專利名稱：經由鎂螯合的pcr熱啟動的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過執(zhí)行聚合酶鏈反應方法(PCR)擴增核酸的技術領 域。更精確地，本發(fā)明提供了用于執(zhí)行PCR的新型熱啟動替代方案， 這防止非特異性的引發(fā)事件和假擴增產物的產生。
現(xiàn)有
背景技術：
伴隨核酸擴增和更特別地伴隨PCR的主要問題是非特異性擴增產 物的產生。在許多情況下，這是由于在其實際的熱循環(huán)程序前的非特 異性寡核苷酸引發(fā)和隨后的引物延伸事件，因為耐熱的DNA聚合酶在 環(huán)境溫度下也是適度活性的。例如，經常觀察到由于最終由偶然發(fā)生 的引物二聚化和后續(xù)延伸的擴增產物。為了克服這個問題，本領域眾
所周知的是進行所謂的"熱啟動"PCR,其中擴增反應所需的一種組分與 反應混合物分開或維持無活性狀態(tài)，直至反應混合物的溫度首次升高。 因為聚合酶在這些條件下不起作用，所以在引物無一可以特異性結合 的時間段期間不存在引物延伸。為了達到這種作用，已應用幾種方法 a) DNA聚合酶的物理分離
物理分離可以例如通過固體蠟的屏障來獲得，所述固體蠟使包含 DNA聚合酶的區(qū)室與包含大量其他試劑的區(qū)室分開。在第一個加熱步 驟期間，蠟隨后自動熔化且流體區(qū)室混合(Chou,Q.,等人，Nucleic Acids Res 20 ( 1992 ) 1717-23, US 5,411,876)?？商娲兀跀U增反應前， DNA聚合酶被親和固定化在固體支持體上，并且僅通過熱介導的釋放 而釋放到反應混合物內(Nilsson， J.，等人，Biotechniques 22 ( 1997) 744-51 )。然而，這兩種方法是費時的且不便于執(zhí)行。
b ) DNA聚合酶的化學修飾
對于這種類型的熱啟動PCR, DNA聚合酶由于化學修飾而可逆地 滅活。更精確地，將不耐熱的封閉基團引入TaqDNA聚合酶內，這使 得酶在室溫下無活性(US 5,773,258 )。這些封閉基團在高溫下在前PCR 步驟期間被去除，從而使得酶變得活化。此種不耐熱的修飾例如可以 通過使檸康酐或烏頭酐(Aconitric Anhydride)與酶的賴氨酸殘基偶聯(lián)來獲得(US 5,677， 152)。攜帶此種修飾的酶同時是作為Amplitaq Gold (Moretti, T.,等人，Biotechniques 25 ( 1998 )716-22 )或FastStart DNA 聚合酶(Roche Molecular Biochemicals )商購可得的。然而，封閉基團
的引入是在酶所有空間可利用的賴氨酸殘基上任意發(fā)生的化學反應。 因此，化學修飾的酶制劑的再現(xiàn)性和品質可能有變化且?guī)缀醪荒芗右钥刂啤?br> c) DNA聚合酶的重組修飾
Taq聚合酶的冷敏感突變體已借助于基因工程進行制備。這些突變 體不同于野生型酶之處在于它們缺乏N末端(US 6,241,557)。與天然 或野生型重組Taq聚合酶形成對比，這些突變體在35T下是完全無活 性的，且因此它們可以在一些情況下用于執(zhí)行熱啟動PCR。然而，N 末端截短的冷敏感突變體形式需要低鹽緩沖液條件，與野生型酶相比 較具有較低的持續(xù)合成能力且因此僅能用于擴增短靶核酸。此外，因 為截短形式缺乏5'-3'外切核酸酶活性，所以它不能用于基于TaqMan 檢測形式的實時PCR實驗。
d) 經由核酸添加劑的DNA聚合酶抑制
非特異性退火的引物延伸已顯示通過添加短雙鏈DNA片段得到抑 制(Kainz， P.，等人，Biotechniques 28 ( 2000) 278-82 )。在這種情
但不依賴對照模板(competitor) DNA自身的序列。然而，過量的對照 模板DNA影響核酸擴增反應產量的程度是未知的。
可替代地，可以使用具有導致限定的二級結構的特定序列的寡核 苷酸適體。此種適體已使用SELEX技術就對DNA聚合酶的極高親和 力進行選擇(US 5,693,502， Lin, Y.和Jayasena, S.D.,〗MolBio1271 (1997) 100-11 )。在實際熱循環(huán)過程自身前擴增混合物內此種適體的 存在再次導致與DNA聚合酶的高親和力結合和隨后其活性的不耐熱抑 制(US 6,020,130)。然而，由于選擇過程，迄今為止的所有可利用的 適體僅能與一個特定種類的DNA聚合酶組合使用。
e ) Taq DNA抗體
達到T叫DNA聚合酶的不耐熱抑制的替代方法是添加針對純化的 酶產生的單克隆抗體(Kellogg, D. E.,等人，Biotechniques 16 ( 1994 ) 1134-7; Sharkey, D. J.,等人，Biotechnology ( N Y ) 12 ( 1994 ) 506-9 )。如同寡核苷酸適體，抗體與TaqDNA聚合酶在環(huán)境溫度下以抑制方式 以高親和力結合(US 5,338,671 )。復合物在熱循環(huán)過程自身前的預熱 步驟中分解。這導致總體上擴增的基本上費時的延長，特別是如果應 用用于快速熱循環(huán)的規(guī)程(WO 97/46706 )。
案，其中除Taq聚合酶外，將〗列如來自大腸桿菌coli)的外^核酸 酶III作為補料加入擴增混合物內，以消化非特異性引物二聚體中間物。 如上文7>開的，外切核酸酶III識別雙鏈DNA作為底物，如例如草巴/引 物或耙/引物延伸產物雜交物。消化借助于切割在3'末端脫氧核苷酸殘 基的5'末端上的磷酸二酯鍵而發(fā)生。因為這種類型的外切核酸酶在環(huán) 境溫度下有活性，所以所有非特異性退火的引物和引物延伸產物因此 被消化。在一些實施方案中，這導致擴增反應甚至增強的特異性。然 而，依賴于預溫育時間的持續(xù)時間的非特異性引物消化可以導致引物 濃度中相當大和不受控制的減少，這依次可以影響擴增反應自身。
