一種輔助檢測豬肌內脂肪含量性狀的方法及其專用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助檢測豬肌內脂肪含量性狀的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明提供的方法，是檢測待測豬的GenBank?AGGession?Number?CU856557.2的第97782位脫氧核糖核苷酸是A還是G，確定待測豬的基因型是AA還是GG，GG基因型的豬的肌內脂肪含量性狀高于AA基因型的豬；所述AA基因型為GenBank?AGGession?Number?CU856557.2的自5′末端第97782位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述GG基因型為GenBank?AGGession?Number?CU856557.2的自5′末端第97782位脫氧核糖核苷酸為G的純合體。應用本發(fā)明的方法可降低育種花費，有效提高實際生產中的豬肌內脂肪含量，提高經濟效益。本發(fā)明的方法操作簡單、準確度高、可實現自動化檢測，將在豬育種中發(fā)揮巨大作用。
【專利說明】一種輔助檢測豬肌內脂肪含量性狀的方法及其專用試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種輔助檢測豬肌內脂肪含量性狀的方法及其專用試劑盒。
【背景技術】
[0002]我國地方豬種聞名于世的一大優(yōu)良特性就是肉品質優(yōu)良，這些地方品種、含地方品種血液的培育品種甚至是中外雜交商品豬肉都因其優(yōu)良的肉品質，廣受消費者歡迎，例如北京黑豬肉、萊蕪黑豬肉、黑山豬肉、蘇太豬肉等深受消費者好評。并且，這些高品質豬肉的售價為普通豬肉的1.5-3倍，充分體現了當前階段我國地方品種豬的商業(yè)價值。眾所周知，我國地方豬種豬肉廣受歡迎的一個重要因素是肌內脂肪含量(IMF)高。豬肉中的脂肪含量特別是肌內脂肪含量直接影響口感，研究表明肌內脂肪與豬肉的風味、嫩度和多汁性直接相關(張建，陳偉，張?zhí)礻枺聭c.豬肉質性狀遺傳改良研究進展.山東農業(yè)大學學報(自然科學版).2012，43 (4):641-644.),是豬肉品質性狀中最具有經濟價值的性狀，因此育種價值很高。但這種肉品質性狀只能在動物屠宰后才能測定，常規(guī)選育只能采用同胞或半同胞測定，一方面加大育種成本，另一方面選育準確度降低，遺傳進展緩慢。分子生物技術的飛速發(fā)展和豬遺傳連鎖圖譜的構建，為肉品質性狀開展育種更準確、進展更快速的分子育種提供了研究基礎。
[0003]有研究對豬肉肌內脂肪率QTL進行定位分析，將這一肉品質性狀QTL定位于12號染色體上，定位區(qū)間為 42-43Mb(Ma J, Ren J, Guo Y, Duan Y, Ding N, Zhou L, Li L, YanX，Yang K，Huang Lj Song Y，Xie Jj Milan D，Huang L.Genome-wide identificationof quantitative trait loci for carcass composition and meat quality ina large-scale White Duroc x Chinese Erhualian resource population.AnimGenet.2009，40(5):637-647.)。也有全基因組關聯(lián)研究(GWAS)，將肌內脂肪含量性狀全基因組顯著關聯(lián)區(qū)間定位于12號染色體上43-55Mb區(qū)間(Luo W，Cheng D, Chen S，Wang L，LiY，Ma X，Song X，Liu X，Li Wj Liang Jj Yan H，Zhao K, Wang Cj Wang Lj Zhang L.Genome-wideassociation analysis of meat quality traits in a porcine Large WhiteXMinzhuintercross population.J Int Biol Sc1.2012 ;8 (4):580-595.)。豬 MYHC(myosin heavychain)基因作為MYH基因家族成員之一，位于此QTL和GWAS顯著區(qū)間內。
