專(zhuān)利名稱(chēng)：cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及CDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法。
背景技術(shù)：
從生物個(gè)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、死亡，到組織的分化、凋亡以及細(xì)胞對(duì)各種生物、 理化因子的應(yīng)答，本質(zhì)上都涉及到基因的選擇性表達(dá)。不同細(xì)胞間或同一細(xì)胞不同時(shí)間與空間，基因表達(dá)的差異決定著生命活動(dòng)的多樣性。基因在時(shí)間和空間上的有序表達(dá)貫穿和調(diào)控了個(gè)體的整個(gè)生命過(guò)程。高等生物大約有幾萬(wàn)個(gè)不同的基因，在一定時(shí)間、空間中，任何一個(gè)細(xì)胞中僅有10% 15%的基因表達(dá)，并受到嚴(yán)格調(diào)控。這種在不同細(xì)胞間或同一細(xì)胞中，基因按時(shí)間和空間順序選擇性地、有序地進(jìn)行表達(dá)，稱(chēng)為基因的差別性表達(dá)?；虻牟顒e性表達(dá)有兩種方式，分別為新出現(xiàn)的基因表達(dá)與表達(dá)量差異的基因表達(dá)?；虮磉_(dá)的變化是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的核心機(jī)制。由于細(xì)胞的各種生理過(guò)程或病理改變?cè)诒举|(zhì)上都是由基因表達(dá)的改變所決定的。因此，通過(guò)比較不同細(xì)胞或同一類(lèi)細(xì)胞不同生理?xiàng)l件下、 不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的基因表達(dá)的差異，將為分析整個(gè)細(xì)胞的生命過(guò)程提供有用的信息。一旦獲取差異表達(dá)的基因?qū)⒂兄诹私庹Ｉ碜兓筒±砀淖兊姆肿訖C(jī)制，為基因診斷、 基因治療和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)提供新的視角。因此，分離和克隆差異表達(dá)基因成為分子生物學(xué)研究的一個(gè)努力方向。近年來(lái)，分離差異表達(dá)基因的技術(shù)不斷發(fā)展與完善，目前這些方法已得到廣泛應(yīng)用，并已成功分離了許多差異表達(dá)的基因。肌內(nèi)脂肪的形成是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，在個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)期其性狀的表現(xiàn)也會(huì)有所不同。從根本上講，在日齡和環(huán)境條件基本一致的情況下，肌內(nèi)脂肪的沉積的變化是由控制肌內(nèi)脂肪沉積的基因在不同的表達(dá)所決定的。Anderson等(1973)認(rèn)為，豬脂肪組織的增長(zhǎng)在前1 2個(gè)月主要是脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加，在2-5月齡是脂肪細(xì)胞數(shù)目增加和脂肪細(xì)胞體積增大共存，5 6月齡以后的發(fā)育主要為脂肪細(xì)胞體積的增大。在不同類(lèi)型的豬肌肉中的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪型豬和瘦肉型豬脂肪細(xì)胞的增殖和肥大能力均存在顯著差異，前者脂肪細(xì)胞成熟的速度較慢而后者脂肪細(xì)胞成熟的速度較快，表明脂肪細(xì)胞在不同品種間的成熟速度有明顯的差異，這種差異也可能是導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪沉積速度差異的一個(gè)重要原因。在動(dòng)物細(xì)胞里，80%以上的能量是在線粒體中合成的。糖和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)酵解和三羧酸循環(huán)后脫下的氫經(jīng)線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞系統(tǒng)即呼吸鏈，最后傳遞給氧。呼吸鏈中的復(fù)合物I即NADH脫氫酶是最復(fù)雜的酶系，其作用是催化NADH的2個(gè)電子傳遞至輔酶Q。還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH是細(xì)胞能量代謝所必需的輔酶，其分子量為770.8kDa，等電點(diǎn)為3.0。NADH在生化過(guò)程中起電子傳遞作用，能量反應(yīng)中的電子，通常都先被傳遞至NAD，再還原成NADH，經(jīng)過(guò)傳遞鏈傳遞電子至氧，并釋放能量，氧化磷酸化作用便利用這些能量制造ATP，1分子NADH還原產(chǎn)生3分子ATP。它在生物體內(nèi)的糖酵解、檸檬酸循環(huán)和光合作用等過(guò)程中，起著電子傳遞的重要作用。