奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條,包括吸水紙、分析膜、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、樣品墊和底板,分析膜含有用抗白色念珠菌單克隆抗體包被的檢測線以及用羊抗兔IgG包被的質(zhì)控線,金標(biāo)抗體結(jié)合墊包被膠體金標(biāo)記的白色念珠菌抗兔多克隆抗體。本發(fā)明應(yīng)用于奶牛乳房炎病原的檢測,具有特異、準(zhǔn)確、快速、操作簡單等特點,適于基層畜牧養(yǎng)殖、畜牧技術(shù)推廣和畜牧動物檢疫使用。因此,本發(fā)明對快速診斷奶牛乳房炎具有重要價值。
【專利說明】奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于奶牛乳房炎檢測【技術(shù)領(lǐng)域】,尤其涉及一種奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]白色念珠菌(Candida albicans)又稱白假絲酵母菌,是人和動物真菌性疾病中最常見、最主要的共患條件致病真菌之一。此菌侵入乳腺并在乳腺內(nèi)繁殖,使得奶牛乳腺炎頻發(fā),尤其會造成頑固性乳房炎的頻發(fā),不但制約奶牛乳業(yè)的發(fā)展,而且嚴(yán)重影響原料奶的品質(zhì),給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失;同時,這也威脅著人類健康。雖然該菌診斷有傳統(tǒng)的病原微生物學(xué)分離鑒定、PCR以及TCTA顯色檢測等方法,但這些方法對技術(shù)要求較高,而且費時、不經(jīng)濟(jì)。采取易于采樣、便于檢測疾病的手段對維護(hù)奶牛產(chǎn)后健康和奶牛場經(jīng)濟(jì)效益至關(guān)重要,而建立準(zhǔn)確、及時的診斷技術(shù)是控制白色念珠菌危害的基本前提。
[0003]膠體金免疫層析技術(shù)因其具有快速、便捷,不需要特殊設(shè)備,結(jié)果判斷直觀等優(yōu)勢,越來越受到人們的重視。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異、準(zhǔn)確、快速的奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條。
[0005]為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條,包括吸水紙、分析膜、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、樣品墊和底板,分析膜含有用抗白色念珠菌單克隆抗體包被的檢測線(T)以及用羊抗兔IgG包被的質(zhì)控線(C),金標(biāo)抗體結(jié)合墊包被膠體金標(biāo)記的白色念珠菌抗兔多克隆抗體。
[0006]抗白色念珠菌單克隆抗體是利用雜交融合技術(shù)篩選出白色念珠菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株而得;白色念珠菌抗兔多克隆抗體是應(yīng)用白色念珠菌顆粒性抗原多次免疫新西蘭大白兔而得。
[0007]分析膜為硝酸纖維膜,金標(biāo)抗體結(jié)合墊為玻璃纖維膜。
[0008]上述奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條的制備方法,包括以下步驟:
[0009](I)制備白色念珠菌抗體
[0010]抗白色念珠菌單克隆抗體是采用乳化的白色念珠菌作為抗原,分階段多次免疫Balb/c小鼠,再進(jìn)行細(xì)胞融合,篩選出陽性雜交細(xì)胞株后,制備腹水而得;白色念珠菌抗兔多克隆抗體是采用白色念珠菌作為抗原多次免疫新西蘭大白兔制備而得的高效價抗白色念珠菌多克隆抗體;
[0011](2)制備分析膜
[0012]將步驟(I)制備的白色念珠菌單克隆抗體在硝酸纖維膜包被形成檢測線,羊抗兔IgG在硝酸纖維膜包被形成質(zhì)控線,備用;
[0013](3)制備金標(biāo)抗體結(jié)合墊[0014]采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液,并采用標(biāo)記體系標(biāo)記白色念珠菌抗兔多克隆抗體,將金標(biāo)抗體在支持膜上固相化;
[0015](4)組裝試紙條
[0016]將步驟(2)的分析膜、步驟(3)的金標(biāo)抗體結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、底板組裝成膠體金快速檢測試紙條。