[0004]有研究表明，MYH基因家族基因多態(tài)性及表達量與肌內脂肪含量顯著相關(Davoli R，Fontanesi Lj Cagnazzo Mj et al.1dentification of SNPsj mapping andanalysis of allele frequencies in two candidate genes for meat productiontraits:theporcine myosin heavy chain2B(MYH4) and the skeletal muscle myosinregulatory light chain2(HUMMLC2B).Anim Genet.2003 ；34:221-225 ；Xu YJ，Jin ML, WangLJjet al.Differential proteome analysis of porcine skeletal muscles betweenMeishan and Large White.J Anim Sc1.2009 ;87:2519-2527 ;Hu HMj Wang JY，Zhu RSj etal.Effect of myosin heavy chain composition of muscles on meat quality in Laiwupigs and Duroc.Sci China Ser C-Life Sc1.2008 ;51:127-132.)。因此，MYHC 基因可作為豬肌內脂肪含量性狀候選基因，具有很高研究價值。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供輔助檢測豬肌內脂肪含量性狀的方法。
[0006]本發(fā)明提供的輔助檢測檢測豬肌內脂肪含量性狀的方法，是檢測待測豬的GenBank AGGession Number CU856557.2 (包含 MYHC 基因全長序列)的第 97782 位脫氧核糖核苷酸是A還是G，確定待測豬的基因型是AA還是GG，GG基因型的豬的肌內脂肪含量高于AA基因型的豬的肌內脂肪含量；所述AA基因型為GenBank AGGession Number⑶856557.2的自5'末端第97782位脫氧核糖核苷酸為A的純合體；所述GG基因型為GenBank AGGession Number CU856557.2的自5'末端第97782位脫氧核糖核苷酸為G的純合體。
[0007]所述確定待測豬的GenBank AGGession Number OJ856557.2 的自 5'末端第97782位脫氧核糖核苷酸是A還是G的方法可采用任何現有方法，如測序分析、PCR-SSCP,PCR-RFLP 法等。 [0008]所述確定待測豬的GenBankAGGession Number CU856557.2 的自 5'末端第97782位脫氧核糖核苷酸是A還是G的方法具體可為測序分析。所述測序分析包括PCR擴增和對PCR擴增產物進行測序的步驟；所述PCR擴增所用的引物對滿足如下條件:以豬的基因組DNA為模板進行PCR擴增的產物含有GenBank AGGession Number CU856557.2的自5'末端第97782位脫氧核糖核苷酸。
[0009]所述PCR擴增所用的引物對具體可為由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對。當采用所述引物對進行PCR擴增時，根據待測豬的基因組DNA的不同，擴增得到的DNA片段為序列3所示的核苷酸序列或序列4所示的核苷酸序列。
[0010]本發(fā)明的另一個目的是提供一種輔助鑒定豬的肌內脂肪含量性狀的試劑。
[0011]本發(fā)明提供的試劑，是檢測待測豬的MYHC基因的GenBank AGGession Number⑶856557.2的第97782位脫氧核糖核苷酸是A還是G還是A和G的物質。
[0012]上述試劑中，所述物質為由序列表中序列I所示的單鏈DNA分子和序列表中序列
2所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
[0013]本發(fā)明第三個目的是提供輔助鑒定豬的肌內脂肪含量性狀的試劑盒。
[0014]本發(fā)明提供的試劑盒，含有上述的試劑。
[0015]上述試劑或上述試劑盒在輔助檢測待測豬肌內脂肪含量中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0016]或上述的試劑或上述的試劑盒在制備輔助檢測待測豬肌內脂肪含量產品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0017]上述方法或上述的試劑或上述的試劑盒在豬育種中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0018]所述待測豬具體可為大民雜交豬(大白豬和民豬雜交而成)。
[0019]豬GenBank AGGession Number CU856557.2 自 5'末端第 97782 位脫氧核糖核苷酸存在一個脫氧核糖核苷酸的差異(A/G)，該單核苷酸多態(tài)被命名為g.97782A>G。GG純合基因型群體比AA純合基因型群體肌內脂肪含量高約1.38%，所以該位點可作為豬肌內脂肪含量性狀分子育種標記。
[0020]本發(fā)明的第四個目的是提供一種培育高肌內脂肪含量豬的方法。
[0021]本發(fā)明提供的方法，包括選擇GG基因型或AG基因型的豬進行育種；所述GG基因型為 MYHC 基因的 GenBank AGGession Number CU856557.2 的自 5’末端第 97782 位脫氧核糖核苷酸為G的純合體，所述AG因型為MYHC基因的GenBank AGGession NumberCU856557.2的自5’末端第97782位脫氧核糖核苷酸為A和G的雜合體。
