專利名稱：一種殺菌肽cad的重組表達(dá)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉一種天蠶素殺菌肽的表達(dá)及制備方法，尤其涉及一種天蠶素殺菌肽Cecropin AD (CAD)的重組表達(dá)及其制備方法。
背景技術(shù)：
殺菌肽(anti2microbial peptides)是具有抗菌活性短肽的總稱。1981年瑞典科學(xué)家Steiner等從惜古比天蠶(Hyatophora cecropia)蛹中誘導(dǎo)分離得到一種殺菌肽，并將其命名cecropin。殺菌肽一般含有37 39個氨基酸殘基，不含半胱氨酸，其N端區(qū)域具有強(qiáng)堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結(jié)構(gòu)，而在C端區(qū)域可形成疏水螺旋，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，多數(shù)多肽的C端被酰胺化，酰胺化對其抗菌活性具有重要作用。天蠶素(cecropins)對革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌具有很強(qiáng)的殺傷力，而對真菌和真核細(xì)胞沒有毒性。天然存在的天蠶素殺菌肽分為cecropin A、cecropin B和cecropin D,其中天蠶素殺菌肽AD是由cecropin A和cecropin D設(shè)計合成的37個氨基酸的雜合肽,不含半胱氨酸，其N端區(qū)域具有強(qiáng)堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結(jié)構(gòu)，而在C端區(qū)域可形成疏水螺旋，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，多數(shù)多肽的C端被酰胺化，酰胺化對其抗菌活性具有重要作用。該抗菌肽分子具有獨(dú)特的廣譜抗菌活性，體外試驗已證明它能有效的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄 球菌、沙門氏菌等有害菌，因此，它成為抗生素替代物的絕佳選擇之一。隨著研究工作的深入開展，發(fā)現(xiàn)某些抗菌肽會對部分真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有很強(qiáng)的殺傷作用，并且在其它領(lǐng)域也具有很好的應(yīng)用前景。
目前，國內(nèi)外在殺菌肽AD的基因工程方面開展了不少研究工作，有關(guān)殺菌肽基因在大腸桿菌、酵母、昆蟲桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)、以及哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)研究均已有報道。黃亞東等利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了天蠶殺菌肽AD(黃亞東，中國抗生素雜志，2003，28:304-307)。而使用昆蟲病毒載體系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，實驗步驟繁瑣，條件不易于控制，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。黃亞東采用PCR技術(shù)改造殺菌肽AD基因，構(gòu)建了酵母重組分泌型表達(dá)載體，用Pichia pastoris系統(tǒng)表達(dá)了殺菌肽AD (黃亞東，華南理工大學(xué)自然科學(xué)版，2003，30:13-16)。但酵母表達(dá)系統(tǒng)不僅培養(yǎng)密度低，殺菌肽的表達(dá)量有限，而且殺菌肽表達(dá)酰胺化不完全，影響其抗菌活性，同時酵母表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。中國專利CN101307316A公開了抗菌肽CAD在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)及重組枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但研究表明枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶比較多對目的蛋白易降解，并且給純化目的蛋白帶來困難。迄今為止，主要是使用細(xì)菌特別是大腸桿菌作為以重組技術(shù)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的宿主菌細(xì)胞。