專利名稱：經(jīng)由鎂螯合的pcr熱啟動(dòng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)方法(PCR)擴(kuò)增核酸的技術(shù)領(lǐng)域。更精確地，本發(fā)明提供了用于執(zhí)行PCR的新型熱啟動(dòng)替代方案，這防止非特異性的引發(fā)事件和假擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。
背景技術(shù)：
伴隨核酸擴(kuò)增和更特別地伴隨PCR的主要問題是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。在許多情況下，這是由于在其實(shí)際的熱循環(huán)程序前的非特異性寡核苷酸引發(fā)和隨后的引物延伸事件，因?yàn)槟蜔岬腄NA聚合酶在環(huán)境溫度下也是適度活性的。例如，經(jīng)常觀察到由于最終由偶然發(fā)生的引物二聚化和后續(xù)延伸的擴(kuò)增產(chǎn)物。為了克服這個(gè)問題，本領(lǐng)域眾所周知的是進(jìn)行所謂的“熱啟動(dòng)” PCR，其中擴(kuò)增反應(yīng)所需的一種組分與反應(yīng)混合物分開或維持無活性狀態(tài)，直至反應(yīng)混合物的溫度首次升高。因?yàn)榫酆厦冈谶@些條件下不起作用，所以在引物無一可以特異性結(jié)合的時(shí)間段期間不存在引物延伸。為了達(dá)到這種作用，已應(yīng)用幾種方法:a) DNA聚合酶的物理分離物理分離可以例如通過固體蠟的屏障來獲得，所述固體蠟使包含DNA聚合酶的區(qū)室與包含大量其他試劑的區(qū)室分開。在第一個(gè)加熱步驟期間，蠟隨后自動(dòng)熔化且流體區(qū)室混合(Chou，Q.，等人，Nucleic AcidsRes20 (1992) 1717_23，US5, 411，876)?？商娲兀跀U(kuò)增反應(yīng)前，DNA聚合酶被親和固定化在`固體支持體上，并且僅通過熱介導(dǎo)的釋放而釋放到反應(yīng)混合物內(nèi)(Nilsson, J.,等人,Biotechniques22 (1997) 744-51)。然而,這兩種方法是費(fèi)時(shí)的且不便于執(zhí)行。b) DNA聚合酶的化學(xué)修飾對(duì)于這種類型的熱啟動(dòng)PCR，DNA聚合酶由于化學(xué)修飾而可逆地滅活。更精確地，將不耐熱的封閉基團(tuán)引入Taq DNA聚合酶內(nèi)，這使得酶在室溫下無活性(US5，773，258)。這些封閉基團(tuán)在高溫下在前PCR步驟期間被去除，從而使得酶變得活化。此種不耐熱的修飾例如可以通過使朽1康酐或?yàn)躅^酐(Aconitric Anhydride)與酶的賴氨酸殘基偶聯(lián)來獲得(US5，677，152)。攜帶此種修飾的酶同時(shí)是作為Amplitaq Gold(Moretti，T.，等人，Biotechniques25(1998)716-22)或 FastStart DNA 聚合酶(Roche MolecularBiochemicals)商購(gòu)可得的。然而，封閉基團(tuán)的引入是在酶所有空間可利用的賴氨酸殘基上任意發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。因此，化學(xué)修飾的酶制劑的再現(xiàn)性和品質(zhì)可能有變化且?guī)缀醪荒芗右钥刂啤) DNA聚合酶的重組修飾Taq聚合酶的冷敏感突變體已借助于基因工程進(jìn)行制備。這些突變體不同于野生型酶之處在于它們?nèi)狈末端(US6，241，557)。與天然或野生型重組Taq聚合酶形成對(duì)t匕，這些突變體在35°C下是完全無活性的，且因此它們可以在一些情況下用于執(zhí)行熱啟動(dòng)PCR0然而，N末端截短的冷敏感突變體形式需要低鹽緩沖液條件，與野生型酶相比較具有較低的持續(xù)合成能力且因此僅能用于擴(kuò)增短靶核酸。此外，因?yàn)榻囟绦问饺狈?' -3'外切核酸酶活性，所以它不能用于基于TaqMan檢測(cè)形式的實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)。d)經(jīng)由核酸添加劑的DNA聚合酶抑制非特異性退火的引物延伸已顯示通過添加短雙鏈DNA片段得到抑制(Kainz，P.，等人，Biotechniques28 (2000) 278-82)。在這種情況下，引物延伸在低于短雙鏈DNA片段的解鏈溫度的溫度下得到抑制，但不依賴對(duì)照模板(Competitor)DNA自身的序列。然而，過量的對(duì)照模板DNA影響核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)量的程度是未知的?？商娲兀梢允褂镁哂袑?dǎo)致限定的二級(jí)結(jié)構(gòu)的特定序列的寡核苷酸適體。此種適體已使用SELEX技術(shù)就對(duì)DNA聚合酶的極高親和力進(jìn)行選擇(US5，693，502，Lin, Y.和Jayasena, S.D., J Mol Biol271 (1997) 100-11)。在實(shí)際熱循環(huán)過程自身前擴(kuò)增混合物內(nèi)此種適體的存在再次導(dǎo)致與DNA聚合酶的高親和力結(jié)合和隨后其活性的不耐熱抑制(US6, 020, 130)。然而，由于選擇過程，迄今為止的所有可利用的適體僅能與一個(gè)特定種類的DNA聚合酶組合使用。e)Taq DNA 抗體達(dá)到Taq DNA聚合酶的不耐熱抑制的替代方法是添加針對(duì)純化的酶產(chǎn)生的單克隆抗體(Kellogg, D.E.，等人，Biotechniquesl6 (1994) 1134-7 ； Sharkey, D.J.，等人，Biotechnology (NY) 12 (1994) 506-9)。如同寡核苷酸適體,抗體與Taq DNA聚合酶在環(huán)境溫度下以抑制方式以高親和力結(jié)合(US5，338，671)。復(fù)合物在熱循環(huán)過程自身前的預(yù)熱步驟中分解。這導(dǎo)致總體上擴(kuò)增的基本上費(fèi)時(shí)的延長(zhǎng)，特別是如果應(yīng)用用于快速熱循環(huán)的規(guī)程(W097/46706)。US5，985，619公開了使用熱啟動(dòng)抗體用于執(zhí)行PCR的具體實(shí)施方案，其中除Taq聚合酶外，將例如來自大腸桿菌(E.coli)的外切核酸酶III作為補(bǔ)料加入擴(kuò)增混合物內(nèi)，以消化非特異性引物二聚體中間物。如上文公開的，外切核酸酶III識(shí)別雙鏈DNA作為底物，如例如靶/引物或靶/引物延伸產(chǎn)物雜交物。消化借助于切割在3'末端脫氧核苷酸殘基的5'末端上的磷酸二酯鍵而發(fā)生。因?yàn)檫@種類型的外切核酸酶在環(huán)境溫度下有活性，所以所有非特異性退火的引物和引物延伸產(chǎn)物因此被消化。在一些實(shí)施方案中，這導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)甚至增強(qiáng)的特異性。然而，依賴于預(yù)溫育時(shí)間的持續(xù)時(shí)間的非特異性引物消化可以導(dǎo)致引物濃度中相當(dāng)大和不受控制的減少，這依次可以影響擴(kuò)增反應(yīng)自身。