專利名稱：一種控制黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種控制黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的方法。
背景技術(shù)：
黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一類絲狀擔(dān)子菌白腐真菌，含有一套優(yōu)秀的木質(zhì)素分解系統(tǒng)。這套優(yōu)秀的木質(zhì)素分解系統(tǒng)由系列胞外過氧化物酶組成，典型的酶系如木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶。這些胞外過氧化物酶對底物的氧化具有高度非特異性的特點，可以降解多種有機物，包括天然高聚物、還原性化合物、氧化性化合物、有毒化合物等。因此黃孢原毛平革菌在許多生物科技領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用價值，如危險廢棄物的處理、污染土地的生物修復(fù)、生物燃料的制備、生物制漿和生物漂白等。液態(tài)沉浸式發(fā)酵是培養(yǎng)絲狀真菌和生產(chǎn)胞外酶最經(jīng)濟的一種生產(chǎn)方式。在菌絲球發(fā)酵生產(chǎn)過程中，絲狀真菌的形態(tài)會直接影響發(fā)酵體系中物性參數(shù)、基質(zhì)傳遞等，所以菌絲球的形態(tài)對發(fā)酵產(chǎn)品的生成，發(fā)酵過程的控制至關(guān)重要。絲狀真菌——黃孢原毛平革菌發(fā)酵周期較長，隨著發(fā)酵時間的增加，菌絲球形態(tài)和數(shù)量的變化及胞外代謝產(chǎn)物的積累，引起發(fā)酵過程中溶氧和傳質(zhì)速率降低，進而影響有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率和活性。這嚴(yán)重制約了黃孢原毛平革菌的應(yīng)用。近年來，黃孢原毛平革菌在印染廢水處理方面已逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點，其研究主要涉及黃孢原毛平革菌的產(chǎn)酶特性及菌絲球的吸附特性。菌絲球的吸附性能與其比表面積相關(guān)，因此黃孢原毛平革菌的發(fā)酵產(chǎn)率以及菌絲球的形態(tài)將直接影響其在處理工業(yè)印染廢水中的應(yīng)用效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種控制黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的方法，該方法能高效便捷的控制黃孢原毛平革菌菌絲形態(tài)，獲得球狀菌絲團體，該菌絲團體在染料脫色方面具有較佳的應(yīng)用效果。一種控制黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的方法，添加無機納米粒子至黃孢原毛平革菌液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得球狀黃孢原毛平革菌菌絲團體。上述方案中，所述球狀黃孢原毛平革菌菌絲團體內(nèi)部分布有所述無機納米粒子。上述方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的具體步驟為:將活化后的黃孢原毛平革菌菌種制備成孢子懸浮液，接種到添加有所述無機納米粒子的液體培養(yǎng)基中，每升添加有無機納米粒子的液體培養(yǎng)基中孢子接種量為2.0X IO6 3.0X IO6個，于3(T33°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速140 150rpm，培養(yǎng)5 7天。

上述方案中，所述無機納米粒子采用高溫高壓蒸汽滅菌，所述液體培養(yǎng)基中的組分采用過濾除菌，將所述無機納米粒子在無菌條件下添加至所述液體培養(yǎng)基中與所述液體培養(yǎng)基中的組分混合。上述方案中，過濾除菌中所用過濾器為0.22微米的微濾膜。
上述方案中，所述液體培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖10g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣0.lg/L，藜蘆醇0.lg/L，酒石酸銨0.2g/L，及痕量元素溶液70ml/L ；所述痕量元素溶液配方為:硫酸鎂3g/L，硫酸錳0.5g/L，氯化鈉1.0g/L，七水硫酸亞鐵
0.lg/L，氯化鈷0.lg/L，硫酸銅0.lg/L，七水硫酸鋅0.lg/L，十二水硫酸鋁鉀10mg/L，硼酸10mg/L, 二水鑰酸鈉10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。上述方案中，所添加的無機納米粒子為氧化物。上述方案中，所述氧 化物為A1203、SiO2、或TiO2。上述方案中，以IL所述液體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述無機納米粒子在所述液體培養(yǎng)基中的添加量為0.0l-1Ogo上述方案中，所述無機納米粒子的粒徑為10-1000nm。本發(fā)明所選用的黃孢原毛平革菌菌種來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CICC 14076。本發(fā)明的基本原理:黃孢原毛平革菌生長初期，通過納米粒子與孢子和菌絲之間的相互作用來影響菌絲球的大小和數(shù)量；生長中后期，通過納米粒子與菌絲球的相互作用，同時納米粒子進入到菌絲球的內(nèi)部使其形態(tài)和致密度發(fā)生變化。納米粒子與孢子和菌絲球相互作用示意圖見圖1。本發(fā)明有益的效果在于:
(I)添加無機納米粒子至液體培養(yǎng)基中，能有效的控制菌絲生長形態(tài)，同時由于納米粒子進入菌絲球的內(nèi)部，有利于將菌絲球內(nèi)部更多的活性位點暴露出來，從而提高黃孢原毛平革菌發(fā)酵產(chǎn)率及其對染料的降解率，該方法成本低廉，簡單易行，效果顯著。(2)該方法培養(yǎng)獲得的菌絲球比表面積大，能有效的提高黃孢原毛平革菌對染料的吸附率。