大腸桿菌的主要優(yōu)點(diǎn)是:遺傳背景清楚，易于遺傳操作并能保持轉(zhuǎn)化株的穩(wěn)定性；經(jīng)大體積培養(yǎng)可獲得高產(chǎn)率的表達(dá)產(chǎn)物；帶有易于純化的標(biāo)簽蛋白；細(xì)胞易于培養(yǎng)，且培養(yǎng)周期短，從而可降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)。由于殺菌肽的組成特點(diǎn)，僅由氨基酸組成，不含外源成分及化學(xué)修飾，不需要翻譯后加工修飾，可以采用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。但殺菌肽對大腸桿菌有很強(qiáng)的毒性，分子量較小不能直接進(jìn)行表達(dá)，需要借助融合蛋白來封閉殺菌肽的毒性。然而，使用大腸桿菌生產(chǎn)生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的另一個重要缺點(diǎn)是，表達(dá)產(chǎn)物在宿主胞漿內(nèi)形成包涵體，即無生物活性的不溶性聚合體。為了克服原核表達(dá)容易形成包涵體的缺點(diǎn)，人們常采用融合表達(dá)，希望在大腸桿菌中高效表達(dá)外源蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種殺菌肽CAD的重組表達(dá)；
本發(fā)明的另一目的是提供一種殺菌肽CAD的制備方法。本發(fā)明殺菌肽CAD的重組表達(dá)，是以pUC18為表達(dá)載體，以大腸桿菌E.coli ER2566為宿主，以天蠶素殺菌肽CAD的基因與分子伴侶β -半乳糖苷酶Abg蛋白標(biāo)簽融合,合成編碼Abg-CAD的融合基因重組表達(dá)。所述融合基因的核苷酸序列為: ATGGGCGGCCATCATCATCATCATCATGGCGGCAATGTTCTTCTGCTGATTTGCTATGGCGGCGATTATAAT
CCGGAACAATGGCCGGAAGAAATTTGGTATGAAGATGCAAAACTTATGCAAAAAGCAGGCGTTAATCTTGTTCTGCTTGGCATTTTTCTGTGGCTGAAAATTGAACCGCTGGATGGCGTTTTTGATTTTGAATGGCTTGATAAAGTTATTGATATTCTTTATGATCATGGCGTTTATATTAATCTTGGCACAGCAACAGCAACAACACCGGCATGGTTTGTTAAAAAATATCCGGATCTGCTTCCGATTGATGAACTGGGCCTTAAAGCAGTTGTTTGCCTGTGCAGACTTGTTAGAGTTGGCAATTGCCTTATTGGCGGCGTTCTGTTTTGCAGAAGAACAGAACTTTTTACATATTGCTGCACAAGAGTT ；
其氨基酸序列序列為: MGGHHHHHHGGNVLSSICYGGDYNPEQWPEEIWYEDAKLMQKAGVNLVSLGIFSffSKIEPSDGVFDFEWLDKVIDILYDHGVYINLGTATATTPAWFVKKYPDSLPIDESGLKAVKWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK。本發(fā)明殺菌肽CAD的制備方法，包括以下工藝步驟:
(I)將天蠶素殺菌肽CAD的基因與分子伴侶β -半乳糖苷酶Abg蛋白標(biāo)簽融合，合成編碼Abg- CAD融合蛋白的融合基因；具體是采用固相亞磷酰胺三酯法合成如下片段:在AbgDNA序列的N-末端連上親和層析純化標(biāo)簽6 XHis的DNA序列；在其C-末端連上FactorXa蛋白酶識別位點(diǎn)Ile-Glu-Gly-Arg和目的蛋白CAD的DNA序列，并在整個融合DNA序列的5’端和3’端分別加上EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)堿基。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Pst I對殺菌肽的Abg- CAD融合基因進(jìn)行雙酶切，并與同樣用限制性內(nèi)切酶雙酶切的表達(dá)載體PUC18質(zhì)粒連接，構(gòu)建一種表達(dá)毒性蛋白的表達(dá)載體；
(3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli ER 2566，獲得基因工程菌；