[0017]步驟(3)中的標(biāo)記體系為:膠體金顆粒在20nm以下極其穩(wěn)定,抗體蛋白與膠體金結(jié)合最適宜的pH值為8?9,最適結(jié)合膠體金的抗體蛋白量為20?40 μ g/mL,最佳穩(wěn)定劑為10%PEG20000,最佳膠體金復(fù)合物緩沖液的組分為pH值為8?9的Tris - HCl緩沖液、1%BSA、0.5%PEG20000、10% 蔗糖和 2%Tween - 20。
[0018]針對目前缺乏簡便、快捷、有效的奶牛乳房炎白色念珠菌檢測方法,發(fā)明人研制了奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條:首先通過免疫動物、細(xì)胞融合及ELISA檢測等技術(shù)制備抗白色念珠菌的單克隆抗體;采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金顆粒,標(biāo)記白色念珠菌抗兔多克隆抗體作為膠體金墊;將點涂有抗白色念珠菌單克隆抗體和羊抗兔IgG的硝酸纖維素膜、膠體金墊、樣品墊及吸收墊組裝制成檢測乳房炎真菌病原一白色念珠菌的快速診斷試紙條。本發(fā)明應(yīng)用于奶牛乳房炎病原的檢測,具有特導(dǎo)、準(zhǔn)確、快速、操作簡單等特點,適于基層畜牧養(yǎng)殖、畜牧技術(shù)推廣和畜牧動物檢疫使用,對奶牛業(yè)發(fā)展將有深遠(yuǎn)的影響。因此,本發(fā)明對快速診斷和有效治療乳房炎有著十分重要的意義。
[0019]本發(fā)明奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條具有以下優(yōu)點:
[0020](I)檢測快速,10-20min出結(jié)果。
[0021](2)特異性好,該試紙條與大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌等病原菌均無交叉反應(yīng),與白色念珠菌的特異顯色高。
[0022](3)靈敏度高,檢測靈敏度為IO2Cfu.mL'
[0023](4)穩(wěn)定性好,4°C條件下保存30天后的試紙條穩(wěn)定性依然較好。
[0024](5)與PCR檢測法對比實驗中,試紙條的陽性符合率為86.67% (13/15),有2份未檢出,陰性符合率為90% (9/10)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條的組裝結(jié)構(gòu)圖,圖中:1樣品墊,2PVC底板,3測試線,4硝酸纖維素膜(NC膜),5吸水濾紙,6控制線,7膠體金墊。
【具體實施方式】
[0026]實施例1白色念珠菌多克隆抗體的制備
[0027]I材料與方法
[0028]1.1菌株:標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌,臨床鑒定白色念珠菌,金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株。
[0029]1.2主要試劑和儀器:馬丁肉湯、沙氏營養(yǎng)瓊脂,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG,弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑,透析袋、電泳儀,電泳槽,紫外凝膠成像系統(tǒng),核酸蛋白分析儀,超高速冷凍離心機(jī)。
[0030]1.3實驗動物:新西蘭大白兔(廣西大學(xué)動物實驗基地)。[0031]2實驗方法
[0032]2. 1白色念珠菌的抗原制備
[0033]將保存的分離鑒定好白色念珠菌在沙氏固體培養(yǎng)基上劃線,37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18?48h,挑取單個菌落,在馬丁肉湯液培養(yǎng)基中再培養(yǎng)12?18h后,再加入0. 4%的甲醛 滅活48小時后,涂板進(jìn)行細(xì)菌活性檢測,細(xì)菌完全死亡后,收菌置至4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 2 實驗動物免疫
[0034]將制備好的白色念珠菌抗原免疫動物,選取2?3月齡,體重為2?3kg的新西蘭 大白兔2只作為免疫動物,一免:lmL108cfu ? mL—1滅活白色念珠菌與弗氏完全佐劑等比例 混合后充分超聲波乳化,在四肢內(nèi)側(cè)皮下分點注射。3周后,進(jìn)行二免,0. 5X 108cfu 滅 活白色念珠菌與弗氏不完全佐劑等比例混合,背部皮下多點注射,同時采血分離血清進(jìn)行 ELISA檢測。每隔三周,分別進(jìn)行三免和四免。加免在四免后一周,大量采血,分離血清,并 ELISA檢測抗體的特異性。
