奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，采用傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法以及基于病原菌16S?rRNA基因采用序列分析方法和雙引物PCR-SSCP技術(shù)對中國荷斯坦奶牛乳房炎致病菌進行分離和鑒定。雙引物PCR-SSCP技術(shù)和序列分析方法鑒定結(jié)果基本相同。雙引物PCR-SSCP技術(shù)的結(jié)果多態(tài)性較好，結(jié)果與序列分析結(jié)果類似，是一種高效，簡單和經(jīng)濟的鑒定病原菌的方法，為中國南方荷斯坦奶牛乳房炎致病菌的快速鑒定提供理論依據(jù)，從而為奶牛乳房炎的診治提供了理論基礎(chǔ)。
【專利說明】奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及奶牛乳房炎防治領(lǐng)域，具體涉及用16S rRNA基因的雙引物PCR-SSCP作為高效，簡便和經(jīng)濟的方法來鑒定奶牛乳房炎的致病菌。
【背景技術(shù)】
[0002]奶牛乳房炎是全球范圍內(nèi)奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最嚴(yán)重的疾病之一。乳房炎會造成牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量的嚴(yán)重影響，該病大約消耗所有疾病經(jīng)濟的38%。在物理，化學(xué)等因素刺激下會使乳房組織產(chǎn)生炎癥，但主要是由一種或多種微生物感染乳腺所造成。據(jù)報道乳房炎主要是由于細菌的感染，也有少數(shù)情況是由于真菌的感染造成的。例如金黃色葡萄球菌經(jīng)常會引起乳牛壞疽性乳房炎。目前，奶牛乳房炎的防治方法有很多種，主要通過優(yōu)化管理方式，如正確的擠奶方式和減少奶牛外界接觸環(huán)境中的病原體，但是乳房炎在治療和預(yù)防方面依然很大程度上依賴于抗生素的使用。抗菌藥物被廣泛用于控制金黃色葡萄球菌的感染，然而在臨床治療過程中，由于盲目的大量使用抗生素導(dǎo)致耐藥菌株的不斷產(chǎn)生使這些藥物的使用受到了嚴(yán)重的爭議。如果不能及時有效地控制金黃色葡萄球菌的感染，會造成慢性細菌性乳房炎疾病。在不能明確確定乳房炎病因的情況下，雖然可以通過優(yōu)化擠奶的方式，消毒和抗生素的治療等方法以減少奶牛乳房炎的發(fā)病率，但是這些方法有一定的盲目性。因此需要確定奶牛乳房炎主要致病菌的種類，并針對具體病原菌采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施，才能更有效的降低奶牛乳房炎發(fā)病率，及時治愈病牛。
[0003]現(xiàn)階段確定奶牛乳房炎致病菌主要是通過傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)確定其種類，此過程周期長且不能及時準(zhǔn)確的確定致病菌種類以便于乳房炎疾病預(yù)防和治療，因此研發(fā)和完善一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的新型診斷方法迫在眉睫。
[0004]16S rRNA存在于所有的微生物中，并且包括保守區(qū)和可變區(qū)，所以16S rRNA基因的序列分析常用作微生物進化關(guān)系分析的靶基因。基于16S rRNA基因序列的PCR技術(shù)的應(yīng)用是一種精確的鑒定方法。國內(nèi)外有些實驗室偏向于使用此技術(shù)來鑒定少量的致病菌，但是這種方法需要大量的時間和花費，不能廣泛應(yīng)用于奶牛乳房炎致病菌的鑒定中。
[0005]目前，國內(nèi)外有些實驗室采用一對引物的PCR-SSCP技術(shù)對常見病原菌進行鑒定。因為SSCP技術(shù)是一項簡單，快速，高效的鑒定微生物的技術(shù)。但是有些病原菌的SSCP圖譜多態(tài)性較差，難以與其他致病菌區(qū)別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，用16S rRNA基因的雙引物PCR-SSCP作為高效，簡便和經(jīng)濟的方法來鑒定奶牛乳房炎的致病菌。
[0007]具體技術(shù)方案如下:
[0008]一種奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，包括如下步驟:
[0009](I)采集奶樣；
[0010](2)分離致病菌；[0011](3)提取病原菌菌落DNA ;
[0012](4)合成引物；
[0013](5) PCR擴增產(chǎn)物檢測；
[0014](6)雙引物的PCR-SSCP分析。
[0015]進一步地，步驟(1)進一步為采集40頭乳房炎性奶牛的40個奶樣。
[0016]進一步地,步驟(2)進一步包括如下步驟:
[0017](2-1)將采集的奶樣分別接種于普通培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培
養(yǎng)基;
[0018](2-2) 37°C培養(yǎng)24_48h，根據(jù)菌落形態(tài)作純化培養(yǎng)；
[0019](2-3)按常規(guī)方法涂片、革蘭氏染色、鏡檢；
[0020](2-4)初步鑒定致病菌種類。
[0021]進一步地,步驟(3)進一步包括如下步驟:
[0022](3-1)挑取適量 菌落于裝有1000ii I無菌水的離心管中，12000r/min離心5min，吸
去水使細菌沉淀盡可能干燥；
[0023](3-2)向裝有細菌沉淀的離心管中加入100 U I溶液I，混勻，室溫放置IOmin ；
[0024](3-3)加入200 U I溶液II,蓋緊離心管,顛倒數(shù)次混勻,冰上放置5min ；
[0025](3-4)加入150 U I溶液III，蓋緊離心管，顛倒數(shù)次混勻,冰上放置IOmin ；
[0026](3-5) 12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中；
[0027](3-6)向上清液中加入等體積的酚:氯仿:異戊醇，反復(fù)混勻，12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中；
[0028](3-7)向上清液中加入2倍體積的無水乙醇，混勻，冰上放置lOmin，12000r/min離心5min; (3-8)倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體；
[0029](3-9)用lml70%乙醇洗滌DNA沉淀，混勻，12000r/min離心5min，倒去上清液，
