本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途。

背景技術(shù)：

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella mutocida，Pm)是引起多種畜禽巴氏桿菌病的革蘭氏陰性病原菌，一般寄生于動物的上呼吸道，具有條件致病性，在某些應(yīng)激條件刺激下，可引起帶菌動物發(fā)生出血性敗血病或呼吸系統(tǒng)疾病。家畜中以牛、豬、兔、綿羊發(fā)病較多，山羊、鹿、駱駝、馬、驢、犬、貓和水貂等亦可感染發(fā)病。禽類中以雞、火雞和鴨最易感，鵝、鴿次之。根據(jù)莢膜抗原的特異性，可將Pm分為5個血清型(A、B、D、E、F)。在我國，引起禽和豬巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清A型Pm，引起牛的主要為莢膜A型和B型Pm，莢膜A型主要表現(xiàn)為牛纖維素性化膿性肺炎，莢膜B型主要表現(xiàn)為牛出血性敗血癥。由于Pm可以在同種或不同種動物間互相傳染，對養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重。

多殺性巴氏桿菌病主要通過呼吸道和消化道傳播，在養(yǎng)殖場環(huán)境中病畜、病禽的排泄物、分泌物及帶菌動物將多殺性巴氏桿菌排向環(huán)境，細(xì)菌漂浮在空氣中，形成病原氣溶膠，健康動物經(jīng)呼吸道吸入多殺性巴氏桿菌氣溶膠后即可感染。由于巴氏桿菌病原血清型復(fù)雜，各型之間沒有交叉保護(hù)性，疫苗防控本病難度較大，通過定期監(jiān)測，結(jié)合衛(wèi)生消毒及生物安全等可有效預(yù)防本病的發(fā)生。

多殺性巴氏桿菌病的病原學(xué)診斷方法主要有細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、動物回歸試驗等，但這些方法費時、操作繁瑣、準(zhǔn)確率低，不適合臨床快速診斷和監(jiān)測的需要，很難做到早期預(yù)警和隱性感染牛的篩查。

以環(huán)境氣溶膠樣本為監(jiān)測對象，應(yīng)用靈敏、特異和快速的Real-Time PCR方法可以有效地進(jìn)行群體監(jiān)測，并對牛場衛(wèi)生消毒和生物安全效果進(jìn)行評估。但由于多殺性巴氏桿菌氣溶膠中細(xì)菌的含量很低，對檢測方法的靈敏度要求很高，再加之氣溶膠樣本的采集相對較困難，因此，目前還未有針對多殺性巴氏桿菌氣溶膠采用TaqMan技術(shù)進(jìn)行檢測的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示。

具體序列如下：

正向引物：5′-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTG-3′；(SEQ ID NO.1)

反向引物：5′-GACAAGGAAATATAAACCGGCAAA-3′；(SEQ ID NO.2)

探針：5′-(Cy5)TCCTTGACAACGGCGCAACTGATTG(BHQ-2)-3′(SEQ ID NO.3)。

第二方面，本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合。

進(jìn)一步的，該試劑盒中還包括：陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對照和實時熒光定量PCR(qPCR)試劑。

所述陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如SEQIDNo.4所示(241個堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGCCGGTTTATATTTCCTTGTCAGTCTGATTTATCAATATTTCCATGTTGAGTTACGTTTCTTATGGCCATTATTGAAGCCATTAACGACAGAGCGGTTTAATTTATTTATCGTGTATTGGTTACCTATTTTGGTCTTTTCTTCGTGTTCCAACGGTTTAAT-3'；(SEQ ID NO.4)

所述陰性對照為pEASY-Y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

所述實時熒光定量PCR(qPCR)試劑為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)試劑。

第三方面，本發(fā)明提供一種非診斷目的的檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的方法，步驟如下：

(1)采集環(huán)境氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA；

(3)以提取的基因組總DNA為模板，采用上述的試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增體系的擴(kuò)增曲線對環(huán)境氣溶膠樣本中是否含有多殺性巴氏桿菌進(jìn)行判斷，擴(kuò)增曲線Ct值≤37.0時，擴(kuò)增曲線成S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有多殺性巴氏桿菌病原核酸，檢測結(jié)果為陽性；當(dāng)擴(kuò)增曲線Ct值＞37.0時，擴(kuò)增曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有多殺性巴氏桿菌病原核酸，檢測結(jié)果為陰性。