[0035]2. 3血清抗體純化
[0036]血清抗體通過正辛硫-硫酸銨沉淀法純化,通過核酸分析儀測定,SDS-PAGE垂 直電泳分析。
[0037]3.實驗結(jié)果
[0038]獲得了較高抗白色念珠菌的多克隆抗體,間接ELISA法檢測效價可達(dá)1:140萬以 上,經(jīng)提純后其含量為10?30mg/mL,具有良好的敏感性;葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌各6 株以及臨床未分離出白色念珠菌其它菌株各6株,共24株菌均檢測無交叉反應(yīng)現(xiàn)象。
[0039]實施例2白色念珠菌單克隆抗體的制備
[0040]1材料與方法
[0041]1. 1實驗材料:Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞,白色念珠菌,金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株,大腸 桿菌標(biāo)準(zhǔn)株,鏈球菌;細(xì)胞培養(yǎng)皿,50mL尖底離心管,96孔酶標(biāo)板,透析袋等。
[0042]1. 2實驗動物:Balb/c小鼠。
[0043]2.實驗方法
[0044]2. 1試驗動物免疫
[0045]選6?7周齡的Balb/c雌性小鼠6只進(jìn)行免疫。初次免疫,0. 25mL2X107cfu ?m^1 滅活白色念珠菌與弗氏完全佐劑等比例混合,超聲乳化,在腹部皮下多點注射。3周后,第2 次免疫,0. 25mL2X107cfu -mL^滅活白色念珠菌與弗氏不完全佐劑等比例混合,背部皮下多 點注射。每隔三周分別進(jìn)行第3次和第4次免疫。最后一次免疫后一周收集血液,以ELISA 檢測抗體的特異性及SDS - PAEG電泳法。
[0046]2. 2細(xì)胞雜交融合
[0047](1)在融合操作前24小時,將兩個70cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿里的骨髓瘤細(xì)胞用胰蛋白酶 乙二胺四乙酸混合液脫離傳代一次。
[0048](2)次日,抽掉骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)皿里的培養(yǎng)液,分別加入5mL GENMED清理液 (Reagent A),清洗生長中的細(xì)胞表面,吸掉5mL清洗液,分別加入3mL胰蛋白酶乙二胺四乙 酸混合液,鋪滿整個培養(yǎng)平面置37°C培養(yǎng)箱3分鐘。
[0049](3)用手震動培養(yǎng)皿,使細(xì)胞脫落,然后分別加入10mL GENMED清理液(Reagent A),分別取兩種細(xì)胞懸液(骨髓瘤細(xì)胞2?5X107,再已備好小鼠脾臟細(xì)胞1X108)的兩個父代細(xì)胞合并到一個50mL錐形離心管,離心10分鐘,棄上清。加入IOmL GENMED清理液(Reagent A),混勻后,離心1000r.min_110分鐘,去上清,用手指輕輕彈擊離心管外壁直至細(xì)胞顆粒群松散。
[0050](4)加入1.5mL GENMED融合液(Reagent B),充分混勻,置于室溫下I分鐘。加入IOmL GENMED清理液(Reagent A),輕輕混勻后,離心1000r ^mirT1IO分鐘,去上清。加入完全細(xì)胞培養(yǎng)液8mL,充分混勻。
[0051](5)移入備有飼養(yǎng)層細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中,2~4 ±夾,每孔加200 μ L細(xì)胞融合的懸液,放進(jìn)37 °C培養(yǎng)箱。
[0052](6) 72小時后開始細(xì)胞篩選,直至獲得融合雜合子細(xì)胞克隆(10~14天)。
[0053]2.3陽性雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng) [0054]經(jīng)吹打陽性的雜交瘤細(xì)胞懸浮移到含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的24孔板里擴(kuò)大培養(yǎng),與原孔一起加新鮮的HT培養(yǎng)基(24孔加0.5mL,原孔加0.1mL),并在5%C02培養(yǎng)24~28小時,用ELISA檢測,對分泌抗體穩(wěn)定性較強(qiáng)的細(xì)胞株做重點培養(yǎng)及保存,做好編號并命名并及時凍存。