(4)通過培養(yǎng)基因工程菌組成型表達(dá)獲得融合蛋白Abg-CAD:將篩選的基因工程菌單克隆，接種到LB+Amp培養(yǎng)基中，于溫度37°C、搖速225 rpm下振蕩培養(yǎng)10 12h ;再按5%的比例轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，于溫度30°C、搖速225rpm下培養(yǎng)至菌液OD為0.6 0.8，
0.5mM的IPTG誘導(dǎo)10 12h ;離心收集菌體，加入裂解液，超聲破菌后離心，取上清液，進(jìn)行N1-NTA親和層析，再經(jīng)洗滌、洗脫，即得含Abg-CAD的可溶性融合蛋白。所述裂解液是由TriS-HCl緩沖液，pH8.0的NaCl溶液，pH8.0的CaCl2溶液組成的混合體系；其用量為:在50ml混合體系中，20mM Tris-HCLlOOmM NaCl, 2mM CaCl2 ； Img的Factor Xa酶加入50mg融合蛋白底物,25°C溫育不超過6小時.所述超聲破菌的工藝:在超聲波的功率400w下，超聲2s，停2s，共2(Γ40個周期。(5)融合蛋白Abg-CAD分離純化后,通過Factor Xa蛋白酶酶切,純化,獲得天蠶素殺菌肽CAD。所述Factor Xa蛋白酶酶切獲得殺菌肽CAD的工藝為:在分離純化后的融合蛋白中加入Factor Xa蛋白酶，于25°C進(jìn)行酶切反應(yīng)，檢測酶切完全后的融合蛋白進(jìn)行N1-NTA親和層析，收集穿透液，即得純化后的殺菌肽CAD。經(jīng)考馬氏亮藍(lán)染色，BandScan軟件分析，證實本發(fā)明制備的殺菌肽AD，蛋白純度達(dá)90%以上。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明通過 Abg蛋白與殺菌妝CAD基因融合，以借助Abg蛋白來封閉殺菌妝AD的毒性，使融合蛋白的毒性減弱，蛋白表達(dá)量明顯提高。2、本發(fā)明的殺菌肽CAD的重組融合表達(dá)可能促使重組蛋白胞內(nèi)區(qū)域化，降低對酶解的敏感性。3、本發(fā)明的通過與分子伴侶β -半乳糖苷酶Abg蛋白標(biāo)簽融合，由于Abg有一個親水表面和一個高度疏水的內(nèi)核，這對于在其它情況下不可溶的蛋白能起到一個類似于洗滌劑的效果，從而增強(qiáng)所融合目的蛋白的可溶性。4、以Abg蛋白作為融合標(biāo)簽,能給被Factor Xa蛋白酶準(zhǔn)確無誤地切除融合標(biāo)簽，產(chǎn)生天然N端的目標(biāo)蛋白。目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)為可溶性蛋白，通過N1-NTA柱親和層析、Sephadex G_25脫鹽和Factor Xa蛋白酶酶切，最終獲得蛋白純度超過95%。5、本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建比較簡單，成本低，為取代抗生素應(yīng)用于醫(yī)藥、獸藥、水產(chǎn)、飼料添加劑等產(chǎn)業(yè)奠定了基礎(chǔ)。


圖1為殺菌肽CAD表達(dá)和制備的Tricine-SDS-PAGE 圖2為本發(fā)明殺菌肽CAD蛋白對不同細(xì)菌的抑菌圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明殺菌肽CAD的融合基因的表達(dá)及制備方法作進(jìn)一步的說明。未特別指明，實施例中所有的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所采用的CAD的基因、載體pUC18、宿主細(xì)胞E.coli ER 2566等可由商業(yè)途徑得到:如CAD的基因由南京金斯瑞合成，表達(dá)載體由克隆載體pUC18、宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coli ER 2566 購自 Biovector 公司。1、Abg-CAD殺菌肽融合基因的人工合成
根據(jù)大腸桿菌的偏愛密碼子優(yōu)化β -半乳糖苷酶(Abg)和天蠶素殺菌肽CAD，采用固相亞磷酰胺三酯法合成如下片段:在Abg DNA序列的N-末端連上親和層析純化標(biāo)簽6XHis的DNA序列；在其C-末端連上Factor Xa蛋白酶識別位點(diǎn)Ile-Glu-Gly-Arg和目的蛋白CAD的DNA序列，并在整個融合DNA序列的5’端和3’端分別加上EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)堿基。2、pUC18-Abg-CAD表達(dá)載體的構(gòu)建