真空抽干或在空氣中干燥；
[0030](3-10)加入30 ii ITE緩沖液(其中含有20 y g/ml胰RNA酶)，使DNA完全溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031]進一步地,步驟(5)進一步包括如下步驟:
[0032](5-1)取5 ii LPCR擴增產(chǎn)物加入I U L溴酚藍上樣緩沖液混勻；
[0033](5-2)在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，恒壓80V，電泳30min ；
[0034](5-3)將膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照；
[0035](5-4)第一對引物的PCR產(chǎn)物取370bp處取條帶，進行膠回收；
[0036](5-5)測序，比對確定細菌種類。
[0037]進一步地,步驟(6)進一步包括如下步驟:
[0038](6-1) PCR 擴增產(chǎn)物 98°C變性 IOmin ；
[0039](6-2)經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠150V電泳5~7h，銀染顯色；
[0040](6-3)根據(jù)電泳圖譜，鑒定圖譜。
[0041]進一步地，步驟(3-2)中所述溶液I為50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris ? HCl(pH8.0)，IOmmoI/L EDTA(pH8.0)。
[0042]進一步地，步驟(3-3)中所述溶液II為1%SDS，0.2%Na0H，用前等體積混合。[0043]進一步地，步驟(3-4)中所述溶液III為5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5m。
[0044]進一步地，鑒定方法基于16S rRNA基因的序列分析和雙引物PCR-SSCP方法。
[0045]與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明為了快速分離和鑒定中國南方荷斯坦奶牛乳房炎的病原菌，采用傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法以及基于病原菌16S rRNA基因采用序列分析方法和雙引物PCR-SSCP技術(shù)對中國荷斯坦奶牛乳房炎致病菌進行分離和鑒定。結(jié)果:雙引物PCR-SSCP技術(shù)的結(jié)果多態(tài)性較好，結(jié)果與序列分析結(jié)果相同，是一種高效，簡單和經(jīng)濟的鑒定病原菌的方法，為中國南方荷斯坦奶牛乳房炎致病菌的快速鑒定提供理論依據(jù)，從而為奶牛乳房炎的診治提供了理論基礎(chǔ)。
[0046]具體來說:用16S rRNA可變區(qū)的兩對引物進行PCR-SSCP分析，解決了以16S rRNA可變區(qū)的一對引物進行PCR-SSCP分析時圖譜的多態(tài)性差不易區(qū)分的問題。
[0047]本發(fā)明在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，設(shè)計特異引物擴增目標(biāo)微生物的16S rRNA基因可變區(qū)的三對引物用于序列分析和PCR-SSCP分析。PCR-SSCP技術(shù)操作簡單，容易掌握，實驗步驟少，周期短且靈敏度高。不同的致病菌具有特異性目的條帶。鑒定過程簡單方便，成本低廉，速度快。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1為PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠圖A:引物RW01，DG74 ；B:雙引物P11P，P13P和ER10，ERll
[0049]圖2為細菌序列比對
[0050]圖3為致病菌的進化關(guān)系
[0051]圖4為雙引物的SSCP圖譜
【具體實施方式】
[0052]下面根據(jù)附圖對本發(fā)明進行詳細描述，其為本發(fā)明多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。
[0053](I)奶樣采集:40個奶樣采自安徽蕪湖衛(wèi)崗奶牛場40頭乳房炎性奶牛。
[0054](2)分離致病菌:將采集的奶樣分別接種于普通培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)24-48h，根據(jù)菌落形態(tài)作純化培養(yǎng)。按常規(guī)方法涂片、革蘭氏染色、鏡檢。初步鑒定致病菌種類。
[0055](3)病原菌菌落DNA的提取:挑取適量菌落于裝有1000 無菌水的離心管中，12000r/min離心5min。吸去水使細菌沉淀盡可能干燥。向裝有細菌沉淀的離心管中加入100 ill 溶液 I (50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris ? HCl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0))，混勻，室溫放置lOmin。加入200 U I溶液II (1%SDS，0.2%Na0H,用前等體積混合)，蓋緊離心管，顛倒數(shù)次混勻，冰上放置5min。加入150 y I溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸
11.5ml,水28.5ml),蓋緊離心管，顛倒數(shù)次混勻，冰上放置IOmin0 12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中。向上清液中加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25: 24: 1)，反復(fù)混勻，12000r/min離心5min，取上清液于另一離心管中。向上清液中加入2倍體積的無水乙醇,混勻，冰上放置lOmin，12000r/min離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。用lml70%乙醇洗漆DNA沉淀，混勻，12000r/min離心5min,倒去上清液，真空抽干或在空氣中干燥。加入30 u ITE緩沖液(其中含有20 u g/ml胰RNA酶)，使DNA完全溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0056](4)引物的合成:引物由上海生物公司合成，具體位置、序列、長度和退火溫度見附件中的表一。