[0022]上述GenBank AGGession Number CU856557.2 于 2008.7.15 提交序列。
[0023]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明使用基因測序方法檢測g.97782A>G,只需進行PCR反應，測序即可判別個體的基因型，基因型判型非常準確，檢測費用不高，具有很高的育種實踐應用價值。用本發(fā)明的方法對豬肌內脂肪含量性狀進行選擇，可使豬平均肌內脂肪含量提高約1.38%，從而獲得高肌內脂肪含量豬。應用本發(fā)明提供的方法對豬進行育種，可對待選豬進行早期篩選，有效地緩解實際生產中的選優(yōu)良種豬時間長的問題，降低育種花費，有效降低或提高實際生產中的 豬肌內脂肪含量。本發(fā)明的檢測方法操作簡單、費用不高、準確度高，并可實現自動化的直接檢測。本發(fā)明將在豬的育種工作中發(fā)揮巨大作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為豬MYHC基因g.97782A>G突變位點反向測序圖【具體實施方式】
[0025]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0026]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027]以下實施例中的引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。
[0028]大民雜交豬:該豬購自中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平實驗豬場。
[0029]實施例1、輔助鑒定豬肌內脂肪含量性狀
[0030]一、豬MYHC基因g.97782A>G多態(tài)性位點的確定
[0031]1、PCR 擴增
[0032]根據豬MYHC 基因基因組 DNA 序列(GenBank AGGession Number CU856557.2)信息，設計一對引物如下:
[0033]U(上游引物):5’ -TTCCTTTCCTGAGCCTGAGA-3’(序列表的序列 I)；
[0034]D (下游引物):5’ -AAGTTCCGAAAAGCTCAGCA-3’ (序列表的序列 2)。
[0035]選擇大民雜交豬(2頭)為實驗材料。以大民雜交豬的基因組DNA為模板，使用引物U和D進行PCR擴增。
[0036]擴增體系為:基因組DNA200ng，IOXPCR擴增緩沖液5 μ 1，dNTPslOmM，上、下游引物各 50ng, Taq DNA 聚合酶 0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用 ddH20 補充反應體系至 50 μ I。
[0037]PCR反應條件為:95°C變性5min ;然后95°C變性20s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0038]PCR產物經瓊脂糖凝膠檢測后于-20°C保存。以2頭大民雜交豬的基因組DNA為模板進行擴增的產物分別命名為產物1、產物2。
[0039]2、克隆測序及序列分析
[0040]分別將2種PCR產物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收純化，回收的DNA片段連接載體pGEM-T (Promega公司)后，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(明日百傲(北京)科技有限公司)，根據載體上的羧卞青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的Τ7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定(英濰捷基(上海)貿易有限公司)。測序結果表明:產物I為序列Μ1，產物2為序列M2 ;序列Ml和序列M2的長度均為244bp，只存在一個脫氧核糖核苷酸的差異(A/G)(見圖1，AA基因型反向測序結果為TT，GG基因型反向測序結果為CC)，此脫氧核糖核苷酸為 GenBank AGGession Number CU856557.2 (2008.7.15)的自 5'末端第97782位脫氧核糖核苷酸，將該單核苷酸多態(tài)命名為g.97782A>G。序列Ml的核苷酸序列見序列表的序列3 (GenBank AGGession Number OJ856557.2第97782位在序列3中對應的是5’末端第160位的A)，序列M2的核苷酸序列見序列表的序列4 (GenBank AGGessionNumber CU856557.2第97782位在序列3中對應的是5，末端第160位的G)。將GenBankAGGession Number CU856557.2的自5'末端第97782位脫氧核糖核苷酸為A的純合體基因型命名為AA，GenBank AGGession Number CU856557.2的自5'末端第97782位脫氧核糖核苷酸為G的純合體基因型為GG，它們的雜合體基因型為AG。