NADH對(duì)活化生物體內(nèi)多酶系統(tǒng)，促進(jìn)核酸、蛋白、多糖的合成和代謝，增加物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控，改善代謝功能等具有重要的作用，同時(shí)NADH在維持細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和能量代謝中也起重要作用。細(xì)胞內(nèi)NADH含量的升高，使脂肪酸氧化減弱。同時(shí)NADH含量升高又促進(jìn)脂肪酸的合成。隨著年齡的增長(zhǎng)，組織器官日趨老化，從能量供應(yīng)充足的狀態(tài)到能量供應(yīng)不足，組織器官出現(xiàn)其功能異常，特別是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)細(xì)胞功能退化，如帕金森氏綜合征，阿爾海姆茨病等，并導(dǎo)致全身性疾病發(fā)生，如疲勞綜合征。研究表明NADH能增加內(nèi)源性多巴胺合成和改善帕金森氏綜合征癥狀，預(yù)防帕金森氏綜合征黑質(zhì)變性過(guò)程和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活分化。NADH不僅是一種重要的生化試劑，同時(shí)也可能作為一種生化藥物發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。cDNA-AFLP技術(shù)是Bachem等發(fā)明的。該技術(shù)是將AFLP技術(shù)應(yīng)用于mRNA表達(dá)差異分析基礎(chǔ)上發(fā)展的一種mRNA指紋圖譜技術(shù)。該技術(shù)保留了 AFLP技術(shù)的可靠性與高效性， 可廣泛地應(yīng)用于動(dòng)植物差異基因的分離及鑒定。cDNA-AFLP在cDNA酶切片段兩端加上統(tǒng)一的接頭作為PCR擴(kuò)增的模板，使經(jīng)典PCR反應(yīng)的可靠性大為提高。Habu等比較了 DDRT-PCR 和cDNA-AFLP技術(shù)擴(kuò)增結(jié)果，重復(fù)性可達(dá)100%。Fukuda等的試驗(yàn)也證實(shí)cDNA-AFLP分析再現(xiàn)性達(dá)95%以上。本試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)由引物擴(kuò)增出的差異表達(dá)片斷均可重復(fù)出現(xiàn)，即使是不同個(gè)體的材料也能擴(kuò)增得到相同的差異片段，從而也證實(shí)該試驗(yàn)方法的重復(fù)性好及可靠性高的特點(diǎn)。cDNA-AFLP技術(shù)程序多且復(fù)雜，從RNA的提取到電泳銀染每個(gè)環(huán)節(jié)要求都必須嚴(yán)格，只有這樣才能獲得最佳效果。高質(zhì)量的模板是AFLP標(biāo)記順利完成的關(guān)鍵基礎(chǔ)。所以在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，人們大多使用AFLP試劑盒來(lái)完成各項(xiàng)研究(有些直接讓公司來(lái)做)。因?yàn)樗闷饋?lái)方便，不會(huì)產(chǎn)生因體系不佳帶來(lái)的問(wèn)題，但使用試劑盒的費(fèi)用非常昂貴。目前還未報(bào)道cDNA-AFLP技術(shù)在豬肌內(nèi)脂肪上的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)利用CDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，蘇太商品豬屠宰后采取背最長(zhǎng)肌，根據(jù)肌內(nèi)脂肪的含量從中選取最高和最低各5頭以上構(gòu)建RNA池，提取肌內(nèi)脂肪部位的總RNA，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA，用識(shí)別序列分別為6bp和4bp的兩種限制性?xún)?nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段兩端與相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列連接后，利用與所述的限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，再以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得脂肪含量差異表達(dá)基因的差異片段，回收差異片段，進(jìn)行克隆及測(cè)序，從而獲得蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因。其中，所述的識(shí)別序列為6bp的限制性?xún)?nèi)切酶優(yōu)選EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶，所述的識(shí)別序列為6bp的限制性?xún)?nèi)切酶優(yōu)選Taq I限制性?xún)?nèi)切酶。