步驟(1)中，采集環(huán)境氣溶膠樣本的方法為：采用國際標(biāo)準(zhǔn)的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-impinger，簡稱AGI)，以30mL含0.01％(V/V)牛血清白蛋白的PBS(pH7.0)為采樣介質(zhì)，按照12.5L/min的采樣流量采集30min，收集養(yǎng)殖場環(huán)境中的氣溶膠樣本。

步驟(2)中，提取氣溶膠樣本的基因組總DNA的方法為：將采集到的氣溶膠樣本在室溫下離心，棄上清液，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA試劑盒(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑盒)提取總DNA。

步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL，包括2×Probe qPCR Mix 10μL，模板1μL，10μmol/L的正向引物和反向引物各0.8μL，探針0.6μL，RNase Free ddH₂O 6.8μL。

步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：預(yù)變性95℃30s，然后95℃變性5s、61℃退火延伸30s進(jìn)行45個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號，最后40℃30s反應(yīng)結(jié)束。

本發(fā)明的有益效果：

(1)針對現(xiàn)有技術(shù)中對多殺性巴氏桿菌的防治現(xiàn)狀及危害的分析，本發(fā)明選擇多殺性巴氏桿菌Kmt1基因所共有的序列設(shè)計合成引物，建立TaqMan實時熒光定量PCR，可將養(yǎng)殖場氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌和其它病原進(jìn)行區(qū)分，并在養(yǎng)殖場環(huán)境中開展多殺性巴氏桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查，對養(yǎng)殖場中不同環(huán)境區(qū)域，包括動物飼養(yǎng)舍、運動場、擠奶廳及產(chǎn)房等采集氣溶膠樣品，利用TaqMan實時熒光定量PCR檢測多殺性巴氏桿菌的含量及其分布情況，預(yù)報巴氏桿菌病發(fā)生的風(fēng)險，為場區(qū)衛(wèi)生消毒試劑的選擇、使用次數(shù)及重點消毒區(qū)域的確定提供參考。

(2)本發(fā)明的試劑盒可以檢測養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠中多殺性巴氏桿菌，具有簡捷快速、靈敏特異、低廉準(zhǔn)確及實用性強(qiáng)等優(yōu)點。利用本發(fā)明的方法可以對養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠中的多殺性巴氏桿菌的流行與隱性感染進(jìn)行群體監(jiān)測，為養(yǎng)殖場多殺性巴氏桿菌病的防控提供技術(shù)支持，也可以開展多殺性巴氏桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查，為多殺性巴氏桿菌病的科學(xué)防控提供理論支撐。

(3)本發(fā)明建立的TaqMan實時熒光定量PCR檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌方法，通過倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度檢測，最低濃度為5.0個拷貝/反應(yīng)。以多殺性巴氏桿菌、牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、絲狀支原體絲狀亞種SC型等基因組DNA等為模板，在建立的檢測方法下進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明僅有多殺性巴氏桿菌有陽性擴(kuò)增，其他菌株擴(kuò)增均為陰性，表明與其他菌株無交叉反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性。

對3個不同濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了批內(nèi)檢測和批間檢測，計算出批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，其批內(nèi)誤差和批間誤差均小于10％。批內(nèi)和批間重復(fù)試驗Ct值的統(tǒng)計學(xué)分析表明：相同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒Ct值之間差異均不顯著(P>0.05)。

本發(fā)明所述的檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途，既可應(yīng)用于養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠中多殺性巴氏桿菌的檢測與鑒定，也可用于臨床血液、血清、奶樣、鼻拭子、組織等樣本的檢測與鑒定。本發(fā)明的方法可用于養(yǎng)殖場環(huán)境中臨床樣本的直接檢測，也可用于科學(xué)研究等非疾病的診斷。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進(jìn)一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1：TaqMan實時熒光定量PCR檢測多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(熒光定量PCR儀自動生成)，利用480Ⅱ中Gene Scanning Software Version 1.5的Abs Quant/2nd Derivative Max分析模式建立擴(kuò)增動力學(xué)曲線，圖中曲線1-9代表5.0×10⁸-5.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，曲線10為陰性對照，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。

