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DMD基因捕獲探針及其在DMD基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):12645188閱讀:639來源:國知局
DMD基因捕獲探針及其在DMD基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法與工藝
本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域
中,DMD基因捕獲探針及其在DMD基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
:DMD基因是假肥大型肌營養(yǎng)不良綜合征致病基因(DMD/BMD),位于X染色體Xp21.2區(qū)域,是目前已知的最大的人類基因,含有79個(gè)外顯子,基因突變概率較高,在新生兒男嬰中達(dá)到約1:3500。DMD基因含有多種突變類型,單個(gè)或多個(gè)外顯子缺失突變最為常見,約占60~70%,單個(gè)或多個(gè)外顯子重復(fù)擴(kuò)增突變,約占5~10%,點(diǎn)突變包括單個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸置換、缺失或插入等,約占DMD所有突變的25%~35%。DMD基因龐大,突變發(fā)生率高,突變類型多樣,各種各樣的突變加在一起據(jù)統(tǒng)計(jì)達(dá)到四、五千種之多,這就給臨床上DMD基因檢測(cè)帶來了很大的困難。傳統(tǒng)的DMD基因突變檢測(cè)方法,對(duì)于不同的突變類型需要選擇不同的檢測(cè)技術(shù),對(duì)于點(diǎn)突變,需要應(yīng)用Sanger測(cè)序進(jìn)行檢測(cè),對(duì)于外顯子重復(fù)或缺失突變,需要應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)(a-CGH)、MLPA或多重PCR等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),上述檢測(cè)策略和方法檢測(cè)效率低,而且不能確定外顯子缺失的精確位點(diǎn)與片段大小,因此,本領(lǐng)域需要能同時(shí)檢測(cè)DMD多種突變類型的更準(zhǔn)確和效率更高的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測(cè)DMD基因全基因的突變。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明首先提供了DMD基因捕獲探針。所用DMD基因的序列為人類參考基因組版本Hg19(更新日期為2015年8月6日)的chrX:31137345-33357726。本發(fā)明所提供的DMD基因捕獲探針,按照捕獲探針的制備方法制備,所述捕獲探針的制備方法包括:制備N個(gè)亞探針,連接所述N個(gè)亞探針,得到DMD基因捕獲探針;N為大于等于2的一個(gè)自然數(shù);所述N個(gè)亞探針滿足所述N個(gè)亞探針能覆蓋所述DMD基因的全部序列。上述DMD基因捕獲探針中,所述亞探針均可為單鏈DNA。上述DMD基因捕獲探針中,在所述DMD基因上任何兩個(gè)相鄰的亞探針均可滿足上游亞探針的下游有一個(gè)或多個(gè)核苷酸與下游亞探針的上游重疊。在所述DMD基因上任何兩個(gè)相鄰的亞探針具體均可滿足上游亞探針的下游有3個(gè)核苷酸與下游亞探針的上游重疊。上述DMD基因捕獲探針中,所述N個(gè)亞探針的長度均可為50-150bp。所述N個(gè)亞探針的長度具體均可為60bp。所述N個(gè)亞探針可為38954個(gè)亞探針。上述DMD基因捕獲探針中,所述N個(gè)亞探針的序列均可滿足:第1條亞探針的序列為DMD基因的第1-60位;第2條亞探針的序列為DMD基因的第58-117位;第3條亞探針的序列為DMD基因的第115-174位;……第n條亞探針的序列為DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位;……第38953條亞探針的序列為DMD基因的第2220265-2220324位;第38954條亞探針的序列為DMD基因的第2220322-2220381位;其中,n為1-38954中的任一個(gè)自然數(shù)。上述DMD基因捕獲探針中,所述連接所述N個(gè)亞探針可包括下述A1)和A2):A1)連接所述N個(gè)亞探針,得到長鏈DNA和/或環(huán)狀DNA;A2)將所述長鏈DNA和/或所述環(huán)狀DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到所述DMD基因捕獲探針。