所述的EcoR I接頭序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，Taq I接頭序列為SEQID No. 3 和 SEQ ID No. 4。所述的與EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No. 5，與Taq I限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No. 6。所述的選擇性擴(kuò)增引物一條為EcoRI選擇性引物，另一條為T(mén)aqI選擇性引物。所述的EcoRI 選擇性引物選自 El :SEQ ID No. 7，E2 :SEQ ID No. 8，E3 :SEQ ID No. 9，E4 :SEQ ID No. 10，E5 :SEQ ID No. 11，E6 :SEQ ID No. 12，E7 :SEQ ID No. 13，E8 SEQ ID No. 14，E9 =SEQ ID No. 15中的任意一條；所述的iTaqI選擇性引物選自Tl =SEQ ID No. 16，T2 =SEQ ID No. 17，T3 :SEQ ID No. 18, T4 :SEQ ID No. 19，T5 :SEQ ID No. 20，T6 :SEQ ID No. 21，T7 =SEQ ID No. 22，T8 =SEQ ID No. 23 ；共形成72種選擇性擴(kuò)增引物對(duì)組合。所述的選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序如下94°C 4min ； [94°C 30s,65°C lmin(每個(gè)循環(huán)降低 0. 7°C )，72°C lmin] X 12 ； (94°C 30s, 56°C lmin，72°C lmin) X 25 ；72°C 7min。有益效果本發(fā)明將cDNA-AFLP應(yīng)用于分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因， 經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)優(yōu)化了 AFLP體系，發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪沉積的相關(guān)候選基因。較之于現(xiàn)今流行的芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)基因的方法，本發(fā)明具有重復(fù)性好，假陽(yáng)性率低，試驗(yàn)成本少的特點(diǎn)。


圖1瓊脂糖變性膠RNA完整性檢測(cè)，其中1 肌內(nèi)脂肪高組；2 肌內(nèi)脂肪低組。圖2預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，M =DNA Marker ；1 肌內(nèi)脂肪含量高組；2 肌內(nèi)脂肪含量低組。圖3cDNA-AFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖，1 肌內(nèi)脂肪含量高組；O 肌內(nèi)脂肪含量低組。圖4菌落陽(yáng)性克隆的PCR檢測(cè)結(jié)果，M =DNA Ladder Marker ；A1-A4指示192bp片斷；B1-B4指示310bp片斷。圖5NADH4基因擴(kuò)增結(jié)果，1-6為肌內(nèi)脂肪含量低組個(gè)體，7_12為肌內(nèi)脂肪含量高組個(gè)體。圖6EcoRI內(nèi)切酶酶切NAHD4，M =DNA Marker ； 1-6為肌內(nèi)脂肪含量低組個(gè)體，7-12 為肌內(nèi)脂肪含量高組個(gè)體。圖7用于實(shí)時(shí)熒光定量分析的兩組個(gè)體背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量，H和L分別代表肌內(nèi)脂肪最高和最低組；*表示差異顯著< 0. 05)。圖8蘇太豬NADH4基因在不同肌內(nèi)脂肪含量中的相對(duì)表達(dá)水平，L 表示肌內(nèi)脂肪含量低組NADH4基因的相對(duì)表達(dá)量；H 表示肌內(nèi)脂肪含量高組NADH4基因的相對(duì)表達(dá)量。 ”表示差異極顯著(P <0.01)。
具體實(shí)施例方式1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背最長(zhǎng)肌來(lái)自90頭180日齡的蘇太商品豬，來(lái)自蘇州蘇太豬育種中心。屠宰后采取背最長(zhǎng)肌，一部分保存于-20°C，用于IMF含量的測(cè)定；一部分立即置于液氮中速凍，-70°C保存，根據(jù)IMF的含量從中選取最高和最低各6頭構(gòu)建RNA池，分別記為脂肪含量最高組和脂肪含量最低組，用于cDNA-AFLP分析。