f)經(jīng)修飾的引物單獨(dú)或與外切核酸酶組合使用EP0799888和GB2293238公開了給PCR反應(yīng)添加:V封閉的寡核苷酸。由于:V封閉，這些寡核苷酸不能充當(dāng)引物。封閉的寡核苷酸設(shè)計(jì)為與PCR引物競(jìng)爭(zhēng)/相互作用，這導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的減少。另一個(gè)替代方案是硫代磷酸酯寡核苷酸引物與外切核酸酶III組合在PCR反應(yīng)混合物中的使用(EP0744470)。在這種情況下，通常接受雙鏈以及單鏈DNA底物的3'外切核酸酶降解雙鏈體人為產(chǎn)物例如引物二聚體以及遺留(carry over)擴(kuò)增子，同時(shí)使單鏈擴(kuò)增引物不降解。類似地，已提議使用具有基 本修飾的3'末端和經(jīng)由大腸桿菌內(nèi)切核酸酶IV的模板依賴性去除的引物(US5，792，607)。一般想法的具體實(shí)施方案在EP1275735中找到。它的說明書公開了用于執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的組合物，其包含(i)耐熱的DNA聚合酶，(ii)耐熱的3' -5'外切核酸酶，和
(iii)具有經(jīng)修飾的3'末端殘基的用于核酸擴(kuò)增的至少一種引物，這經(jīng)由所述耐熱的DNA聚合酶不延伸，以及使用這種組合物用于執(zhí)行PCR反應(yīng)的方法。此外，該方法涉及包含此種組合物的試劑盒。然而，公開的替代方案的主要缺點(diǎn)是，對(duì)于每種PCR反應(yīng)需要經(jīng)修飾的引物，這導(dǎo)致關(guān)于增加每次個(gè)別測(cè)定的成本增加的要求。g)其他PCR添加劑本領(lǐng)域已知的其他有機(jī)添加劑如DMS0、甜菜堿和甲酰胺(W099/46400 ；Hengen,P.N., Trends Biochem Sci22(1997)225-6 ；Chakrabarti, R.和 Schutt, C.E., NucleicAcids Res29 (2001) 2377-81)導(dǎo)致富含GC序列的擴(kuò)增的改善，而不是引物二聚體形成的阻止。類似地，發(fā)夾推測(cè)通過去除蛋白質(zhì)如組蛋白可以刺激體外連綴轉(zhuǎn)錄，以使得染色體DNA可接近(Hildebrand, C.E.,等人，Biochimica et BiophysicaActa477 (1977) 295-311)。已知單鏈結(jié)合蛋白(US5,449，603)或 tRNA (Sturzenbaum, S.R.,Biotechniques27 (1999) 50-2)的添加導(dǎo)致這些添加劑與引物的非共價(jià)結(jié)合。這種結(jié)合在PCR期間加熱時(shí)被破壞。還發(fā)現(xiàn)DNA解旋酶的添加阻止引物的隨機(jī)退火(Kaboev，0.K.，等人，Bioorg Khim25 (1999) 398-400)。此外，在幾種情況下可以使用聚谷氨酸(W000/68411)，以抑制低溫下的聚合酶活性。此外，已知聚陰離子聚合酶抑制劑可以依賴于應(yīng)用的溫育溫度控制耐熱的DNA聚合酶的活性。US6，667，165公開了熱啟動(dòng)實(shí)施方案，其特征在于無活性的聚合酶抑制劑復(fù)合物在低于40°C溫度下 形成。在40°C _55°C之間，抑制劑與模板DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Taq聚合酶，而在高于55°C的溫度下，抑制劑從聚合酶活性位點(diǎn)排代。然而，當(dāng)使用具有較低退火溫度的引物時(shí)，抑制劑趨向減少可獲得的產(chǎn)物產(chǎn)量。h)鎂螯合因?yàn)槟蜔岬木酆厦冈缇鸵阎獌H在Mg2+陽(yáng)離子的存在下是有活性的，所以已嘗試在熱循環(huán)規(guī)程開始前螯合鎂，以避免錯(cuò)誤引發(fā)和非特異性引物延伸。如US6，403，341中公開的，Mg2+可以以沉淀物的形式存在，并且因此在擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)不能利用。溫度在第一輪熱循環(huán)期間增加后，沉淀物溶解且Mg2+變得在前3個(gè)循環(huán)內(nèi)完全可用。此種溶液已顯示是相當(dāng)可應(yīng)用的，并且能夠提供良好的熱啟動(dòng)結(jié)果。另一方面，此種溶液不允許制備包含除引物和靶核酸外的所有試劑的主混合物，這是執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)所必需的。因此，測(cè)定間數(shù)據(jù)再現(xiàn)性和數(shù)據(jù)比較是復(fù)雜的?？紤]到概述的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供用于熱啟動(dòng)PCR的改善的替代組合物和方法，這允許不僅在擴(kuò)增過程自身前還在熱循環(huán)過程期間抑制非特異性引發(fā)和引物延伸。更精確地，本發(fā)明的目的是提供用于熱啟動(dòng)PCR的替代組合物和方法，在其中不能發(fā)生非特異性退火引物的延伸。

發(fā)明內(nèi)容
能夠催化聚合酶鏈反應(yīng)的大多數(shù)耐熱的聚合酶依賴二價(jià)陽(yáng)離子通常為Mg2+的存在。本發(fā)明基于通過向聚合酶鏈反應(yīng)混合物中添加二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合化合物來產(chǎn)生熱啟動(dòng)效果的原理，所述二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合化合物以溫度依賴性方式結(jié)合二價(jià)陽(yáng)離子。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所述合成肽以0.0lmM-1OOOO U M的親和常數(shù)結(jié)合所述二價(jià)
陽(yáng)離子。因?yàn)榇蠖鄶?shù)耐熱的聚合酶是Mg2+依賴性的，所以所述二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)選是結(jié)合Mg2+的基序(motive)。在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成肽包含至少一次氨基酸序列基序X1X2X3，其中Xl是帶負(fù)電荷的氨基酸，優(yōu)選地天冬氨酸X2是甘氨酸或脂族氨基酸X3是帶負(fù)電荷的氨基酸在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含下述的組合物-耐熱的DNA聚合酶-至少一類二價(jià)陽(yáng)離子，優(yōu)選地Mg2+-脫氧核苷酸 -緩沖液-如上文公開的具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所述組合物進(jìn)一步包含至少一種核酸化合物，例如應(yīng)變得擴(kuò)增的引物和/或靶核酸。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含下述的試劑盒-如上文公開的肽，和-耐熱的DNA聚合酶在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增特定靶核酸的方法，其包括下述步驟-提供懷疑包含所述靶核酸的樣品-加入如上文公開的組合物，和-執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)在具體實(shí)施方案中，所述聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，對(duì)由所述擴(kuò)增產(chǎn)生的所述擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)施解鏈曲線分析。


