對(duì)蜂房哈夫尼亞菌g5907，g5908，g5913，g5916特異的核苷酸及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及對(duì)蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913,G5916特異的核巧酸，尤其設(shè) 及對(duì)蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913,G5916的0抗原基因簇中單個(gè)基因特異的核巧 酸及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜂房哈夫尼亞菌（偏訪iaaiWi)為腸桿菌科中的一種，菌體呈直桿狀，無(wú)芙膜，能 動(dòng)，兼性厭氧，有呼吸和發(fā)酵兩種類(lèi)型的代謝方式，在人類(lèi)呼吸道、腸道，動(dòng)物腸道和肉類(lèi)奶 制品等食物中較為為常見(jiàn)。蜂房哈夫尼亞菌是一種條件致病菌，該菌在免疫力低下的人群 中可W引起菌血癥，呼吸道感染，尿路感染及其他感染，它可能與腸胃炎有一定關(guān)系，此外， 還可W導(dǎo)致蛋雞的卡他性腸炎和肝脾腫大，保加利亞虹縛魚(yú)中動(dòng)物流行性敗血病等動(dòng)物疾 病。
[0003] 細(xì)菌分型與鑒定方法主要有傳統(tǒng)的表型方法、血清學(xué)方法W及分子鑒定方法。然 而，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的血清分型和鑒定方法存在著一定的問(wèn)題，如血清分型運(yùn) 種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類(lèi)不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和 儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，不 同的0抗原產(chǎn)生的抗血清之間經(jīng)常存在交叉反應(yīng)。因此，建立基于分子生物學(xué)技術(shù)的血清 鑒定方法成為發(fā)展方向。
[0004] 蜂房哈夫尼亞菌的表面抗原，既有0抗原也有H抗原，但是主要用0抗原進(jìn)行分 型，并且0抗原研究的比較透徹。目前已確定蜂房哈夫尼亞菌的正式血清型方案是由俄羅 斯莫斯科研究疫苗和血清的梅契尼科夫研究所的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室提出的，確認(rèn)了 39個(gè)0和36 個(gè)H型。運(yùn)種分類(lèi)方法一直是研究菌株間流行病學(xué)關(guān)系的首選方法，并且在比對(duì)來(lái)自不同 地方不同時(shí)間的菌株方面尤為有用。對(duì)于其分子鑒定也越來(lái)越受到人們的重視，分子生物 學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有速度快且易于大規(guī)模使用的優(yōu)點(diǎn)，是目前國(guó)際上公認(rèn)的致病菌檢測(cè)的發(fā)展 方向。
[0005] 近年來(lái)，越來(lái)越多的分子技術(shù)用于病原菌的分型、鑒定、檢測(cè)及病害診斷，包括轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū)（口巧序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長(zhǎng)度 多態(tài)性（RFL巧分析等。分子生物學(xué)方法不僅可用于蜂房哈夫尼亞菌的快速血清分型篩查， 穩(wěn)定的鑒定結(jié)果可W彌補(bǔ)表型特征鑒定方法的不足。和傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，運(yùn)些基于多聚 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的分子檢測(cè)技術(shù)，不需要經(jīng)過(guò)病原菌的分離、純培養(yǎng)等過(guò)程，而且具有快 速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerasechainreaction,簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù)）作為微生物 檢測(cè)技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測(cè)速度快、特異 性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的增菌過(guò)程，再通過(guò)離屯、及裂解制備細(xì)菌DNA 模板，就可W在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過(guò)程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測(cè)樣品中是否含 有待測(cè)的致病性微生物的目的。PCR的擴(kuò)增過(guò)程僅需I. 5小時(shí)。運(yùn)對(duì)檢驗(yàn)檢疫部口和臨床 檢驗(yàn)無(wú)疑是極大提高了工作速度，同時(shí)也降低了工作成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供了本發(fā)明設(shè)及對(duì)蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913， G5916特異的核巧酸，其特征在于所述的核巧酸具有： 1) 沈QIDNO: 1-8所示的核巧酸中的一種； 2) 與SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸互補(bǔ)的核巧酸中的一種；所述的SEQIDNO: 1-8如 下：