圖2：TaqMan實時熒光定量PCR檢測多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用480Ⅱ中Gene Scanning Software Version 1.5的Abs Quant/2nd Derivative Max分析模式分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果各點基本在一條直線上，圖中，各點的標(biāo)準(zhǔn)品濃度從左到右依次為5.0×10¹-5.0×10⁸拷貝數(shù)/反應(yīng)。

圖3：常規(guī)PCR檢測多殺性巴氏桿菌靈敏性擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖中，1-9號泳道分別是模板為5.0×10⁸-5.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，10號泳道為陰性對照。

圖4：TaqMan實時熒光定量PCR檢測多殺性巴氏桿菌特異性擴(kuò)增曲線，其中，曲線1和2的模板分別為，A型多殺性巴氏桿菌和B型多殺性巴氏桿菌DNA，均為S型曲線；曲線3-9分別為：牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌，絲狀支原體絲狀亞種SC型均為一條直線，擴(kuò)增反應(yīng)為陰性；曲線10為陰性對照。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中還未針對多殺性巴氏桿菌氣溶膠采用TaqMan技術(shù)進(jìn)行檢測的相關(guān)報道?；诖?，本發(fā)明提出了一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途。

在本申請的一種實施方案中，提供了一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示。

具體序列如下：

正向引物：5′-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTG-3′；(SEQ ID NO.1)

反向引物：5′-GACAAGGAAATATAAACCGGCAAA-3′；(SEQ ID NO.2)

探針：5′-(Cy5)TCCTTGACAACGGCGCAACTGATTG(BHQ-2)-3′(SEQ ID NO.3)。

檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的難點主要為：

一方面，氣溶膠(aerosol)是指懸浮在氣體中的固體和/或液體微粒與氣體載體共同組成的多相體系。根據(jù)微粒的成分可以劃分為生物氣溶膠和化學(xué)氣溶膠。在氣溶膠的體系中，把具有生命的氣溶膠粒子和活性粒子以及由有生命活性的機(jī)體所釋放到空氣中的各種質(zhì)粒統(tǒng)稱為生物氣溶膠，又稱為微生物氣溶膠，主要分為細(xì)菌氣溶膠、病毒氣溶膠和真菌氣溶膠等，與人類及動物的健康密切相關(guān)。通過監(jiān)測養(yǎng)殖場環(huán)境中氣溶膠微生物，可以有效地預(yù)警預(yù)測傳染病的暴發(fā)流行。

但由于氣溶膠樣本的采集相對較困難，而且氣溶膠中細(xì)菌的含量較低，若有效檢出氣溶膠中的目標(biāo)細(xì)菌，對檢測方法的靈敏度要求很高。因此，目前對于多殺性巴氏桿菌多采用鼻拭子樣本進(jìn)行檢測，針對的是單一個體，難以實現(xiàn)群體監(jiān)測。

另一方面，莢膜是多殺性巴氏桿菌表面的主要組分之一，也是其重要的毒力因子之一，在多殺性巴氏桿菌抗吞噬的過程中發(fā)揮著十分重要的作用。多殺性巴氏桿菌中負(fù)責(zé)莢膜合成的基因在其基因組中成簇存在，在所有與多殺性巴氏桿菌莢膜形成的相關(guān)基因中，hyaD、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD等基因表現(xiàn)出了相應(yīng)的莢膜型特異性，Townsend等(2001)利用這些基因不同位點的序列設(shè)計引物，用于鑒定多殺性巴氏桿菌莢膜血清型的分型。

脂多糖是多殺性巴氏桿菌表面的另一種重要組成成分，也是其主要毒力因子之一。有報道在多殺性巴氏桿菌Heddleston1、2、3、4、5、8、10、11、12、13、14及15型菌株的外核編碼簇中均存在一個高度保守的基因hptE，該基因與fpg相鄰，其所編碼的庚糖基轉(zhuǎn)移酶(HptE)對于多殺性巴氏桿菌LPS內(nèi)核多糖和外核多糖之間的相互連接是必需的。由于多殺性巴氏桿菌LPS的外核編碼簇位于兩個保守的基因priA和fpg之間，并且不同Heddleston血清型菌株外核編碼簇的長短不一，因此可以分別基于priA和HptE作為起始和終止位點設(shè)計引物，實現(xiàn)對Heddleston血清型多殺性巴氏桿菌的診斷。