所述制備方法在連接所述N個(gè)亞探針前還可包括對(duì)所述N個(gè)亞探針進(jìn)行磷酸化修飾。對(duì)所述N個(gè)亞探針進(jìn)行磷酸化修飾具體可為在所述N個(gè)亞探針的5′端進(jìn)行磷酸化修飾。所述磷酸化修飾可利用T4多聚核苷酸激酶或NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進(jìn)行。利用NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進(jìn)行所述磷酸化修飾的反應(yīng)體系可為:所述N個(gè)亞探針10μl、10×反應(yīng)緩沖液5μl、10mMATP5μl、T4多聚核苷酸激酶2.5μl和H2027.5μl。所述反應(yīng)體系中所述N個(gè)亞探針的濃度可為5ng/μl。所述反應(yīng)體系中10×反應(yīng)緩沖液、ATP和T4多聚核苷酸激酶均為NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒中試劑。所述磷酸化修飾的反應(yīng)條件可為37℃30min。所述連接所述N個(gè)亞探針可利用ssDNA連接酶或epicentre的ssDNA連接試劑盒(CircLigaseTMIIssDNALigase,epicentre)進(jìn)行。所述連接的反應(yīng)體系可為:所述N個(gè)亞探針的磷酸化產(chǎn)物或所述N個(gè)亞探針20μl、CircLigaseII10×ReactionBuffer5μl、50mMMnCl22.5μl、5MBetaine10μl、CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5μl和H2O10μl。所述連接的反應(yīng)條件可為60℃60min。步驟A2)中,在進(jìn)行將所述長鏈DNA或所述環(huán)狀DNA進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)還可包括利用生物素對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。進(jìn)行所述擴(kuò)增可采用隨機(jī)引物進(jìn)行。所述隨機(jī)引物可為由A、C、G和T這四個(gè)核苷酸隨機(jī)組成的長度均為6bp的46條單鏈DNA所形成的混合物。所述隨機(jī)引物中所有單鏈DNA的摩爾數(shù)均可相同。將所述長鏈DNA和/或所述環(huán)狀DNA進(jìn)行擴(kuò)增以及利用生物素對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記可利用Qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行。利用Qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)體系可為:所述長鏈DNA和/或所述環(huán)狀DNA10μl、2×反應(yīng)緩沖液25μl、Bio-16-dUTP5μl、Replig_Enzyme1μl和H2O9μl。其中,2×反應(yīng)緩沖液中含有所述隨機(jī)引物。利用Qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)溫度可為37℃。利用Qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)間可不小于16小時(shí)。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了所述N個(gè)亞探針。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了DMD基因突變檢測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明所提供的DMD基因突變檢測(cè)系統(tǒng),包括所述DMD基因捕獲探針或所述N個(gè)亞探針。上述系統(tǒng)可由所述DMD基因捕獲探針或所述N個(gè)亞探針與檢測(cè)基因突變所需的儀器和/或試劑組成。所述檢測(cè)基因突變所需的試劑不包括所述DMD基因捕獲探針或所述N個(gè)亞探針。所述檢測(cè)基因突變所需的儀器和/或試劑可為構(gòu)建全基因組文庫所需的儀器和/或試劑,和/或,捕獲DMD基因所需的儀器和/或試劑,和/或,進(jìn)行測(cè)序所需的儀器和/或試劑。所述捕獲DMD基因所需的儀器和/或儀器可為MyOne磁珠和/或邁基諾基因科技股份有限公司的緩沖液HY、2X結(jié)合緩沖溶液、WB1緩沖液、WB3緩沖液和/或稀釋緩沖溶液。