本發(fā)明屬于基因檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ALDH2基因多態(tài)性的引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：酒精代謝過程產(chǎn)生的乙醇和乙醛的過量富集及硝酸甘油代謝的受阻經(jīng)常會給人帶來健康隱患，如酒精性肝病，神經(jīng)疾病，心血管疾病，食管癌，胃癌等疾病。人類乙醛脫氫酶(aldehydedehydrogenase,ALDH)是酒精代謝的關(guān)鍵酶。ALDH有19種同工酶，其中ALDH2最為重要，具有脫氫酶活性，對人體內(nèi)乙醛的氧化發(fā)揮主要的作用(即與體內(nèi)代謝酒精的能力直接相關(guān))。ALDH2主要作用為乙醇代謝通路中的第二相代謝的催化劑，在線粒體內(nèi)將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸釋放入血液，而后血液將乙酸輸送到其他組織進入三羧酸循環(huán)，最后氧化為CO2。分子生物學(xué)研究顯示，ALDH2是一個四聚體，只要其中的一個亞基缺少或發(fā)生結(jié)構(gòu)改變就足以導(dǎo)致其酶活性的喪失或活性下降。迄今為止，研究者在人類ALDH2基因的序列上發(fā)現(xiàn)了84個單核苷酸多態(tài)(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位點，但研究主要集中在rs671位點上，即ALDH2基因第12外顯子中的一個SNP，導(dǎo)致賴氨酸替代了原有的谷氨酸(Glu504Lys)。Glu504Lys是ALDH2基因上最重要的一個SNP位點，該位點與ALDH2蛋白的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此影響該酶的活性。在人群中，ALDH2酶的基因以3種形式出現(xiàn)，具有正常催化乙醛活性的野生純合型G/G，即ALDH2*1*1；催化活性下降的突變雜合子型G/A(只有ALDH2蛋白正常水平的6.25％)，即ALDH2*1*2；失去催化活性的突變純合子型A/A，即ALDH2*2*2。ALDH2基因的變異對乙醛的催化活性的影響是影響飲酒人群腫瘤發(fā)生的重要因素，其中以其rs671位點的多態(tài)性最為顯著。最新的研究成果表明，ALDH2除了具有脫氫酶活性以外還具有酯酶活性，可以催化硝酸甘油水解產(chǎn)生NO.，ALDH2基因的Glu504Lys多態(tài)則會影響硝酸甘油的療效。有文獻表明這種突變與部分國人含服硝酸甘油治療心絞痛無效相關(guān)。因此,臨床醫(yī)師在使用硝酸甘油時,需考慮患者的這一遺傳因素。通過對ALDH2基因的檢測，將為硝酸甘油的用藥、飲酒指導(dǎo)及相關(guān)高風(fēng)險疾病的提示提供有效的參考依據(jù)。ALDH2基因檢測的臨床意義包括：(1)揭示個體酒精代謝能力的不同。ALDH2基因與酒精在人體內(nèi)的分解代謝有關(guān)。ALDH2基因突變將使酒精在體內(nèi)的代謝過程受阻，導(dǎo)致大量乙醛滯留在體內(nèi)。除了損傷肝臟導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌；(2)檢測ALDH2酶對藥物代謝速率的快、慢，合理調(diào)整藥物劑量，提高療效、降低毒副反應(yīng)發(fā)生概率；(3)指導(dǎo)臨床正確使用硝酸甘油，減少用藥無效情況。如果病人基因中攜帶有ALDH2(Glu504Lys)突變，乙醛脫氫酶2的硝酸脂酶活性會降低10倍以上，使硝酸甘油無法產(chǎn)生一氧化氮，難以發(fā)揮藥效。在過去的20年，為適應(yīng)臨床需要，以DNA探針和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的分子手段檢測耐藥基因取得了很大進展，其中部分方法已被美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床工作。從最初的焦磷酸測序到后期的基因芯片等技術(shù)都可以檢測基因多態(tài)性位點分型，但焦磷酸具有擴增時間較長、操作繁瑣等缺陷，基因芯片技術(shù)雖然可同時檢測多個位點，但成本也非常高，操作復(fù)雜，所需時間長，不適宜臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用。實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction，簡稱RealTimePCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。Taqman熒光定量技術(shù)是以Taqman熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。只有探針特異結(jié)合的片段發(fā)生PCR擴增時，Taq酶的5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。常用的熒光基團是FAM，TET，VIC，HEX。