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1. 2主要試劑及試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase, RNase 抑制齊[J :Promega 公司；Trizol 試劑盒 Invitrogen 公司；rTaq DNA Polymerase, dNTP 上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、Taq I 限制性?xún)?nèi)切核酸酶、T4 DNA 連接酶、DNA Ladder Marker TaKaRa 公司；EcoR I 限制性核酸內(nèi)切酶Fermentas 公司；insT/Aclone PCR Product Cloning Kit:MBI 公司；TOPO TA Cloning Kit for Sequencing : Invitrogen 公司；丙烯酰胺、N-N’亞甲基雙丙烯酰胺南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司；凝膠回收試劑盒天為時(shí)代公司。1.3主要溶液及其配制1. 3. IRNA提取試劑配制(1)0. 的DEPC(焦磷酸二乙酯)處理水ImL DEPC加至999mL去離子水，37°C 過(guò)夜(大于12h)，然后高壓滅菌。(2)異戊醇/氯仿取1 49的體積比即可，放于棕色瓶中。(3) 2M醋酸鈉(ρΗ4· 0)加16. 42g無(wú)水醋酸鈉于40mL DEPC水和35mL冰醋酸中， 用冰醋酸調(diào)PH4. 0，加水至IOOmL后，然后高壓滅菌。(4)苯酚/異戊醇/氯仿取25 24 1的體積比混合即可，放于棕色瓶中。(5) 75%乙醇500mL =DEPC水125mL加100%乙醇375mL即可。配試劑時(shí)器皿均要高壓滅菌，器皿要高壓30min或干烤2h，并戴手套操作。(6)水飽和酚(ρΗ4· 5)。1. 3. 2雙鏈cDNA的合成及酶切所需溶液的配制(1)10% SDS (無(wú)須滅菌)SDS IOg溶于IOOmL雙蒸水中，30°C以上貯存。 (2) 0. 25M EDTA (pH 8. 0)(高壓滅菌)(NaOH 調(diào) pH 值)EDTA 9. 325g ；加雙蒸水定容至 IOOmL0(3) 10moL/L乙酸銨用70mL室溫的ddH20溶解77g乙酸銨，定容至IOOmL,用 0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌。(4) IOmM ATP :27. 5g ATP (disodium salt)，加入 4mL ddH20 調(diào)節(jié) pH 至 7. 0 后加 ddH20 補(bǔ)足 5mL，-20°C保存。1. 3. 3電泳試劑配制(1) 10XTBE 緩沖液稱(chēng)取 108g Tris,7. 44g Na2EDTA · 2H20、55g 硼酸，溶入 800mL
水，定容至IL0(2)溴乙錠(lOmg/mL)儲(chǔ)存液稱(chēng)取Ig溴乙錠，加IOOmL去離子水，攪拌至溶解， 置于棕色瓶避光保存。工作液濃度為0. 5 μ g/mL。(3)1%的瓊脂糖膠稱(chēng)取Ig瓊脂糖，置于250mL錐形瓶，加入IOmL 10XTBE和 90mL去離子水混勻，放入微波爐加熱融化，冷卻至55°C再加入5 μ L 0. 5 μ g/mL的溴乙錠， 搖勻灌膠。(4) 30%丙烯酰胺取^Og丙烯酰胺、IOg N, N-甲叉雙丙烯酰胺加水溶解過(guò)濾定容至 1000mL。(5) 10% APS 取Ig過(guò)硫酸銨加水溶解定容IOOmL即可。(6)6X 上樣緩沖液(Loading Buffer)溴酚藍(lán)，0. 25% ；二甲苯青，0. 25% ；甘油，30% ；加蒸餾水定容至5mL。1.3.4染色溶液的配制(1)固定液IL 10%的冰乙酸取IOOmL冰乙酸加900mL混合即可。(2)染色液Ig硝酸銀加1. 5mL37%的甲醛溶于IL水中。(3)顯色液在2L蒸餾水中加入60g Na2CO3, 3mL37 %甲醛和400uL硫代硫酸鈉 (10mg/mL)。(4)固定液IL 10%的冰乙酸取IOOmL冰乙酸加900mL混合即可。實(shí)施例11.1 總 RNA 提取分別提取脂肪含量最高組和脂肪含量最低組的背最長(zhǎng)肌，用Trizol —步法提取 的肌內(nèi)脂肪部位的總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，其OD26tZOD28tl比值為1. 8 2. O 之間，說(shuō)明樣品的純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求?？俁NA經(jīng)甲醛和甲酰胺變性處理后，經(jīng)1. 2%甲 醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)圖1。1. 2雙鏈cDNA的合成及其精制根據(jù)cDNA合成試劑盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit)要求進(jìn)行操作，以1. 1 中得到的RNA為模板合成cDNA第一鏈，再以在第一條cDNA鏈為基礎(chǔ)合成cDNA第二條鏈， 并對(duì)合成的cDNA進(jìn)行精制。1.3酶切和接頭的連接(1)第一歩Taq I酶酶切(體系為30 μ L)
雙鏈cDNA (600ng)5μ
