本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與中國荷斯坦奶牛繁殖性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記及檢測(cè)該分子標(biāo)記的試劑盒，以及該snp分子標(biāo)記和試劑盒的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

分子標(biāo)記輔助選擇(markerassistantselect，mas)由于充分利用了遺傳標(biāo)記、表型和系譜信息，比常規(guī)遺傳評(píng)定方法具有更大的信息量，可提高個(gè)體遺傳評(píng)定的準(zhǔn)確性。meuwissen等(2001)通過模擬證明，根據(jù)標(biāo)記信息預(yù)測(cè)育種值的準(zhǔn)確性可達(dá)85％。在無后裔測(cè)定記錄的情況下，育種值的估計(jì)達(dá)到如此高的準(zhǔn)確度具有非常重大的意義。在牛育種中應(yīng)用mas有許多優(yōu)點(diǎn)：不易受環(huán)境的影響，沒有性別、年齡的限制，允許進(jìn)行早期選種，縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，從而提高選種的效率和準(zhǔn)確性。kashi等(2008)指出，在奶牛上，利用mas對(duì)后備公牛進(jìn)行性狀基因篩選，其速度比傳統(tǒng)的后裔測(cè)定方法要快20～30％。通過提前選擇種公牛，mas可獲得雙倍的遺傳進(jìn)展。

pcr-sscp(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism)屬于單核苷酸多態(tài)性(snp)的一種形式。pcr-sscp分子標(biāo)記是在pcr和dna單鏈凝膠電泳技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種基因變異檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是：在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，dna單鏈的遷移率除與dna的長(zhǎng)短有關(guān)外，更主要的是取決于dna單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，dna單鏈可自折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，這種構(gòu)象由dna單鏈堿基順序所決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)部的相互作用(主要為氫鍵)來維持。相同長(zhǎng)度的dna單鏈因順序不同，甚至單個(gè)堿基的改變，造成單鏈構(gòu)象的變化，從而引起電泳遷移率的不同，表現(xiàn)出多態(tài)性，即單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)。作為一種新的dna序列變異檢測(cè)手段，pcr-sscp法與傳統(tǒng)的檢測(cè)基因變異的方法相比確有獨(dú)到之處：1)它可以發(fā)現(xiàn)靶dna片段中未知位置的堿基突變；takao經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的dna片段中的單堿基突變，90％可被sscp發(fā)現(xiàn)；2)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈dna分離，還可以進(jìn)一步提純。

對(duì)泌乳性能的高強(qiáng)度選擇打亂了群體的遺傳穩(wěn)態(tài)，泌乳性能與功能性狀間的負(fù)相關(guān)造成高產(chǎn)奶牛群體繁殖性能的退化。據(jù)報(bào)道，每年有15-20％的奶牛由于繁殖問題而被迫淘汰，其造成的直接和間接損失嚴(yán)重影響奶業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。衡量繁殖性能的常用指標(biāo)主要包括初產(chǎn)月齡、產(chǎn)后第一次配種天數(shù)、空懷天數(shù)、產(chǎn)犢間隔、受胎指數(shù)等，由于這些性狀的遺傳力較低、缺乏數(shù)據(jù)記錄，導(dǎo)致很難將其考慮到育種計(jì)劃中。以繁殖性能的候選基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和數(shù)量遺傳學(xué)的方法，分析這些基因的多態(tài)性與生產(chǎn)性能的相關(guān)性，找出對(duì)生產(chǎn)有利的基因型或等位基因，進(jìn)而將這些基因或與其緊密連鎖的基因作為標(biāo)記應(yīng)用于選種，不但可以提高選種的準(zhǔn)確性，更重要的是可以在動(dòng)物還不能表現(xiàn)出性狀的早期就可以通過檢測(cè)基因型對(duì)動(dòng)物進(jìn)行選擇，這顯然比傳統(tǒng)的僅依據(jù)表型值進(jìn)行選擇更經(jīng)濟(jì)和可靠。

奶牛的繁殖性能與機(jī)體能量代謝密切相關(guān)，圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡(negativeenergybalance，neb)是引起高產(chǎn)奶牛繁殖性能退化的重要原因。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ，pparγ)是由pparg基因編碼的一種配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控動(dòng)物能量穩(wěn)態(tài)、糖脂代謝和免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究表明，pparγ是連接哺乳動(dòng)物能量代謝和繁殖生理過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，pparγ在黃體和胎盤中的高表達(dá)對(duì)孕酮生成、胚胎著床和維持妊娠具有重要作用。如果pparg基因的核苷酸序列發(fā)生變異，就可能可能對(duì)pparγ與配體的結(jié)合及共價(jià)修飾激活產(chǎn)生影響，降低pparγ/rxrα與能量穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因啟動(dòng)子上游ppre的親和力，繼而影響pparγ的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)，擾亂機(jī)體的能量穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性，對(duì)發(fā)情、排卵和胚胎發(fā)育等繁殖生理過程產(chǎn)生影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與中國荷斯坦奶牛繁殖性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供檢測(cè)該分子標(biāo)記的試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于提供鑒定具有高繁殖性能的中國荷斯坦奶牛的方法。