[0041]二、豬MYHC基因g.97782A>G多態(tài)位點與豬肌內脂肪含量的相關性分析
[0042]為確定g.97782A>G多態(tài)位點與豬肌內脂肪含量性狀是否相關，以585頭大民雜交豬為實驗材料，進行如下試驗:提取每頭豬的基因組DNA，用上述引物U和D進行PCR擴增并對每頭豬的PCR擴增產物進行測序分析，確定每頭豬的基因型是GG還是AG還是AA，方法同步驟一。根據豬的基因型確定豬肌內脂肪含量:GG基因型的待測豬的豬肌內脂肪含量高于AG基因型的待測豬，AG基因型的待測豬的豬肌內脂肪含量聞于AA基因型的待測豬。
[0043]用索氏提取法檢測豬肌內脂肪含量(IMF)性狀，對g.97782A>G位點與性狀以最小二乘法開展關聯(lián)分析。所用模型如下:
[0044]Y = S+P+B+G+e
[0045]其中Y為性狀測定值，S為性別效應，P為胎次效應，B為屠宰批次效應，G為基因型效應，e為殘差效應。
[0046]結果見表1。
[0047]表1豬MYHC基因突變位點g.97782A>G基因型與肌內脂肪含量相關性狀的關聯(lián)
【權利要求】
1.一種輔助鑒定豬的肌內脂肪含量性狀的方法，是檢測待測豬的MYHC基因的GenBankAGGession Number CU856557.2的第97782位脫氧核糖核苷酸是A還是G還是A和G,以確定待測豬的基因型是AA還是AG還是GG，根據所述待測豬的基因型確定肌內脂肪含量性狀:GG基因型的待測豬的肌內脂肪含量聞于或候選聞于AG基因型的待測豬，AG基因型的待測豬的肌內脂肪含量聞于或候選聞于AA基因型的待測豬；所述GG基因型為MYHC基因的GenBank AGGession Number CU856557.2的自5’末端第97782位脫氧核糖核苷酸為G的純合體，所述AG因型為MYHC基因的GenBank AGGession Number CU856557.2的自5’末端第97782位脫氧核糖核苷酸為A和G的雜合體，所述AG因型為MYHC基因的GenBank AGGessionNumber⑶856557.2的自5’末端第97782位脫氧核糖核苷酸為A的純合體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述檢測待測豬的MYHC基因的GenBankAGGession Number⑶856557.2的第97782位脫氧核糖核苷酸是A還是G還是A和G為測序分析； 所述測序分析包括PCR擴增和對PCR擴增產物進行測序兩個步驟；所述PCR擴增所用的引物對滿足如下條件:以所述待測豬的基因組DNA為模板進行PCR擴增的產物含有MYHC基因 GenBank AGGession Number CU856557.2 的第 97782 位脫氧核糖核苷酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增所用的引物對為由序列表中序列I所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
4.一種輔助鑒定豬的肌內脂肪含量性狀的試劑，是檢測待測豬的MYHC基因的GenBankAGGession Number⑶856557.2的第97782位脫氧核糖核苷酸是A還是G還是A和G的物質。
5.根據權利要求4所述的試劑，其特征在于:所述物質為由序列表中序列I所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
6.輔助鑒定豬的肌內脂肪含量性狀的試劑盒，含有權利要求4或5所述的試劑。
7.權利要求4或5所述的試劑或權利要求6所述的試劑盒在輔助檢測待測豬肌內脂肪含量中的應用； 或權利要求4或5所述的試劑或權利要求6所述的試劑盒在制備輔助檢測待測豬肌內脂肪含量產品中的應用。
8.權利要求1-7所述的方法、試劑或試劑盒在豬育種中的應用。
9.一種培育高肌內脂肪含量豬的方法，包括選擇GG基因型或AG基因型的豬進行育種；所述GG基因型為MYHC基因的GenBank AGGession Number CU856557.2的自5’末端第97782位脫氧核糖核苷酸為G的純合體，所述AG因型為MYHC基因的GenBankAGGessionNumber⑶856557.2的自5’末端第97782位脫氧核糖核苷酸為A和G的雜合體。
【文檔編號】A01K67/027GK103937895SQ201410168524
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權日:2014年4月24日
【發(fā)明者】王立賢, 張龍超, 王立剛, 趙克斌, 顏華 申請人:中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所