f)經修飾的引物單獨或與外切核酸酶組合使用
EP 0 799 888和GB 2293238公開了給PCR反應添加3'封閉的寡核 苷酸。由于3'封閉，這些寡核苷酸不能充當引物。封閉的寡核苷酸設 計為與PCR引物竟爭/相互作用，這導致非特異性產物的減少。
另 一個替代方案是硫代磷酸酯寡核苷酸引物與外切核酸酶III組合 在PCR反應混合物中的使用(EP 0 744 470)。在這種情況下，通常接 受雙鏈以及單鏈DNA底物的3'外切核酸酶降解雙鏈體人為產物例如^ I 物二聚體以及遺留(carry over)擴增子，同時使單鏈擴增引物不降解。 類似地，已提議使用具有基本修飾的3'末端和經由大腸桿菌內切核酸 酶IV的模板依賴性去除的引物(US 5,792,607 )。
一般想法的具體實施方案在EP 1 275 735中找到。它的說明書公 開了用于執(zhí)行核酸擴增反應的組合物，其包含(i)耐熱的DNA聚合 酶，(ii)耐熱的3'-5'外切核酸酶，和(iii)具有經修飾的3'末端殘 基的用于核酸擴增的至少一種引物，這經由所述耐熱的DNA聚合酶不 延伸，以及使用這種組合物用于執(zhí)行PCR反應的方法。此外，該方法 涉及包含此種組合物的試劑盒。
然而，公開的替代方案的主要缺點是，對于每種PCR反應需要經 修飾的引物，這導致關于增加每次個別測定的成本增加的要求。g)其他PCR添加劑
本領域已知的其他有機添加劑如DMSO、甜菜石咸和甲酰胺(WO 99/46400; Hengen， P. N. ， Trends Biochem Sci 22 ( 1997 ) 225-6; Chakrabarti, R.和Schutt, C. E., Nucleic Acids Res 29 ( 2001 ) 2377-81 ) 導致富含GC序列的擴增的改善，而不是引物二聚體形成的阻止。類似 地，發(fā)夾推測通過去除蛋白質如組蛋白可以刺激體外連綴轉錄，以使 得染色體DNA可接近(Hildebrand, C. E.,等人，Biochimica et Biophysica Act"77 ( 1977) 295-311 )。
已知單鏈結合蛋白(US 5,449,603 )或tRNA ( St畫nba跳S. R.， Biotechniques 27 ( 1999) 50-2)的添加導致這些添加劑與引物的非共價 結合。這種結合在PCR期間加熱時被破壞。還發(fā)現(xiàn)DNA解旋酶的添 加阻止引物的隨機退火(Kaboev, O.K.,等人，Bioorg Khim 25 ( 1999 ) 398-400 )。此外，在幾種情況下可以使用聚谷氨酸(WO 00/68411 ), 以抑制低溫下的聚合酶活性。
此外，已知聚陰離子聚合酶抑制劑可以依賴于應用的溫育溫度控 制耐熱的DNA聚合酶的活性。US 6,667,165公開了熱啟動實施方案， 其特征在于無活性的聚合酶抑制劑復合物在低于4(TC溫度下形成。在 40°C-55。C之間，抑制劑與模板DNA竟爭結合Taq聚合酶，而在高于 55。C的溫度下，抑制劑從聚合酶活性位點排代。然而，當使用具有較 低退火溫度的引物時，抑制劑趨向減少可獲得的產物產量。
h )鎂螯合
因為耐熱的聚合酶早就已知僅在Mg2+陽離子的存在下是有活性 的，所以已嘗試在熱循環(huán)規(guī)程開始前螯合鎂，以避免錯誤引發(fā)和非特 異性引物延伸。如US 6,403,341中公開的，Mg2+可以以沉淀物的形式 存在，并且因此在擴增反應開始時不能利用。溫度在第一輪熱循環(huán)期 間增加后，沉淀物溶解且Mg2+變得在前3個循環(huán)內完全可用。此種溶 液已顯示是相當可應用的，并且能夠提供良好的熱啟動結果。另一方 面，此種溶液不允許制備包含除引物和靶核酸外的所有試劑的主混合 物，這是執(zhí)行核酸擴增反應所必需的。因此，測定間數(shù)據(jù)再現(xiàn)性和數(shù) 據(jù)比較是復雜的。
考慮到概述的現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的是提供用于熱啟動PCR的 改善的替代組合物和方法，這允許不僅在擴增過程自身前還在熱循環(huán)過程期間抑制非特異性引發(fā)和引物延伸。更精確地，本發(fā)明的目的是 提供用于熱啟動PCR的替代組合物和方法，在其中不能發(fā)生非特異性 退火引物的延伸。
發(fā)明概述
能夠催化聚合酶鏈反應的大多數(shù)耐熱的聚合酶依賴二價陽離子通
常為Mg2+的存在。本發(fā)明基于通過向聚合酶鏈反應混合物中添加二價 陽離子結合化合物來產生熱啟動效果的原理，所迷二價陽離子結合化 合物以溫度依賴性方式結合二價陽離子。
因此，在第一個方面，本發(fā)明涉及具有不超過30個氨基酸的長度 包含二價陽離子結合位點的合成肽。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所迷合成肽以0.01 mM- 10 000 pM的親和 常數(shù)結合所述二價陽離子。
因為大多數(shù)耐熱的聚合酶是Mg2+依賴性的，所以所述二價陽離子 結合位點優(yōu)選是結合Mg2+的基序(motive)。
在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成肽包含至少一次氨基酸序 列基序X1X2X3，其中
Xl是帶負電荷的氨基酸，優(yōu)選地天冬氨酸
X2是甘氨酸或脂族氨基酸
X3是帶負電荷的氨基酸