圖1給出了納米粒子與孢子和菌絲球相互作用示意圖。圖2給出了實施例1所獲得的菌絲球掃描電鏡圖。圖3給出了實施例1的發(fā)酵液的蛋白電泳圖。圖4給出了實施例1所獲得的菌絲球與染料作用后的形態(tài)圖。圖5給出了實施例2所獲得的菌絲球與染料作用后的形態(tài)圖。圖6給出了實施例3所獲得的菌絲球與染料作用后的形態(tài)圖。圖中，1，4_納米粒子，2-孢子，3-菌絲球，M-蛋白分子量標(biāo)記，泳道1_對照，泳道2-添加了納米粒子的發(fā)酵結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例進一步對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。實施例1:
一種控制黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的方法，其包括如下步驟:
(O菌種活化:將黃孢原毛平革菌接種在平板培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，待培養(yǎng)2 3天后轉(zhuǎn)入室溫下培養(yǎng)至菌絲鋪滿平板；
(2)添加無機納米粒子:以IL液體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加0.0lg的TiO2納米粒子，該納米粒子的粒徑為10nm，以不添加該TiO2納米粒子的培養(yǎng)基作為對比例；
(3)菌體的培養(yǎng):將步驟(I)所得的活化后的菌種制備成孢子懸浮液，接種到步驟(2)所得到的添加有TiO2納米粒子的液體培養(yǎng)基，每升添加有TiO2納米粒子的液體培養(yǎng)基中孢子接種量為2.0X 106 3.0X IO6個，于30°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)5 7天，得到黃孢原毛平革菌菌絲球的發(fā)酵液。其中，步驟(I)中的平板培養(yǎng)基配方為:麥芽粉10g/L，葡萄糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，酵母浸膏2g/L，天冬酰胺lg/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂lg/L，瓊脂20g/L。步驟(2)中的液體培養(yǎng)基配方為:葡萄糖10g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣
0.lg/L,藜蘆醇0.lg/L,酒石酸銨0.2g/L,及痕量元素溶液70ml/L ;該痕量元素溶液配方為:硫酸鎂3g/L，硫酸錳0.5g/L，氯化鈉1.0g/L，七水硫酸亞鐵0.lg/L，氯化鈷0.lg/L，硫酸銅0.lg/L，七水硫酸鋅0.lg/L，十二水硫酸鋁鉀10mg/L，硼酸10mg/L，二水鑰酸鈉10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。其中步驟(2)的TiO2納米粒子采用高溫高壓蒸汽滅菌，液體培養(yǎng)基中的組分采用過濾除菌，將無機納米粒子與液體培養(yǎng)基中的組分在無菌條件下混合。過濾除菌中所用過濾器為0.22微米的微濾膜。采用這種滅菌方法可以有效的降低TiO2納米粒子的團聚。對步驟(3)所得到的發(fā)酵液中的菌絲球做掃描電鏡(SEM)測試，菌絲球的微觀結(jié)構(gòu)見圖2。由圖2可以看出，納米粒子與菌絲互相作用，納米粒子進入菌絲球的內(nèi)部，使菌絲球的致密度降低，從而增大了菌絲球的比表面積，故菌絲球的吸附能力增強。同時，添加了納米粒子的培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后菌絲球的數(shù)量明顯增多，結(jié)果如表I所示，進一步增加了菌絲球總的比表面積。表I添加納米粒子后菌絲球數(shù)量和大小變化
_數(shù)量/個平均直徑/mm
對照 240 3.259'
實施例 l|477 11.9651
同時，由于納米粒子進入菌絲球的內(nèi)部,使得菌絲球內(nèi)部更多的活性位點暴露出來,有
利于胞外酶合成及分泌，提高其降解能力。因此，對步驟(3)所得到的發(fā)酵液進行SDS-PAGE
蛋白凝膠電泳實驗，得到的蛋白電泳結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，添加無機納米粒子后發(fā)
酵產(chǎn)物的總蛋白量增加。為進一步驗證其降解和吸附能力，將上述發(fā)酵液直接中加入結(jié)晶紫染料，震蕩培養(yǎng)。如圖4所示，加入結(jié)晶紫染料至發(fā)酵液后，發(fā)酵液中的黃孢原毛平革菌菌絲球會吸附染料，使得黃孢原毛平革菌菌絲球的外表面延伸有若干毛刺的球狀形態(tài)清晰可見。每隔一定的時間取樣，將樣品離心后，取上清，在染料最大吸收波長下檢測染料吸光值的變化，同時采用丙酮抽提法將菌體吸附的染料洗脫下來，分光光度計測定最大吸收波長下的吸收值。計算黃孢原毛平革菌對染料的脫色率和吸附率。結(jié)果顯示，與對照相比，在6小時內(nèi)，染料的脫色率從21%提高到59%，增加了約3倍；在I小時內(nèi)染料的吸附率從15%提高到58%，增加了約4倍。實施例2:
本實施例的控制黃孢原毛平革菌菌 絲生長形態(tài)的方法與實施例1大致相同，不同之處在于:1)以1L液體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加5g的SiO2納米粒子，該納米粒子的粒徑為500nm ；
2)發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:于32°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速145rpm，培養(yǎng)5 7天。按照與實施例1相同的方法進行染料脫色率和吸附率的測試。如圖5所示，加入結(jié)晶紫染料至發(fā)酵液后，使得本實施例中的黃孢原毛平革菌菌絲球的球狀形態(tài)清晰可見。6小時內(nèi)，染料的脫色率從21%提高到70%，增加了約3.5倍；在I小時內(nèi)染料的吸附率從15%提高到70%，增加量約4.5倍。實施例3:
本實施例的控制黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的方法與實施例1大致相同，不同之處在于:1)以1L液體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加IOg的Al2O3納米粒子，該納米粒子的粒徑為800nm ；
2)發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:于33°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速140rpm，培養(yǎng)5 7天。按照與實施例1相同的方法進行染料脫色率和吸附率的測試。如圖6所示，加入結(jié)晶紫染料至發(fā)酵液后，使得本實施例中的黃孢原毛平革菌菌絲球的球狀形態(tài)清晰可見。6小時內(nèi)，染料的脫色率從21%提高到49%，增加了約2.3倍；在I小時內(nèi)染料的吸附率從15%提高到48%，增加量約3.3倍。由實施例1至實施例3可知，通過添加納米粒子至液體培養(yǎng)基中進行黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的控制，可以使黃孢原毛平革菌菌絲球的比表面積增大，暴露在外的活性位點增多，從而提高其降解能力和吸附能力。同時，通過納米粒子的種類、粒徑、以及濃度的選擇可以實現(xiàn)黃孢原毛平革菌菌絲球表面的形態(tài)和大小可調(diào)，使其能夠適應(yīng)各類特性的待吸附物質(zhì)。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，例如納米粒子還可以選用其他種類的氧化物，這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種控制黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的方法，其特征在于，添加無機納米粒子至黃孢原毛平革菌液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得球狀黃孢原毛平革菌菌絲團體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述球狀黃孢原毛平革菌菌絲團體內(nèi)部分布有所述無機納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的具體步驟為:將活化后的黃孢原毛平革菌菌種制備成孢子懸浮液，接種到添加有所述無機納米粒子的液體培養(yǎng)基中，每升添加有無機納米粒子的液體培養(yǎng)基中孢子接種量為2.0X IO6 3.0X IO6個，于30 33°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速14(Tl50rpm，培養(yǎng)5 7天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述無機納米粒子采用高溫高壓蒸汽滅菌，所述液體培養(yǎng)基中的組分采用過濾除菌，將所述無機納米粒子在無菌條件下添加至所述液體培養(yǎng)基中與所述液體培養(yǎng)基中的組分混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，過濾除菌中所用過濾器為0.22微米的微濾膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖10g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣0.lg/L，藜蘆醇0.lg/L，酒石酸銨0.2g/L，及痕量元素溶液70ml/L;所述痕量元素溶液配方為:硫酸鎂3g/L，硫酸錳0.5g/L，氯化鈉1.0g/L，七水硫酸亞鐵0.lg/L，氯化鈷0.lg/L，硫酸銅0.lg/L，七水硫酸鋅0.lg/L，十二水硫酸招鉀10mg/L,硼酸10mg/L, 二水鑰酸鈉10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所添加的無機納米粒子為氧化物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述氧化物為A1203、SiO2、或Ti02。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，以IL所述液體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述無機納米粒子在所述液 體培養(yǎng)基中的添加量為0.0l-1Ogo
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述無機納米粒子的粒徑為lO-lOOOnm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種控制黃孢原毛平革菌菌絲生長形態(tài)的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明將無機納米粒子添加至黃孢原毛平革菌液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過無機納米粒子與孢子和菌絲之間的作用，同時納米粒子進入菌絲球內(nèi)部，獲得球狀黃孢原毛平革菌菌絲團體，該菌絲團體在染料脫色方面具有較佳的應(yīng)用效果。
文檔編號C12R1/645GK103160456SQ20131006772
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者蘇寶連, 李其昌, 李昱, 謝浩 申請人:武漢理工大學(xué)