人工合成的融合基因Abg-CAD用EcoR I和Pst I雙酶切，與同樣用兩種酶雙酶切的PUC18質(zhì)粒連接，構(gòu)建一種表達(dá)毒性蛋白的表達(dá)載體pUC18-Abg-CAD ;將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli ER 2566 ;將測序正確的pUC18-Abg-CAD轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BR 2566化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞用氨芐青霉素抗性平板篩挑選陽性轉(zhuǎn)化子，獲得基因工程菌E.coli ER 2566/pUC18-Abg-CAD。3、殺菌妝CAD蛋白的獲得
(1)將篩選的基因工程菌E.coli ER 2566/pUC18-Abg-CAD單克隆，接種到LB+Amp培養(yǎng)基中，于37°C，搖速225 rpm下振蕩培養(yǎng)10 12h ；
(2)擴(kuò)大培養(yǎng):按5%比例轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，于30°C、搖速225rpm下培養(yǎng)至菌液OD為 0.6 0.8，0.5mM 的 IPTG 誘導(dǎo) 10 12h ；
(3)離心收集菌體:在50ml如下反應(yīng)體系中:20mMTris-HCl, IOOmM NaCl, 2mM CaCl2(ρΗ8.0 25°C ) , Img的Factor Xa酶加入50mg融合蛋白底物,溫育不超過6小時；超聲波(功率400w，超聲2s，停2s，共30個周期)破菌，離心分離上清和沉淀，收集上清液，15%Tricine -SDS-PAGE 檢測。4、融合蛋白的純化
將上述離心收集的上清菌體用Lysis buffer (IOmmol /L咪唑,300mmol/L NaCl,50mmo 1/L Na3P04, p H 8.0)重懸后加入溶菌酶至終濃度為lg/L，冰浴中放置30min后超聲破碎，IOOOOg 40C離心30 min，收集上清。上清利用AKTA purifier 100系統(tǒng)經(jīng)過HisTrapTMFF crude 親和層析，用 Wash buffer(20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl, 50 mmol /L Na3P04, pH 8.0 )洗去雜蛋白后，再用 Elution buffer (250mmol/L 咪唑，300 m mol/LNaCl，50 mmol/L Na3P04, pH 8.0)洗脫，收集唯一的洗脫峰即為融合蛋白，并進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 檢測。5、利用Factor Xa蛋白酶切除Abg蛋白標(biāo)簽
將收集的融合蛋白脫鹽后，參考NEB公司Factor Xa Protease的酶切條件，加入Factor Xa Protease 和終濃度 2 mmo 1/L 的 DTT,于 25 °C 切割 6h,取樣進(jìn)行 Tricine-SDS-PAGE電泳檢測。6、殺菌肽CAD的純化
將酶切樣品再經(jīng)His TrapTMFF crude親和層析:先用緩沖液(20 mmol/L咪唑，150mmol/L NaCl, 50 mmol/L Na3P04, pH 8.0 )平衡親和柱，酶切樣品過柱，收集穿透液(殺菌肽 ZLJ)，上樣完畢后用緩沖液(40 mmol/L 咪唑，150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Na3P04, pH
8.0)進(jìn)行洗滌，收集洗滌液。最后，以緩沖液(250mmol/L咪唑，150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Na3P04, pH 8.0)進(jìn)行目的蛋白Abg標(biāo)簽洗脫純化，于_20°C下保存。純化后的蛋白殺菌肽 CAD 進(jìn)行 Tricine -SDS-PAGE。圖1為為殺菌肽CAD生產(chǎn)工藝相關(guān)節(jié)點(diǎn)的Tricine-SDS-PAGE，其中，泳道I為NEB公司蛋白marker ;泳道2為大腸桿菌表達(dá)宿主菌ER2566 ;泳道3為殺菌肽工程菌可溶蛋白上清部分，箭頭所指為融合蛋白；泳道4為分離純化后的殺菌肽融合蛋白；泳道5為經(jīng)裂解后的殺菌肽融合蛋白，箭頭所指為殺菌肽CAD單體；泳道6為經(jīng)純化后的殺菌肽CAD單體，分子量大小3.9kD,與蛋白marker標(biāo)準(zhǔn)相比較得出，殺菌肽Abg-CAD的濃度彡lg/ L?？扇苄阅康牡鞍渍季w總目的蛋白的90%以上，蛋白純度達(dá)95%以上。Abg-CAD融合蛋白的核苷酸序列為: ATGGGTGGTCATCATCATCATCATCACGGCGGCAATGTGTTATCCTCAATTTGTTACGGAGGAGATTATAAC