所述進(jìn)行測(cè)序所需的儀器和/或試劑可為利用二代測(cè)序所需的儀器和/或試劑。所述二代測(cè)序可為利用Illumina測(cè)序平臺(tái)或其他測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行的測(cè)序,如IlluminaHiSeq2000、IlluminaHiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或XTen。所述系統(tǒng)可為僅包括相關(guān)試劑的試劑或試劑盒。所述系統(tǒng)也可為含有所述DMD基因捕獲探針或所述N個(gè)亞探針的生物芯片。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了所述捕獲探針的制備方法。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了DMD基因突變檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供的DMD基因突變檢測(cè)方法,包括利用所述DMD基因捕獲探針捕獲待測(cè)樣本的DMD基因,然后對(duì)捕獲的DMD基因進(jìn)行測(cè)序,根據(jù)所述待測(cè)樣本的測(cè)序結(jié)果確定所述待測(cè)樣本的DMD基因的突變。上述DMD基因突變檢測(cè)方法中,所述確定所述待測(cè)樣本的DMD基因的突變可將所述待測(cè)樣本的測(cè)序結(jié)果與對(duì)照樣本的DMD基因的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較確定;所述對(duì)照樣本的DMD基因未發(fā)生突變。所述對(duì)照樣本的DMD基因的檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方法可包括:利用所述DMD基因捕獲探針捕獲對(duì)照樣本的DMD基因,然后對(duì)捕獲的DMD基因進(jìn)行測(cè)序,得到所述對(duì)照樣本的測(cè)序結(jié)果。上述DMD基因突變檢測(cè)方法中,所述對(duì)捕獲的DMD基因進(jìn)行測(cè)序可利用現(xiàn)有技術(shù)中的測(cè)序方法(如二代測(cè)序的方法,但不僅限于二代測(cè)序的方法)進(jìn)行,只要能達(dá)到對(duì)捕獲的DMD基因測(cè)序的目的即可。所述二代測(cè)序可為利用Illumina測(cè)序平臺(tái)或其他測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行的測(cè)序,如IlluminaHiSeq2000、IlluminaHiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或XTen。所述DMD基因突變檢測(cè)方法可為非診斷目的的DMD基因突變檢測(cè)方法。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用:X1、所述DMD基因捕獲探針或所述N個(gè)探針在檢測(cè)DMD基因突變中的應(yīng)用;X2、所述DMD基因捕獲探針或所述N個(gè)探針在制備檢測(cè)DMD基因突變產(chǎn)品中的應(yīng)用;X3、所述DMD基因捕獲探針或所述N個(gè)探針在診斷或輔助診斷假肥大型肌營養(yǎng)不良綜合征中的應(yīng)用;X4、所述DMD基因捕獲探針或所述N個(gè)探針在制備診斷或輔助診斷假肥大型肌營養(yǎng)不良綜合征產(chǎn)品中的應(yīng)用;X5、所述系統(tǒng)在檢測(cè)DMD基因突變中的應(yīng)用;X6、所述系統(tǒng)在制備檢測(cè)DMD基因突變產(chǎn)品中的應(yīng)用;X7、所述系統(tǒng)在診斷或輔助診斷假肥大型肌營養(yǎng)不良綜合征中的應(yīng)用;X8、所述系統(tǒng)在制備診斷或輔助診斷假肥大型肌營養(yǎng)不良綜合征產(chǎn)品中的應(yīng)用;X9、所述DMD基因突變檢測(cè)方法在診斷或輔助診斷假肥大型肌營養(yǎng)不良綜合征中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明,利用本發(fā)明的DMD基因捕獲探針及DMD基因突變檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)待測(cè)樣本DMD基因的突變進(jìn)行檢測(cè):利用本發(fā)明的DMD基因捕獲探針檢測(cè)待測(cè)樣本的DMD基因缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變的結(jié)果與利用MLPA的檢測(cè)結(jié)果完全一致,利用本發(fā)明的DMD基因捕獲探針檢測(cè)待測(cè)樣本的DMD基因點(diǎn)突變,其結(jié)果與利用Sanger測(cè)序?qū)ν蛔兾稽c(diǎn)上下游引物對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果完全一致。