一種用于擴(kuò)增灰葡萄孢菌四個(gè)基因的方法及其多重pcr引物組的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種同時(shí)擴(kuò)增灰葡萄抱菌的方法W及對于 四種殺菌劑的抗性突變基因的引物組。
【背景技術(shù)】
[0002] 灰霉病是在露地、保護(hù)地常見且防治非常困難的一種真菌性病害，其致病菌是灰 葡萄抱菌度OtrytisCinerea),屬半知菌亞口?；移咸驯Ь募闹鞣秶謴V泛，包括200 多種植物，例如番茄、黃瓜、葡萄等生活中常見的蔬菜和水果，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的危害極大。目 前對于灰霉病的防治方法包括農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治等，其中仍W化學(xué)防治為主。 常用的殺菌劑包括苯并咪挫類、二甲酯亞胺類、N-苯氨基甲酸醋類、苯氨基喀晚類等。
[0003] 灰葡萄抱菌具有繁殖快、遺傳變異大和適合度高等特點(diǎn)，已對多種殺菌劑產(chǎn)生了 一定程度的抗性，甚至產(chǎn)生了多重抗性。對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的主要原因是藥物作用的祀 位點(diǎn)基因發(fā)生點(diǎn)突變，使得殺菌劑無法發(fā)揮其原本的效果。田間的菌株在多種殺菌劑的選 擇壓力下，極有可能產(chǎn)生多種交互抗性，因此針對灰葡萄抱菌的特定一種殺菌劑的抗性突 變檢測已經(jīng)不足W滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，實(shí)現(xiàn)其對多種殺菌劑抗性突變的同時(shí)檢測是十分 有意義的。
[0004] 灰葡萄抱菌對苯并咪挫類殺菌劑和N-苯氨基喀晚類殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因 是0-微管蛋白基因（e-tub)發(fā)生E198A、E198V、E198K、F200Y等突變；對二甲酯亞胺 類殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因是組氨酸激酶基因度sOSl)發(fā)生I365S、I365R、I365N、Q369P、 V368F+Q369H、Q369P+N373S、N373S等突變；對環(huán)酷菌胺殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因是3-酬基還 原酶基因（erg27)發(fā)生F412S、F412I、F412V等突變；對晚酷菌胺殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因是 班巧酸脫氨酶鐵硫蛋白基因（S化B)發(fā)生肥72Y、肥72R、肥721^、P225T、P225F、P225LN230I 等突變。本發(fā)明是在已知灰葡萄抱菌對多種殺菌劑的抗藥性等突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引 物組同時(shí)擴(kuò)增0-化6、83〇51、6'旨27、5化6四個(gè)基因片段，可作為后續(xù)的基因忍片等高通量 檢測方法的模板，從而實(shí)現(xiàn)灰葡萄抱菌對四種殺菌劑抗性突變的同時(shí)檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是在已知灰葡萄抱菌對苯并咪挫類、晚酷菌胺類、異菌脈和環(huán)酷菌胺等多 種殺菌劑的抗藥性突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，建立的一種用于同時(shí)擴(kuò)增0-tub、BsOSUerg27、 S化B四種基因片段的PCR引物組。本發(fā)明可直接采用提取的灰葡萄抱菌基因組作為模板， 用設(shè)計(jì)的引物組對模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得富集的四個(gè)基因片段。本發(fā)明是首次采用多重PCR 方法對灰葡萄抱菌的四個(gè)抗藥性突變基因進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，為后期抗藥位點(diǎn)的檢測大大減少 了工作量。
[0006] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增灰葡萄抱菌0-tub、BsOSl、erg27、S化B四個(gè)基因片段的 引物組，經(jīng)過對PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，將四個(gè)基因片段在同一PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。
[0007] 本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是：（1)首次在同一個(gè)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增灰葡萄抱菌e-tub、 BsOSl、erg27、S化B四個(gè)基因片段，四個(gè)基因片段中含有對多數(shù)殺菌劑的抗性突變位點(diǎn)，為 后期檢測灰葡萄抱菌對多種殺菌劑的抗藥性減少了工作量。（2)反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增少， 對后續(xù)的檢測沒有影響。
[0008] -種用于擴(kuò)增灰葡萄抱菌四個(gè)基因的方法，其特征在于共分兩步：
[0009] 第一步：提取灰葡萄抱菌基因組
[0010] 第二步：進(jìn)行PCR反應(yīng)：采用四對引物，分別用于擴(kuò)增灰葡萄抱菌0-tub、BsOSU erg27、S化B基因，四對引物分別為
[0011]沈QIDN0:1 CGATACCGTTGTCGAGCCAT
[0012] 沈QIDN0:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTT
[0013]沈QIDN0:3 ACACCGACCCAGCACCAGA