CCAGAGCAATGGCCAGAGGAAATTTGGTATGAAGATGCTAAGTTGATGCAAAAAGCGGGGGTGAATTTAGTATCTTT
AGGGATTTTCAGTTGGAGCAAGATCGAACCGTCTGATGGAGTGTTCGACTTTGAATGGCTAGACAAGGTTATAGATA
TACTATATGACCACGGTGTTTATATTAACTTGGGGACGGCGACTGCAACTACTCCAGCTTGGTTTGTAAAAAAGTAT
CCAGATTCTTTGCCGATCGATGAAAGCGGATTGAAGGCCGTTAAGTGGAAGCTGTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGG
CCAGCGTGTTCGTGATGCTGTTATCTCTGCTGGCCCGGCTGTTGCTACGGTTGCTCAGGCTACGGCTCTGGCTAAA。Abg-CAD融合蛋白的氨基酸序列為: MGGHHHHHHGGNVLSSICYGGDYNPEQWPEEIWYEDAKLMQKAGVNLVSLGIFSffSKIEPSDGVFDFEWLDK
VIDILYDHGVYINLGTATATTPAWFVKKYPDSLPIDESGLKAVKWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK。7、殺菌肽CAD抑菌活性的鑒定
采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔擴(kuò)散法，以金黃 色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌和酵母菌為實驗菌株，將供試菌懸浮液(0D600=0.2 0.3)20ul與55°C的LB固體培養(yǎng)基25ml混勻后平鋪板待其凝固后，用滅過菌的打孔器(直徑5_)打孔，孔中加20ul純化后的蛋白殺菌肽CAD，在37 °C培養(yǎng)過夜。圖2為上述制備的殺菌肽CAD對不同細(xì)菌的抑菌圖。其中，A為對金黃色葡萄球菌的抑菌圖，B為對沙門氏菌的抑菌圖，C為對大腸桿菌抑菌圖，D為對酵母菌的抑菌圖。從圖2可以看出，本發(fā)明制備的蛋白殺菌肽CAD對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、對酵母菌等都具有很好的抑制效果，因而在醫(yī)藥、獸藥、水產(chǎn)、飼料添加劑中具有廣泛的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種殺菌肽CAD的重組表達(dá)，是以PUC18為表達(dá)載體，以大腸桿菌E. coli ER 2566為宿主，以天蠶素殺菌肽CAD的基因與分子伴侶β -半乳糖苷酶Abg蛋白標(biāo)簽融合，合成編碼Abg-CAD的融合基因重組表達(dá)。
2.如權(quán)利要求I所述天蠶素殺菌肽AD的重組表達(dá)，所述融合基因的核苷酸序列為ATGGGCGGCCATCATCATCATCATCATGGCGGCAATGTTCTTCTGCTGATTTGCTATGGCGGCGATTATAATCCGGAACAATGGCCGGAAGAAATTTGGTATGAAGATGCAAAACTTATGCAAAAAGCAGGCGTTAATCTTGTTCTGCTTGGCATTTTTCTGTGGCTGAAAATTGAACCGCTGGATGGCGTTTTTGATTTTGAATGGCTTGATAAAGTTATTGATATTCTTTATGATCATGGCGTTTATATTAATCTTGGCACAGCAACAGCAACAACACCGGCATGGTTTGTTAAAAAATATCCGGATCTGCTTCCGATTGATGAACTGGGCCTTAAAGCAGTTGTTTGCCTGTGCAGACTTGTTAGAGTTGGCAATTGCCTTATTGGCGGCGTTCTGTTTTGCAGAAGAACAGAACTTTTTACATATTGCTGCACAAGAGTT ； 其氨基酸序列為MGGHHHHHHGGNVLSSICYGGDYNPEQWPEEIWYEDAKLMQKAGVNLVSLGIFSffSKIEPSDGVFDFEWLDKVIDILYDHGVYINLGTATATTPAWFVKKYPDSLPIDESGLKAVKWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK。