針對TaqMan探針熒光猝滅不徹底的問題，2000年美國ABI公司推出了一種新TaqMan探針–MGB探針(miNO.rgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate)，3’段采用了非熒光性的猝滅基團–猝滅基團吸收報告基團的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對核酸特異性擴增的實時監(jiān)測，而且具有靈敏度和特異性高、自動化程度高、無污染、成本低廉等特點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供TaqMan-MGB探針法檢測人類ALDH2基因多態(tài)性的引物。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述引物在TaqMan-MGB探針法檢測ALDH2基因多態(tài)性中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ALDH2基因多態(tài)性的試劑盒，它包括如下核酸序列：(1)擴增ALDH2基因rs671多態(tài)性位點的引物對，其核苷酸序列SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示；(2)用于檢測ALDH2基因rs671多態(tài)性位點的TaqMan-MGB探針，其核苷酸序列如SEQIDNO.：3和SEQIDNO.：4所示，其中，SEQIDNO.：3標(biāo)記FAM信號，SEQIDNO.：4標(biāo)記VIC信號；上述引物對和熒光探針對在一次檢測中共同使用。一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ALDH2基因多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒包括：權(quán)利要求1所述的引物和探針。作為優(yōu)選，該試劑盒包括：2×PCR反應(yīng)混合液、陽性標(biāo)準(zhǔn)品。其中，所述的2×PCR反應(yīng)混合液包括：Tris-HCL10mM，引物SEQIDNO：1～210μM，探針SEQIDNO.：3和SEQIDNO.：410μM，MgCl22mM，KCL50mM，dNTPs0.2mM，TaqDNA聚合酶2U/μL。所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為GG基因型標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和AA基因型標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，所述GG基因型標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的插入序列如SEQIDNO.：5所示，所述AA基因型標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的插入序列如SEQIDNO.：6所示.TaqMan-MGB探針法檢測人類ALDH2基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟：(1)提取人外周血基因組DNA；(2)分別以提取的人外周血基因組DNA和權(quán)利要求2中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用SEQIDNO.：1～6所示的引物和探針，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)；(3)根據(jù)檢測到的熒光信號值對rs671位點進行基因型判定。步驟(2)中，實時熒光定量PCR反應(yīng)的擴增體系如下：總體積20μL，2×PCR反應(yīng)混合液10μL，SEQIDNO.：10.2μM，SEQIDNO.：20.2μM，SEQIDNO.：30.2μM，SEQIDNO.：40.2μM，模板DNA50ng。步驟(2)中，實時熒光定量PCR反應(yīng)的擴增程序為：95℃，2min；95℃，10s，60℃，45s，收集熒光，40個循環(huán)。有益效果：(1)使用一種穩(wěn)定性強，特異性高的短TaqMan-MGB探針，短探針的熒光報告基團和猝滅基團的距離更近，猝滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高；同時也簡化了探針的設(shè)計和成本；(2)本發(fā)明使用的探針對于等位基因的區(qū)分更理想，對單堿基的多態(tài)性分型更精準(zhǔn)；(3)本發(fā)明所述的核酸序列具有操作簡便、靈敏度高、特異性強及成本低廉等優(yōu)點，可用于硝酸甘油的用藥、飲酒指導(dǎo)及相關(guān)高風(fēng)險疾病的提示提供有效的參考依據(jù)。附圖說明圖1為10例標(biāo)本的檢測結(jié)果圖示。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1：DNA提取取200μL外周血，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取(購自杭州新捷生物科技有限公司)，提取DNA用于后續(xù)實驗或者存放于-20℃。實施例2：檢測ALDH2基因的rs671多態(tài)性的擴增引物和TaqMan-MGB探針，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成：擴增ALDH2基因的引物對：F(SEQIDNO.：1)：5′-CCCTTTGGTGGCTACAAGATG-3′，R(SEQIDNO.