本發(fā)明還提供了一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸中的一種。所述的試劑盒，還包括如下試劑：10ml dNTP30y1 ;10X酶特異性反應(yīng)緩沖液50y1 ;5U/y1耐熱DNA聚合酶5y1 ;混合引物 IOiil(各標(biāo)準(zhǔn)菌株特異的上下游引物，單數(shù)為上游引物，雙數(shù)為下游引物，G5908為SEQID 側(cè)：1-2典5908為沈9 10側(cè)：3-4典5913為沈9 10側(cè)：5-6龍5916為沈9 10側(cè)：7-8);陽(yáng) 性對(duì)照品10y1 ;陰性對(duì)照品10y1 ;(1地2〇 5ml。
[000引其中所述的PCR引物優(yōu)選為所述如SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸中的一種。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了對(duì)蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913,G5916特異的SEQ IDNO: 1-8核巧酸在制備用于該菌不同菌株G5907,G5908,G5913,G5916的PCR試劑盒。
[0010] 本發(fā)明所述蜂房哈夫尼亞菌指的是取樣于敗血癥、尿道感染、傷口感染等臨床標(biāo) 本培養(yǎng)物的粗提液或是蜂房哈夫尼亞菌的純培養(yǎng)物的粗提液。收集蜂房哈夫尼亞菌并提取 基因組是采用常規(guī)方法制備獲得。
[0011] 針對(duì)蜂房哈夫尼亞菌的PCR試劑盒，整個(gè)檢測(cè)步驟包括樣品預(yù)處理一擴(kuò)增一電泳 檢測(cè)結(jié)果。引物和PCR反應(yīng)體系所需要的試劑已預(yù)先加入擴(kuò)增管中，使用者只需將預(yù)處理 后的樣本加入擴(kuò)增管，啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)即可，簡(jiǎn)單快速的完成檢測(cè)工作。
[0012] 本發(fā)明還提供一種液相檢測(cè)忍片，包括液相磁珠和連接在液相磁珠上的寡核巧酸 探針，W及相應(yīng)探針?biāo)谄嗡鶎?duì)應(yīng)的相應(yīng)引物；其中所述核巧酸優(yōu)選為如SEQIDNO: 1-8 所示的核巧酸。
[0013] 本發(fā)明還提供一種微列陣，其包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸優(yōu)選為如SEQ IDNO: 1-8所示的核巧酸。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了對(duì)蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913,G5916特異的核巧 酸在制備用于檢測(cè)蜂房哈夫尼亞菌PCR試劑盒、檢測(cè)蜂房哈夫尼亞菌的基因忍片方面、檢 測(cè)蜂房哈夫尼亞菌微陣列方面的應(yīng)用。所述的檢測(cè)蜂房哈夫尼亞菌指的是檢測(cè)引起支氣管 炎，肺炎，尿路感染，傷口感染和敗血癥的細(xì)菌。
[0015] 本發(fā)明公開(kāi)的對(duì)蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913,G5916特異的核巧酸與現(xiàn) 有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)實(shí)用性強(qiáng) 本發(fā)明建立的一種PCR反應(yīng)體系，可檢測(cè)蜂房哈夫尼亞菌，提供血清分型檢測(cè)所用到 的特異引物，利用該P(yáng)CR方法可W對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
[001引 （2)準(zhǔn)確性高 本發(fā)明通過(guò)對(duì)蜂房哈夫尼亞菌的各血清型特異的基因的PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品得到一條 目的條帶，將得到目的片段與已知長(zhǎng)度相比較，就可W得到蜂房哈夫尼亞菌所對(duì)應(yīng)菌株編 號(hào)。
[0017] (3)檢測(cè)成本相對(duì)較低 可W推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商品監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域，并為其他不同致 病菌檢測(cè)組合提供技術(shù)模式。