3.如權(quán)利要求I所述殺菌肽CAD的制備方法，包括以下工藝步驟 (1)將天蠶素殺菌肽CAD的基因與分子伴侶β-半乳糖苷酶Abg蛋白標(biāo)簽融合，合成編碼Abg- CAD融合蛋白的融合基因； (2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Pst I對殺菌肽的Abg- CAD融合基因進(jìn)行雙酶切，并與同樣用限制性內(nèi)切酶雙酶切的表達(dá)載體PUC18質(zhì)粒連接，構(gòu)建一種表達(dá)毒性蛋白的表達(dá)載體； (3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Ε.coli ER 2566，獲得基因工程菌； (4)通過培養(yǎng)基因工程菌組成型表達(dá)獲得融合蛋白Abg-CAD； (5 )融合蛋白Abg-CAD分離純化后，通過Factor Xa蛋白酶酶切，純化，獲得殺菌肽CAD。
4.如權(quán)利要求3所述殺菌肽CAD的制備方法，其特征在于步驟(I)所述的標(biāo)簽融合，是采用固相亞磷酰胺三酯法合成如下片段在Abg DNA序列的N-末端連上親和層析純化標(biāo)簽6XHis的DNA序列；在其C-末端連上Factor Xa蛋白酶識別位點(diǎn)Ile-Glu-Gly-Arg和目的蛋白CAD的DNA序列，并在整個融合DNA序列的5’端和3’端分別加上EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)堿基。
5.如權(quán)利要求3所述殺菌肽CAD的制備方法，其特征在于步驟(4)所述通過培養(yǎng)基因工程菌組成型表達(dá)獲得融合蛋白Abg-AD的工藝為將篩選的基因工程菌單克隆，接種到LB+Amp培養(yǎng)基中，于溫度37°C、搖速225 rpm下振蕩培養(yǎng)10 12h ;再按5%的比例轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，于溫度30°C、搖速225rpm下培養(yǎng)至菌液OD為O. 6 O. 8，O. 5mM的IPTG誘導(dǎo)10 12h ;離心收集菌體，加入裂解液，超聲破菌后離心，取上清液，進(jìn)行Ni-NTA親和層析，再經(jīng)洗滌、洗脫，即得含Abg-AD的可溶性融合蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述殺菌肽CAD的制備方法，其特征在于所述裂解液是由Tris-HCl緩沖液，PH8. O的NaCl溶液，pH8. O的CaCl2溶液組成的混合體系；其用量為在50ml混合體系中，20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl, 2mM CaCl2 ； Img 的 Factor Xa 酶加入 50mg 融合蛋白底物，25°C溫育不超過6小時。
7.如權(quán)利要求3所述天蠶素殺菌肽CAD的制備方法，其特征在于所述超聲破菌的工藝在超聲波的功率400w下，超聲2s，停2s，共20 40個周期。
8.如權(quán)利要求3所述殺菌肽CAD的制備方法,其特征在于步驟(5)所述Factor Xa蛋白酶酶切獲得殺菌肽CAD的工藝為在分離純化后的融合蛋白中加入Factor Xa蛋白酶，于25°C進(jìn)行酶切反應(yīng)，檢測酶切完全后的融合蛋白進(jìn)行Ni-NTA親和層析，收集穿透液，即得純化后的殺菌肽Abg-CAD。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種殺菌肽CAD的重組表達(dá)及制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是將天蠶素殺菌肽CAD的基因與分子伴侶β-半乳糖苷酶Abg蛋白標(biāo)簽融合，合成編碼Abg-殺菌肽CAD融合蛋白的融合基因；再用限制性內(nèi)切酶對殺菌肽CAD融合基因進(jìn)行雙酶切，并與同樣用限制性內(nèi)切酶雙酶切的表達(dá)載體pUC18質(zhì)粒連接，構(gòu)建一種表達(dá)毒性蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliER2566，獲得基因工程菌；然后通過培養(yǎng)基因工程菌組成型表達(dá)獲得融合蛋白Abg-CAD；最后通過FactorXa蛋白酶酶切，純化，獲得殺菌肽CAD，其中可溶性目的蛋白占菌體總目的蛋白的90%以上，蛋白純度達(dá)95%以上，為取代抗生素應(yīng)用于醫(yī)藥、獸藥、水產(chǎn)、飼料添加劑等產(chǎn)業(yè)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/70GK103255159SQ201310067480
公開日2013年8月21日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者姬生躍, 李偉麗, 武剛 申請人:張掖市奧林貝爾生物科技有限公司