[0057](5)PCR擴增產(chǎn)物檢測:取5 ii LPCR擴增產(chǎn)物加入I U L溴酚藍上樣緩沖液混勻，在
0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，恒壓80V，電泳30min，將膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。第一對引物的PCR產(chǎn)物取370bp處取條帶，進行膠回收。由上海生物工程有限公司測序，比對確定細菌種類，結(jié)果見附件圖2和表二。
[0058](6)雙引物的PCR-SSCP分析:PCR擴增產(chǎn)物98°C變性IOmin后，經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠150V電泳5~7h，銀染顯色。根據(jù)電泳圖譜，鑒定圖譜。結(jié)果見附件圖4所示。
[0059]本實驗確定了 7種常見的奶牛乳房炎致病菌的圖譜?？筛咝А?zhǔn)確的確定奶牛乳房炎的致病菌，從而有針對性采用藥物治療，減少抗生素的濫用頻率。奶牛的耐藥性相對減弱，乳房炎奶牛相對減少，牛奶的質(zhì)量有所提高，保證了乳制品的質(zhì)量，具有很高的市場價值和潛力。
[0060]表一:引物
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)采集奶樣； (2)分離致病菌； (3)提取病原菌菌落DNA； (4)合成引物； (5)PCR擴增產(chǎn)物檢測； (6)雙引物的PCR-SSCP分析。
2.如權(quán)利要求1所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(1)進一步為采集40頭乳房炎性奶牛的40個奶樣。
3.如權(quán)利要求1或2所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(2)進一步包括如下步驟: (2-1)將采集的奶樣分別接種于普通培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基; (2-2) 37°C培養(yǎng)24-48h，根據(jù)菌落形態(tài)作純化培養(yǎng)； (2-3)按常規(guī)方法涂片、革蘭氏染色、鏡檢； (2-4)初步鑒定致病菌種類。
4.如權(quán)利要求1-3中一項所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(3)進一步包括如下步驟: (3-1)挑取適量菌落于裝有1000 u I無菌水的離心管中，12000r/min離心5min，吸去水使細菌沉淀盡可能干燥； (3-2)向裝有細菌沉淀的離心管中加入100 ill溶液I，混勻，室溫放置IOmin ； (3-3)加入200 u I溶液II,蓋緊離心管,顛倒數(shù)次混勻,冰上放置5min ； (3-4)加入150ii I溶液III,蓋緊離心管，顛倒數(shù)次混勻,冰上放置IOmin ； (3-5) 12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中； (3-6)向上清液中加入等體積的酹:氯仿:異戍醇,反復(fù)混勻，12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中； (3-7)向上清液中加入2倍體積的無水乙醇，混勻，冰上放置lOmin，12000r/min離心5min ； (3-8)倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體； (3-9)用Iml70%乙醇洗滌DNA沉淀，混勻，12000r/min離心5min，倒去上清液，真空抽干或在空氣中干燥； (3-10)W；v30iaTE緩沖液(其中含有20 u g/ml胰RNA酶)，使DNA完全溶解，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> 5.如權(quán)利要求1-4中一項所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(5)進一步包括如下步驟: (5-1)取5 ii LPCR擴增產(chǎn)物加入I U L溴酚藍上樣緩沖液混勻； (5-2)在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，恒壓80V，電泳30min ； (5-3)將膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照； (5-4)第一對引物的PCR產(chǎn)物取370bp處取條帶，進行膠回收；(5-5)測序，比對確定細菌種類。
6.如權(quán)利要求1-5中一項所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(6)進一步包括如下步驟: (6-1) PCR擴增產(chǎn)物98°C變性IOmin ； (6-2)經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠150V電泳5~7h，銀染顯色； (6-3)根據(jù)電泳圖譜，鑒定圖譜。
7.如權(quán)利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(3-2)中所述溶液 I 為 50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris ? HCl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0)。
8.如權(quán)利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(3-3)中所述溶液II為1%SDS，0.2%NaOH，用前等體積混合。
9.如權(quán)利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，步驟(3-4)中所述溶液III為5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5m。
10.如權(quán)利要求1-9中一項所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法，其特征在于，鑒定方法基于16S rRNA基因的序列分 析和雙引物PCR-SSCP方法。
【文檔編號】C12Q1/04GK103642925SQ201310676837
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】楊蘭英, 蔡亞非, 劉再群 申請人:安徽師范大學(xué)