圖1圖1顯示了如實(shí)施例1中公開的具有序列DTRTDIET的鎂結(jié)合肽的效果。當(dāng)肽存在于PCR反應(yīng)混合物中時(shí)，引物二聚體產(chǎn)物形成(1=0> )被抑制，而對(duì)特異性產(chǎn)物形成(一)沒有影響。泳道1:來自Roche Applied Science的分子量標(biāo)記VI
2，7:50ng 模板 DNA3，8:25ng 模板 DNA4，9: IOng 模板 DNA5，10:5ng 模板 DNA6，11:1ng 模板 DNA泳道2-6的產(chǎn)物在不存在肽的情況下進(jìn)行擴(kuò)增，泳道7-11的產(chǎn)物在具有序列H-DIETDIET-NH2的2mM肽的存在下進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)肽存在于PCR反應(yīng)混合物中時(shí)，引物二聚體產(chǎn)物形成()被抑制，而對(duì)特
異性產(chǎn)物形成(一)沒有影響。圖2圖2顯示了序列H-ro⑶FD⑶-NH2的鎂結(jié)合肽的效果。當(dāng)肽存在于PCR反應(yīng)中時(shí)，引物二聚體產(chǎn)物形成(減少，平行觀察到特異性產(chǎn)物形成(一)的增加。泳道1:來自Roche Applied Science的分子量標(biāo)記VI2:25ng 革巴 DNA,無肽3:25ng 革巴 DNA, 3mM 妝4: IOng | E DNA,無肽5: IOng 革巴 DNA, 3mM 妝圖3圖3A:在不存在鎂結(jié)合肽的情況下具有102-106個(gè)G6TOH RNA拷貝的RT-PCR。圖3b:在不存在鎂結(jié)合肽的情況下具有102-106個(gè)G6TOH RNA拷貝的RT-PCR的解鏈曲線分析。圖3c:在ImM鎂結(jié)合肽的存在下具有102-106個(gè)G6TOH RNA拷貝的RT-PCR。圖3d:在ImM鎂結(jié)合肽的存在下具有102-106個(gè)G6TOH RNA拷貝的RT-PCR的解鏈曲線分析。圖4泳道2-6的產(chǎn)物在不存在肽H-DIETDIETDIET-NH2的情況下進(jìn)行擴(kuò)增，泳道7_11在具有序列H-DIETDIETDIET-NH2的2.0mM肽的存在下進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)肽存在于PCR反應(yīng)混合物中時(shí)，引物二聚體產(chǎn)物形成被抑制，而對(duì)特異性產(chǎn)物形成(一)沒有影響。泳道1,12:來自 Roche Applied Science 的分子量標(biāo)記 V2，7:50ng 模板 DNA3,8:25ng 模板 DNA4，9:1Ong 模板 DNA5,10:5ng 模板 DNA6，11:1ng 模板 DNA
具體實(shí)施例方式能夠催化聚合酶鏈反應(yīng)的大多數(shù)耐熱的聚合酶依賴二價(jià)陽(yáng)離子通常為Mg2+的存在。本發(fā)明基于通過向聚合酶鏈反應(yīng)混合物中添加二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合化合物來產(chǎn)生熱啟動(dòng)效果的原理，所述二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合化合物以溫度依賴性方式結(jié)合二價(jià)陽(yáng)離子。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽。還可以使用具有小于17個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度的較小合成肽。因?yàn)殛P(guān)于二價(jià)陽(yáng)離子的結(jié)合位點(diǎn)需要至少3-4個(gè)氨基酸殘基(參見下文)，所以尺寸下限是代表二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)單體的由3-4個(gè)氨基酸組成的肽。如果所述合成肽包含超過一個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)基序，即如果它們包含2次、3次或4次所述基序，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。然而，除代表二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合序列基序的氨基酸外，根據(jù)本發(fā)明的所述合成肽可以包含更多的氨基酸，其可以不是此種基序的部分，但可以有助于所述肽的其他特征。例如，另外的氨基酸殘基可以增加所述肽在不同溶劑中的溶解度。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“合成肽”定義為由酰胺鍵連接的氨基酸鏈，其已借助于縮合進(jìn)行化學(xué)合成。然而，明確排除的是已借助于分離和(任選的)斷裂得自活生物的肽或肽片段。此種合成肽可以根據(jù)本領(lǐng)域一般眾所周知的方法使用。合成基于其中氨基酸在縮合反應(yīng)中借助于形成酰胺鍵與新生肽鏈連接的自動(dòng)化循環(huán)反應(yīng)。偶聯(lián)的氨基酸的反應(yīng)性側(cè)鏈由可適當(dāng)去除的保護(hù)基覆蓋。技術(shù)發(fā)展水平的全面概括在Fields，G.B.，Noble, R.L.，J.Peptide ProteinRes.35(1990) 161-214中給出。此種化學(xué)合成導(dǎo)致具有一般的H2N末端(通常稱為“H”)和具有羧基酰胺化物的C末端(通常稱為“_NH2”)的肽的產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的肽能夠結(jié)合二價(jià)陽(yáng)離子。結(jié)合的強(qiáng)度主要依賴于二價(jià)陽(yáng)離子的性質(zhì)連同肽的基本肽序列基序。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所述合成肽在中性PH下以