因此，對于多殺性巴氏桿菌而言，能夠作為靶標(biāo)序列的保守基因的種類有多種，但以不同的保守基因區(qū)域設(shè)計的引物不同，對多殺性巴氏桿菌的診斷和檢測的效果不同。本申請對用于設(shè)計引物的多殺性巴氏桿菌的靶標(biāo)序列進(jìn)行了優(yōu)化篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以Kmt1基因作為靶標(biāo)序列設(shè)計引物，可以同時診斷多殺性巴氏桿菌莢膜A、B、D、E和F 5個血清型，并能提高檢測分析的特異性。

本申請在試驗過程中，設(shè)計了多組不同的引物和探針，并分別進(jìn)行組合，經(jīng)反應(yīng)后分別檢測其特異性和擴(kuò)增效率，以篩選最優(yōu)的可用于臨床檢測的引物和探針組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上述的引物和探針組合對多殺性巴氏桿菌進(jìn)行檢測的特異性和靈敏度最優(yōu)，而其他的引物和探針組合則不能滿足氣溶膠中多殺性巴氏桿菌檢測的靈敏度要求。

在本申請的另一種實施方案中，提供了一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合；還包括：陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對照和實時熒光定量PCR(qPCR)試劑(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑盒)。

本申請利用TaqMan實時熒光定量PCR檢測多殺性巴氏桿菌的含量及其分布情況，預(yù)報巴氏桿菌病發(fā)生的風(fēng)險，為場區(qū)衛(wèi)生消毒試劑的選擇、使用次數(shù)及重點消毒區(qū)域的確定提供參考。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細(xì)說明本申請的技術(shù)方案。

480Ⅱ熒光定量PCR儀(羅氏公司)，梯度PCR儀(TaKaRa公司)，MS-I型多功能微生物采樣器(青島眾瑞智能儀器有限公司)。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(目錄號：DP302)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(目錄號：DP209)和高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(目錄號：DP107)購自天跟生化科技(北京)有限公司；pEASY-T3載體試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司。Probe qPCR Mix試劑盒(Code No.：RR391)、LA Taq(Code No.：RR02MA)均購自寶生物工程(大連)有限公司。其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

多殺性巴氏桿菌A型標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC390)、多殺性巴氏桿菌B型標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC391)、絲狀支原體絲狀亞種SC型(MmmSC)PG1株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌等常見微生物核酸樣品由本實驗室保存；臨床上確診為多殺性巴氏桿菌陽性的氣溶膠DNA樣本由山東師范大學(xué)反芻動物疾病研究中心保存。

本發(fā)明實施例中所用的未進(jìn)行具體說明試驗材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

實施例1：引物與探針的設(shè)計

參考GeneBank中多殺性巴氏桿菌特異性的Kmt1基因(GengBank No.AF016259)，利用Primer Express 3.0軟件設(shè)計兩對特異性引物和探針，具體序列見表1。設(shè)計引物時，首先在Genebank數(shù)據(jù)上BLAST了引物設(shè)計區(qū)域Kmt1基因的保守性，均與多殺性巴氏桿菌菌株100％匹配。再對設(shè)計的上下游引物和探針進(jìn)行BLAST對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不與其他基因序列相匹配，保證了引物序列的特異性。經(jīng)過預(yù)實驗篩選了一對最佳的引物(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)和探針(如SEQ ID NO.3所示)，由華大基因合成，預(yù)期擴(kuò)增DNA產(chǎn)物101bp。

表1多殺性巴氏桿菌特異性的引物對與探針序列

實施例2：檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌方法的建立及檢測方法的靈敏性、特異性考察

1、多殺性巴氏桿菌Kmt1基因部分片段的擴(kuò)增

以多殺性巴氏桿菌陽性病料DNA作為模板，應(yīng)用上游引物Pm-F：5'-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTG-3'(SEQ ID NO.1所示)和下游引物Mb-241-R：5'-ATTAAACCGTTGGAACACGAAGA-3'進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL：10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、LA Taq 0.5μL(5U/μL)、模板2μL，10μmol/L的上、下游引物分別為1μL，滅菌超純水32.5μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)入94℃30s，58℃30s，72℃30s，共進(jìn)行32個循環(huán)；72℃延伸10min，最后停止于4℃。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳鑒定，然后按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行切膠純化。