在第二個方面，本發(fā)明涉及包含下述的組合物 -耐熱的DNA聚合酶 -至少一類二價陽離子，優(yōu)選地Mg2十 -脫氧核苷酸 -緩沖液
-如上文公開的具有不超過30個氨基酸的長度包含二價陽離子 結合位點的合成肽
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所述組合物進一步包含至少一種核酸化合 物，例如應變得擴增的引物和/或耙核酸。
在第三個方面，本發(fā)明涉及包含下述的試劑盒
-如上文7>開的肽，和
-耐熱的DNA聚合酶在第四個方面，本發(fā)明涉及用于擴增特定靶核酸的方法，其包括 下迷步驟
_提供懷疑包含所迷靶核酸的樣品 -加入如上文7>開的組合物，和 _執(zhí)行聚合酶鏈反應
在具體實施方案中，所述聚合酶鏈反應進行實時監(jiān)控。 在進一步具體的實施方案中，對由所述擴增產生的所迷擴增產物 實施解鏈曲線分析。
附圖簡述

圖1
圖1顯示了如實施例1中公開的具有序列DIETDIET的鎂結合肽 的效果。當肽存在于PCR反應混合物中時，引物二聚體產物形成 被抑制，而對特異性產物形成(—)沒有影響。
泳道h來自Roche Applied Science的分子量標記VI 2, 7: 50ng模板DNA 3， 8: 25ng模板DNA
4, 9: 10ng模板DNA
5, 10: 5ng模板DNA 6， 11: lng模板DNA
泳道2-6的產物在不存在肽的情況下進行擴增，泳道7- 11的產 物在具有序列H-D1ETDIET-NH2的2 mM肽的存在下進行擴增。
當肽存在于PCR反應混合物中時，引物二聚體產物形成 被抑制，而對特異性產物形成(—)沒有影響。
圖2
圖2顯示了序列H- FDGDFDGD-NH2的鎂結合肽的效果。當肽存 在于PCR反應中時，引物二聚體產物形成(減少，平行觀察到 特異性產物形成(—)的增加。
泳道1:來自Roche Applied Science的分子量標記VI 2: 25 ng耙DNA，無肽 3: 25ng耙DNA, 3 mM肽 4: 10ng耙DNA,無肽5: 10ng耙DNA, 3 mM肽 圖3
圖3A:在不存在鎂結合肽的情況下具有102 - 106個G6PDH RNA 拷貝的RT-PCR。
圖3b:在不存在鎂結合肽的情況下具有102 - 106個G6PDH RNA 拷貝的RT-PCR的解鏈曲線分析。
圖3c:在1 mM鎂結合肽的存在下具有102 - 106個G6PDH RNA 拷貝的RT-PCR。
圖3d:在1 mM鎂結合肽的存在下具有102 - 106個G6PDH RNA 拷貝的RT-PCR的解鏈曲線分析。 圖4
泳道2 - 6的產物在不存在肽H- DIETDIETDIET-NH2的情況下進 行擴增，泳道7-11在具有序列H-DIETDIETDIET-NH2的2.0 mM肽 的存在下進行擴增。當肽存在于PCR反應混合物中時，引物二聚體產 物形成(1=0)被抑制，而對特異性產物形成(—)沒有影響。
泳道1 ， 12:來自Roche Applied Science的分子量標記V
2, 7: 50ng模板DNA
3, 8: 25ng模板DNA
4, 9: 10ng模板DNA
5, 10: 5ng模板DNA
6, 11: lng模板DNA
發(fā)明詳述
能夠催化聚合酶鏈反應的大多數(shù)耐熱的聚合酶依賴二價陽離子通 常為Mg2+的存在。本發(fā)明基于通過向聚合酶鏈反應混合物中添加二價 陽離子結合化合物來產生熱啟動效果的原理，所述二價陽離子結合化 合物以溫度依賴性方式結合二價陽離子。
因此，在第一個方面，本發(fā)明涉及具有不超過30個氨基酸的長度 包含二價陽離子結合位點的合成肽。還可以使用具有小于17個氨基酸 的長度的較小合成肽。因為關于二價陽離子的結合位點需要至少3-4 個氨基酸殘基(參見下文)，所以尺寸下限是代表二價陽離子結合位 點單體的由3-4個氨基酸組成的肽。如果所述合成肽包含超過一個二價陽離子結合位點基序，即如果它們包含2次、3次或4次所述基序，
這也在本發(fā)明的范圍內。然而，除代表二價陽離子結合序列基序的氨 基酸外，根據(jù)本發(fā)明的所述合成肽可以包含更多的氨基酸，其可以不 是此種基序的部分，但可以有助于所述肽的其他特征。例如，另外的 氨基酸殘基可以增加所述肽在不同溶劑中的溶解度。
在本發(fā)明的背景中，術語"合成肽，，定義為由酰胺鍵連接的氨基酸 鏈，其已借助于縮合進行化學合成。然而，明確排除的是已借助于分 離和(任選的)斷裂得自活生物的肽或肽片段。
此種合成肽可以根據(jù)本領域一般眾所周知的方法使用。合成基于 其中氨基酸在縮合反應中借助于形成酰胺鍵與新生肽鏈連接的自動化 循環(huán)反應。偶聯(lián)的氨基酸的反應性側鏈由可適當去除的保護基覆蓋。
技術發(fā)展水平的全面概括在Fields, G.B., Noble， R丄.，J. Peptide Protein Res. 35 ( 1990) 161-214中給出。此種化學合成導致具有一般的H2N末 端(通常稱為"H")和具有羧基酰胺化物的C末端(通常稱為"-NH2") 的肽的產生。
根據(jù)本發(fā)明的肽能夠結合二價陽離子。結合的強度主要依賴于二 價陽離子的性質連同肽的基本肽序列基序。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所 述合成肽在中性pH下以0.01 mM- 10 000 的親和常數(shù)結合所述二 價陽離子。具有較強的親和率的化合物例如ED丁A當加入擴增反應時 已顯示導致有害作用，而另一方面，當此種肽化合物加入核酸擴增反 應時，需要最低限度的親和率以產生可測量的陽性效果。更優(yōu)選地， 所述親和常數(shù)具有0.1 mM- 1000 mM的值。最優(yōu)選地，所述親和常數(shù) 具有1 mM - 100 mM的值。