0.0lmM-1OOOOiiM的親和常數(shù)結(jié)合所述二價(jià)陽(yáng)離子。具有較強(qiáng)的親和率的化合物例如EDTA當(dāng)加入擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)已顯示導(dǎo)致有害作用，而另一方面，當(dāng)此種肽化合物加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，需要最低限度的親和率以產(chǎn)生可測(cè)量的陽(yáng)性效果。更優(yōu)選地，所述親和常數(shù)具有
0.1mM-1OOOmM的值。最優(yōu)選 地，所述親和常數(shù)具有ImM-1OOmM的值。因?yàn)榇蠖鄶?shù)耐熱的聚合酶是Mg2+依賴性的，所以所述二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)選是結(jié)合Mg2+的基序。在下文的部分中，應(yīng)用下述氨基酸分類。無亞類:甘氨酸(Gly)G脯氨酸(Pro)P非極性，脂族:丙氨酸(Ala)，A纈氨酸(Val)，V亮氨酸(Leu)，L異亮氨酸(Ile)I芳族:苯丙氨酸(Phe)，F(xiàn)酪氨酸(Tyr)，Y色氨酸(Trp)W極性，不帶電的:
絲氨酸(Ser)，S蘇氨酸(Thr)，T半胱氨酸(Cys),C甲硫氨酸(Met)，M天冬酰胺(Asn)，N谷氨酰胺(Gln)，0帶正電荷的:賴氨酸(Lys)，K精氨酸(Arg)，R組氨酸(His)H帶負(fù)電荷的:天冬氨酸(Asp)，D谷氨酸(Glu)E優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的 合成肽包含至少一次氨基酸序列基序X1X2X3，其中Xl是帶負(fù)電荷的氨基酸，優(yōu)選地天冬氨酸X2是甘氨酸或脂族氨基酸X3是帶負(fù)電荷的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，X3是谷氨酸。如果是這種情況，那么X2優(yōu)選是異亮氨酸。同樣優(yōu)選地，與X3鄰近的C末端有X4，所述X4是極性不帶電的氨基酸例如蘇氨酸。最優(yōu)選地，X2是異亮氨酸且與X3鄰近的C末端有X4，所述X4是極性不帶電的氨基酸例如蘇氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X3是天冬氨酸。如果是這種情況，那么X2優(yōu)選是甘氨酸。同樣優(yōu)選地，與Xl鄰近的N末端有X0，所述XO是芳族氨基酸例如苯丙氨酸。最優(yōu)選地，X2是異亮氨酸且與Xl鄰近的N末端有X0，所述XO是芳族氨基酸例如
苯丙氨酸。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含下述的組合物-耐熱的DNA聚合酶-至少一類二價(jià)陽(yáng)離子，優(yōu)選地Mg2+-脫氧核苷酸-緩沖液-如上文公開的具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽。根據(jù)本發(fā)明的此種組合物用于執(zhí)行以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)形式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。作為耐熱的聚合酶，可以使用各種各樣的酶。優(yōu)選地，所述耐熱的DNA聚合酶選自敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix),閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus),硫還原球菌屬物種(Desulfurococcus sp.) Tok.,嗜熱喊甲燒桿菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)，甲燒球菌屬物種(Methanococcus sp.)(例如詹氏甲燒球菌(jannaschii),沃氏甲燒球菌(voltae)),熾熱甲燒嗜熱菌(Methanothermus fervidus.),火球菌屬(Pyrococcus)物種(激烈火球菌(furiosus)、種類GB-D、沃氏火球菌(woesii)、abysi1、horikoshi1、KOD> Deep Vent、Proofstart), Pyrodictium abyssii,隱蔽熱網(wǎng)菌(Pyrodictium occultum),硫化葉菌屬物種(Sulfolobus sp.)(例如嗜酸熱硫化葉菌(acidocaldarius)、硫橫礦硫化葉菌(solfataricus)),熱球菌屬(Thermococcus)物種(zilligi1、barossi1、fumicolans、gorgonarius、JDF-3、kodakaraensis KODI>litoralis、種類 9 分度North-7、種類 JDF-3、gorgonarius、TY),嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum),非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus),棲熱袍菌屬物種(Thermotogasp.)(例如海棲熱袍菌(maritima)、那不勒斯棲熱袍菌(neapolitana)),嗜熱堿甲燒桿菌，棲熱菌屬(Thermus)物種(例如,水生棲熱菌(aquaticus)、布氏棲熱菌(brockianus)、絲狀棲熱菌(filiformis)、黃棲熱菌(fIavus)、乳棲熱菌(Iacteus)、紅色棲熱菌(rubens)、紅棲熱菌(ruber)、嗜熱棲熱菌(thermophilus)、Z05或Dynazyme)。還在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是其突變體、變體或衍生物、嵌合或“融合-聚合酶”，例如Phusion(Finnzymes或 New England biolab s,目錄號(hào) F-530S)或 iProof (Biorad,目錄號(hào) 172-5300), PfxUltima (Invitrogen,目錄號(hào) 12355012)或 HerculaseII Fusion (Stratagene,目錄號(hào)600675)。此外，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含上述一種或多種聚合物的摻合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，耐熱的DNA聚合酶是DNA依賴性聚合酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，耐熱的DNA聚合酶具有另外的逆轉(zhuǎn)錄酶活性且可以用于RT-PCR。關(guān)于此種酶的一個(gè)例子是嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus) (Roche Diagnostics 目錄號(hào):11480014001)。還在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是上文匯集的一種或多種聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的摻合物，所述逆轉(zhuǎn)錄酶例如來自MMLV、AMV、AMLV、HIV、EIAV、RSV的聚合酶和這些逆轉(zhuǎn)錄酶的突變體。