鳥(niǎo)分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于特異性檢測(cè)和任選地定量來(lái)自于個(gè)體樣品的鳥(niǎo)分枝桿菌亞種副 結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium spp.paratuberculosis) (MAP)的方法。為此，根據(jù) 本發(fā)明的方法，通過(guò)核酸擴(kuò)增和特異性寡核苷酸來(lái)檢測(cè)樣品中IS900域（IS90〇region)的 存在。另一方面，本文提供了用于通過(guò)擴(kuò)增方法對(duì)樣品中MAP進(jìn)行特異性檢測(cè)的檢驗(yàn)試劑 盒。最后，公開(kāi)了適用于特異性檢測(cè)MAP的特異性寡核苷酸。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 鳥(niǎo)分枝桿菌（Mycobacterium avium)是一種具有多種宿主的分枝桿菌種 (mycobacterium species)。一方面，鳥(niǎo)分枝桿菌可在禽類中引起結(jié)核病，另一方面其也是 人類和其它哺乳動(dòng)物中的病原體。鳥(niǎo)分枝桿菌的一個(gè)種是鳥(niǎo)分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿 菌（MAP),其為分枝桿菌屬（genus Mycobacterium)的專性（obligate)病原菌。MAP被 視為是引起副結(jié)核?。↗ohne' s disease)的原因，特別是在反芻動(dòng)物身上會(huì)出現(xiàn)該疾病。 除了反芻動(dòng)物和人以外，在其它動(dòng)物物種，特別是野生動(dòng)物，尤其是野兔、鳥(niǎo)類、野貓、浣熊 和老鼠中也可能檢測(cè)出MAP亞種。此外，關(guān)于該病原體在臨床上可能涉及人中的"克羅恩 病"（"Crohn' s disease"）存在著討論。
[0003] 自19世紀(jì)初就已知MAP病原體為副結(jié)核病的病原（causative agent)。副結(jié)核 病是一種慢性腸道疾病，其會(huì)在數(shù)星期的時(shí)間導(dǎo)致持續(xù)的體重減輕。在最后的階段，這種 疾病會(huì)產(chǎn)生致命的結(jié)果。成年的家養(yǎng)反芻動(dòng)物，如牛、綿羊和山羊，以及野生的反芻動(dòng)物和 動(dòng)物園動(dòng)物主要會(huì)被感染。通常，病原體的傳播主要發(fā)生在新生的小牛和最多6個(gè)月大的 小牛中。此處，感染大多不易察覺(jué)地發(fā)生并且通過(guò)口腔-糞便的途徑無(wú)法察覺(jué)地轉(zhuǎn)移，甚 至被感染的奶牛的初乳會(huì)含有病原體。在伴隨無(wú)規(guī)律且不可控的病原體分泌（pathogen excretion)的幾年時(shí)間的潛伏期之后，該疾病通常先在年齡較大的母牛中出現(xiàn)。目前還沒(méi) 有治療方法。過(guò)去，疫苗顯示出了令人懷疑的結(jié)果，以至于它們目前在德國(guó)沒(méi)有被使用。通 常情況下，購(gòu)買亞臨床上表現(xiàn)（subclinically)感染的或被持久性感染的動(dòng)物造成了畜群 中的新感染。恰恰是臨床上不顯著的攜帶者和未識(shí)別的排菌者（excreters)是造成長(zhǎng)期持 續(xù)的家畜感染的重要原因。正是由于副結(jié)核病的廣泛分布和經(jīng)濟(jì)損失，目前亟需改進(jìn)的診 斷方法和控制程序的開(kāi)發(fā)。在德國(guó)，根據(jù)動(dòng)物傳染病法§ 78a 2款（§ 78a Art. 2 of the Infectious Animal Diseases Law)副結(jié)核病須予以具報(bào)。
[0004] 副結(jié)核病的診斷是控制和早期識(shí)別副結(jié)核病的重要元素。已有依賴于例如基于抗 體測(cè)試的各種測(cè)試方法和診斷方法。然而，商業(yè)上可獲得的測(cè)試的一個(gè)問(wèn)題是靈敏度和特 異性的不足。此外，由于因這些測(cè)試的靈敏度不夠而使血清學(xué)檢測(cè)（serologically)陰性 的排菌者可以保留在畜群中并因此可進(jìn)一步傳播疾病，基于抗體的測(cè)試是不適用的。