0.1%BSA2μ
10 χ Buffer2.5μ
T"aql 酶(5υ/μ Ιμ
ddH2〇19.5μ 65°C酶切 2h，80°C失活 20min。(2)第二步EcoR I酶酶切Taq I酶酶切產(chǎn)物 30 μ LEcoR I 酶(5U/ μ L) 2 μ LIOXBuffer4μ LddH204 μ L37°C反應(yīng) 4h，70°C失活 15min。(3)接頭的連接
EcoR I酶酶切產(chǎn)物40μ
10 χ Τ4 DNABuffer3μ
T4DNA 連接酶(350υ/μ 1.5μ
EcoR I 接頭序列(5 pmol)1.5μ Taq I 接頭序列(50 pmol)1 .5mL
ATP(IOmM)1.5mL
ddH2〇ImL16°C連接過(guò)夜，65°C失活15min。1 15稀釋作為預(yù)擴(kuò)增的模板。Taq I 接頭序列5，-GACGATGAGTCCTGAC-3，(SEQ ID No. 3)3，-TACTCAGGACTGGC-5，(SEQ ID No. 4)EcoR I 接頭序歹Ij :5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，(SEQ ID No. 1)3，-CATCTGACGCATGGTTAA-5，(SEQ ID No. 2)將人工合成等量的兩條TaqI (EcoRI)單鏈寡核苷酸于95°C加熱5min，冷卻至室 溫。-20°C保存?zhèn)溆谩?. 4預(yù)擴(kuò)增cDNA酶切片斷加上接頭后，進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，使用預(yù)擴(kuò)增引物，預(yù)擴(kuò)增的目的是 使目的數(shù)量増加，以保證在選擇性擴(kuò)增中盡量覆蓋各種豐度的差異表達(dá)基因。預(yù)擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件如下
初級(jí)模板(1.3中加上接頭的cDNA片段)5mL
10 X PCR Buffer5pL
dNTPs(四種成分各2.5mM)2pL
25mM MgCI23pL
EcoR I預(yù)擴(kuò)增弓丨物1.5mL
yaql預(yù)擴(kuò)增引物1.5m L
rTaq 酶0.25m L
ddH2〇31.75mLEcoR I 預(yù)擴(kuò)增引物5，-GACTGCGTACCAATTCA-3，(SEQ ID No. 5)；Taq I 預(yù)擴(kuò)增引物5，-GATGAGTCCTGACCGAA-3，(SEQ ID No. 6)；反應(yīng)程序94°C 4min ； (94 °C 30s，56°C lmin，72°C lmin) X 23 ；72°C IOmin0 擴(kuò) 增結(jié)束后，取10 y L樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在50 700bp區(qū)域應(yīng)該有彌散，不應(yīng)該有大 于2Kb的片段，點(diǎn)樣孔也不該有殘留，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物的檢測(cè)表明，產(chǎn)物集中在1Kb以 內(nèi)(如圖2)，在AFLP擴(kuò)增的正常范圍內(nèi)，表明cDNA酶切充分、連接及預(yù)擴(kuò)增效果較好，為選 擇性擴(kuò)增提供了理想的模板。1. 5選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋15倍作為選擇性擴(kuò)增的模板。選擇性擴(kuò)增的體系
預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物(稀釋15倍)5ML
10 X PCR Buffer5pL
dNTPs(四種成分各2.5mM)2μl25mM MgCI23μlEcoR I選擇性引物(見(jiàn)表1)1.5μlT"aq I選擇性引物(見(jiàn)表1)1.5μlrTaq 酶 0.25μlddH2〇 31.75μl表1 AFLP選擇性擴(kuò)增弓丨物序列
權(quán)利要求
1.利用CDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，其特征在于蘇太商品豬屠宰后采取背最長(zhǎng)肌，根據(jù)肌內(nèi)脂肪的含量從中選取最高和最低各5頭以上構(gòu)建 RNA池，提取肌內(nèi)脂肪部位的總RNA，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA，用識(shí)別序列分別為6bp 和4bp的兩種限制性?xún)?nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段兩端與相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列連接后，利用與所述的限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，再以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得脂肪含量差異表達(dá)基因的差異片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，其特征在于所述的識(shí)別序列為6bp的限制性?xún)?nèi)切酶為EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶，所述的識(shí)別序列為6bp的限制性?xún)?nèi)切酶為T(mén)aq