙門菌腸道亞種的代表株(S.Gallinarum, S.Enteritidis, S.ffeltevreden, S.Paratyphi, S.Typhi LT2, S.Dublin)。圖5:不同種和亞種沙門菌的高分辨率熔解曲線分析。PCR完成后，對沙門菌邦戈?duì)柗N和腸道沙門菌的6個亞種的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，觀察不同種和亞種的熔解溫度。設(shè)計(jì)的探針-1和探針_2和不同株沙門菌的序列有不同程度的堿基序列不吻合(圖3、圖4)。因此，高分辨率熔解曲線技術(shù)方便地把沙門菌分成3組:i)重要的致病菌腸道亞種(熔解溫度69.5°C )，ii )豪頓亞種(熔解溫度64.2V )和雙亞利桑拉亞種(熔解溫度63.8°C )，iii)邦戈?duì)柹抽T菌(熔解溫度54.8°C )、英迪加亞種(熔解溫度57で)、薩拉姆亞種(熔解溫度55.5で)、亞利桑那亞種(熔解溫度54.5°C)。陰性對照的樣品不顯示熔解峰。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的PCR檢測方法所用引物和探針的核苷酸序列如下:上游引物5 ‘-GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3 ‘下游引物5 ‘-CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3 ‘探針-1:5‘-ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3 ‘探針-25 <-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3 ‘本發(fā)明的檢測方法過程如下:(I)制備 PCR 用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑(standard)。由 Intergrated DNA Technology合成沙門菌ttrRSBCA的序列，此序列涵蓋PCR的擴(kuò)增區(qū)域。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技術(shù)，計(jì)算合成物所含的ttrRSBCA的基因拷貝數(shù)目。隨后，對合成物進(jìn)行稀釋，制備每10 U I合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的ttrRSBCA，作為PCR用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑。(2)制備待檢樣品的DNAホ旲板。動物幾便、雞肉樣品等待測樣品保存于Eppendorf管(-20° C或者長期保存-80° C)，用于DNA純化，純化的DNA洗脫在IOOiU TltlEai (含IOmM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH8.5)作為 PCR 的擴(kuò)增模板。(3)PCR擴(kuò)增體系。20 U I的擴(kuò)增體系包含10 U I的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑(standard)、IxPCR緩沖液、I U M上游引物、I y M下游引物、0.2 y M的探針_1、0.2 y M的探針-2、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 ii M dNTP。(4) PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。PCR擴(kuò)增包括18個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(high-stringency step-down)和 25 個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐还猥@得循環(huán)(relaxed-stringencyfluorescence acquisition)。18 個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán):6xl5sec I 95。C，60sec I74° C;9xl5sec 95° C, 60sec 0 } 72 ° C; 3xl5sec I 95 ° C, IOsec 70 ° C, 15sec 72° C.25 個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán):25xl5sec 95 ° C，8sec I 58 ° C，IOsec Q65。C, andl5sec I 72° C。(5)高分辨率熔解曲線分析。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，立即實(shí)施高分辨率熔解曲線分析，溫度從38° C上升到80° C，以每秒0.2° C遞增。數(shù)據(jù)分析是分析640nm:530 nm(F2/Fl)的熒光強(qiáng)度的比例。F2/F1的第一衍生值(_d(F2/Fl)/dt)被讀為該DNA的熔解溫度。(6) PCR結(jié)果的判定和定量分析。DNA模板的制備過程均設(shè)有DNA提取的陰性和陽性對照，隨后的PCR擴(kuò)增對象包括待測樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽性對照、定量的標(biāo)準(zhǔn)試劑(每10 u I standard含IO4, IO3, IO2, IO1拷貝的沙門菌ttrRSBCA)。本發(fā)明的PCR擴(kuò)增效率高，有效地?cái)U(kuò)增含IO1拷貝的沙門菌ttrRSBCA的standard。實(shí)施例1:沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株的PCR擴(kuò)增用血平板復(fù)蘇15株保存的腸道沙門菌腸道亞種傷寒血清型，進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌菌落放置于IXPBS緩沖液中，置于100°C水中水浴5分鐘，4°C 10000rpm/min離心10分鐘，取IOiU作為PCR模板。用本發(fā)明技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及高分辨率熔解曲線分析(具體技術(shù)細(xì)節(jié)如上所迷)。結(jié)果顯示，PCR能特異高效的擴(kuò)增腸道沙門菌腸道亞種傷寒血清型，且出現(xiàn)69° C的熔解溫度。 實(shí)施例2:健康犬糞便攜帯沙門菌的檢測收集的新鮮糞便立即凍存于_80°C冰箱，后取出200mg用于核酸提取(用FastDNA Kit方法)，取IOyl作為PCR模板。用本發(fā)明技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及高分辨率熔解曲線分析(具體技術(shù)細(xì)節(jié)和參數(shù)如上所述)。待測的127個糞便樣品中，10個為陽性(10/127，7.9%)。熔解曲線分析表明并經(jīng)基因測序證實(shí)，其中7例為腸道沙門菌腸道亞種(熔解溫度69°C，2例為腸道沙門菌豪頓亞種(熔解溫度64.2°C), I例為腸道沙門菌亞利桑那亞種(熔解溫度54.5℃。
權(quán)利要求
1.一種沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型的引物及探針，其特征在于檢測引物為: 上游引物:5’ -GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3， 下游引物:5 ’ -CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3， 所述探針為:探針-1:5’ -ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3’探針-2:5，-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3，。
2.一種沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型試劑盒，包括5倍定量PCR反應(yīng)液22 U I,以及22 的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5 PM的上游引物、5 PM下游引物、1 PM的探針-1、1 PM的探針-2。
3.一種沙門菌分型方法，該方法包括以下步驟: (1)用權(quán)利要求1引物和探針PCR擴(kuò)增待測樣本，擴(kuò)增出210bp的條帶，且熒光檢測在640nm波長增強(qiáng)的為沙門菌陽性樣本； (2)PCR完成后，對步驟(I)沙門菌陽性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解溫度對沙門菌進(jìn)行分型，分型標(biāo)準(zhǔn)是:i)重要的致病菌腸道亞種熔解溫度69.5°C，ii)豪頓亞種，熔解溫度64.2°C;雙亞利桑拉亞種熔解溫度63.8°C，iii)邦戈?duì)柹抽T菌熔解溫度54.8°C、英迪加亞種熔解溫度57°C、薩拉姆亞種熔解溫度55.5°C、亞利桑那亞種熔解溫度 54.5 0C o
全文摘要
一種沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型的引物、探針及試劑盒。所述引物序列如SEQIDNO.1和2所示，所述探針為SEQIDNO.3和4。用上述引物和探針PCR擴(kuò)增待測菌，擴(kuò)增出210bp條帶，且熒光檢測在640nm波長增強(qiáng)的為沙門菌陽性樣本；再根據(jù)熔解溫度可對沙門菌進(jìn)行分型。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢明顯，具有很高的特異性和敏感,可以方便的把主要病原菌(腸道沙門菌腸道亞種)和邦戈?duì)柹抽T菌、腸道沙門菌的其它亞種區(qū)分開。本發(fā)明的技術(shù)相比，可以方便地廣泛的用于診斷人畜沙門菌的感染和細(xì)菌性食物中毒。
文檔編號C12Q1/68GK103114148SQ201310068510
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者王成明, 徐步, 王志強(qiáng), 許傳靈, 危藍(lán)菁, 張繼壘 申請人:揚(yáng)州大學(xué)