與現(xiàn)有的MLPA技術(shù)只能檢測(cè)DMD基因外顯子是否存在缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變相比,利用本發(fā)明的DMD基因捕獲探針及DMD基因突變檢測(cè)方法對(duì)DMD基因進(jìn)行檢測(cè)不僅可以檢測(cè)DMD基因是否存在缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變,還可以精確定位斷裂點(diǎn)區(qū)域以及片段大小,還可以檢測(cè)待測(cè)樣本的DMD基因的點(diǎn)突變。因此,與現(xiàn)有技術(shù)中的方法(MLPA、Sanger等)相比,本發(fā)明的DMD基因捕獲探針與DMD基因突變檢測(cè)方法具有一次檢測(cè)多種突變類型以及檢測(cè)DMD基因全基因所有突變的優(yōu)勢(shì),且準(zhǔn)確性高,避免假陰性、假陽性出現(xiàn),能提高臨床DMD基因突變檢測(cè)的效率與準(zhǔn)確性。另外,本發(fā)明的DMD基因捕獲探針對(duì)DMD基因的捕獲均達(dá)到了92%以上覆蓋,在沒有缺失的情況下最高達(dá)到了99.92%;其捕獲效率均在40%以上,從至少覆蓋到4X、10X和20X的參數(shù)來看,平均覆蓋比例分別達(dá)到92%、90%和84%以上,覆蓋率根據(jù)缺失情況表現(xiàn)不同,探針的整體均一性非常好,具有很好的穩(wěn)定性。表明,本發(fā)明的DMD基因捕獲探針可以用于捕獲DMD基因及DMD基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)。附圖說明圖1為臨床樣本DMD基因突變檢測(cè)高通量測(cè)序圖譜。圖2與圖3為樣本C161206C01401的MLPA檢測(cè)結(jié)果圖。圖4與圖5為樣本C161201C02901的MLPA檢測(cè)結(jié)果圖。圖6與圖7為樣本C161001C04601的MLPA檢測(cè)結(jié)果圖。圖8與圖9為樣本C161027C03701的MLPA檢測(cè)結(jié)果圖。圖10與圖11為樣本C161105C03201的MLPA檢測(cè)結(jié)果圖。圖12為Sanger測(cè)序驗(yàn)證待測(cè)樣本DMD基因點(diǎn)突變。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述,給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明,而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn),均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、DMD基因捕獲探針的制備1、單鏈亞探針的序列設(shè)計(jì)及制備所用DMD基因的序列為人類參考基因組版本Hg19(更新日期為2015年8月6日)的chrX:31137345-33357726。根據(jù)DMD基因序列設(shè)計(jì)DMD基因捕獲單鏈亞探針的序列,每條單鏈亞探針的長度為60bp,各單鏈亞探針的序列如下:第1條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第1-60位(即chrX:31137345-31137404);第2條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第58-117位;第3條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第115-174位;……第n條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位;……第38953條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第2220265-2220324位;第38954條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第2220322-2220381位(即chrX:33357667-33357726)。其中,n為1-38954中的任一個(gè)自然數(shù)。