本發(fā)明提供一種與中國荷斯坦奶牛繁殖性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記，其核苷酸序列如seqidno.1所示，在該序列的第118bp處的堿基為g或t。

本發(fā)明的與中國荷斯坦奶牛繁殖性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記通過seqidno.2-3所示的引物擴(kuò)增得到。

本發(fā)明提供了上述snp分子標(biāo)記在鑒定高繁殖性能中國荷斯坦奶牛中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，當(dāng)pparg基因seqidno.1所示序列的位點(diǎn)表現(xiàn)為gg基因型時(shí)，表明待測(cè)中國荷斯坦奶牛屬于高繁殖性能的中國荷斯坦奶牛。

本發(fā)明提供了上述snp分子標(biāo)記在中國荷斯坦奶牛分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)采用pcr和測(cè)序技術(shù)篩選到與中國荷斯坦奶牛繁殖性狀相關(guān)的上述snp標(biāo)記；

(2)通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)檢測(cè)待測(cè)中國荷斯坦奶牛的基因型；

(3)根據(jù)基因型進(jìn)行高繁殖性能的中國荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種的選育，當(dāng)上述分子標(biāo)記基因型為gg，則待測(cè)中國荷斯坦奶牛為高繁殖性能中國荷斯坦奶牛。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，選擇不同page帶型個(gè)體的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物各3份測(cè)序，確定不同page帶型所對(duì)應(yīng)的基因型。其他未測(cè)序個(gè)體，則可直接根據(jù)page帶型判定對(duì)應(yīng)的基因型，不需要對(duì)所有個(gè)體都測(cè)序。

本發(fā)明提供了用于檢測(cè)上述snp分子標(biāo)記的引物對(duì)，分別為正向引物f：5′-tgtaactcaacctcctgtt-3′(seqidno.2)和反向引物r：5′-aagatgctgtcagtgaact-3′(seqidno.3)。

本發(fā)明提供了上述seqidno.2-3所示的引物對(duì)在鑒定高繁殖性能中國荷斯坦奶牛中的應(yīng)用，以及在中國荷斯坦奶牛分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了含有上述引物對(duì)的試劑盒在鑒定高繁殖性能中國荷斯坦奶牛中的應(yīng)用，以及在中國荷斯坦奶牛分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種鑒定高繁殖性能中國荷斯坦奶牛的方法，

(1)提取待測(cè)中國荷斯坦奶牛的基因組dna；

(2)以步驟(1)的基因組dna為模版，利用權(quán)利要求6所述引物對(duì)通過pcr反應(yīng)擴(kuò)增出中國荷斯坦奶牛pparg基因323bp片段；

(3)檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增序列中118bp處的堿基為g，且基因型為gg時(shí)，則待測(cè)牛屬于高繁殖性能的中國荷斯坦奶牛。

上述方法的步驟(2)中，pcr反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25μl計(jì)為：模板dna1μl，10×buffer(15mmol/lmgcl2)2.5μl，dntp(2.5mmol/l)2μl，引物f和r(12.5pmol/μl)各0.5μl，taqdna聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，超純水18.0μl；步驟(2)中pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

本發(fā)明對(duì)中國荷斯坦奶牛pparg基因的snp位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并與產(chǎn)后第一次配種天數(shù)、空懷天數(shù)和受胎指數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，通過spss軟件一般線性模型程序分析發(fā)現(xiàn)，gg基因型個(gè)體的產(chǎn)后第一次配種天數(shù)、空懷天數(shù)和受胎指數(shù)顯著低于tt基因型個(gè)體(p<0.05)。每個(gè)g等位基因替代t等位基因會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)后第一次配種天數(shù)縮短8.83天，空懷天數(shù)縮短15.7天，受胎指數(shù)降低0.25次。該多態(tài)位點(diǎn)的檢出，為中國荷斯坦奶牛繁殖性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明中與中國荷斯坦奶牛繁殖性狀相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受中國荷斯坦奶牛年齡、性別的限制，可用于中國荷斯坦奶牛的早期選育，甚至在剛出生時(shí)就可準(zhǔn)確的進(jìn)行篩選，可顯著加快中國荷斯坦奶牛繁殖性狀的遺傳進(jìn)展。

(2)檢測(cè)中國荷斯坦奶牛pparg基因單核苷酸多態(tài)性的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，檢測(cè)成本低。