[0005] 為了能夠在將來(lái)實(shí)施有效的根除計(jì)劃，可靠的病原體檢測(cè)方法是必要的。分子生 物學(xué)，特別是基于核酸擴(kuò)增的方法已經(jīng)常性地被討論。特別地，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 的分子生物學(xué)方法被認(rèn)為是非常有前途的。PCR是用來(lái)確認(rèn)疑似樣品中MAP DNA的快速且 可靠的方法。這一方面，插入序列（insertion sequence) IS900以及ISMav2、hspX和F57 的域已被確定為MAP基因組中特別合適的域。插入單元IS900特別凸現(xiàn)為適用于（特別是 通過(guò)PCR方法的）分子診斷的域。IS900是1451bp的片段，其具有參照菌株MAP-K10的基 因組中的17個(gè)拷貝。由于這一高的拷貝數(shù)量，可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)方法中更高的靈敏度并使得 IS900成為合適的靶向域。已描述了基于靶向序列IS900的檢測(cè)MAP用的傳統(tǒng)和實(shí)時(shí)PCR。
[0006] 由此，DE102007015775A1中包括了適用于特異性檢測(cè)MAP的寡核苷酸。此外，該文 獻(xiàn)公開(kāi)了相應(yīng)的用于檢測(cè)MAP的方法和試劑盒。由EP 2 009118 A2已知有基于IS900和 F57特異性引物的檢測(cè)和定量MAP用的方法。
[0007] 然而，一如既往，上述那些方法仍然存在高特異性時(shí)靈敏度不足的弱點(diǎn)。
[0008] Bull等人，2007，Plos One, ll，el229描述了用于檢測(cè)MAP的實(shí)時(shí)PCR分析法。 Miinster P.，等人，2011，Vet Microbiol, 154 (1-2) ,197-201 公開(kāi)了一種用于檢測(cè) MAP 的半 逆轉(zhuǎn)錄PCR(semi-rested PCR)(snPCR)。高靈敏度被描述。然而，snPCR需要兩個(gè)PCR運(yùn)行 的性能。已知snPCR是一種具有高污染風(fēng)險(xiǎn)的方法，因而不適合高樣品通量情況下的常規(guī) 使用。
[0009] 然而，在高靈敏度和高特異性的情況下檢測(cè)被感染的個(gè)體是必要的，從而能執(zhí)行 適當(dāng)?shù)南麥绯绦颍╡radication program)。特別地，此方法還應(yīng)當(dāng)對(duì)生物樣品，例如糞便、器 官、牛奶和組織樣品來(lái)說(shuō)是可操作的，并且無(wú)需進(jìn)行大量的需要長(zhǎng)達(dá)16周的時(shí)間或處理步 驟的預(yù)培養(yǎng)。
[0010] 此外，該方法應(yīng)能允許適當(dāng)?shù)淖詣?dòng)化?，F(xiàn)有技術(shù)中描述的方法則不允許。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 在一方面，本申請(qǐng)涉及用于在來(lái)自個(gè)體的樣品中特異性檢測(cè)或定量鳥(niǎo)分枝桿菌亞 種副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium spp.paratuberculosis) (MAP)的方法。為此， 根據(jù)本發(fā)明的方法包括通過(guò)核酸擴(kuò)增在樣品中檢測(cè)MAP基因組的IS900域（IS90〇region) 的步驟，其中該擴(kuò)增利用分別由根據(jù)Seq. IDNo.1和Seq. IDNo.2序列的至少15個(gè)連續(xù)的 核苷酸組成的特異性寡核苷酸來(lái)進(jìn)行，并且至少一個(gè)MAP基因組的IS900域的檢測(cè)指示了 樣品中MAP的存在。
[0012] 然后發(fā)現(xiàn)了如本文所用的特異性寡核苷酸，即分別具有根據(jù)Seq. ID No. 1和Seq. ID No. 2的序列的至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸的寡核苷酸，這在基于一種核酸擴(kuò)增的診斷方法 中實(shí)現(xiàn)了針對(duì)MAP的出色的特異性和靈敏度。
[0013] 本文優(yōu)選的是根據(jù)Seq. ID No. 1和/或Seq. ID No. 2的彼此獨(dú)立的寡核苷酸，所述 寡核苷酸具有這兩個(gè)序列的至少16個(gè)，例如17個(gè)或18個(gè)連續(xù)的，并且特別是至少19個(gè)核 苷酸。更優(yōu)選的是根據(jù)Seq. ID No. 1和/或Seq. ID No. 2的特異性寡核苷酸的至少一種， 其具有所述序列的至少11、12、13、14、15個(gè)，特別是至少16、17、18、19個(gè)或全部核苷酸。清 楚的是，還包括其中一種寡核苷酸例如具有根據(jù)Seq. ID No. 1的序列的至少18個(gè)核苷酸以 及根據(jù)Seq. ID No. 2序列的至少19個(gè)核苷酸的實(shí)施方式。每一種變化均被包括在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。