利用原位合成的方法,根據(jù)序列分別為上述各探針序列在芯片合成寡核苷酸探針,得到捕獲DMD基因的38954條單鏈亞探針。利用35%的氨水,將固定在芯片上的38954條單鏈亞探針洗脫下來,收集到離心管中,利用真空濃縮儀濃縮后,加入超純水溶解,成為一個(gè)DMD基因的38954條單鏈亞探針的混池;調(diào)整探針濃度到50ng/μl。2、可以捕獲DMD基因全基因的DMD基因捕獲探針的制備1)單鏈亞探針的5′磷酸化修飾:利用NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進(jìn)行。5′磷酸化修飾的反應(yīng)體系如下:組分體積(μl)38954條單鏈亞探針的混池(50ng/μl)1010×反應(yīng)緩沖液(ReactionBuffer)510mMATP5T4PolynucleotideKinase(T4多聚核苷酸激酶)2.5H2027.5總反應(yīng)體積50μl,該反應(yīng)體系中,除38954條單鏈亞探針的混池和H2O外的試劑均為T4多聚核苷酸激酶試劑盒中試劑?;旌暇鶆蚝?,恒溫加熱器或PCR儀器上37℃恒溫孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后,利用微量PCR產(chǎn)物回收試劑盒按照其操作流程進(jìn)行產(chǎn)物純化回收,洗脫體積20μl,得到磷酸化產(chǎn)物;2)連接反應(yīng):將步驟1)得到的磷酸化產(chǎn)物,利用商業(yè)的ssDNA連接試劑盒(CircLigaseTMIIssDNALigase,epicentre)連接,連接反應(yīng)體系如下:組分體積(μl)步驟1)得到的磷酸化產(chǎn)物20CircLigaseII10×ReactionBuffer550mMMnCl22.55MBetaine10CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5H2O10總反應(yīng)體積為50μl,該反應(yīng)體系中,除步驟1)得到的磷酸化產(chǎn)物和H2O外的試劑均為ssDNA連接試劑盒中試劑?;旌暇鶆蚝?,60℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物利用微量DNA回收試劑盒按照其操作流程進(jìn)行產(chǎn)物純化回收,回收產(chǎn)物,得到連接產(chǎn)物(長鏈DNA和環(huán)狀DNA)。通過凝膠電泳,鑒別連接產(chǎn)物片段,結(jié)果顯示得到了成功連接的連接產(chǎn)物。3)標(biāo)記生物素與擴(kuò)增:利用Qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒,反應(yīng)體系如下:組分體積(μl)步驟2)得到的連接產(chǎn)物102×反應(yīng)緩沖液(2×ReactionBuffer)25Bio-16-dUTP5Replig_Enzyme1H2O9總體積50μl,該反應(yīng)體系中,除步驟2)得到的連接產(chǎn)物和H2O外的試劑均為全基因組擴(kuò)增試劑盒中試劑,其中,2×反應(yīng)緩沖液中含有隨機(jī)引物,隨機(jī)引物為由A、C、G和T這四個(gè)核苷酸隨機(jī)組成的長度均為6bp的46條單鏈DNA所形成的混合物,該混合物中所有單鏈DNA的摩爾數(shù)均相同?;旌暇鶆蚝?,37度恒溫孵育16小時(shí)以上。反應(yīng)產(chǎn)物采用DNA回收試劑盒,按照試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程,進(jìn)行DNA純化,得到DMD基因捕獲探針。采用Nanodrop2000進(jìn)行定量,并將DMD基因捕獲探針稀釋到150ng/μl,形成最終的DMD基因捕獲探針溶液。實(shí)施例2、DMD基因突變檢測(cè)方法的建立1.待測(cè)樣本全基因組文庫構(gòu)建1.1超聲片段化:將起始量為0.5-3μg的待測(cè)樣本全基因組DNA,用1×lowTEBuffer(Thermo)稀釋到30ng/μL。采用CovarisS2超聲儀進(jìn)行超聲片段化,按標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定Covaris系統(tǒng)的值,6次循環(huán)×60s,水浴溫度:5℃,占空比:20%,強(qiáng)度:5,模式:Frequencysweeping,得到片段化的DNA。1.2末端補(bǔ)平:分別取100μL步驟1.1的片段化的DNA、8μLdNTPs、2μLEndPolishing酶I(10U/μL,Agilent)和16μLEndPolishing酶II(5U/μL,Agilent),加水到總體積為200μL,25℃孵育30min后,用PureLinkPCR純化試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行純化,得到末端補(bǔ)平的DNA。