[0055]2.4有限稀釋法單克隆化
[0056]在96孔板中進(jìn)行有限稀釋法單克隆化細(xì)胞培養(yǎng),將前一天預(yù)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞,再進(jìn)行細(xì)胞克隆化。待做克隆化的雜交瘤細(xì)胞用含20%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋每毫升中
5、10、50個細(xì)胞,分別加入己準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中,每孔100 μ L。到第二次或第三次亞克隆時,只作一個稀釋度,調(diào)整至每毫升5~10個細(xì)胞,將96孔板放在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定時觀察,待細(xì)胞長到孔面積約一半時,吸半培養(yǎng)液檢測,陽性孔中的細(xì)胞繼續(xù)單克隆化,并擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存?zhèn)溆谩?br>
[0057]2.5腹水的制備
[0058](I)腹水誘導(dǎo):注射雜交瘤細(xì)胞之前一兩周,將用于誘導(dǎo)腹水的每只小鼠腹腔注射IFA0.2mL/只,進(jìn)行分籠并加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。
[0059](2)擴(kuò)大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞株:檢測到強(qiáng)陽性的上清抗體雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至對數(shù)生長期,并用作于誘導(dǎo)腹水。
[0060](3)注射雜交瘤細(xì)胞:收集對數(shù)生長期內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞于1000~1500r ^mirT1離心5~lOmin,棄上清,用約0.5~ImL RPMI1640無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,每只小鼠1.p6~32 X IO5個雜交瘤細(xì)胞。
[0061](4)收集腹水:約7~10天后觀察Balb/c小鼠腹部,有明顯腹部腫脹者,用12號注射器針頭穿刺腹腔下側(cè)收取腹水并測定其效價,存于-80°C備用。
[0062]2.6腹水效價和特異性檢測
[0063]腹水樣品用ELISA及SDS - PAEG進(jìn)行檢測分析。
[0064]2.7白色念珠菌單克隆抗體腹水交叉反應(yīng)實驗同白色念珠菌多克隆抗體的檢測。
[0065]2.8白色念珠菌單克隆抗體(腹水)正辛硫-硫酸銨沉淀純化
[0066]3.實驗結(jié)果
[0067]本實驗通過免疫Balb/c小鼠、雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)、陽性克隆細(xì)胞篩選、有限稀釋法及SDS - PAGE、ELISA檢測等技術(shù),成功的制備了抗白色念珠菌的單克隆抗體。共獲得了 4株能穩(wěn)定分泌抗白色念珠菌單克隆抗體的細(xì)胞株。用間接ELISA法檢測,效價可達(dá)到1:102400以上。交叉反應(yīng)實驗,以葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌以及臨床上未分離出白色念珠菌其它菌株樣品代替抗原,檢測交叉反應(yīng)現(xiàn)象。純化后單克隆抗體蛋白濃度的測定,純化兩次單克隆抗體蛋白過蛋白核酸分析儀測定,其含量分別達(dá)31.32mg/mL、27.65mg/mL。
[0068]實施例3膠金體的制備
[0069]1.材料與方法
[0070]1.1主要試劑:HAuC14,兔抗白色念珠菌多克隆抗體,檸檬酸三鈉,牛血清白蛋白(BSA),脫脂奶粉,PEG20000, K2CO30
[0071]1.2主要儀器:高速冷凍離心機(jī),電子臺秤,氣浴恒溫振蕩器,DK - SD型電熱恒溫水槽,紫外一可見分光分光度計。
[0072]1.3檸檬酸三鈉還原法的膠體金制備
[0073]膠體金的制備采取檸檬酸三鈉還原法,用500mL的燒杯,加入2.4mLl%的HAuCl4于240mL蒸餾水中(終濃度為0.01%),分別分裝于6個80mL燒杯中,各40mL。電磁爐加熱至沸騰,加入1%的檸檬酸三鈉,各為0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、lmL、l.2mL (分別標(biāo)記為:
1、2、3、4、5、6號),繼續(xù)加熱并攪拌,用肉眼觀察膠體金溶液顏色變化,等溶液由黃變黑、紫、酒紅色后再加熱5~lOmin。冷卻至室溫,各樣品用超純水補(bǔ)足至40mL,繼續(xù)加熱5min、冷卻、補(bǔ)足超純水,重復(fù)三次。
[0074]1.4膠體金紫外光掃描鑒定
[0075]用紫外-可見光分光光度儀對6種不同膠體金在400~700nm波長下進(jìn)行掃描,獲得膠體金吸收光譜,并測定出`最大吸收峰波的吸光值。據(jù)光譜的膠體金顆粒直徑及分布特征,制備不同直徑膠體金顆粒,對膠體金進(jìn)行掃描,獲得膠體金最大吸收峰波長與粒徑在10~90nm粒徑范圍內(nèi)得出Y=0.4271X+514.56 (r=0.874,F(xiàn)〈0.01)直線回歸關(guān)方程(X為顆粒粒徑,Y為最大吸收峰波長),按Y=0.4271X+514.56方程可算出各膠體金顆粒直徑大小。再把6種不同的膠體金溶液靜置于4°C一段時間,在不同的時間段檢查膠體金溶液的顏色變化和顆粒沉淀情況,選出一種較穩(wěn)定的膠體金標(biāo)記抗體用。
[0076]1.5最適宜抗體蛋白結(jié)合量
[0077]通過Mey氏穩(wěn)定化試驗方:取20mL膠體金溶液用0.1moL/L K2CO3調(diào)節(jié)pH值,用14個1.5mL EP管分別取ImL膠體金溶液,再用不同濃度的兔抗白色念珠菌多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記,每種濃度的做7個樣,室溫攪拌30min后加入0.lmL10%NaCI溶液,室溫靜置一兩小時,觀察膠體金一抗體溶液的顏色,再進(jìn)紫外分光度掃描測定520nm/580nm的OD值,選出制備金標(biāo)抗最佳的抗體量。
[0078]1.6抗體蛋白與膠體金結(jié)合最適宜pH值的選擇
[0079]通過Mey氏穩(wěn)定化試驗:取8個1.5mL EP管,各加入ImL膠體金,分別用0.1moL/LK2CO3調(diào)pH為5、6、7、8、9、10、11、12后,每個pH做7樣,每管各加入濃度為30 μ g/ml的兔抗白色念珠菌多克隆抗體10(^1^,攪拌301^11后各管分別加入0.lmL10%NaCl液體,室溫下靜置I~2h,觀察其顏色變化,再用紫外分光光度計掃描測定各管520nm/580nm的OD值,選出最佳制備金標(biāo)抗的pH值。
[0080]1.7抗體一膠體金復(fù)合物穩(wěn)定劑的選擇
[0081]為了防止金標(biāo)抗體在長時間內(nèi)發(fā)生聚沉,將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體復(fù)合物分別選用BSA、PEG20000作穩(wěn)定劑,并比較它們之間使用的效果,選擇金標(biāo)抗體發(fā)生沉淀最少的做為穩(wěn)定劑。其方法:用3個1.5mL EP管,分別加入ImL已配制好金標(biāo)抗體溶液,分別加入穩(wěn)定劑 10%BSA100 μ L ;10%PEG20000100 μ L ;10%BSA50 μ L+10%PEG2000050 μ L 放置一段時間,顏色仍保持紅色,不聚沉或聚沉較少的為最佳穩(wěn)定劑。
[0082]1.8膠體金復(fù)合物緩沖液的選擇
[0083]選用不同的緩沖液稀釋已標(biāo)記的抗體膠體金復(fù)合物,選出有利于保持膠體金復(fù)合物狀態(tài)穩(wěn)定的緩沖液,本實驗選配制三種膠體金抗體緩沖液。比較這三種緩沖液的穩(wěn)定性及膠體金顆粒聚沉情況,通過正交設(shè)計進(jìn)行實驗,選出最佳的膠體金-抗體復(fù)合物緩沖液。
[0084]2.實驗結(jié)果
[0085]篩選出直徑為20nm的膠體金顆粒較穩(wěn)定,與抗體蛋白與膠體金結(jié)合最適宜pH值應(yīng)是8?9,最適結(jié)合抗體蛋量為20μ g/mL。本實驗選取了最佳穩(wěn)定劑10%PEG20000。根據(jù)本實驗中緩沖液對金標(biāo)抗的影響最大,影響最小的因素是Tween - 20濃度,選出最佳優(yōu)化膠體金復(fù)合物緩沖液組分PH值為8?9的Tris - HCl緩沖液、1%BSA、0.5%PEG20000、10%鹿糖、2%Tween - 20。
[0086]實施例4試紙條組成及臨床應(yīng)用
[0087]1.材料與方法
[0088]1.1菌株:白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、鏈球菌。