具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽以這樣的濃度存在，一旦組合物用于擴(kuò)增靶核酸，所述濃度就允許“熱啟動(dòng)效果”。通常，包含Mg2+結(jié)合位點(diǎn)的肽可以以0.1-1OmM的終濃度存在。優(yōu)選地，包含Mg2+結(jié)合位點(diǎn)的肽以0.5_5mM存在。高度優(yōu)選的是l_3mM的濃度。DNA聚合酶、脫氧核苷酸和其他緩沖液組分的濃度以標(biāo)準(zhǔn)量存在，其濃度是本領(lǐng)域眾所周知的。Mg2+濃度可以為0.lmM-3mM，并且優(yōu)選適應(yīng)且在實(shí)驗(yàn)上進(jìn)行最優(yōu)化。然而，因?yàn)闈舛茸钸m值通常依賴于使用的實(shí)際引物序列，所以無法在理論上進(jìn)行預(yù)測(cè)。除了上文公開的組合物，如果這些組合物進(jìn)一步包含至少一種核酸化合物，那么這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，此種組合物可以包含用于執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的至少一對(duì)擴(kuò)增引物。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以是PCR反應(yīng)混合物，所述PCR反應(yīng)混合物另外包含至少部分純化的核酸樣品，由其將擴(kuò)增懷疑存在于所述樣品中的靶核酸序列。此外，此種組合物可以包含用于實(shí)時(shí)檢測(cè)分別的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光化合物，以及分別地2、3、4或5-6種不同標(biāo)記的雜交探針，所述雜交探針不限于但選自如將在下文公開的檢測(cè)方法中有用的FRET雜交探針、TaqMan探針、分子信標(biāo)(Molecular Beacons)和單標(biāo)記的探針。可替代地，此種組合物可以包含dsDNA結(jié)合熒光實(shí)體例如SybrGreen，其僅當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及至少包含下述的試劑盒⑴耐熱的DNA聚合酶
(ii)如上文公開的合成Mg2+結(jié)合肽，和優(yōu)選地，此種試劑盒包含至少⑴耐熱的DNA聚合酶(ii)如上文公開的合成Mg2+結(jié)合肽，和(iii)MgC12貯存液以調(diào)整最終的Mg2+濃度最優(yōu)選地，此種試劑盒包含至少⑴耐熱的DNA聚合酶(ii)如上文公開的合成Mg2+結(jié)合肽，(iii)MgC12貯存液以調(diào)整最終的Mg2+濃度(iv)脫氧核苷-三-磷酸的混合物，和(V)緩沖液此外，根據(jù)本發(fā)明的此種試劑盒可以是包含至少一對(duì)擴(kuò)增引物的參數(shù)特異性試劑盒。此種試劑盒還可以包含多對(duì)擴(kuò)增引物和優(yōu)選地2、3、4或5對(duì)擴(kuò)增引物。此外，此種試 劑盒可以包含用于實(shí)時(shí)檢測(cè)分別的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光化合物，以及分別地2、3、4或5-6種不同標(biāo)記的雜交探針，所述雜交探針不限于但選自如將在下文公開的檢測(cè)方法中有用的FRET雜交探針、TaqMan探針、分子信標(biāo)和單標(biāo)記探針。可替代地，此種試劑盒可以包含dsDNA結(jié)合熒光實(shí)體，其僅當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。例如，此種試劑盒可以包含SybrGreen。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，此種試劑盒特別適合于執(zhí)行單步RT-PCR，并且包含TaqDNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶例如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的摻合物。在進(jìn)一步的示例性具體實(shí)施方案中，此種試劑盒特別適合于執(zhí)行單步實(shí)時(shí)RT-PCR，并且包含核酸檢測(cè)實(shí)體例如SybrGreen或熒光標(biāo)記的核酸檢測(cè)探針。不同組分可以各自單獨(dú)貯藏于不同容器中。可替代地，不同組分可以全部一起貯藏于I個(gè)貯藏容器中。同樣可替代地，僅組分(i)-(v)亞類的任意選擇的組合可以一起貯藏。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組分如酶(i)或酶加包含1§隊(duì)的反應(yīng)緩沖液、(1見1^(1、^、“、0和肽一起忙藏。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增特定靶核酸的方法，其包括下述步驟-提供懷疑包含所述靶核酸的樣品-加入如上文公開的組合物，和-執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)用于執(zhí)行和最優(yōu)化核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。特別地，本領(lǐng)域使用的最常見方法是如US4，683，195、US4，683，202和US4，965，188中詳細(xì)公開的聚合酶鏈反應(yīng)。特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法包括下述步驟a)提供待擴(kuò)增的懷疑包含靶核酸的樣品b)提供具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽c)提供DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液和Mg2+鹽d)提供設(shè)計(jì)為特異性擴(kuò)增預(yù)定靶核酸的擴(kuò)增引物對(duì)。提及的所有組分的添加可以以任意順序來進(jìn)行。然而，為了達(dá)到熱啟動(dòng)效果，即為了阻止在熱循環(huán)擴(kuò)增規(guī)程自身前在較低溫度下的錯(cuò)誤引發(fā)和隨后的引物延伸，重要的是所述合成肽在DNA聚合酶、dNTPs和擴(kuò)增引物組合前加入反應(yīng)混合物中。盡管包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的所述合成肽如何導(dǎo)致更特異性的擴(kuò)增反應(yīng)的機(jī)制仍未詳細(xì)了解，但假定在較低溫度下肽與Mg2+形成復(fù)合物是合理的，所述Mg2+自身已知是引物延伸反應(yīng)中DNA聚合酶的輔因子。定量復(fù)合物形成導(dǎo)致游離Mg2+濃度中的減少，其結(jié)果是由于缺乏其輔因子的可用性，DNA聚合酶活性被滅活。