因為大多數(shù)耐熱的聚合酶是Mg2+依賴性的，所以所述二價陽離子 結合位點優(yōu)選是結合Mg2+的基序。
在下文的部分中，應用下述氨基酸分類。
無亞類
甘氨酸(Gly) G 脯氨酸(Pro) P 非極性，脂族 丙氨酸(Ala) , A 纈氨酸(Val) , V亮氨酸(Leu) , L 異亮氨酸(He) I 芳族
苯丙氨酸(Phe) , F 酪氨酸(Tyr) ， Y 色氨酸(Trp) W 極性，不帶電的 絲氨酸(Ser) ， S 蘇氨酸(Thr) , T 半胱氨酸(Cys) , C 曱硫氨酸(Met) , M 天冬酰胺(Asn) , N 谷氨酰胺(Gin) , O 帶正電荷的 賴氨酸(Lys) , K 精氨酸(Arg ) , R 組氨酸(His) H 帶負電荷的 天冬氨酸(Asp) , D 谷氨酸(Glu) E
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的合成肽包含至少一次氨基酸序列基序 X1X2X3,其中
Xl是帶負電荷的氨基酸，優(yōu)選地天冬氨酸 X2是甘氨酸或脂族氨基酸 X3是帶負電荷的氨基酸。 在一個實施方案中，X3是谷氨酸。
如果是這種情況，那么X2優(yōu)選是異亮氨酸。同樣優(yōu)選地，與X3 鄰近的C末端有X4，所述X4是極性不帶電的氨基酸例如蘇氨酸。
最優(yōu)選地，X2是異亮氨酸且與X3鄰近的C末端有X4，所述X4 是極性不帶電的氨基酸例如蘇氨酸。
在另一個實施方案中，X3是天冬氨酸。如果是這種情況，那么X2優(yōu)選是甘氨酸。同樣優(yōu)選地，與XI鄰 近的N末端有XO,所述XO是芳族氨基酸例如苯丙氨酸。
最優(yōu)選地，X2是異亮氨酸且與XI鄰近的N末端有X0，所述XO
是芳族氨基酸例如苯丙氨酸。
在第二個方面，本發(fā)明涉及包含下述的組合物
-耐熱的DNA聚合酶
-至少一類二價陽離子，優(yōu)選地Mg2十
-脫氧核苷酸
-緩沖液
-如上文公開的具有不超過30個氨基酸的長度包含二價陽離子 結合位點的合成肽。
根據(jù)本發(fā)明的此種組合物用于執(zhí)行以聚合酶鏈反應(PCR )形式的 核酸擴增反應。
作為耐熱的聚合酶，可以使用各種各樣的酶。優(yōu)選地，所迷耐熱 的DNA聚合酶選自敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix ),閃爍古生J求菌
(Archaeoglobus fulgidus ), 硫還原球菌屬物種(Desulfurococcus sp.) Tok.， 嗜熱堿甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum )， 曱 烷球菌屬物種(Methanococcus sp.)(例如詹氏甲烷J求菌(jannaschii), 沃氏甲烷球菌(voltae )),熾熱曱烷嗜熱菌(Methanothermus fervidus.), 火球菌屬(Pyrococcus)物種(激烈火球菌(furiosus )、種類GB-D、 沃氏火球菌(woesii )、 abysii、 horikoshii、 KOD、 Deep Vent、 Proofstart ), Pyrodictium abyssii, 隱蔽熱網菌(Pyrodictium occultum),石危化葉菌 屬物種(Sulfolobus sp.)(例如嗜酸熱疏化葉菌(acidocaldarius)、硫 石黃礦硫化葉菌(solfataricus ))，熱球菌屬(Thermococcus )物種(zilligii、 barossii 、 fumicolans 、 gorgonarius、 JDF-3、 kodakaraensis KODI、 litoralis 、 種類9分度North-7、種類JDF-3、 gorgonarius、 TY),嗜酸熱原體
(Thermoplasma acidophilum )，非洲棲熱月空菌(Thermosipho africanus ), 棲熱袍菌屬物種(Thermotoga sp.)(例如海棲熱袍菌(maritima )、 那不勒斯棲熱袍菌(neapolitana)),嗜熱堿甲烷桿菌，棲熱菌屬
(Thermus )物種(例如，水生棲熱菌(aquaticus )、布氏棲熱菌
(brockianus)、絲^l犬棲熱菌(filiformis )、黃棲熱菌(flavus)、專'L棲 熱菌(lacteus)、紅色棲熱菌(rubens)、紅棲熱菌(ruber)、嗜熱棲熱菌(thermophilus) 、 Z05或Dynazyme)。還在本發(fā)明的范圍內的 是其突變體、變體或衍生物、嵌合或"融合-聚合酶"，例如Phusion (Finnzymes或New England biolabs，目錄號F誦530S )或iProof( Biorad, 目錄號172-5300 ), Pfx Ultima( Invitrogen,目錄號12355012 )或Herculase II Fusion (Stratagene,目錄號600675 )。此外，根據(jù)本發(fā)明的組合物 可以包含上述一種或多種聚合物的摻合物。
在一個實施方案中，耐熱的DNA聚合酶是DNA依賴性聚合酶。 在另一個實施方案中，耐熱的DNA聚合酶具有另外的逆轉錄酶活性且 可以用于RT-PCR。關于此種酶的一個例子是嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus ) ( Roche Diagnostics目錄號11 480 014 001 )。還在本 發(fā)明的范圍內的是上文匯集的 一種或多種聚合酶與逆轉錄病毒逆轉錄 酶的摻合物，所述逆轉錄酶例如來自MMLV、 AMV、 AMLV、 HIV、 EIAV、 RSV的聚合酶和這些逆轉錄酶的突變體。
