用于鑒定能夠誘導(dǎo)呼吸道致敏的物質(zhì)的方法和用于該方法中的陣列和分析試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于鑒定能夠誘導(dǎo)呼吸道致敏的物質(zhì)的方法和用于該方法 中的陣列和分析試劑盒 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于鑒定能夠誘導(dǎo)呼吸道致敏（respiratory sensitization)的物質(zhì) (agent)的方法以及用于所述方法中的陣列和分析試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 通常，將過(guò)敏定義為在對(duì)其他方面無(wú)害的抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答后呈現(xiàn)的不良狀態(tài)。 它是稱(chēng)為超敏反應(yīng)的一類(lèi)結(jié)果中的成員，將超敏反應(yīng)定義為導(dǎo)致組織損傷的有害免疫應(yīng)答 (Janeway, C. , Travers, P. , Hunt, S. , ffalport, M. , 1997. Allergy and hypersensitivity. ImmunoBiology:The Immune System in Health and Disease. Garland Publishing, New York)。所導(dǎo)致的工業(yè)毒理學(xué)家特別關(guān)注的病癥包括呼吸道過(guò)敏和過(guò)敏性接觸性皮炎 (A⑶）。呼吸道過(guò)敏是上和/或下呼吸道對(duì)異生物體（xenobiotic)的超敏反應(yīng)。這種超敏 反應(yīng)是即時(shí)的，具有在異生物體暴露后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生的臨床特征，并且可以包括 喘息、氣促、胸悶、支氣管收縮和/或鼻充血。在極端情況中，反應(yīng)可以引發(fā)低血壓和致命的 過(guò)敏反應(yīng)。在一般的人群中，呼吸道過(guò)敏最常見(jiàn)是由環(huán)境蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的，所述環(huán)境蛋白質(zhì)包 括花粉、塵螨排泄物和動(dòng)物毛肩。然而，在職業(yè)環(huán)境中，呼吸道過(guò)敏可以由工業(yè)化合物引起， 所述工業(yè)化合物包括高分子量（HMW)化合物，如蛋白質(zhì)去污劑，以及低分子量（LMW)化學(xué) 品。由于它們的小尺寸，LMW化學(xué)變應(yīng)原作為半抗原，其首先與蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成復(fù)合物，然 后其能夠啟動(dòng)免疫應(yīng)答。
[0003] 呼吸道對(duì)HMW和LMW化合物的過(guò)敏的發(fā)展可以歸因于職業(yè)性哮喘的產(chǎn)生，職業(yè) 性哮喘的特征在于由于歸因于特定工作環(huán)境的誘因和條件引起的可變氣流限制和/或非 特異性的支氣管超反應(yīng)性（Chan-Yeung，M.，Malo，J.L.，1994. Aetiological agents in occupational asthma.Eur. Respir. J. 7, 346-371 ；Karol,M. H. , 1994. Animal models of occupational asthma. Eur. Respir. J. 7, 555-568)。重要的是注意到除了這種免疫病因?qū)W 之外，非免疫原性物質(zhì)，如刺激物，也在職業(yè)性哮喘的發(fā)展中起著重要作用。在許多情況中， 共同暴露于變應(yīng)原和刺激物引起了病癥。臨床研宄已經(jīng)表明了高達(dá)20%的成人發(fā)作哮喘 是由職業(yè)因素引起的，并且這些病例中的90%涉及免疫學(xué)機(jī)理（Mapp，C. E.，2005. Genetics and the occupational environment. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 5, 113 - 118)〇此 外，職業(yè)性哮喘是發(fā)達(dá)國(guó)家中最普遍的職業(yè)性肺病。因此，具有作為呼吸道變應(yīng)原的潛能的 化合物的鑒定和表征對(duì)于工業(yè)毒理學(xué)家而言是一個(gè)重要的研宄領(lǐng)域。