溫度循環(huán)規(guī)程開始后，合成肽和二價(jià)陽(yáng)離子之間的不耐熱的復(fù)合物分解，并且Mg2+再次可用作輔因子用于聚合酶催化的引物延伸反應(yīng)。優(yōu)選地，在核酸擴(kuò)增期間添加的合成肽包含至少一次氨基酸序列基序X1X2X3，其中Xl是帶負(fù)電荷的氨基酸，優(yōu)選地天冬氨酸X2是甘氨酸或脂族氨基酸X3是帶負(fù)電荷的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，X3是谷氨酸。如果是這種情況，那么X2優(yōu)選是異亮氨酸。同樣優(yōu)選地，與X3鄰近的C末端有X4，所述X4是極性不帶電的氨基酸例如蘇氨酸。最優(yōu)選地，X2是異亮氨酸且與X3鄰近的C末端有X4，所述X4是極性不帶電的氨基酸例如蘇氨酸。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，X3是天冬氨酸。如果是這種情況，那么X2優(yōu)選是甘氨酸。同樣優(yōu)選地，與Xl鄰近的N末端有X0，所述XO是芳族氨基酸例如苯丙氨酸。最優(yōu)選地，X2是異亮氨酸且與Xl鄰近的N末端有X0，所述XO是芳族氨基酸例如
苯丙氨酸。在具體實(shí)施方案中，所述聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。存在用于此種監(jiān)控的不同檢測(cè)形式。a) TaqMan 形式:單鏈雜交探針用2種組分進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)?shù)谝环N組分用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，吸收的能量轉(zhuǎn)移至第二種組分，所謂的猝滅劑。在PCR反應(yīng)的退火步驟期間，雜交探針與靶DNA結(jié)合，并且在隨后的延長(zhǎng)期過程中通過Taq聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性降解。因此激發(fā)的熒光組分和猝滅劑彼此在空間上分開，并且從而可以測(cè)量第一種組分的熒光發(fā)射。TaqMan探針測(cè)定在US5，210, 015、US5, 538，848和US5, 487，972中詳細(xì)公開。TaqMan雜交探針和試劑混合物在US5，804, 375中公開。b)釋放形式:此外，限制于等位基因特異性檢測(cè)的2種其他形式近期已得到公開，其基于下述原理:由于關(guān)于其與靶核酸結(jié)合的匹配或錯(cuò)配情形，標(biāo)記的3'末端核苷酸的釋放的特異性檢測(cè)。US6，391，551公開了這樣的方法，其特征在于在靶序列和探針之間的完美匹配已發(fā)生的情況下，雜交探針的3'末端核苷酸由解聚酶釋放。類似地，EP0930370建議使用由報(bào)道分子和猝滅劑部分標(biāo)記的引物，其特征在于在引物和擴(kuò)增靶之間未發(fā)生完美匹配的情況下，3' -5'校正活性去除I個(gè)部分。
c)分子信標(biāo):這些雜交探針也用第一種組分和猝滅劑進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記優(yōu)選位于探針的2個(gè)末端上。作為探針二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果，2種組分在溶液中空間上鄰近。與靶核酸雜交后，2種組分彼此分開，從而使得用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)后，可以測(cè)量第一種組分的熒光發(fā)射(US5, 118，801)。d) FRET 雜交探針:FRET雜交探針測(cè)試形式對(duì)于所有種類的同質(zhì)雜交測(cè)定尤其有用(Matthews，J.A.和 Kricka, L.J., Analytical Biochemistryl69 (1988) 1-25)。它的特征在于 2 種單鏈雜交探針，所述2種單鏈雜交探針同時(shí)使用且與擴(kuò)增的靶核酸相同鏈的鄰近位點(diǎn)互補(bǔ)。2種探針用不同的熒光組分進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，第一種組分將吸收的能量轉(zhuǎn)移給第二種組分，從而使得當(dāng)2種雜交探針與待檢測(cè)的靶分子的鄰近位置結(jié)合時(shí)，可以測(cè)量第二種組分的熒光發(fā)射?？商娲兀瑸榱吮O(jiān)控FRET受體組分熒光中的增加，還可能監(jiān)控FRET供體組分的熒光減少作為雜交事件的定量測(cè)量。特別地，F(xiàn)RET雜交探針形式可以在實(shí)時(shí)PCR中使用，以檢測(cè)擴(kuò)增的靶DNA。在本領(lǐng)域已知的實(shí)時(shí)PCR的所有檢測(cè)形式中，F(xiàn)RET雜交探針形式已證明是高度靈敏、精確和可靠的(W097/46707 ；W097/46712 ；W097/46714)。作為使用2種FRET雜交探針的替代方案，還可能使用突光標(biāo)記的探針和僅一種標(biāo)記的寡核苷酸探針(Bernard,P.S.,等人,AnalyticalBiochemistry255 (1998) 101-107)。在這點(diǎn)上，可以任意選擇，無論引物是用FRET供體還是用FRET受體化合物進(jìn)行標(biāo)記。e)單標(biāo)記探針(SLP)形式:這種檢測(cè)形式由用單一熒光染料在5'或3'末端上標(biāo)記的單寡核苷酸組成(W002/14555) o 2種不同設(shè)計(jì)可以用于寡聚體(oligo)標(biāo)記:G_粹滅(G-Quenching)探針和硝基H引哚去粹滅(Nitroindole-D`equenching)探針。在G-粹滅實(shí)施方案中，突光染料與寡聚體5'-或3'-末端上的C附著。當(dāng)探針與靶雜交時(shí)，在2個(gè)G' s位于與C相對(duì)的靶鏈上和互補(bǔ)寡核苷酸探針旁邊的位置I中的情況下，熒光顯著減少。在硝基吲哚去猝滅實(shí)施方案中，熒光染料與寡核苷酸的5'-或3'-末端上的硝基吲哚附著。硝基吲哚以某種方式減少游離探針的熒光信號(hào)。當(dāng)探針與靶DNA雜交時(shí)，由于去猝滅作用，熒光增加。f) SybrGreen 形式:如果在擴(kuò)增產(chǎn)物使用雙鏈核酸結(jié)合部分進(jìn)行檢測(cè)的情況下，實(shí)時(shí)PCR在根據(jù)本發(fā)明的添加劑的存在下進(jìn)行，那么這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，分別的擴(kuò)增產(chǎn)物還可以根據(jù)本發(fā)明通過熒光DNA結(jié)合染料進(jìn)行檢測(cè)，在用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)后，所述熒光DNA結(jié)合染料在與雙鏈核酸相互作用后發(fā)出相應(yīng)的熒光信號(hào)。染料SybrGreenI和SybrGold(MolecularProbes)已證明特別適合于這種應(yīng)用?？商娲乜梢允褂们度肴玖?。