1.3連接P1和P2接頭:分別取SOLiD接頭1(PleA)50μmol/L和接頭2(P2eA)50μmol/L各26μL(AppliedBiosystems)、步驟1.2的末端補(bǔ)平的DNA48μL、T4DNA連接酶10μL(50U),加水到總體積為200μL,室溫孵育15min。然后利用PureLinkPCR純化試劑盒(Thermo)進(jìn)行純化,得到連接接頭的DNA。1.4DNA片段回收:采用預(yù)制的2%SizeSelectGel(AppliedBiosystems),放到E-GeliBase上。將連接接頭的DNA分3份各20μL加入上樣孔,分子量對(duì)照用0.2μg的50bpladder,無樣品孔及回收孔分別用20μL、25μL水填滿,電泳約12min,吸出進(jìn)入樣品回收孔的150~200bp之間的DNA片段,得到回收的純化DNA片段。1.5缺口平移:步驟1.4的回收的純化DNA片段需要采用切口平移法進(jìn)行文庫模板量的平衡的線性擴(kuò)增。每100μL步驟1.4的回收的純化DNA片段加400μL的mastermix(Agilent),按程序進(jìn)行反應(yīng):72℃20min,95℃5min;然后95℃15s,54℃15s,70℃1min進(jìn)行10到12個(gè)循環(huán);70℃再延伸5min;4℃保存。然后利用PureLinkPCR純化試劑盒(Thermo)進(jìn)行純化并定量至35ng/μL,得到待測(cè)樣本全基因組文庫,取1μL待測(cè)樣本全基因組文庫進(jìn)行FlashGel(2.2%,Lonza公司)電泳,約10min。2.DMD基因全基因捕獲將步驟1中得到的1μg(50ng/ul,20ul)待測(cè)樣本全基因組文庫與5μL實(shí)施例1的DMD基因捕獲探針溶液混合,在PCR儀上95℃孵育7分鐘,65℃孵育2分鐘,加入65℃預(yù)熱的緩沖液HY23μL,65℃雜交22小時(shí),然后加入64μL2X結(jié)合緩沖溶液混合后,得到混合液,將混合液轉(zhuǎn)移至含有50μLMyOne磁珠(Thermo)的管中,旋轉(zhuǎn)1h,然后將MyOne磁珠用WB1緩沖液常溫清洗15min,然后用WB3緩沖液65℃洗3次,每次15分鐘,得到捕獲DMD基因的MyOne磁珠。將上述捕獲DMD基因的MyOne磁珠用稀釋緩沖溶液重懸,得到得到磁珠懸液,然后以磁珠懸液中磁珠上捕獲的DMD基因?yàn)槟0?、用擴(kuò)增引物(Illumina測(cè)序通用引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃30s,1個(gè)循環(huán);98℃25s,65℃30s,72℃30s,15個(gè)循環(huán);72℃5min,1個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用SPRI珠子(BeckmanCoulter,USA)進(jìn)行純化,得到捕獲的DMD基因全基因。其中,緩沖液HY、2X結(jié)合緩沖溶液、WB1緩沖液、WB3緩沖液和稀釋緩沖溶液分別為邁基諾基因科技股份有限公司產(chǎn)品。3.測(cè)序與分析將步驟2中得到的捕獲的DMD基因全基因通過IlluminaHiSeq2000進(jìn)行高通量測(cè)序,得到測(cè)序的數(shù)據(jù),然后對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。測(cè)序數(shù)據(jù)分析的過程包括單核苷酸位點(diǎn)變異(SNV)分析過程、插入缺失標(biāo)記分析(InDel分析)流程和外顯子大片段缺失/重復(fù)分析流程。單核苷酸位點(diǎn)變異(SNV)分析過程包括如下步驟:(1)測(cè)序儀(IlluminaHiSeq2000)獲取原始短序列;(2)去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù);(3)把短序列(用SOAPaligner軟件)定位到人類基因組數(shù)據(jù)相應(yīng)的位置上(所用到參數(shù):soap2.20-a-b-t-v3-142-s63-m100-x400,其中序列錯(cuò)配數(shù)為3);(4)統(tǒng)計(jì)測(cè)序結(jié)果信息,短序列數(shù)量、目標(biāo)區(qū)域覆蓋大小、平均測(cè)序深度等;(5)過濾低質(zhì)量值(質(zhì)量值>=20)和低覆蓋度(深度>=10)的單核苷酸;(6)利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