[0004] 不是所有引起特定免疫應(yīng)答的化合物都將具有引起呼吸道超敏性的潛能。較 大數(shù)量的化合物與皮膚超敏性和ACD的發(fā)展相關(guān)，并且認(rèn)為對(duì)呼吸道不具有致敏作用 (Kimber,I. , Dearman, R. J. , 2005. What makes a chemical a respiratory sensitizer ? Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 5, 119-124)。與呼吸道過(guò)敏不同，ACD 是由細(xì)胞介導(dǎo) 的免疫應(yīng)答引起的延遲型超敏反應(yīng)的實(shí)例（Janeway等，1997,上文）。A⑶是最常見(jiàn)的職 業(yè)病之一，其中多種化合物成為病原體，因此，這些化合物的主動(dòng)鑒定和表征也是相當(dāng)重要 的（Saary, J.，Qureshi, R.，Palda, V.，DeKoven, J.，Pratt, M.，Skotnicki-Grant, S.，Holnes s,L. , 2005. A systematic review of contact dermatitis treatment and prevention. J. Am. Acad. Dermatol. 53, 845) 〇
[0005] 導(dǎo)致呼吸道過(guò)敏或ACD的超敏性的發(fā)展由兩個(gè)截然不同的階段組 成。第一個(gè)是致敏，其涉及免疫狀況的發(fā)展，而第二個(gè)是激發(fā)，其導(dǎo)致過(guò)敏的臨 床呈現(xiàn)(Briatico-Vangosa, G. , Braun, C. L. , Cookman, G. , Hofmann, T. , Kimber, I. , Loveless, S. E. , Morrow, T. , Pauluhn, J. , Sorensen, T. , Niessen, H. J. , 1994. Respiratory allergy:hazard identification and risk assessment. Fundam.Appl. Toxicol. 23, 145 - 158)。因此，之前未暴露的（未免疫（naive))但易感個(gè)體沒(méi)有經(jīng)歷他 們第一次暴露于過(guò)敏性蛋白質(zhì)或化學(xué)品時(shí)的過(guò)敏癥狀。最少，需要兩次暴露；然而，在許 多情況中，可能需要在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)的重復(fù)暴露。在易感個(gè)體初次遭遇過(guò)敏性化合物的過(guò) 程中，化合物被樹(shù)突細(xì)胞（抗原加工和呈遞細(xì)胞）識(shí)別為外來(lái)物，呈遞給T細(xì)胞，并且引起 特定的原發(fā)性免疫應(yīng)答，這導(dǎo)致致敏。這接著可能是致敏的個(gè)體隨后暴露于相同化合物時(shí) 過(guò)敏的實(shí)際激發(fā)。激發(fā)通過(guò)免疫應(yīng)答的激活和所得到的細(xì)胞信號(hào)來(lái)介導(dǎo)，所述細(xì)胞信號(hào) 導(dǎo)致炎性反應(yīng)和過(guò)敏癥狀。過(guò)敏反應(yīng)的性質(zhì)和嚴(yán)重程度取決于各種因素，包括個(gè)體的遺 傳背景、變應(yīng)原的特征以及致敏和激發(fā)階段過(guò)程中暴露的途徑、持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度（Arts，J. H. , Kuper, C. , 2003. Approaches to induce and elicit respiratory allergy:impact of route and intensity of exposure. Toxicol.Lett. 140 - 141, 213 - 222 ；Arts, J. H. ,Mommers, C. , de Heer, C. , 2006. Dose - response relationships and threshold levels in skin and respiratory allergy. Crit. Rev. Toxicol. 36, 219 - 251)〇
[0006] 盡管存在一些一般性的相似性，但在目前了解的呼吸道過(guò)敏和A⑶的病因?qū)W中存 在重要的機(jī)理差異。通常，將呼吸道過(guò)敏歸類(lèi)為涉及IgE的I型超敏反應(yīng)，而A⑶是由T細(xì) 胞介導(dǎo)的IV型超敏反應(yīng)（Janeway等，1997,上文）。認(rèn)為這些超敏性是根據(jù)特定的機(jī)理發(fā)展 的，所述機(jī)理取決于T輔助（Th)細(xì)胞的功能性亞群（即，Thl和Th2細(xì)胞）的不同激活。呼吸 道致敏和過(guò)敏的發(fā)展與T淋巴細(xì)胞的Th2群的優(yōu)先誘導(dǎo)相關(guān)。Th2細(xì)胞的特征在于大量白細(xì) 胞介素（IL) _4、-10和-13的產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生有利于體液免疫功能以及B細(xì)胞的 刺激和分化，以產(chǎn)生 IgE(綜述于 Dearman, R. J.