2、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將回收的目的片斷克隆至pEAST-T3載體，重組質(zhì)粒送華大基因測序，將測序結(jié)果與序列表中SEQ ID NO.4所示的序列進(jìn)行比對，正確的重組質(zhì)粒命名為pEAST-T3-Kmt1。以該質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度計測定其濃度為102ng/μL，按照下述公式計算出每μL質(zhì)粒中的DNA拷貝數(shù)，結(jié)果拷貝數(shù)為5.0×10⁹拷貝/μL。

質(zhì)?？截悢?shù)濃度(copies/μL)＝質(zhì)粒濃度×(6.02×10²³)/DNA堿基數(shù)×2×324.5(堿基的平均分子量)

3、TaqMan實時熒光定量PCR的擴(kuò)增條件的建立

設(shè)立上下游引物和探針終濃度梯度為0.1-1.0mol/L，以確定反應(yīng)的最佳引物和探針濃度；設(shè)立溫度梯度為59-62℃，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，選取最佳退火溫度。以Ct最小值、熒光最高值為標(biāo)準(zhǔn)，分別對退火溫度、引物濃度、探針濃度、循環(huán)條件進(jìn)行優(yōu)化(接下來的步驟4中的各項參數(shù)即為優(yōu)化結(jié)果)。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將質(zhì)粒pEAST-T3-Kmt1按10倍進(jìn)行倍比稀釋至5.0×10⁸-5.0×10⁰拷貝數(shù)/μL，以每一個標(biāo)準(zhǔn)品(每一濃度平行做3管重復(fù))和待測樣本為模板進(jìn)行TaqMan實時熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：2×Probe qPCR Mix 10μL，質(zhì)粒pEAST-T3-Kmt1：1μL，濃度為10μmol/L的上游引物和下游引物(如SEQ ID NO.1、2所示)各0.8μL，濃度為10μmol/L的Probe(如SEQ ID NO.3所示)0.6μL，RNase Free ddH₂O 6.8μL。同時設(shè)置陰性對照，進(jìn)行擴(kuò)增，選擇618-660nm波長的Cy5通道吸收熒光信號，反應(yīng)程序如下：

預(yù)變性：95℃30s(升溫速率4.4℃/s)，1cycle。

PCR：分析模式：定量分析，95℃5s(升溫速率4.4℃/s)，61℃30s(升溫速率2.2℃/s，Acquisition Mode:Single)，45cycles。

降溫：40℃30s(升溫速率2.2℃/s)，1cycle。

如圖1、2所示，根據(jù)待測樣品中目的基因的拷貝數(shù)，便可以推導(dǎo)出所檢測養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的濃度(Copies/m³air)。

5、靈敏性檢測

按照上述步驟4建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法進(jìn)行靈敏性試驗，如圖1所示，每個擴(kuò)增曲線模板為5.0×10⁸-5.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，曲線10為陰性對照，最低檢測限為5.0拷貝。常規(guī)PCR(引物同定量引物)的電泳檢測結(jié)果如圖3所示，最低可以觀察到5.0×10¹拷貝數(shù)/反應(yīng)的模板量的電泳條帶，表明TaqMan實時熒光定量PCR比普通PCR的靈敏性高10倍。

6、特異性檢測

按照上述步驟4建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法進(jìn)行特異性試驗，結(jié)果如圖4所示，1和2號曲線分別是以A型多殺性巴氏桿菌和B型多殺性巴氏桿菌DNA為模板的擴(kuò)增曲線，3-10分別為牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌，絲狀支原體絲狀亞種SC型和陰性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，均沒有特異性熒光曲線。證實所設(shè)計的引物擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌特異性好，與其它菌株無交叉反應(yīng)。因此，步驟4用Pm-F、Pm-R和Pm-Probe建立的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法可用于鑒定未知樣本是否有多殺性巴氏桿菌核酸的存在。

需要說明的是，本發(fā)明的多殺性巴氏桿菌檢測方法之所以具有靈敏性高(檢測限達(dá)5拷貝/反應(yīng))、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，是基于特殊的靶標(biāo)(Kmt1基因)設(shè)計引物，并對引物進(jìn)行優(yōu)化篩選而實現(xiàn)的。目前已報道的用于多殺性巴氏桿菌分型診斷的多殺性巴氏桿菌的保守基因序列有多個，但如何從眾多的保守基因序列中選擇靶標(biāo)進(jìn)行引物設(shè)計是方案設(shè)計的難點所在。