息對(duì)單核苷酸變異進(jìn)行注釋,確定突變位點(diǎn)發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點(diǎn)、氨基酸改變、單核苷酸功能(錯(cuò)義突變/無義突變/可變剪切位點(diǎn))、SIFT預(yù)測(cè)單核苷酸影響蛋白功能預(yù)測(cè);(7)根據(jù)疾病樣品和正常樣品信息,選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的單核苷酸變異作為候選的單核苷酸變異,在候選的單核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人類基因組、其他外顯子測(cè)序項(xiàng)目中出現(xiàn)的單核苷酸變異。同時(shí)過濾掉SIFT預(yù)測(cè)對(duì)蛋白功能無影響的單核苷酸變異作為最后疾病相關(guān)的候選單核苷酸變異位點(diǎn);插入缺失標(biāo)記分析(InDel分析)流程包括如下步驟:(1)把去除接頭序列和低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)用Burrows-WheelerAligner(BWA)比對(duì)到人類基因組上(所以到參數(shù):bwaaln-L-l31–I10-k2-t7-e40);(2)用GATK軟件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息;(3)利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息對(duì)InDel進(jìn)行注釋,確定突變位點(diǎn)發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點(diǎn)、編碼區(qū)域序列的改變、對(duì)氨基酸的影響、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移碼突變);(4)根據(jù)疾病樣品和正常樣品信息,選出檢測(cè)樣品所共有的而在正常組中不存在的InDel作為候選的InDels,在候選的InDels中去除掉在dbSNP、其他外顯子測(cè)序項(xiàng)目中出現(xiàn)的InDel,最后篩選出疾病相關(guān)的候選InDels;外顯子大片段重復(fù)/缺失分析流程包括如下步驟:(1)測(cè)序儀(IlluminaHiSeq2000)獲取原始短序列;(2)去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù);(3)把短序列(用SOAPaligner軟件)定位到人類基因組數(shù)據(jù)相應(yīng)的位置上(所用到參數(shù):soap2.20-a-b-t-v3-l42-s63-m100-x400,其中序列錯(cuò)配數(shù)為3);(4)統(tǒng)計(jì)目標(biāo)區(qū)域覆蓋大小,然后根據(jù)每個(gè)目標(biāo)區(qū)域位點(diǎn)的位置信息為橫坐標(biāo),每個(gè)位置相應(yīng)的覆蓋度為縱坐標(biāo)作圖,通過每個(gè)位點(diǎn)的讀取深度,進(jìn)行位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析得出重復(fù)擴(kuò)增和缺失的分析圖,同時(shí)通過末端配對(duì)作圖法(paired-endmapping,PEM)得到相關(guān)的斷裂點(diǎn)位置。實(shí)施例3、利用實(shí)施例1的DMD基因捕獲探針與實(shí)施例2的DMD基因突變檢測(cè)方法檢測(cè)臨床樣本的DMD基因突變經(jīng)知情同意,選擇DMD基因存在外顯子缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變的5例患者的DNA樣本(經(jīng)MLPA檢測(cè)驗(yàn)證,圖2-圖11)作為待測(cè)樣本,利用MLPA檢測(cè)陰性的DNA樣本作為正常對(duì)照(陰性對(duì)照),應(yīng)用實(shí)施例2的DMD基因突變檢測(cè)方法檢測(cè)DMD基因突變。MLPA檢測(cè)DMD基因是否存在外顯子缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變所用試劑盒為MLPAP052檢測(cè)試劑盒(HRC-Holland)。結(jié)果顯示,5例MLPA檢測(cè)陽性的樣本高通量測(cè)序圖見圖1,數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表1和表3。