I限制性?xún)?nèi)切酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，其特征在于所述的EcoR I接頭序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2, Taq I接頭序列接頭序列為 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，其特征在于所述的與EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物序列為 SEQ IDNo. 5，與Taq I限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No. 6。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，其特征在于所述的選擇性擴(kuò)增引物一條為EcoRI選擇性引物，另一條為T(mén)aqI選擇性引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，其特征在于所述的EcoRI選擇性引物選自El =SEQ ID No. 7，E2 =SEQ ID No. 8，E3 SEQ ID No. 9，E4 :SEQ ID No. 10，E5 :SEQ ID No. 11，E6 :SEQ ID No. 12，E7 :SEQ ID No. 13， E8 =SEQ ID No. 14，E9 =SEQ ID No. 15中的任意一條；所述的iTaqI選擇性引物選自Tl =SEQ ID No. 16，T2 =SEQ ID No. 17，T3 :SEQ ID No. 18，T4 :SEQ ID No. 19，T5 :SEQ ID No. 20, T6 SEQ ID No. 21, T7 =SEQ ID No. 22，T8 =SEQ ID No. 23 ；共形成72種選擇性擴(kuò)增引物對(duì)組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，其特征在于所述的選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序如下94°C 4min ;[94°C 30s, 65°C lmin(每個(gè)循環(huán)降低 0. 7°C )，72°C lmin] X 12 ； (94°C 30s, 56°C lmin，72°C lmin) X 25 ； 72 °C 7min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任意一條所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法，其特征在于所述的分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法還包括回收差異片段，進(jìn)行克隆及測(cè)序。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因的方法。蘇太商品豬屠宰后采取背最長(zhǎng)肌，根據(jù)肌內(nèi)脂肪的含量從中選取最高和最低各5頭以上構(gòu)建RNA池，提取肌內(nèi)脂肪部位的總RNA，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA，用識(shí)別序列分別為6bp和4bp的兩種限制性?xún)?nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段兩端與相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列連接后，利用與所述的限制性?xún)?nèi)切酶人工接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，再以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得脂肪含量差異表達(dá)基因的差異片段，回收差異片段，進(jìn)行克隆及測(cè)序，從而獲得蘇太豬肌內(nèi)脂肪含量差異表達(dá)基因。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102286466SQ201110197190
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月14日
發(fā)明者張子敬, 張寶樂(lè), 徐銀學(xué), 李紀(jì)委 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)