具有不超過30個氨基酸的長度包含二價陽離子結合位點的合成肽 以這樣的濃度存在， 一旦組合物用于擴增靶核酸，所述濃度就允許"熱 啟動效果"。通常，包含Mg2+結合位點的肽可以以0.1 - 10mM的終濃 度存在。優(yōu)選地，包含Mg2+結合位點的肽以0.5 - 5 mM存在。高度優(yōu) 選的是1 - 3 mM的濃度。
DNA聚合酶、脫氧核苦酸和其他緩沖液組分的濃度以標準量存在， 其濃度是本領域眾所周知的。Mg2+濃度可以為0.1 mM-3 mM，并且 優(yōu)選適應且在實驗上進行最優(yōu)化。然而，因為濃度最適值通常依賴于 使用的實際引物序列，所以無法在理論上進行預測。
除了上文公開的組合物，如果這些組合物進一步包含至少一種核 酸化合物，那么這也在本發(fā)明的范圍內。例如，此種組合物可以包含 用于執(zhí)行核酸擴增反應的至少 一 對擴增引物。根據(jù)本發(fā)明的組合物還 可以是PCR反應混合物，所述PCR反應混合物另外包含至少部分純化 的核酸樣品，由其將擴增懷疑存在于所述樣品中的耙核酸序列。
此外，此種組合物可以包含用于實時檢測分別的擴增產物的焚光 化合物，以及分別地2、 3、 4或5-6種不同標記的雜交探針，所述雜 交探針不限于但選自如將在下文公開的檢測方法中有用的FRET雜交 探針、T叫Man探針、分子信標(Molecular Beacons )和單標記的探針?？商鎊地，此種組合物可以包含dsDNA結合熒光實體例如SybrGreen, 其僅當與雙鏈DNA結合時發(fā)出焚光。
在第三個方面，本發(fā)明涉及至少包含下述的試劑盒
(i) 耐熱的DNA聚合酶
(ii) 如上文公開的合成Mg2+結合肽，和 優(yōu)選地，此種試劑盒包含至少
(i) 耐熱的DNA聚合酶
(ii) 如上文公開的合成Mg2+結合肽，和
(iii) MgC12貯存液以調整最終的Mg2+濃度 最優(yōu)選地，此種試劑盒包含至少
(i) 耐熱的DNA聚合酶
(ii) 如上文公開的合成Mg2+結合肽，
(iii) MgC12貯存液以調整最終的Mg2+濃度
(iv) 脫氧核普-三-磷酸的混合物，和
(v) 緩沖液
此外，根據(jù)本發(fā)明的此種試劑盒可以是包含至少 一 對擴增引物的 參數(shù)特異性試劑盒。此種試劑盒還可以包含多對擴增引物和優(yōu)選地2、 3、 4或5對擴增引物。
此外，此種試劑盒可以包含用于實時檢測分別的擴增產物的焚光 化合物，以及分別地2、 3、 4或5 - 6種不同標記的雜交探針，所迷雜 交探針不限于但選自如將在下文公開的檢測方法中有用的FRET雜交 探針、TaqMan探針、分子信標和單標記探針?？商娲?，此種試劑盒 可以包含dsDNA結合焚光實體，其僅當與雙鏈DNA結合時發(fā)出熒光。 例如，此種試劑盒可以包含SybrGreen。
在一個示例性實施方案中，此種試劑盒特別適合于執(zhí)行單步 RT-PCR,并且包含T叫DNA聚合酶和逆轉錄酶例如AMV逆轉錄酶的 摻合物。在進一步的示例性具體實施方案中，此種試劑盒特別適合于 執(zhí)行單步實時RT-PCR,并且包含核酸檢測實體例如SybrGreen或熒光 標記的核酸檢測探針。
不同組分可以各自單獨貯藏于不同容器中?？商娲兀煌M分 可以全部一起貯藏于1個貯藏容器中。同樣可替代地，僅組分(i) -(v)亞類的任意選擇的組合可以一起貯藏。在優(yōu)選實施方案中，組分如酶(i)或酶加包含MgU2的反應緩沖液、dNTPs (i、 ii、 iv、 v)和 肽一起貯藏。
在第四個方面，本發(fā)明涉及用于擴增特定靶核酸的方法，其包括 下述步驟
-提供懷疑包含所述靶核酸的樣品 -加入如上文公開的組合物，和 -執(zhí)行聚合酶鏈反應
用于執(zhí)行和最優(yōu)化核酸擴增反應的方法是本領域眾所周知的。特 別地，本領域使用的最常見方法是如US 4,683,195、 US 4,683,202和 US 4,965,188中詳細公開的聚合酶鏈反應。
特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法包括下迷步驟
a) 提供待擴增的懷疑包含靶核酸的樣品
b) 提供具有不超過30個氨基酸的長度包含二價陽離子結合位點 的合成肽
c) 提供DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液和Mg2+鹽
d) 提供設計為特異性擴增預定靶核酸的擴增引物對。 提及的所有組分的添加可以以任意順序來進行。然而，為了達到
i吳引發(fā)和隨后的引物延伸，重^的是所述合成肽在DNA聚合酶、dNTPs 和擴增引物組合前加入反應混合物中。
盡管包含二價陽離子結合位點的所述合成肽如何導致更特異性的 擴增反應的機制仍未詳細了解，但假定在較低溫度下肽與Mg2+形成復 合物是合理的，所述Mg2+自身已知是引物延伸反應中DNA聚合酶的 輔因子。定量復合物形成導致游離Mg2+濃度中的減少，其結果是由于 缺乏其輔因子的可用性，DNA聚合酶活性被滅活。溫度循環(huán)規(guī)程開始 后，合成肽和二價陽離子之間的不耐熱的復合物分解，并且Mg2+再次 可用作輔因子用于聚合酶催化的引物延伸反應。
優(yōu)選地，在核酸擴增期間添加的合成肽包含至少 一次氨基酸序列 基序X1X2X3,其中
Xl是帶負電荷的氨基酸，優(yōu)選地天冬氨酸
X2是甘氨酸或脂族氨基酸
X3是帶負電荷的氨基酸。在一個實施方案中，X3是谷氨酸。