，Betts, C. J.，Humphreys, N.，F(xiàn)lanagan, B. F. ,Gilmour, N. J. , Basketter, D. A. , Kimber, I. , 2003. Chemical allergy:considerations for the practical application of cytokine profiling. Toxicol. Sci. 71, 137 - 145) 〇 這些抗體結(jié)合肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面上的受體。在隨后暴露于變應(yīng)原時(shí)，這些 細(xì)胞釋放各種炎性介質(zhì)，包括組胺、白細(xì)胞三烯和細(xì)胞因子，這導(dǎo)致了呼吸道過(guò)敏的即 時(shí)超敏性。除了促進(jìn)IgE產(chǎn)生，Th2細(xì)胞因子還促進(jìn)呼吸道過(guò)敏中涉及的其他細(xì)胞的 生長(zhǎng)和分化，包括肥大細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞（綜述于Kimber, I.，1996. Chemical-induced hypersensitivity.見(jiàn):Smialowicz, R. J. , Holsapple, M. P. (Eds. ), Experimental Immunotoxicology. CRC Press, New York, pp. 391 - 417)。在重復(fù)暴露于過(guò)敏性化合物和呼 吸道過(guò)敏激發(fā)時(shí)，可能發(fā)展大范圍的氣道重塑、粘液積聚和慢性炎性應(yīng)答，這引起了哮喘癥 狀的發(fā)展。
[0007] 相反，接觸性致敏和A⑶的發(fā)展主要與T淋巴細(xì)胞的Thl群的誘導(dǎo)相關(guān)。這些細(xì)胞 的特征在于IL-2、干擾素-y(IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF-0)的產(chǎn)生。研宄者已經(jīng) 表明延遲型接觸性超敏性的發(fā)展特異地依賴(lài)于Thl細(xì)胞和IFN-0的產(chǎn)生（Diamantstein， T., Eckert, R. , Volk, H. D. , Kupier-ffeglinski, J. ff., 1988. Reversal by interferon-gamma of inhibition of delayed-type hypersensitivity induction by anti_CD4or anti-interleukin 2receptor (CD25)monoclonal antibodies. Evidence for the physiological role of the CD4+THl+subset in mice. Eur. J. Immunol. 18, 2101-2103)〇 致敏應(yīng)答與記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生相關(guān)，在隨后遭遇抗原時(shí)激活了記憶T細(xì)胞，導(dǎo)致了超敏性 應(yīng)答。這種反應(yīng)涉及角質(zhì)化細(xì)胞的激活和促炎細(xì)胞因子的釋放，以募集非抗原特異性T細(xì) 胞和單核細(xì)胞至接觸部位，這導(dǎo)致急性炎性應(yīng)答。有趣的是，Thl細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-y也對(duì) 抗Th2細(xì)胞應(yīng)答和IgE的產(chǎn)生，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4對(duì)抗Thl細(xì)胞的發(fā)展。此外，已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)了 IFN-y在呼吸道過(guò)敏中抑制肥大細(xì)胞功能，而IL-4抑制A⑶的激發(fā)階段（綜述于 Kimber，1996上文）。因此，不僅每種Th細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞因子促進(jìn)它們譜系的生長(zhǎng)和分化 以及隨后的超敏性應(yīng)答，它們還對(duì)抗其他細(xì)胞群的增殖，作為進(jìn)一步指引免疫應(yīng)答的方式。