[001引【附圖說(shuō)明】： 圖1表示本發(fā)明G5907特異引物檢測(cè)蜂房哈夫尼亞菌及其他標(biāo)準(zhǔn)菌株電泳結(jié)果圖，wzr基因Pl和P2目的條帶為23化P，其余的菌株沒(méi)有任何條帶，具體菌株信息見(jiàn)表2 ; 圖2表示本發(fā)明G5907特異引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中檢測(cè)了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無(wú)任何條帶，具體菌株信息見(jiàn)表2 ; 圖3表示本發(fā)明G5908的r巧基因P3和P4引物檢測(cè)蜂房哈夫尼亞菌及其他標(biāo)準(zhǔn)菌株 電泳結(jié)果圖，目的條帶為269bp，具體菌株信息見(jiàn)表2 ; 圖4表示本發(fā)G5908的wzy基因P3和P4引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中檢測(cè) 了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無(wú)任何條帶，具體菌株信息見(jiàn)表； 圖5表示本發(fā)G5913的r巧基因P5和P6引物檢測(cè)蜂房哈夫尼亞菌及其他標(biāo)準(zhǔn)菌株電 泳結(jié)果圖，目的條帶為189bp，其余的菌株沒(méi)有任何條帶，具體菌株信息見(jiàn)表2 ; 圖6表示本發(fā)明G5913的基因P5和P6引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中檢 測(cè)了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無(wú)任何條帶，具體菌株信息見(jiàn)表2 ; 圖7表示本發(fā)G5916的r巧基因P5和P6引物檢測(cè)蜂房哈夫尼亞菌及其他標(biāo)準(zhǔn)菌株電 泳結(jié)果圖，目的條帶為23化P，其余的菌株沒(méi)有任何條帶，具體菌株信息見(jiàn)表2 ; 圖8表示本發(fā)明G5916的基因P5和P6引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中檢 測(cè)了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無(wú)任何條帶，具體菌株信息見(jiàn)表2 ; 圖9表示分別用蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913,G5916特異引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)血清 型的電泳結(jié)果圖，具體菌株信息見(jiàn)表2 ; 其中：蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913,G5916表示相應(yīng)血清型引物擴(kuò)增結(jié)果，第 一個(gè)泳道是 2000bpDNAmarker或化bplusDL。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件。其中蜂房哈夫尼亞菌來(lái)源于波蘭華沙（PCM CollectionofMicroorganismsatIITDPAN,Wroclaw)。
[0020]連施例I:基閑紀(jì)的提取 37°C營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)蜂房哈夫尼亞菌，收集細(xì)菌，提取基因組具體步驟如下： 用500ul50mMTris-肥Up冊(cè).0)和IOul0. 4M邸TA重懸細(xì)胞，37°C溫育20分鐘，然 后加入IOullOmg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小時(shí)，再加入3UllOmg/ml的RNase，65°C溫育30分鐘。加等體積酪 抽提，取上清液，再用等體積的酪：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)溶液抽提兩次，取上清液，再用 等體積的乙酸抽提W除去殘余的酪。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并 用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ulTE中。基因組DNA通過(guò)0. 4%的瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)。
[0011] 連施例2:序列破譯 提取蜂房哈夫尼亞菌G5907,G5908,G5913,G5916標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組，通過(guò)Solexa pair-end測(cè)序技術(shù)對(duì)蜂房哈夫尼亞菌各標(biāo)準(zhǔn)基因組進(jìn)行全基因組測(cè)序獲得該0血清型的 序列，運(yùn)用Blast及PSI-Blast進(jìn)行序列比對(duì)，采用TMHMMServers. 0program進(jìn)行跨膜結(jié) 構(gòu)預(yù)測(cè)，運(yùn)用ClustalWprogram進(jìn)行序列對(duì)齊及篩選保守和特定基因片段，最終獲得蜂房 哈夫尼亞菌各個(gè)血清型的0抗原基因簇序列及破譯結(jié)果。
[0022] 連施例3:引物巧計(jì) 根據(jù)基因簇破譯情況和建庫(kù)比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)wzy和WZX基因是蜂房哈夫尼亞菌0抗原 特異的基因，