如果是這種情況，那么X2優(yōu)選是異亮氨酸。同樣優(yōu)選地，與X3 鄰近的C末端有X4，所迷X4是極性不帶電的氨基酸例如蘇氨酸。
最優(yōu)選地，X2是異亮氨酸且與X3鄰近的C末端有X4,所述X4 是極性不帶電的氨基酸例如蘇氨酸。
在另一個實施方案中，X3是天冬氨酸。
如果是這種情況，那么X2優(yōu)選是甘氨酸。同樣優(yōu)選地，與XI鄰 近的N末端有XO,所述XO是芳族氨基酸例如苯丙氨酸。
最優(yōu)選地，X2是異亮氨酸且與XI鄰近的N末端有X0,所述X0 是芳族氨基酸例如苯丙氨酸。
在具體實施方案中，所述聚合酶鏈反應進行實時監(jiān)控。存在用于 此種監(jiān)控的不同檢測形式。
a) TaqMan形式
單鏈雜交探針用2種組分進行標記。當?shù)谝环N組分用合適波長的 光激發(fā)時，根據(jù)熒光共振能量轉移的原理，吸收的能量轉移至第二種 組分，所謂的猝滅劑。在PCR反應的退火步驟期間，雜交探針與耙DNA 結合，并且在隨后的延長期過程中通過Taq聚合酶的5'-3'外切核酸酶 活性降解。因此激發(fā)的熒光組分和猝滅劑彼此在空間上分開，并且從
而可以測量第 一種組分的焚光發(fā)射。TaqMan探針測定在US 5，210,015 、 US 5,538,848和US 5,487,972中詳細公開。TaqMan雜交探針和試劑混 合物在US 5,804,375中公開。
b) 釋放形式
此外，限制于等位基因特異性檢測的2種其他形式近期已得到公 開，其基于下述原理由于關于其與靶核酸結合的匹配或錯配情形， 標記的3'末端核苷酸的釋放的特異性檢測。US 6,391,551公開了這樣的 方法，其特征在于在靶序列和探針之間的完美匹配已發(fā)生的情況下， 雜交探針的3'末端核苦酸由解聚酶釋放。類似地，EP 0 930 370建議使 用由報道分子和猝滅劑部分標記的引物，其特征在于在引物和擴增耙 之間未發(fā)生完美匹配的情況下，3'-5'校正活性去除1個部分。
c) 分子信標
這些雜交探針也用第 一種組分和猝滅劑進行標記，標記優(yōu)選位于 探針的2個末端上。作為探針二級結構的結果，2種組分在溶液中空間上鄰近。與靶核酸雜交后，2種組分彼此分開，從而使得用合適波長的 光激發(fā)后，可以測量第一種組分的熒光發(fā)射(US 5,118,801 )。
d) FRET雜交探針
FRET雜交探針測試形式對于所有種類的同質雜交測定尤其有用 (Matthews, J.A.和Kricka, L.J., Analytical Biochemistry 169 ( 1988 ) 1-25)。它的特征在于2種單鏈雜交探針，所述2種單鏈雜交探針同時 使用且與擴增的靶核酸相同鏈的鄰近位點互補。2種探針用不同的焚光 組分進行標記。當用合適波長的光激發(fā)時，根據(jù)熒光共振能量轉移的 原理，第一種組分將吸收的能量轉移給第二種組分，從而使得當2種 雜交探針與待檢測的靶分子的鄰近位置結合時，可以測量第二種組分 的熒光發(fā)射?？商娲?，為了監(jiān)控FRET受體組分熒光中的增加，還 可能監(jiān)控FRET供體組分的熒光減少作為雜交事件的定量測量。
特別地，F(xiàn)RET雜交探針形式可以在實時PCR中使用，以檢測擴 增的耙DNA。在本領域已知的實時PCR的所有^r測形式中，F(xiàn)RET雜 交探針形式已證明是高度靈敏、精確和可靠的(WO 97/46707; WO 97/46712; W097/46714)。作為使用2種FRET雜交探針的替代方案， 還可能使用熒光標記的探針和僅一種標記的寡核苷酸探針(Bernard, P. S.，等人，Analytical Biochemistry 255 ( 1998) 101-107)。在這點上， 可以任意選擇，無論引物是用FRET供體還是用FRET受體化合物進行 標記。
e) 單標記探針(SLP)形式
這種檢測形式由用單一熒光染料在5'或3'末端上標記的單寡核苷 酸組成(WO 02/14555 ) 。 2種不同設計可以用于寡聚體(oligo )標記 G-猝滅 (G-Quenching ) 探針和硝基吲哚去猝滅 (Nitroindole-Dequenching)探針。在G-猝滅實施方案中，熒光染料與 寡聚體5'-或3'-末端上的C附著。當探針與靶雜交時，在2個G's位于 與C相對的靶鏈上和互補寡核苷酸探針旁邊的位置1中的情況下，熒 光顯著減少。在硝基吲哚去猝滅實施方案中，熒光染料與寡核苷酸的 5'-或3'-末端上的硝基吲哚附著。硝基吲哚以某種方式減少游離探針的 熒光信號。當探針與靶DNA雜交時，由于去猝滅作用，熒光增加。
f) SybrGreen形式如果在擴增產物使用雙鏈核酸結合部分進行檢測的情況下，實時 PCR在根據(jù)本發(fā)明的添加劑的存在下進行，那么這也在本發(fā)明的范圍
內。例如，分別的擴增產物還可以根據(jù)本發(fā)明通過熒光DNA結合染料 進行檢測，在用合適波長的光激發(fā)后，所述熒光DNA結合染料在與雙 鏈核酸相互作用后發(fā)出相應的熒光信號。染料SybrGreenI和SybrGold (Molecular Probes)已證明特別適合于這種應用?？商娲乜梢允褂?嵌入染料。然而，對于這種形式，為了區(qū)別不同的擴增產物，必須執(zhí) 行分別的解鏈曲線分析(US 6,174,670)。
本發(fā)明的進一步的方面涉及這樣的方法，其特征在于如上文公開 的具有不超過30個氨基酸的長度包含二價陽離子結合位點的合成肽用 于實時PCR和隨后的解鏈曲線分析。