[0008] 從危險(xiǎn)評(píng)價(jià)和調(diào)控觀點(diǎn)看，以上呼吸道過(guò)敏和A⑶之間的區(qū)別是相當(dāng)重要的。研 宄者已經(jīng)探宄了多種動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)方法來(lái)鑒定具有引起呼吸道過(guò)敏潛能的化合物，然 而，沒(méi)有一種方法被研宄團(tuán)體或管理機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用或完全接受（Arts等，2006上文）。相反， 存在多種指導(dǎo)測(cè)定，用于檢測(cè)具有引起接觸性致敏和ACD潛能的化合物。鑒于呼吸道過(guò)敏 和ACD中致敏應(yīng)答的一般性相似性，已經(jīng)表明用于鑒定接觸性致敏潛能的模型也可以用于 呼吸道過(guò)敏潛能的評(píng)價(jià)。然而，由于已知的機(jī)理差異以及歸類(lèi)為呼吸道變應(yīng)原更嚴(yán)重的健 康和調(diào)控問(wèn)題，這些化合物的精確鑒定及其與誘導(dǎo)ACD的化合物的區(qū)別是至關(guān)重要的。需 要的是一致的、系統(tǒng)的和公認(rèn)的用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)和化合物的呼吸道過(guò)敏潛能的方法。
[0009] 呼吸道過(guò)敏是上呼吸道和下呼吸道對(duì)異生物體蛋白質(zhì)或化學(xué)品的I型超敏反 應(yīng)，其中臨床癥狀通常包括喘息、氣促、支氣管收縮和哮喘攻擊（Boverhof DR，Billington R,Gollapudi BB,Hotchkiss JA, Krieger SM 等(2008)Respiratory sensitization and allergy:current research approaches and needs.Toxicol Appl Pharmacol 226:1-13)。機(jī)械地，呼吸道過(guò)敏與Th2細(xì)胞的誘導(dǎo)和提高的B細(xì)胞的IgE產(chǎn)生相關(guān)。由 效應(yīng)器粒細(xì)胞（如，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞）上IgE/變應(yīng)原復(fù)合物引起的Fc e R:s的 交聯(lián)導(dǎo)致促炎分子的釋放（Boverhof 等，2008，上文；Banks DE，Tarlo SM(2000) Important issues inoccupational asthma. Curr Op in Pulm Med 6:37-42 ;Sastre J, Vandenplas 0,Park HS(2003)Pathogenesis of occupational asthma. Eur Respir J 22:364-373)〇 通常，I型超敏反應(yīng)通過(guò)蛋白質(zhì)變應(yīng)原來(lái)引發(fā)，而低分子量化合物具有誘導(dǎo)過(guò)敏性接觸 性皮炎（A⑶）的傾向，A⑶是主要與Thl和⑶8+效應(yīng)器細(xì)胞的誘導(dǎo)相關(guān)的IV型超敏 反應(yīng)。然而，各種化學(xué)品，如二異氰酸醋（Zammit-Tabona M，Sherkin M，Kijek K，Chan H, Chan-Yeung M(1983)Asthma caused by diphenylmethane diisocyanate in foundry workers. Clinical, bronchial provocation, and immunologic studies. Am Rev Respir Dis 128:226-230)、酸酐（Bernstein DI, Patterson R，Zeiss CR(1982)Clinical and immunologic evaluation of trimellitic anhydride-and phthalic anhydride-exposed workers using a questionnaire with comparative analysis of enzyme-linked immunosorbent and radioimmunoassay studies. J Allergy Clin Immunol 69:311-318)、 鉬鹽（Murdoch RD，Pepys J, Hughes EG (1986) IgE antibody responses to platinum group metals:a large scale refinery survey. Br J Ind Med 43:37-43)、反應(yīng)性染料（Docker A, Wattie JM，Topping MD, Luczynska CM, Newman Taylor AJ，等(1987)Clinical and immunological investigations of respiratory disease in workers using reactive dyes. Br J Ind Med 44:534-541)和氯胺T(Bourne MS，F(xiàn)lindt ML，Walker JM(1979)Asthma due to industrial use of chloramine. Br Med J 2:10-12)可能誘導(dǎo)呼吸道致敏，結(jié)果產(chǎn) 生職業(yè)性哮喘和鼻炎。與引起接觸性皮炎的那些相比，已知較少數(shù)的化學(xué)品引起呼吸道過(guò) 敏，然而，健康影響仍然是很糟糕的，因?yàn)槠淇梢耘c致命的結(jié)果相關(guān)。盡管臨床特征與對(duì)蛋 白質(zhì)的過(guò)敏反應(yīng)的那些相似，但應(yīng)答的性質(zhì)常常仍然是未知的。