：2)：5′-GCAGGTCCCACACTCACAGTT-3′；熒光定量分型ALDH2基因的TaqMan-MGB探針：FAM(SEQIDNO.：3)：5′-AGGCATACACTGAAGT-3′，VIC(SEQIDNO.：4)：5′-AGGCATACACTAAAGTG-3′。實施例3：檢測方法儀器：Roche480熒光定量PCR檢測儀，ThermoLegendMicro21高速離心機，太倉華利達實驗室設(shè)備公司W(wǎng)H-866型渦旋振蕩器。(1)以實施例(1)得到的基因組DNA為模板，利用特異性擴增引物和敏感穩(wěn)定的TaqMan-MGB探針進行ALDH2基因的檢測，具體包括如下步驟：(a)PCR反應(yīng)液配制：從2xPCR反應(yīng)混合液和實施例2中的各組分，室溫融化，放冰盒上備用。加樣前10分鐘之內(nèi)，按檢測樣本數(shù)配制PCR反應(yīng)液Xμl：X＝10μlPCR反應(yīng)液+0.4μlF引物+0.4μlR引物+0.6μlFAM探針+0.3μlVIC探針(b)加入模板DNA50ng，加水水補足至總體積20μL，同時設(shè)立陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照。(c)PCR擴增：Roche480熒光定量PCR儀進行ALDH2基因檢測，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2min；95℃10s，60℃45s，40個循環(huán)，熒光采集點在60℃，檢測模式設(shè)置為雙通道探針法，反應(yīng)體積設(shè)置為20。保存文件，運行。實施例4：結(jié)果分析Roche480熒光PCR檢測儀點擊分析，選取末端點基因型分型模式，進入分析窗口，在橫縱坐標(biāo)上分別選定一種熒光信號；將標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記為已知的對應(yīng)基因型，并根據(jù)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)品基因型自動計算樣本的結(jié)果?；蜻x取定量模式，根據(jù)FAM和VIC的信號值對比，手動判讀樣本的結(jié)果。每次實驗陰性對照無熒光信號，結(jié)果合格。實施例5：結(jié)果統(tǒng)計10例標(biāo)本的基因型結(jié)果統(tǒng)計如下：編號結(jié)果編號結(jié)果1001G/A1006G/G1002G/A1007G/A1003G/G1008G/G1004G/G1009G/G1005A/A1010G/G以上所述，是本發(fā)明較佳的實施例，并非本發(fā)明任何形式上或?qū)嵸|(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的范圍前提下，還可以對之做一些修改和改進，這些改進和補充也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>重慶迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司<120>一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ALDH2基因多態(tài)性的引物及其應(yīng)用<130>SG20161223001<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴增ALDH2基因的上游引物<400>1ccctttggtggctacaagatg21<210>2<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴增ALDH2基因的下游引物<400>2gcaggtcccacactcacagtt21<210>3<211>16<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>熒光定量分型ALDH2基因的探針<400>3aggcatacactgaagt16<210>4<211>17<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>熒光定量分型ALDH2基因的探針<400>4aggcatacactaaagtg17<210>5<211>98<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>GG基因型標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒插入序列<400>5ccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcag60gcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgc98<210>6<211>98<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>AA基因型標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒插入的序列<400>6ccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcag60gcatacactaaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgc98當(dāng)前第1頁1 2 3