由于用SybrGreen形式的實時擴增子檢測無法區(qū)別特異性產物和 擴增人為產物例如引物/ 二聚體的事實，所以通常執(zhí)行隨后的解鏈曲線 分析。PCR反應完成后，樣品的溫度組成型增加，并且在SybrGreen 與樣品中存在的雙鏈DNA結合時檢測熒光。雙鏈DNA解離后，信號 立即減少。這種減少用合適的熒光對溫度-時間圖進行監(jiān)控，從而使得 在觀察到最大限度的熒光減少時可以測定一次導數(shù)(first derivative) 值。因為引物/二聚體雙鏈DNAs通常短，所以與雙鏈特異性擴增產物 的解離相比較，解離成單鏈DNA在較低溫度下發(fā)生。
如果在此種解鏈曲線分析期間，具有二價陽離子結合位點的合成 肽存在于樣品內，那么當測定各自的熒光對溫度-時間圖的一次導數(shù)時， 在許多情況下獲得更加陡峭的曲線。
除了 PCR和實時PCR外，F(xiàn)RET雜交探針用于解鏈曲線分析。在 此種測定中，靶核酸首先在一般的PCR反應中用合適的擴增引物進行 擴增。雜交探針可以在擴增反應期間已存在或隨后添加。在PCR反應 完成后，樣品的溫度組成型增加，并且在雜交探針與靶DNA結合時檢 測熒光。在解鏈溫度時，雜交探針從其靶釋放，并且熒光信號立即下 降至背景水平。這種減少用合適的熒光對溫度-時間圖進行監(jiān)控，從而 使得在觀察到最大限度的熒光減少時可以測定一次導數(shù)值。
如果在此種解鏈曲線分析期間，具有不超過30個氨基酸的長度包 含二價陽離子結合位點的合成肽存在于樣品內，那么當測定各自的熒 光對溫度-時間圖的一次導數(shù)時，獲得更加陡峭的曲線。如果分子信標或單標記的探針用作檢測實體用于解鏈曲線分析，那么可以觀察到類 似效果。
提供下述實施例、序列表和圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實 范圍在附加權利要求中闡述。應當理解可以在不背離本發(fā)明的精神的 情況下在闡述的程序中進行修飾。
實施例
實施例1:
合成具有序列H-DIETDIET-NH2的肽，HPLC純化，凍干且溶解 于30 mM Tris-HCl, pH 8.5中。PCR反應在50 jul體積中進行，包含 50 ng、 25 ng、 10 ng、 5 ng或1 ng人基因組DNA, 2.5單位Taq聚合 酶(Roche Applied Science目錄號11146165001 ) , 0.4 mM正向引物 (aga cag tac age cag cct ca ) ( SEQ ID No: 1 ), 0.4 mM反向引物(gac ttc aaa ttt ctg etc etc ) ( SEQ ID NO: 2 ) , 0.2 mM dATP、 dCTP、 dGTP 和dCTP, Taq PCR反應緩沖液(Roche Applied Science目錄號 11146165001 ),具有或不具有H-DIETDIET-NH2-肽。PCR如下執(zhí)行 于94°C 2分鐘，于94°C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35個 循環(huán)，和于72t:經過7分鐘的最終延伸步驟。PCR產物通過瓊脂糖凝 月交電泳進行分析。
如圖1中可見，2.0 mM所公開的肽的添加導致引物/二聚體擴增 產物產生的顯著減少。
實施例2:
具有序列H-FDGDFDGD-NH2的肽的分析。PCR反應在50 pi體積 中進行，包含25 ng或10 ng人基因組DNA,2.5單位Taq聚合酶(Roche Applied Science目錄號11146165001 ) ， 0.4 mM正向引物(aga cag tac age cag cct ca ) ( SEQ ID No: 1) , 0.4mM反向引物(agt atg ccc ccg cacagga) ( SEQ ID NO: 3) , 0.2 mM dATP、 dCTP、 dGTP和dCTP, TaqPCR反應緩沖液(Roche Applied Science目錄號11146165001 ), 具有或不具有H-FDGDFDGD .NH2-肽。PCR循環(huán)條件如下于94°C 2 分鐘，于94°C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35個循環(huán)，和于72。C經過7分鐘的最終延伸步驟。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行 分析。
如圖2中可見，3 mM H-FDGDFDGD-NH2的添加導致減少的引 物/二聚體產物形成。平行地觀察到特異性產物形成的增加。
實施例3:
具有序列H-DIETDIET-NH2的肽在實時RT-PCR中進行分析。PCR 反應在20 pi體積中進行，包含來自Roche Applied Science (目錄號 3261883 )的LightCycler h-G6PDH持家(Housekeeping)基因試劑盒中 可獲得的102、 103、 104、 105和106拷貝的RNA標準，2.4單位Transcriptor 和1.6單位FastStart聚合酶，來自LightCycler RNA擴增試劑盒
(Amplification Kit )SYBR Green( Roche Applied Science目錄號12 015 137 001 )的反應緩沖液，0.5mM正向引物(ggg tgc ate ggg tga cct g )
(SEQ ID NO: 4 ) , 0.5 mM反向引物(age cac tgt gag gcg gga) ( SEQ ID NO: 5),具有或不具有1 mM H-DIETDIET-NH2-肽。PCR在 LightCycler 2.0中如下執(zhí)行于55°C 10分鐘，于95°C 10分鐘，于95°C 10秒、于55°C 10秒和于72°C 13秒的45個循環(huán)。