本申請在實驗過程中以不同的保守基因作為靶標(biāo)區(qū)域，設(shè)計了多組引物，但在檢測過程中有出現(xiàn)與其他細(xì)菌之間的交叉反應(yīng)，檢測的特異性不如以Kmt1基因作為靶標(biāo)設(shè)計的引物。

本申請還以Kmt1基因作為靶標(biāo)設(shè)計了多組引物和不同的探針序列(例如表1中的Kmt1-R2)，通過不同的引物和探針的組合，考察檢測的靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同引物和探針的組合，其檢測的靈敏度相差較大，以SEQ ID NO.1、2和3所示的引物和探針組合的檢測靈敏度最優(yōu)，能夠適用于針對氣溶膠樣本的痕量檢測的要求。

實施例3：用于多殺性巴氏桿菌檢測的試劑盒

試劑盒的組成：實施例1設(shè)計的引物和探針組合，陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對照和實時熒光定量PCR(qPCR)試劑(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑盒)；

陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如SEQ ID No.4所示(241個堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTA TTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGCCGGTTTATATTTCCTTGTCAGTCTGATTTATCAATATTTCCATGTTGAGTTACGTTTCTTATGGCCATTATTGAAGCCATTAACGACAGAGCGGTTTAATTTATTTATCGTGTATTGGTTACCTATTTTGGTCTTTTCTTCGTGTTCCAACGGTTTAAT-3'；(SEQ ID NO.4)

所述陰性對照為pEASY-Y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

實施例4：檢測氣溶膠樣品中多殺性巴氏桿菌試劑盒的應(yīng)用

1、多殺性巴氏桿菌氣溶膠樣品的制備

在奶牛場的不同環(huán)境中(奶牛舍、運動場、擠奶廳、產(chǎn)房等)，應(yīng)用MS-Ⅰ型空氣微生物采樣箱，通過國際標(biāo)準(zhǔn)的AGI采樣器采集多殺性巴氏桿菌氣溶膠樣本。采樣器放置高度為距地面1.5m，然后將30mL含0.01％(V/V)牛血清白蛋白的PBS(pH7.0)注入Proton采樣器，同時滴加一滴橄欖油。將Porton沖擊式穩(wěn)流器的一端接到主機(jī)入氣口上，另一端用橡膠管連接到Proton采樣器的出氣口上。采樣流量為12.5L/min，采樣時間為30min。采樣結(jié)束后將采樣器內(nèi)的采集液收集到50mL離心管后低溫保存。

2、氣溶膠模板DNA制備

將氣溶膠收集液12000r/min離心10min，棄上清，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒制備DNA模板。以30μL ddH₂O溶解模板，-20℃存儲備用。

3、TaqMan實時熒光定量PCR檢測

對采自山東省10個奶牛養(yǎng)殖場的10份氣溶膠樣本DNA樣本進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同實施例1中的步驟4，數(shù)據(jù)的收集和擴(kuò)增曲線的生成由定量PCR儀器自帶軟完成。結(jié)果如表2所示，同時將上述樣本進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(引物為Pm-236-F：5'-TGGGCTTGTCGGTAGTCT-3'，Pm-236-R：5'-CTGTCGTTAATGGCTTCA-3')。

表2不同樣本的多殺性巴氏桿菌檢測結(jié)果

上述結(jié)果說明本方法能靈敏地檢測出奶牛場環(huán)境氣溶膠中的多殺性巴氏桿菌濃度。

以上所述僅為本申請的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東師范大學(xué)

<120> 一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttggtgtgtt gagccaatct g 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacaaggaaa tataaaccgg caaa 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccttgacaa cggcgcaact gattg 25

<210> 4

<211> 241

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttggtgtgtt gagccaatct gcttccttga caacggcgca actgattgga cgttatttat 60

tactcagctt attgttattt gccggtttat atttccttgt cagtctgatt tatcaatatt 120

tccatgttga gttacgtttc ttatggccat tattgaagcc attaacgaca gagcggttta 180

atttatttat cgtgtattgg ttacctattt tggtcttttc ttcgtgttcc aacggtttaa 240

t 241