然而，對(duì)于這種形式，為了區(qū)別不同的擴(kuò)增產(chǎn)物，必須執(zhí)行分別的解鏈曲線分析(US6，174，670)。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及這樣的方法，其特征在于如上文公開的具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽用于實(shí)時(shí)PCR和隨后的解鏈曲線分析。由于用SybrGreen形式的實(shí)時(shí)擴(kuò)增子檢測(cè)無法區(qū)別特異性產(chǎn)物和擴(kuò)增人為產(chǎn)物例如引物/ 二聚體的事實(shí)，所以通常執(zhí)行隨后的解鏈曲線分析。PCR反應(yīng)完成后，樣品的溫度組成型增加，并且在SybrGreen與樣品中存在的雙鏈DNA結(jié)合時(shí)檢測(cè)熒光。雙鏈DNA解離后，信號(hào)立即減少。這種減少用合適的熒光對(duì)溫度-時(shí)間圖進(jìn)行監(jiān)控，從而使得在觀察到最大限度的突光減少時(shí)可以測(cè)定一次導(dǎo)數(shù)(first derivative)值。因?yàn)橐? 二聚體雙鏈DNAs通常短，所以與雙鏈特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的解離相比較，解離成單鏈DNA在較低溫度下發(fā)生。如果在此種解鏈曲線分析期間，具有二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽存在于樣品內(nèi)，那么當(dāng)測(cè)定各自的熒光對(duì)溫度-時(shí)間圖的一次導(dǎo)數(shù)時(shí)，在許多情況下獲得更加陡峭的曲線。除了 PCR和實(shí)時(shí)PCR外，F(xiàn)RET雜交探針用于解鏈曲線分析。在此種測(cè)定中，靶核酸首先在一般的PCR反應(yīng)中用合適的擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增。雜交探針可以在擴(kuò)增反應(yīng)期間已存在或隨后添加。在PCR反應(yīng)完成后，樣品的溫度組成型增加，并且在雜交探針與靶DNA結(jié)合時(shí)檢測(cè)熒光。在解鏈溫度時(shí)，雜交探針從其靶釋放，并且熒光信號(hào)立即下降至背景水平。這種減少用合適的熒光對(duì)溫度-時(shí)間圖進(jìn)行監(jiān)控，從而使得在觀察到最大限度的熒光減少時(shí)可以測(cè)定一次導(dǎo)數(shù)值。如果在此種解鏈曲線分析期間，具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽存在于樣品內(nèi)，那么當(dāng)測(cè)定各自的熒光對(duì)溫度-時(shí)間圖的一次導(dǎo)數(shù)時(shí)，獲得更加陡峭的曲線。如果分子信標(biāo)或單標(biāo)記的探針用作檢測(cè)實(shí)體用于解鏈曲線分析，那么可以觀察到類似效果。提供下述實(shí)施例、序列表和圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍在附加權(quán)利要求中闡述。應(yīng)當(dāng)理解可以在不背離本發(fā)明的精神的情況下在闡述的程序中進(jìn)行修飾。實(shí)施例實(shí)施例1:合成具有序列H-DIETDIET-NH2的肽，HPLC純化，凍干且溶解于30mM Tris-HCl，pH8.5中。PCR反應(yīng)在50iil體積中進(jìn)行，包含50叩、25叩、101^、51^或1叩人基因組0嫩，2.5單位 Taq聚合酶(Roche Applied Science 目錄號(hào) 11146165001) ,0.4mM 正向引物(aga cagtac age cag cct ca) (SEQ ID No:1)，0.4mM反向引物(gacttc aaa ttt ctg ctc ctc) (SEQID NO:2) ,0.2mM dATP、dCTP、dGTP 和 dCTP，Taq PCR 反應(yīng)緩沖液(Roche Applied Science目錄號(hào)11146165001)，具有或不具有H-DIETDIET-NH2-肽。PCR如下執(zhí)行:于94°C 2分鐘，于94°C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35個(gè)循環(huán)，和于72°C經(jīng)過7分鐘的最終延伸步驟。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。如圖1中可見，2.0mM所公開的肽的添加導(dǎo)致引物/二聚體擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的顯著減少。實(shí)施例2:具有序列H-FD⑶FD⑶-NH2的肽的分析。PCR反應(yīng)在50 U I體積中進(jìn)行，包含25ng或 IOng 人基因組 DNA, 2.5 單位 Taq 聚合酶(RocheApplied Science 目錄號(hào) 11146165001),0.4mM 正向引物(aga cag tacagc cag cct ca) (SEQ ID No:1) ,0.4mM 反向引物(agt atgccc ccgcac agg a) (SEQ ID NO:3),0.2mM dATP、dCTP、dGTP 和 dCTP, Taq PCR 反應(yīng)緩沖液(Roche Applied Science 目錄號(hào) 11146165001)，具有或不具有 H-FD⑶FD⑶-NH2-肽。PCR循環(huán)條件如下:于94°C 2分鐘，于94°C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35個(gè)循環(huán)，和于72°C經(jīng)過7分鐘的最終延伸步驟。PCR產(chǎn) 物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
如圖2中可見，3mM H-FD⑶FD⑶-NH2的添加導(dǎo)致減少的引物/ 二聚體產(chǎn)物形成。平行地觀察到特異性產(chǎn)物形成的增加。實(shí)施例3:具有序列H-DIETDIET-NH2的肽在實(shí)時(shí)RT-PCR中進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)在20 yl體積中進(jìn)行，包含來自 Roche Applied Science (目錄號(hào):3261883)的 LightCycler h_G6PDH持家(Houseke印ing)基因試劑盒中可獲得的102、103、104、IO5和IO6拷貝的RNA標(biāo)準(zhǔn)，2.4單位Transcriptor和1.6單位FastStart聚合酶，來自LightCycler RNA擴(kuò)增試劑盒(Amplification Kit) SYBR Green (Roche Applied Science 目錄號(hào) 12015137001)的反應(yīng)緩沖液，0.5mM 正向引物(ggg tgc ate ggg tga cct g) (SEQ ID NO:4) ,0.5mM 反向引物(age cac tgt gag gcg gga) (SEQID NO:5)，具有或不具有 ImM H-DIETDIET-NH2-肽。