[0014] 所述核酸擴(kuò)增方法優(yōu)選為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。其可特別為實(shí)時(shí)PCR。所述PCR 例如為實(shí)時(shí)PCR的形式，特別為定量PCR。
[0015] 相對(duì)于同樣基于PCR的已知方法，使用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物對(duì)（primer pair)，可以在一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中獲得有意義的結(jié)果。此前已知的方法往往依賴于所謂的"巢 式"（"nested"）或"半巢式PCR"（ "semi-nested PCR"）方法。在這些方法中，擴(kuò)增發(fā)生 在兩個(gè)步驟中，即所述方法需要較長(zhǎng)的時(shí)間并且比單一步驟的方法更加昂貴。實(shí)時(shí)PCR的 其它優(yōu)點(diǎn)是MAP DNA的定量的可能性、低污染風(fēng)險(xiǎn)的快速操作以及高靈敏度和特異性的保 證。
[0016] 尤其優(yōu)選的是，在核酸擴(kuò)增中，例如PCR，特別是實(shí)時(shí)PCR，且尤其優(yōu)選地在定量 PCR中，通過(guò)核酸探針來(lái)實(shí)現(xiàn)IS900域的檢測(cè)。這種核酸探針是通常標(biāo)記有標(biāo)簽或標(biāo)記的寡 核苷酸，所述標(biāo)簽或標(biāo)記雜交至MAP基因組的IS900域和/或與MAP基因組的IS900域互 補(bǔ)的核酸。
[0017] 本文中，雜交被理解為核酸分子諸如核酸探針附著至至少一種另外的核酸分子 (此處為經(jīng)擴(kuò)增的基因片段），其中在附著區(qū)域兩個(gè)單獨(dú)的鏈實(shí)質(zhì)上完全互補(bǔ)。還可在核 酸探針和存在的雙鏈DNA之間形成三螺旋。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已知有公知的雜交方 法。特別地，雜交區(qū)域至少70%，例如至少75%，特別是至少80%，優(yōu)選至少90%，例如至 少95 %，特別是至少99 %互補(bǔ)，例如完全互補(bǔ)。
[0018] 在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸為具有根據(jù)Seq. ID No. 3的至少15個(gè)連續(xù)的核苷 酸的寡核苷酸。優(yōu)選的是，探針為具有根據(jù)Seq. ID No. 3的至少16、17或18個(gè)連續(xù)的核苷 酸的寡核苷酸，優(yōu)選具有19個(gè)核苷酸，例如具有20個(gè)核苷酸的Seq. ID No. 3序列本身。 [0019] 此處，以允許用已知方法來(lái)進(jìn)行簡(jiǎn)單檢測(cè)的常規(guī)方式標(biāo)記探針。常規(guī)的標(biāo)簽或標(biāo) 記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如熒光染料如FAM (5-或6-羧基熒光素）、VIC、NID、熒光素、 異硫氰酸突光素（fluorescein isothiocyanate) (FITC)、6_ 羧基-2'，4'，7'，4, 7-六氯突 光素（6-carboxy_2,，4，，7，，4, 7-hexa-chlorofluorescein)，花青染料（cyanine dyes) 如Cy3，Cy5等，若丹明染料（rhodamine dyes)，菲陡染料（phenanthridine dyes)以及本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的其它染料。特別適用于探針檢測(cè)的是FAM和黑洞淬滅劑-1 (black hole quencher-1)(BHQ1)。
[0020] 對(duì)于特定的核酸擴(kuò)增法，例如PCR、實(shí)時(shí)PCR以及特別是定量PCR來(lái)說(shuō)，合適的染料 與合適的擴(kuò)增系統(tǒng)的結(jié)合是本