這個實施例的結果顯示于圖3中。它舉例說明了鎂結合肽減少了 RT-PCR中的引物-二聚體形成。擴增曲線(圖3a)顯示在不存在肽的 情況下，形成非特異性產物。由102、 103和104拷貝的耙擴增的PCR 產物在類似cp值下檢測到。擴增曲線可以衍生自形成的幾種產物。在 圖3b中描迷的解鏈曲線分析中，用103和102拷貝的耙RNA可檢測 到2種解鏈概況。使用粑的這些稀釋，解鏈曲線顯示2種產物。
圖3c顯示在1 mM鎂結合肽的存在下的擴增曲線。耙稀釋的擴增 產物在漸增的交叉點時檢測到，擴增曲線良好分離。與不含鎂結合肽 的實驗相比較，在圖3d的解鏈曲線分析中同樣觀察到特異性的增加。 從106到103的靶稀釋排他地檢測到具有特異性產物的Tm的一條解鏈 曲線。在具有102拷貝的靶的樣品中，主要產物是特異性產物，觀察 到極少的引物-二聚體。
實施例4:合成具有序列H-DIETDIETDIET-NH2 ( SEQ ID NO: 8)的肽， HPLC純化，凍干且溶解于30 mM Tris-HCl, pH8.5中。PCR反應在 50 nl體積中進行，包含50 ng、 25 ng、 10 ng、 5 ng或1 ng人基因組 DNA , 2.5單位Taq聚合酶(Roche Applied Science目錄號 11146165001 ) , 0.4 mM正向引物(caccccgtgctgctgaccga) ( SEQ ID NO: 6 ) ， 0.4 mM反向引物(agg gag gcg gcc acc aga ag) ( SEQ ID NO: 7 ), 0.2 mM dATP、 dCTP、 dGTP和dCTP, Taq PCR反應緩沖液(Roche Applied Science 目錄號 11146165001 ), 具有或不具有 H-DIETDIETDIET-NH2肽，其量如圖4中所指出的。PCR如下執(zhí)行 于94°C 2分鐘，于94°C 10秒、于65aC 30秒和于72°C 15秒的35個 循環(huán)，和于72。C經過7分鐘的最終延伸步驟。PCR產物通過瓊脂糖凝 月交電泳進行分4斤。
圖4顯示具有序列DIETDIETDIET的鎂結合肽的效果。當肽存在 于PCR反應混合物中時，引物二聚體產物形成(i=t>)被抑制，而對 特異性產物形成(—)沒有影響。
實施例5:
合成具有序列H-DIET-NH2的肽，HPLC純化，凍干且溶解于30 mMTris-HCl， pH 8.5中。PCR反應在50 pi體積中進行，包含50 ng、 25 ng、 10 ng、 5 ng或lng人基因組DNA， 2.5單位T叫聚合酶(Roche Applied Science目錄號11146165001 ) , 0.4 mM正向引物Uga cag tac age cag cct ca ) ( SEQ ID NO: 1 ), 0.4 mM反向引物(gac ttc aaa ttt ctg etc etc) (SEQ ID NO: 2) , 0.2mMdATP、 dCTP、 dGTP和dCTP, TaqPCR反應緩沖液(Roche Applied Science目錄號11146165001 ), 具有或不具有H-DIET-NH2-肽。PCR如下執(zhí)行于94°C 2分鐘，于94°C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35個循環(huán)，和于72。C經過7分 鐘的最終延伸步驟。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。在至少3 mMH-DIET-NH2的存在下，觀察到引物/二聚體形成中的減少。
權利要求
1. 具有不超過30個氨基酸的長度包含二價陽離子結合位點的合成肽。
2. 根據(jù)權利要求1的肽，其以0.01 mM- 10 000 的親和常數(shù) 結合所述二價陽離子。
3. 根據(jù)權利要求1 - 2的肽，其結合Mg2+。
4. 根據(jù)權利要求3的肽，其包含至少一次肽序列X1X2X3 其中Xl是帶負電荷的氨基酸，優(yōu)選地天冬氨酸 X2是甘氨酸或脂族氨基酸 X3是帶負電荷的氨基酸。
5. 組合物，其包含-耐熱的DNA聚合酶-至少一類二^f介陽離子，優(yōu)選地Mg2十-脫氧核普酸-緩沖液-根據(jù)權利要求1 - 4的合成肽。
6. 根據(jù)權利要求5的組合物，其進一步包含至少一種核酸化合物。
7. 試劑盒，其包含-根據(jù)權利要求1 - 4的肽 -耐熱的DNA聚合酶。
8. 用于擴增特定靶核酸的方法，其包括下述步驟 -提供懷疑包含所述耙核酸的樣品-加入根據(jù)權利要求5-6的組合物 -執(zhí)行核酸擴增反應。
9. 根據(jù)權利要求8的方法，其特征在于所述核酸擴增反應是實時 監(jiān)控的聚合酶鏈反應。
10. 根據(jù)權利要求8-9的方法，其特征在于對由所述擴增產生的 擴增產物實施解鏈曲線分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有不超過30個氨基酸的長度包含二價陽離子結合位點的合成肽。根據(jù)本發(fā)明的此種肽是用于核酸擴增的組合物的部分且提供所謂的熱啟動效果。
文檔編號C12Q1/68GK101421417SQ200780006644
公開日2009年4月29日 申請日期2007年2月23日 優(yōu)先權日2006年2月27日
發(fā)明者D·海因德爾, F·勞, W·安肯鮑爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司