[0089]1.2主要試劑及耗材:硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維素膜、PVC板等耗材。
[0090]2.實驗方法
[0091]2.1斑點金免疫滲濾試驗
[0092]用斑點金免疫滲濾試驗確定單克隆抗體及羊抗兔IgG包被量,用抗白色念珠菌單克隆抗體做檢測線(T)以及羊抗兔IgG做為質(zhì)控線(C),用PBS (0.01mol/L pH7.4)緩沖液將抗體按1: O?1:128倍比數(shù)稀釋,各取2 μ L點樣于0.45微孔濾膜上,滲入濾膜后形成斑點。待抗體完全充分干燥。將濾膜浸泡于5%脫脂奶粉中,室溫封閉I?2h后。用PBST洗膜2?3次,每次3?5min。然后將洗好的濾膜用吸水濾紙吸干水,再放置一段時間使膜完全干燥后,滴加白色念珠菌懸液(I X 105cfu.mL-1)與金標(biāo)抗體結(jié)合物,室溫靜置數(shù)分鐘。待出現(xiàn)紅色斑點為止。然后在室溫下用PBST洗滌液振蕩洗滌4次,每次3?5min。
[0093]2.2分析膜預(yù)處理
[0094]NC膜(分析膜)首先用0.4%的甘油浸泡半小時后,置于37°C烘干箱中脫水干燥2小時以固定蛋白。
[0095]2.3分析膜封閉液的優(yōu)化
[0096]以0.01 mo I/L PBS緩沖體系配制2種不同的封閉液以不同的濃度(1%、2%、3%、4%、5%脫脂奶粉,1%、2%、3%、4%、5%BSA)分別對分析膜封閉I h,再滴加膠體金溶液,根據(jù)NC膜上背景顯色情況選擇封閉液。
[0097]2.4分析膜干燥方式選擇
[0098]用抗白色念珠菌單克隆抗體和羊抗兔IgG分別作T線和C線包被在NC膜上作為分析膜,經(jīng)過封閉和洗滌處理后的NC膜,在其他條件不變情況下,將它分別置37°C、室溫和4°C干燥,觀察顯色變化。
[0099]2.3膠體金-抗體復(fù)合物結(jié)合墊的制備[0100]將玻璃纖維膜剪成規(guī)格大小一樣的小塊(0.7X10.0cm)作為結(jié)合墊,然后浸泡于膠體金一抗體溶液中30min。室溫自然干燥,觀察結(jié)合墊上金標(biāo)抗體狀態(tài)。
[0101]2.4樣品墊制備
[0102]將玻璃纖維素膜(樣品墊)剪切成2 X IOcm規(guī)格大小的條帶;玻璃纖維素膜浸入預(yù)處理液中(0.01mol/L ρΗ8.2 硼酸,0.5%BSA,0.l%Tween - 20)于 4°C或 37°C孵育 I ~2h 后,將玻璃纖維素膜取出置于烘箱中37°C充分烘干,保存?zhèn)溆谩?br>
[0103]2.5分析膜的抗體包被
[0104]將NC膜做剪成規(guī)格大小一致的(2.5X10.0cm)條帶;膜從下向上Icm處,用移液槍點上抗白色念珠菌的單克隆抗體1:2作為檢測線(T);離檢測帶0.7cm處點上羊抗鼠1:16作為質(zhì)控線;然后將NC膜于烘箱中37°C充分烘干,5%脫脂奶粉中37°C封閉I~2h或4°C過夜,取出干燥保存?zhèn)溆谩?br>
[0105]2.6吸水墊制備
[0106]用濾紙當(dāng)作吸水墊,將它剪成規(guī)格大小一致(3.0XlOcm)的條帶,置于干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?br>
[0107]2.7試紙條組裝 [0108]將已處理好的各種固相材料,依次粘附于PVC底板上,形成一個完整的試紙條,具體流程如下:
[0109](I)將有粘性底板剪成0.75X 14cm規(guī)格大小一致的條帶。
[0110](2)將分析膜黏于底板上4~IOcm處位置,檢測線在前,質(zhì)控線在后。
[0111](3)將金標(biāo)結(jié)合墊貼于粘性底板上2cm處位置,上端壓于分析膜的上端,重疊
0.5cm。
[0112](4)將樣品墊膜粘于底板上,下端壓于金標(biāo)結(jié)合墊的上端,重疊1cm。
[0113](5)吸水墊膜黏于底板上,上端壓于分析膜的下端,重疊Icm.。
[0114](6)裝配成形的條帶保存于干燥的環(huán)境中檢測備用。
[0115]2.8試紙條檢測陽性結(jié)果判定
[0116]以2X IO5Cfu.mL—1標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌懸液作為陽性對照,0.01mol/L PBS緩沖液為陰性對照。臨床鑒定的白色念珠菌樣品懸液點加在試紙條的樣品墊中,待樣品層析完畢后觀察檢測結(jié)果。在檢測應(yīng)區(qū)中,T線及C線都顯紅色條帶,則表示檢測到目的菌株,則判為陽性;若只有T線處顯紅色條帶,則未檢測到目的菌株,則判為陰性;若T線不顯紅色條帶,試紙條失效。
[0117]2.9試紙條靈敏度檢測