PCR在LightCycler2.0中如下執(zhí)行:于55°C 10分鐘，于95°C 10分鐘，于95°C 10秒、于55°C 10秒和于72°C 13秒的45個(gè)循環(huán)。這個(gè)實(shí)施例的結(jié)果顯示于圖3中。它舉例說明了鎂結(jié)合肽減少了 RT-PCR中的引物-二聚體形成。擴(kuò)增曲線(圖3a)顯示在不存在肽的情況下，形成非特異性產(chǎn)物。由102、103和104拷貝的靶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在類似cp值下檢測(cè)到。擴(kuò)增曲線可以衍生自形成的幾種產(chǎn)物。在圖3b中描述的解鏈曲線分析中，用103和102拷貝的靶RNA可檢測(cè)到2種解鏈概況。使用靶的這些稀釋，解鏈曲線顯示2種產(chǎn)物。圖3c顯示在ImM鎂結(jié)合肽的存在下的擴(kuò)增曲線。靶稀釋的擴(kuò)增產(chǎn)物在漸增的交叉點(diǎn)時(shí)檢測(cè)到，擴(kuò)增曲線良好分離。與不含鎂結(jié)合肽的實(shí)驗(yàn)相比較，在圖3d的解鏈曲線分析中同樣觀察到特異性的增加。從106到103的靶稀釋排他地檢測(cè)到具有特異性產(chǎn)物的Tm的一條解鏈曲線。在具有102拷貝的靶的樣品中，主要產(chǎn)物是特異性產(chǎn)物，觀察到極少的引物-二聚體。實(shí)施例4:合成具有序列H-DIETDIETDIET-NH2 (SEQ ID NO:8)的肽，HPLC純化，凍干且溶解于 30mM Tris-HCl，pH8.5 中。PCR 反應(yīng)在 50 y I 體積中進(jìn)行，包含 50ng、25ng、10ng、5ng 或Ing 人基因組 DNA, 2.5 單位 Taq 聚合酶(Roche Applied Science 目錄號(hào) 11146165001),
0.4mM 正向引物(cac ccc gtg ctg ctg acc ga) (SEQ IDNO:6) ,0.4mM 反向引物(agg gaggcg gcc acc aga ag) (SEQ ID NO:7),0.2mM dATP、dCTP、dGTP 和 dCTP, Taq PCR 反應(yīng)緩沖液(RocheApplied Science 目錄號(hào) 11146165001)，具有或不具有 H-DIETDIETDIET-NH2 肽，其量如圖4中所指出的。PCR如下執(zhí)行:于94°C 2分鐘，于94°C 10秒、于65 V 30秒和于720C 15秒的35個(gè)循環(huán)，和于72°C經(jīng)過7分鐘的最終延伸步驟。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。圖4顯示具有序列DIETDIETDIET的鎂結(jié)合肽的效果。當(dāng)肽存在于PCR反應(yīng)混合物中時(shí)，引物二聚體產(chǎn)物形成([=0)被抑制，而對(duì)特異性產(chǎn)物形成(一)沒有影響。實(shí)施例5:合成具有序列H-DIET-NH2的肽，HPLC純化，凍干且溶解于30mM Tris-HCl，pH8.5中。PCR反應(yīng)在50iil體積中進(jìn)行，包含50叩、25叩、101^、51^或1叩人基因組0嫩，2.5單位 Taq 聚合酶(RocheApplied Science 目錄號(hào) 11146165001), 0.4mM 正向引物(aga cagtacagc cag cct ca) (SEQ ID NO:1) , 0.4mM反向引物(gac ttc aaa ttt ctgctc ctc) (SEQID NO:2) ,0.2mM dATP、dCTP、dGTP 和 dCTP，Taq PCR 反應(yīng)緩沖液(Roche Applied Science目錄號(hào)11146165001)，具有或不具有H-DIET-NH2-肽。PCR如下執(zhí)行:于94°C 2分鐘，于940C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35個(gè)循環(huán)，和于72°C經(jīng)過7分鐘的最終延伸步驟。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。在至少3mM H-DIET-NH2的存在下，觀察到引物/ 二聚體形成中的減少 。
權(quán)利要求
1.具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽，其選自 H-DIET-NH2H-DIETDIET-NH2H-DIETDIETDIET-NH2和 H-FD⑶FD⑶-NH2。
2.組合物，其包含 -耐熱的DNA聚合酶 -至少一類二價(jià)陽(yáng)離子，優(yōu)選地Mg2+ -脫氧核苷酸 -緩沖液 -具有不超過30的長(zhǎng)度的合成肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種核酸化合物。
4.試劑盒，其包含 -根據(jù)氨基酸包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合siH的肽 -耐熱的DNA聚合酶。
5.用于擴(kuò)增特定靶核酸的方法，其包括下述步驟 -提供懷疑包含所述靶核酸的樣品 -加入根據(jù)權(quán)利要求2-3的組合物 -執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)是實(shí)時(shí)監(jiān)控的聚合酶鏈反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5-6的方法，其特征在于對(duì)由所述擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)施解鏈曲線分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)由鎂螯合的PCR熱啟動(dòng)。具體地，本發(fā)明涉及具有不超過30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度包含二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)的合成肽。根據(jù)本發(fā)明的此種肽是用于核酸擴(kuò)增的組合物的部分且提供所謂的熱啟動(dòng)效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103172700SQ20131006709
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2007年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日
發(fā)明者W.安肯鮑爾, D.海因德爾, F.勞 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司