本發(fā)明屬于生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種快速鑒定分枝桿菌的引物與方法。
背景技術(shù)：
：分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)、麻風(fēng)分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。NTM和MTBC均可引起肺部及其他部位病變，且臨床癥狀相似，鑒別診斷比較困難。然而，不同分枝桿菌感染引起的疾病其治療方案是截然不同的，在2012年我國(guó)專家達(dá)成的共識(shí)要求在診斷和治療前要進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，以便能對(duì)不同分枝桿菌的感染實(shí)施針對(duì)性的治療方案。所以分枝桿菌菌種鑒定對(duì)于疾病的診斷、治療及預(yù)后意義重大。據(jù)2010年第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的感染率為22.9％，對(duì)人類致病的NTM有20余種。近年來，NTM感染呈增多趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。目前分枝桿菌的檢測(cè)方法主要有以下幾種：1)涂片鏡檢：該方法快速直觀，但靈敏度低，重要是只能鑒定到分枝桿菌屬，后續(xù)仍需做進(jìn)一步的分枝桿菌菌種鑒定；2)羅氏培養(yǎng)法：檢測(cè)周期較長(zhǎng)，通常約8周時(shí)間，靈敏度一般，后續(xù)仍需做進(jìn)一步分枝桿菌菌種鑒定；3)快速培養(yǎng)檢測(cè)法：檢測(cè)周期仍較長(zhǎng)，但比羅氏培養(yǎng)快，靈敏度較羅氏培養(yǎng)高，但污染率也高，后續(xù)需做進(jìn)一步分枝桿菌菌種鑒定并且需要專用儀器和試劑，價(jià)格高；4)分子診斷：目前應(yīng)用最多的是GeneXpert，該方法時(shí)效性很強(qiáng)，可以從痰液標(biāo)本直接出發(fā)，經(jīng)過兩小時(shí)得出結(jié)果，但是該平臺(tái)只能做痰液的結(jié)核分枝桿菌的診斷，其他非結(jié)核分枝桿菌或非痰液標(biāo)本無法檢測(cè)；5)γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)診斷：該方法只用于結(jié)核桿菌的診斷，對(duì)于非結(jié)核分枝桿菌的診斷無效。中國(guó)專利CN102634575B公開了一種分枝桿菌菌種快速鑒定方法及試劑盒，其基本原理為：基于熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)，結(jié)合多重不對(duì)稱PCR技術(shù)和熔解曲線技術(shù)，并運(yùn)用多個(gè)熒光檢測(cè)通道在一個(gè)PCR反應(yīng)中檢測(cè)多種不同熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物所形成的熔解峰，利用熔解峰所示的Tm值來鑒定分枝桿菌菌種。但是，部分分枝桿菌菌種的Tm值差別不明顯，不能明確區(qū)分鑒別，容易造成混淆和錯(cuò)判，該法靈敏度和精確度有待提高?，F(xiàn)有技術(shù)中仍需要一種可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)各標(biāo)本中的分枝桿菌進(jìn)行鑒定且可以直接鑒定到分枝桿菌具體菌種的檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種快速鑒定分枝桿菌的引物與方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法是從原始標(biāo)本出發(fā)對(duì)各類標(biāo)本中的分枝桿菌進(jìn)行靶向測(cè)序鑒定，得到測(cè)序序列后利用BLAST將測(cè)序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得出鑒定結(jié)果，快速、高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)出標(biāo)本中分枝桿菌的菌種類型。本發(fā)明提供一種快速鑒定分枝桿菌的引物，所述引物為以分枝桿菌Hsp65基因?yàn)榘邢蚧?、基于PCR擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物為：5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’(SEQIDNO.1)，下游引物為：5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’(SEQIDNO.2)。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法中，靶向基因的選擇尤其重要，既要保證所選擇的靶向基因具有分枝桿菌屬的特異性，也要保證其具有分枝桿菌屬內(nèi)不同種間的特異性。本發(fā)明發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗(yàn)以及長(zhǎng)時(shí)間的驗(yàn)證后最終選擇了Hsp65基因作為本發(fā)明檢測(cè)方法的靶向基因。Hsp65蛋白是分枝桿菌的一個(gè)主要免疫反應(yīng)蛋白抗原，既含有不同分枝桿菌共同的表位，也含有不同分枝桿菌菌種獨(dú)特的表位，它的編碼基因廣泛存在于分枝桿菌中，同時(shí)，Hsp65基因核苷酸序列的多態(tài)性總體上大于16SrRNA基因多態(tài)性，具有種的特異性，因此其可以用于對(duì)分枝桿菌菌種進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明發(fā)明人以Hsp65基因?yàn)榘邢蚧颍O(shè)計(jì)了大量引物，通過引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，以及通過大量的試驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出了一對(duì)特異性好的引物。本發(fā)明提供的快速鑒定分枝桿菌的引物，可以實(shí)現(xiàn)分枝桿菌的特異性檢測(cè)，準(zhǔn)確性好。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種快速鑒定分枝桿菌的方法，包括如下步驟：S1、從標(biāo)本中提取總的細(xì)菌DNA；S2、以步驟S1所述的總的細(xì)菌DNA為模板DNA，利用本發(fā)明提供的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，結(jié)束后4℃保存；S3、通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)Sanger測(cè)序；S4、對(duì)Sanger測(cè)序法得到的基因序列進(jìn)行分析和處理，獲得檢測(cè)標(biāo)本中Hsp65靶向基因的序列，將Hsp65靶向基因的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定分枝桿菌的菌種類型。優(yōu)選地，所述步驟S1中的標(biāo)本選自臨床樣品，如痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸膜液、腹膜液、尿液、羊膜水、外周血和組織標(biāo)本等中的一種。