[0014]SEQIDNO:4 TTAGCAATAACCGCCCAAA
[0015]沈QIDN0:5 CACCCGCGTAGCAAGAGATG
[0016]沈QIDN0:6 TGAGTCAGGTCTCCCTTTGC
[0017] 沈QIDN0:7 ATCATGCCCTTGAATTTTGTG
[0018]沈QIDN0:8 CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTC
[0019]PCR反應(yīng)混合液中含有提取的待測樣品的基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)體 系如下，
[0020] SEQ IDNO:!, 10.UM 0^uL 化QIDNO:2，IOyM 0.5.此 SEQ!DNO:3, IOuMj|_iL SEQ!DNO;4, IOuMI^iL SE巧技 1st任 5:，IOpMOJjjL SEQ!DNO:6, IOuM 〇.5uL SEQ!DNO:7, IOuM 〇.5uL SE巧技 1st任 8:，IOpMOJjjL dNTP.IOmM 0.5uL Taq!Vil;，20U,VL 0IuL MgCla， 5QMM 0.75uL 不含Mg2+化PCR緩沖液，I〇x 2.5.止 待測基因組，50峭/陣 IjiL 4踰O 15.15 呼
[00引]PCR反應(yīng)程序：94°C5min;94°C30sec，59°C30sec，72°C20sec;72°ClOmin。
[0022] 更具體的本發(fā)明的目的是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的：
[0023] 一種同時(shí)擴(kuò)增四個(gè)灰葡萄抱菌抗藥相關(guān)基因的引物組，其體系包括四對多重PCR 擴(kuò)增引物，分別用于擴(kuò)增灰葡萄抱菌P-化6、83051、6'旨27、5化8四個(gè)基因片段；口〇?反應(yīng)組 分，購自invitrogen公司，包括Taq酶，dNTPs，PCR緩沖液（不含Mg2+) ,MgClz。采用UNIQ-IO 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司，提取待測樣品 的基因組DNA。
[0024]所用的引物序列分別為：SEQIDN0:1CGATACCGTTGTCGAGCCAT，沈QIDN0:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTT，用于擴(kuò)增e-tublin基因；SEQIDN0:3ACACCGACCCAGCACCAGA， SEQIDNO: 4TTAGCAATAACCGCCCAAA,用于擴(kuò)增S化B基因；SEQIDNO: 5 CACCCGCGTAGCAAGAGATG，沈QIDN0:6TGAGTCAGGTCTCCCTTTGC，用于擴(kuò)增BcOSl基因；SEQ IDN0:7ATCATGCCCTTGAATTTTGTG，沈QIDN0:8CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTC，用于擴(kuò)增化邑27 基因。
[00巧]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對照組PCR反應(yīng)，其中實(shí)驗(yàn)組PCR反應(yīng)混合液中含有提取的待測樣 品的基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)體系如下，
[0026] SEQ IDNO: 1，！^iM 0bi± SEQIDNO:2，！化iM 0,薄L SEQIDNO:3，！OyM 1|_山 SEQIDNO:4，！0|_iM 1|_山 SEQIDNO:、！0|_iM 0,薄L 化QI[)NO:6，IOyM 0,5uL 化QI[)NO:7，IOyM 0.5.UL SEQIDNO:8,i0.uM 0,5pL clNTP,IOmM 0,5uL Taq賠，201」4止 0.1,uL MgCk，50'mM 巧片L PCR緩沖液（不含Mg2+}:，1恥 2,5uL 待測基因組，50ng/|iLl(xL ddH,0 段1 卻iL
[0027] 對照組PCR反應(yīng)混合液中加入等量的雙蒸水（d地2〇)作為PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng) 體系如下：
[0028] SEOIDNO:I, IOpM 化沖L SEO !DNO:2, IO'uMO^L SE〇!DNO:3, IO'uMI片L SEQIDNO:4，IO'uMI片L SEQIDNO:、IO.uM 〇.5,uL SE〇!DNO:6, IO.uM 〇.5,uL 化QIDNO:7，IO,uM 〇.5,uL 化QIDNO:8，IOpM 〇.5,uL
[0029] ClNFPIOmM 化 5jiL TaqW,2OU/.1L 0.1,LiL MgCI:，50mM 0.7引止 PCR緩沖液（不含Mg2+) :，l〇x 2.5hL ddH.O 16.15i.lL
[0030] PCR反應(yīng)程序：94°C5min;94°C30sec，59°C30sec，72°C20sec，35巧cles; 72°CIOminO
[003。 PCR結(jié)束后，取5iiL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠（2% )電泳，檢測結(jié)果。
【附圖說明】
[0032] 圖1本發(fā)明實(shí)施例電泳檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1、菌株樣品的多重PCR擴(kuò)增
[0034] 采用UNIQ-IO柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份 有限公司，提取5株待檢測菌株的基因組DNA。PCR反應(yīng)組分，購自invitrogen公司，包括 Taq酶，dNTPs，PCR緩沖液（不含Mg2+)，MgClz。
[0035] 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對照組PCR反應(yīng)，其中實(shí)驗(yàn)組PCR反應(yīng)混合液中含有提取的待測樣 品的基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)體系如下，