[0118]將培養(yǎng)好的白色念珠菌培養(yǎng)物,用0.4%甲醛滅活后,稀釋成2X107、2X106、2X 105,2X10\2X IO3,2X IO2,2X IO1Cfu ?ι?1-1不同濃度的菌液懸液。各取300 μ L點入上述試紙條,每個濃度重復(fù)5次,待樣品層析完畢后觀察檢測結(jié)果。
[0119]2.10試紙條特異的性檢測
[0120]以葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等其它菌株,調(diào)整各菌懸液濃度至2Χ IO5Cfu.ml/1后,用移液槍吸取300 μ L點入試紙條的樣品墊上,每個標(biāo)本重復(fù)3次,待樣品層析完畢后觀察。
[0121]3.實驗結(jié)果[0122]以上制備的白色念珠菌膠體金免疫層析快速檢測試紙條與大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌等病原菌均無交叉反應(yīng),與白色念珠菌的特異顯色高,檢測靈敏度為IO2Cfu ,顯色時間小于10?20min。4°C條件下保存30天后的試紙條穩(wěn)定性依然較好。與PCR檢測法對比實驗中,試紙條的陽性符合率為86.67% (13/15),有2份未檢出,陰性符合率為90%(9/10)。
【權(quán)利要求】
1.一種奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條,包括吸水紙、分析膜、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、樣品墊和底板,其特征在于:所述分析膜含有用抗白色念珠菌單克隆抗體包被的檢測線以及用羊抗兔IgG包被的質(zhì)控線,所述金標(biāo)抗體結(jié)合墊包被膠體金標(biāo)記的白色念珠菌抗兔多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條,其特征在于:所述抗白色念珠菌單克隆抗體是利用雜交融合技術(shù)篩選出白色念珠菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株而得;所述白色念珠菌抗兔多克隆抗體是應(yīng)用白色念珠菌顆粒性抗原多次免疫新西蘭大白兔而得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條,其特征在于:所述分析膜為硝酸纖維膜,金標(biāo)抗體結(jié)合墊為玻璃纖維膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條的制備方法,其特征在于包括以下步驟: (O制備白色念珠菌抗體 抗白色念珠菌單克隆抗體是采用乳化的白色念珠菌作為抗原,分階段多次免疫Balb/c小鼠,再進(jìn)行細(xì)胞融合,篩選出陽性雜交細(xì)胞株后,制備腹水而得;白色念珠菌抗兔多克隆抗體是采用白色念珠菌作為抗原多次免疫新西蘭大白兔制備而得; (2)制備分析膜 將步驟(I)制備的白色念珠菌單克隆抗體在硝酸纖維膜包被形成檢測線,羊抗兔IgG在硝酸纖維膜包被形成質(zhì)控線,備用; (3)制備金標(biāo)抗體結(jié)合墊 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液,并采用標(biāo)記體系標(biāo)記白色念珠菌抗兔多克隆抗體,將金標(biāo)抗體在支持膜上固相化; (4)組裝試紙條 將步驟(2)的分析膜、步驟(3)的金標(biāo)抗體結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、底板組裝成膠體金快速檢測試紙條。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的奶牛乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條的制備方法,其特征在于步驟(3)中所述的標(biāo)記體系為:膠體金顆粒在20nm以下,抗體蛋白與膠體金結(jié)合的pH值為8?9,結(jié)合膠體金的抗體蛋白量為20?40 μ g/mL,穩(wěn)定劑為10%PEG20000,膠體金復(fù)合物緩沖液的組分為PH值為8?9的Tris - HCl緩沖液、1%BSA、0.5%PEG20000、10%蔗糖和2%Tween - 20。
【文檔編號】G01N33/577GK103616514SQ201310674116
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】劉平, 何寶祥, 黃云飛 申請人:廣西大學(xué)