(3)中國荷斯坦奶牛pparg基因snp位點(diǎn)的檢出，為中國荷斯坦奶牛繁殖性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

附圖說明

圖1為中國荷斯坦奶牛pparg基因snp位點(diǎn)page分型圖。

圖2為三種基因型測(cè)序峰圖；依次分別為gg型、tt型和gt型。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1與中國荷斯坦奶牛繁殖性狀相關(guān)的snp標(biāo)記的確定以及檢測(cè)該位點(diǎn)方法的建立

1、提取待測(cè)中國荷斯坦奶牛血液中的基因組dna

由頸靜脈采取不同牧場(chǎng)293頭中國荷斯坦奶牛的血樣，acd抗凝，-20℃保存?zhèn)溆?。牛血液中的基因組dna存在于離心管溶液中，4℃保存?zhèn)溆没?20℃長(zhǎng)期保存。

2、擴(kuò)增含snp位點(diǎn)的核苷酸片段

根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫收錄的pparg基因(genbankno.nc_007320.6)序列設(shè)計(jì)引物，包括正向引物f：5′-tgtaactcaacctcctgtt-3′和反向引物r：5′-aagatgctgtcagtgaact-3′，以上述基因組dna為模板，擴(kuò)增出待測(cè)snp所在的核苷酸片段，如seqidno.1所示。該snp位點(diǎn)位于pcr擴(kuò)增片段的118bp處，該位點(diǎn)堿基為g或t。

其中，pcr反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25μl計(jì)為：模板dna1μl，10×buffer(15mmol/lmgcl2)2.5μl，dntp(2.5mmol/l)2μl，引物f和r(12.5pmol/μl)各0.5μl，taqdna聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，超純水18.0μl；pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

3、page分型

通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)方法檢測(cè)所有待測(cè)中國荷斯坦奶牛的基因型。不同的page帶型代表不同的基因型，三種基因型的分型結(jié)果如圖1所示。

4、基因型判定

本實(shí)施例選取不同page帶型的pcr產(chǎn)物各3份，測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判斷不同page帶型代表的基因型分別為gg、tt或gt。其他未測(cè)序個(gè)體，則可直接根據(jù)page帶型判定基因型，無需對(duì)所有個(gè)體都測(cè)序。如果擴(kuò)增序列中118bp處的堿基為g，且基因型為gg時(shí)，則待測(cè)中國荷斯坦奶牛屬于高繁殖性能的中國荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種。三種基因型的測(cè)序峰圖如圖2所示。

5、上述snp標(biāo)記在中國荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種選育中的應(yīng)用

該snp可作為中國荷斯坦奶牛高繁殖性能的分子遺傳標(biāo)記，選留基因型為gg型的個(gè)體，對(duì)中國荷斯坦奶牛直接進(jìn)行基因型選擇或標(biāo)記輔助選擇，組建高繁殖性能的中國荷斯坦奶牛核心群，從而加快中國荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種的選育。

實(shí)施例2中國荷斯坦奶牛不同基因型與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析與檢測(cè)應(yīng)用

按照實(shí)施例1的方法對(duì)293頭中國荷斯坦奶牛進(jìn)行pcr-sscp檢測(cè)，pparg基因如seqidno.1所示序列118bp位點(diǎn)的分析結(jié)果如表1所示。

表1snp位點(diǎn)在中國荷斯坦奶牛群體中的遺傳多態(tài)性分析

由表1可知，gg型個(gè)體在試驗(yàn)群體中的頻率最高，g為優(yōu)勢(shì)等位基因。he為0.4147，pic為0.3270，處于中度多態(tài)。皮爾遜卡方檢驗(yàn)所得χ²為19.71>χ0.01²(df＝2)＝9.21，則p<0.01，試驗(yàn)群體在該位點(diǎn)極顯著偏離hardy-weinberg平衡狀態(tài)，說明其突變受到漂變、選擇和引種等因素的影響。

運(yùn)用spss軟件，調(diào)用一般線性模型程序，分析snp多態(tài)位點(diǎn)的基因型與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，采用的模型：yijkl＝μ+gi+bj+yk+ml+ε，其中，y為個(gè)體某性狀表型值，μ為群體某性狀均值，gi為基因

型效應(yīng)，bj為品種效應(yīng)，yk為配種年份效應(yīng)，ml為產(chǎn)奶量效應(yīng)，ε為隨機(jī)殘差效應(yīng)。分析結(jié)果如表2和表3所示。

表2中國荷斯坦奶牛pparg基因snp位點(diǎn)與繁殖性狀的相關(guān)性(f檢驗(yàn))

由表2可知，基因型顯著影響產(chǎn)后第一次配種天數(shù)(p<0.01)、空懷天數(shù)(p<0.05)和受胎指數(shù)(p<0.05)。

等位基因加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和替代效應(yīng)