[0036] SEQIDN0:1，化引止SEQIDN0:2，O引止 SEQfDN0:3，IpL SEQfDN0:4，IjiL SECMDN0:5，1〇!_iM 0.非L SE〇rDNO:6, I〇!.iM 0.非L SECMDNO:7，1〇!_iM 0.非L SE〇rDNO:S, 1〇!.iM 0.非L dNTP,IOmM 0卻iL
[0037] Taqi"時(shí)，20U/VLO.lpL MgCb，5〇mM 0.75|iL PCR 緩沖液（不含MgW)，WX 2.5uL 待測基因組，如ng/陣 破L ddH：0 15.!5)jL
[0038] 對照組PCR反應(yīng)混合液中加入等量的雙蒸水（d地2〇)作為PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng) 體系如下：
[0039] S；EQIDNO:l，iOfiM 0,卻正 SEQIDNO:2,iOfiM 0.卽L S；EQIDNO:3，i(VMIuL SEQIDNO:4,iOfiMIgL S；EQIDNO:5，i(VM 0.卽L SEQIDNO:6,iOfiM 0.卽L SEQIDNO:7，IOfiM 〇.5},iL SEQIDNO:8，I叩M 〇.5非 dNTP,IOmM 0.非止 Taq鴨，20U./.UL 0.1j.iL MgCl), 50mM 0.7非止 PCR緩沖液（不含Mg2*) ,l〇x 2.5陣 加Hi'O 16.15沖
[0040] PCR反應(yīng)程序：94°CSmin;94°C30sec，59°C30sec，72°C20sec;72°ClOmin。
[0041] PCR結(jié)束后，取5yL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠（2 %，即0. 6g溶質(zhì)溶解于30ml溶劑） 中電泳，檢測結(jié)果。如圖1所示，點(diǎn)樣孔M為DNAmarker,點(diǎn)樣孔1-5為檢測樣品，點(diǎn)樣孔6 為陰性對照組。根據(jù)電泳結(jié)果，本發(fā)明的引物能夠成功擴(kuò)增出0 -tub、BsOSUerg27、S化B 四個(gè)基因片段。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于擴(kuò)增灰葡萄孢菌四個(gè)基因的方法，其特征在于共分兩步： 第一步：提取灰葡萄孢菌基因組 第二步：進(jìn)行PCR反應(yīng)：采用四對引物，分別用于擴(kuò)增灰葡萄孢菌β-tub、BsOSU erg27、SdhB基因，四對引物分別為 SEQ ID N0:1 CGATACCGTTGTCGAGCCAT SEQ ID NO:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTT SEQ ID NO:3 ACACCGACCCAGCACCAGA SEQ ID NO:4 TTAGCAATAACCGCCCAAA SEQ ID NO:5 CACCCGCGTAGCAAGAGATG SEQ ID NO:6 TGAGTCAGGTCTCCCTTTGC SEQ ID NO:7 ATCATGCCCTTGAATTTTGTG SEQ ID NO:8 CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTC PCR反應(yīng)混合液中含有提取的待測樣品的基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)體系如 下，PCR 反應(yīng)程序：94°C 5min ;94°C 30sec，59°C 30sec，72°C 20sec ;72Γ IOmin02. -種用于擴(kuò)增灰葡萄孢菌四個(gè)基因的多重PCR引物組，對應(yīng)于擴(kuò)增灰葡萄孢菌 β -tub、BsOSl、erg27、SdhB基因，四對引物分別為 SEQ ID NO:I CGATACCGTTGTCGAGCCAT SEQ ID NO:2 GGTTGCTGAGCTTCAAGGTT SEQ ID NO :3 ACACCGACCCAGCACCAGA SEQ ID NO :4 TTAGCAATAACCGCCCAAA SEQ ID NO :5 CACCCGCGTAGCAAGAGATG SEQ ID NO :6 TGAGTCAGGTCTCCCTTTGC SEQ ID NO :7 ATCATGCCCTTGAATTTTGTG SEQ ID NO :8 CTTTGCCTCCCCTTTCTTCTCo
【專利摘要】一種用于擴(kuò)增灰葡萄孢菌四個(gè)基因的方法及其多重PCR引物組涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明是在已知灰葡萄孢菌對苯并咪唑類、啶酰菌胺類、異菌脲和環(huán)酰菌胺等多種殺菌劑的抗藥性突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，建立的一種用于同時(shí)擴(kuò)增β-tub、BsOS1、erg27、SdhB四種基因片段的PCR引物組。本發(fā)明可直接采用提取的灰葡萄孢菌基因組作為模板，用設(shè)計(jì)的引物組對模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得富集的四個(gè)基因片段。本發(fā)明是首次采用多重PCR方法對灰葡萄孢菌的四個(gè)抗藥性突變基因進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，為后期抗藥位點(diǎn)的檢測大大減少了工作量。本發(fā)明經(jīng)過對PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，將四個(gè)基因片段在同一PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11, C12N15/10
【公開號】CN105154432
【申請?zhí)枴緾N201510593450
【發(fā)明人】馬雪梅, 張鑫, 呂寶北, 趙鵬翔, 謝飛
【申請人】北京工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月17日