由于某些標(biāo)本，如組織標(biāo)本等，若沒經(jīng)過分枝桿菌目標(biāo)菌的富集，其含有的分枝桿菌量可能比較少且標(biāo)本量比較少，可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，從標(biāo)本中提取總的細(xì)菌DNA時(shí)，一方面可以通過一種比較好的選擇性培養(yǎng)基，如分枝桿菌快速變色液體培養(yǎng)基(購(gòu)于廣州凱升生物科技有限公司,貨號(hào)KS080763)對(duì)標(biāo)本中的分枝桿菌進(jìn)行短時(shí)間的快速增殖；另一方面可以針對(duì)各種不同類型標(biāo)本，設(shè)計(jì)出不同的DNA提取方法，如針對(duì)痰液標(biāo)本，可以針對(duì)性的選用柱式唾液、尿液基因組DNA抽提試劑盒(購(gòu)于生工生物工程有限公司，貨號(hào)B518266)對(duì)總的細(xì)菌DNA進(jìn)行提取，以便提高DNA提取效率。優(yōu)選地，所述步驟S2中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL、模板DNA2μL、上游引物1μL、下游引物1μL和ddH2O8.5μL；所述上游引物和下游引物的濃度為10pmoL/μL。所述2×TaqPCRMasterMix購(gòu)自天根生化科技有限公司(貨號(hào)KT201)，2×TaqPCRMasterMix中含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑。本發(fā)明所鑒定的分枝桿菌包括臨床常見的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、、田鼠分枝桿菌(M.microti)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、牛分枝桿菌(M.bovis)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、猿猴分枝桿菌(M.simiae)、胃分枝桿菌(M.gastri)、海分枝桿菌(M.marinum)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、膿腫分枝桿菌(M.abscessus)、不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)、愛知分枝桿菌(M.aichiense)、鳥分枝桿菌(M.avium)、迪氏分枝桿菌(M.diernhoferi)、次要分枝桿菌(M.triviale)、偶然分枝桿菌(M.fortuitum)、土地分枝桿菌(M.terrae)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、戈登分枝桿菌(M.gordonae)、蟾蜍分枝桿菌(M.xenopi)、龜分枝桿菌(M.chelonae)、龜分枝桿菌龜亞種(M.chelonaesubsp.chelonae)、龜分枝桿菌膿腫亞種(M.chelonaesubsp.abscessus)、施氏分枝桿菌(M.shimoidei)、亞洲分枝桿菌(M.asiaticum)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、抗熱分枝桿菌(M.thermoresistibile)、田野分枝桿菌(M.agri)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、草分枝桿菌(M.phlei)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種快速鑒定分枝桿菌的引物和方法，從原始標(biāo)本出發(fā)，通過靶向測(cè)序的途徑，對(duì)各類型標(biāo)本中的分枝桿菌進(jìn)行靶向測(cè)序鑒定，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出標(biāo)本中分枝桿菌的菌種類型，具有廣泛性和高效性。附圖說明圖1樣本DNA的Hsp65靶向基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，圖中，M為DNAMarker，1-4為樣本DNA的Hsp65靶向基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2樣本DNA的Hsp65靶向基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物正向測(cè)序得到的序列。圖3樣本DNA的Hsp65靶向基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物反向測(cè)序得到的序列。圖4樣本DNA的Hsp65靶向基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物運(yùn)用DNAman軟件進(jìn)行拼接得到的樣本DNA的Hsp65靶向基因序列。具體實(shí)施方式以下內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一分枝桿菌的鑒定S1、按照柱式唾液、尿液基因組DNA抽提試劑盒(購(gòu)于生工生物工程有限公司，貨號(hào)B518266)說明書從痰液標(biāo)本中提取總的細(xì)菌DNA；S2、PCR擴(kuò)增采用2×TaqPCRMasterMix(購(gòu)自天根生化科技有限公司，貨號(hào)KT201)，以提取得到的總的細(xì)菌DNA為模板；上游引物為：5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’(SEQIDNO.1)，下游引物為：5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’(SEQIDNO.2)，引物的濃度為10pmoL/μL；反應(yīng)體系如表1所示。表1PCR反應(yīng)體系試劑體積(μL)2XMasterMix12.5上游引物1.0下游引物1.0模板DNA2.0ddH2O8.5total25.0PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，結(jié)束后4℃保存。S3、PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果，如圖1所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶亮度較高，條帶單一，大小在450bp左右，表示PCR擴(kuò)增成功。按照iPureDNA膠回收試劑盒(離心柱型)(購(gòu)自廣州艾基生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)K210-S)說明書對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)Sanger測(cè)序。S4、經(jīng)Sanger測(cè)序法得到Hsp65靶向基因的序列后，根據(jù)美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)頒布的《CLSTMM18—A測(cè)序鑒定結(jié)果解釋指南》，對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行分析，剔除質(zhì)量評(píng)分(QV)＜20的序列，然后將剩下的高質(zhì)量的正向測(cè)序得到的序列(如圖2所示)及反向測(cè)序得到的序列(如圖3所示)運(yùn)用DNAman軟件進(jìn)行拼接，最終獲得較高質(zhì)量的Hsp65靶向基因的序列，如圖4所示，將得到的Hsp65靶向基因的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，最終確定標(biāo)本中分枝桿菌的菌種類型為膿腫分枝桿菌(M.abscessus)。SEQUENCELISTING<110>廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司<120>一種快速鑒定分枝桿菌的引物與方法<130>2016<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1accaacgatggtgtgtccat20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2cttgtcgaaccgcataccct20當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3