圖1中,陰性對(duì)照是指MLPA檢測(cè)陰性的樣本的高通量測(cè)序圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測(cè)樣本中有3例外顯子缺失突變和2例外顯子重復(fù)擴(kuò)增突變,陰性對(duì)照中不含有缺失突變和重復(fù)擴(kuò)增突變。通過利用本發(fā)明的DMD基因捕獲探針和DMD基因突變檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果與MLPA驗(yàn)證結(jié)果的比較,發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致,無差異。說明利用本發(fā)明的DMD基因捕獲探針和DMD基因突變檢測(cè)方法檢測(cè)DMD全基因突變效果可靠。另外,現(xiàn)有的MLPA技術(shù)只能檢測(cè)DMD基因外顯子是否存在缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變,而本發(fā)明的DMD基因突變檢測(cè)方法還能精確定位斷裂點(diǎn)區(qū)域以及片段大小。表1、DMD外顯子缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變檢測(cè)另選取4個(gè)樣本經(jīng)實(shí)施例2的方法檢測(cè)為DMD基因點(diǎn)突變樣本,其檢測(cè)結(jié)果如表2和表3所示。這四個(gè)樣本中均不存在缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變。利用MLPAP052檢測(cè)試劑盒對(duì)這四個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)也均未檢測(cè)到任何缺失/重復(fù)擴(kuò)增突變。根據(jù)實(shí)施例2的方法的檢測(cè)結(jié)果在各突變位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)引物,對(duì)相應(yīng)樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Sanger測(cè)序結(jié)果(圖12)與利用實(shí)施例2的方法檢測(cè)的點(diǎn)突變的結(jié)果完全一致。表2.DMD基因點(diǎn)突變檢測(cè)因此,與現(xiàn)有技術(shù)中的方法(MLPA、Sanger等)相比,本發(fā)明的DMD基因捕獲探針與DMD基因突變檢測(cè)方法具有一次檢測(cè)多種突變類型以及檢測(cè)DMD基因全基因所有突變的優(yōu)勢(shì),且準(zhǔn)確性高,避免假陰性、假陽性出現(xiàn),能提高臨床DMD基因突變檢測(cè)的效率與準(zhǔn)確性。表3、測(cè)序數(shù)據(jù)表3中參數(shù)說明:A.測(cè)序數(shù)據(jù)量是指完成DMD基因捕獲的樣本進(jìn)行測(cè)序時(shí)產(chǎn)生的總的測(cè)序數(shù)據(jù);B.覆蓋率:覆蓋目的堿基數(shù)/目的堿基數(shù);C.目的堿基數(shù):指探針設(shè)計(jì)所要覆蓋到的目的區(qū)域的總堿基數(shù);D.覆蓋目的堿基數(shù):指經(jīng)過富集測(cè)序后,能夠成功比對(duì)到設(shè)計(jì)所要覆蓋的堿基區(qū)域的堿基數(shù);E.捕獲效率(有效數(shù)據(jù)量):覆蓋目的堿基數(shù)/測(cè)序數(shù)據(jù)量F.測(cè)序平均深度:指目的區(qū)域測(cè)序時(shí),平均所讀取到的次數(shù);G.平均覆蓋4X比例:指最少讀到4次以上的堿基數(shù)占比;H.平均覆蓋10X比例:指最少讀到10次以上的堿基數(shù)占比;I.平均覆蓋20X比例:指最少讀到20次以上的堿基數(shù)占比;探針質(zhì)量評(píng)估:DMD基因捕獲探針對(duì)DMD基因的捕獲均達(dá)到了92%以上覆蓋,最高達(dá)到了99.92%;其捕獲效率均在40%以上,從至少覆蓋到4X、10X和20X的參數(shù)來看,平均覆蓋比例分別達(dá)到92%、90%和84%以上,探針的整體均一性非常好,具有很好的穩(wěn)定性。表明,本發(fā)明的DMD基因捕獲探針可以用于捕獲DMD基因及DMD基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)。當(dāng)前第1頁1 2 3 
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