[0010] REACH(化學(xué)品的注冊(cè)、評(píng)估和授權(quán)（Registration，Evaluation，and Authorisation of Chemicals))法規(guī)要求歐盟內(nèi)所有新的和現(xiàn)有的化學(xué)品（涉及大約 30000 種化學(xué)品）應(yīng)當(dāng)測(cè)試有害影響（Johansson H，Lindstedt M，Albrekt AS，Borrebaeck CA:A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics 2011，12:399)〇 因 為潛在的致敏劑的鑒定目前需要?jiǎng)游餃y(cè)試，REACH立法將對(duì)測(cè)試需要的動(dòng)物數(shù)量具有巨大 影響。此外，2009年生效的化妝品法第7次修正案對(duì)于人使用的大部分化妝品成分的動(dòng)物 測(cè)試提出了禁止，除了一些在2013年的測(cè)試之外。因此，可靠的用于評(píng)價(jià)化學(xué)品致敏能力 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體外替代方法的研發(fā)是迫切的。
[0011] 用于誘導(dǎo)呼吸道致敏的化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的方法的發(fā)展是非常不充分的，迄 今為止沒(méi)有可用的得到驗(yàn)證的試驗(yàn)（Verstraelen S，Bloemen K，Nelissen I，Witters H，Schoeters G 等（2008)Cell types involved in allergic asthma and their use in in vitro models to assess respiratory sensitization. Toxicol In Vitro 22:1419-1431) ^為了這一目的設(shè)計(jì)的主要體內(nèi)測(cè)定是小鼠IgE測(cè)試（Dearman RJ，Basketter DA，Kimber I (1992)Variable effects of chemical allergens on serum IgE concentration in mice. Preliminary evaluation of a novel approach to the identification of respiratory sensitizers. J Appl Toxicol 12:317-323 ;Dearman RJ，Skinner RA, Humphreys NE，Kimber I(2003)Methods for the identification of chemical respiratory allergens in rodents:comparisons of cytokine profiling with induced changes in serum IgE. J Appl Toxicol 23:199-207) 〇 盡管顯亦出 具有前景的初期結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室間的再現(xiàn)性不足以正式地驗(yàn)證該測(cè)定，并且目前沒(méi)有常 規(guī)地使用。然而，進(jìn)行了嘗試來(lái)研發(fā)基于細(xì)胞的用于呼吸道致敏的測(cè)定，使用樹(shù)突細(xì) 胞系，如 THP-1(Verstraelen S，Nelissen I，Hooyberghs J，Witters H，Schoeters G 等（2009)Gene profiles of THP-lmacrophages after in vitro exposure to respiratory(non-)sensitizing chemicals:identification of discriminating genetic markers and pathway analysis. Toxicol In Vitro 23:1151-1162.)以及上皮 細(xì)胞系，如 BEAS_2B(Verstraelen S，Nelissen I，Hooyberghs J，Witters H，Schoeters G 等（2009)Gene profiles of a human bronchial epithelial cell line after in vitro exposure to respiratory (non-)sensitizing chemic