等位基因加性效應(yīng)用2個(gè)純合子離差的均值計(jì)算：

等位基因顯性效應(yīng)用雜合子與2種純合子均值的離差計(jì)算：

g等位基因替代t等位基因的平均效應(yīng)：s＝a+(q-p)d

其中，p為g等位基因頻率，q為t等位基因頻率，gg、tt和gt分別為各基因型的表型最小二乘均值。等位基因替代效應(yīng)的顯著性檢驗(yàn)是利用線性回歸模型(spss)，通過繁殖性狀對(duì)t等位基因拷貝數(shù)(0、1、2)的回歸來計(jì)算，分別將基因型tt、gt和gg定義為2、1和0。

表3中國荷斯坦奶牛pparg基因不同基因型個(gè)體繁殖性狀最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

表3中同列均數(shù)肩注不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著；*表示差異顯著(p＜0.05)，**表示差異極顯著(p＜0.01)。

由表3可知，gg型產(chǎn)后第一次配種天數(shù)顯著低于gt型(p<0.05)和tt型(p<0.01)；gg型空懷天數(shù)顯著低于gt型(p<0.05)；gg型第1胎次受胎指數(shù)顯著低于gt型(p<0.01)，第2胎次受胎指數(shù)顯著低于gt型和tt型(p<0.05)。

對(duì)于g等位基因，產(chǎn)后第一次配種天數(shù)、空懷天數(shù)和受胎指數(shù)的加性效應(yīng)分別為-6.97d、-11.2d和-0.215t?；蛱娲?yīng)分別為-8.83d、-15.70d和-0.25t，即每個(gè)g等位基因替代t等位基因會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)后第一次配種天數(shù)提前8.83天，空懷天數(shù)縮短15.7天，受胎指數(shù)降低0.25次。等位基因g為高繁殖性能優(yōu)勢(shì)基因。

實(shí)施例3鑒定高繁殖性能中國荷斯坦奶牛的試劑盒的組裝及應(yīng)用

試劑盒中各成分組成如下：100ng/μl牛血液dna；上下游引物，序列分別如seqidno.2-3所示，2.5mmol/ldntps；2.5u/μltaqdna聚合酶；10×taqbuffer(含15mmol/lmgcl2)；超純水。

f：5′-tgtaactcaacctcctgtt-3′(seqidno.2)

r：5′-aagatgctgtcagtgaact-3′(seqidno.3)

試劑盒中pcr總反應(yīng)體系為25μl，其中基因組dna1μl，10×buffer(15mmol/lmgcl2)2.5μl，dntp(2.5mmol/l)2μl，上下游引物(12.5pmol/μl)各0.5μl，taqdna聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，ddh2o18.0μl。pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

反應(yīng)所得產(chǎn)物即為目的核苷酸片段，序列如seqidno.1所示，檢測(cè)該序列118bp位點(diǎn)上的堿基，判斷樣本的基因型。三種基因型可分為gg型、tt型和gt型，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中118bp位點(diǎn)處的堿基為g，且其基因型為gg型，則待測(cè)中國荷斯坦奶牛屬于高繁殖性能的中國荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種。采用本申請(qǐng)上述引物對(duì)待測(cè)dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)后，選擇不同page帶型的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，確定不同page帶型所對(duì)應(yīng)的基因型。其他未測(cè)序個(gè)體，則可直接根據(jù)已確定基因型的page帶型進(jìn)行比對(duì)，不需要對(duì)所有個(gè)體都測(cè)序，就可以判斷不同page帶型對(duì)應(yīng)的是gg型、tt型和gt型中的哪種基因型，進(jìn)而判斷待測(cè)個(gè)體的繁殖性能，繁殖性能由高到低順序?yàn)間g型＞gt型＞tt型。

上文雖然已對(duì)本發(fā)明以及其實(shí)施方式做了詳盡的描述，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以對(duì)相應(yīng)的條件等做一些改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>甘肅民族師范學(xué)院

<120>與中國荷斯坦奶牛繁殖性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>khp171113296.1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>323

<212>dna

<213>中國荷斯坦牛pparg基因

<400>1

tgtaactcaacctcctgttctgtcttccatttctgctctcccagaccgcccaggtttgct60

gaacgtgaagcccattgaggacatacaagacaatctgctgcaagccttggagctgcamct120

caagctgaaccaccccgagtcctcccagctctttgccaagctgctccagaaaatgacaga180

cctcagacagattgtgacagaacacgtgcagctgttgcaagtaataaagaaaacagagac240

ggacatgagtctccacccactcctacaggaaatctacaaggacttgtattagcagagaag300

tccgagttcactgacagcatctt323

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgtaactcaacctcctgtt19

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aagatgctgtcagtgaact19