本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種基于基因捕獲和二代測(cè)序技術(shù)的脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)試劑盒。此外，本發(fā)明還涉及一種基于基因捕獲和二代測(cè)序技術(shù)的脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)方法。該方法采用目標(biāo)區(qū)域捕獲和二代測(cè)序，并涉及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用于估算脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因的拷貝數(shù)。
背景技術(shù)：
：脊髓型肌肉萎縮癥(Spinalmuscularatrophy,SMA)是一類由脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化導(dǎo)致肌萎縮的疾病。根據(jù)患者的發(fā)病率和臨床表現(xiàn)，SMA可分為四類：I型(嚴(yán)重型)、II型(中間型)、III型(輕型)和IV型(成人型)。SMA為常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率為1/5000-1/10000，高居致死性常染色體遺傳病的第二位，攜帶者頻率為1/35-1/80。一般正常人的第五號(hào)染色體有兩個(gè)高度同源的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因(survivalmotorneurongene，SMN)，即靠近染色體末端的SMN1基因和靠近著絲粒的SMN2基因。SMN1和SMN2包括9個(gè)外顯子：1，2a，2b，3～8，但只有外顯子7和8上的兩個(gè)核苷酸(外顯子7：c.840C>T，外顯子8：c.*239G>A)可以區(qū)分SMN1和SMN2。此外，外顯子7上下游還各有一個(gè)堿基(c.835-44G>A，c.*3+100A>G)可以區(qū)分SMN1和SMN2。外顯子7上單個(gè)堿基的差異影響SMN2基因的RNA剪切，使得轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA缺少外顯子7，進(jìn)而導(dǎo)致翻譯出來(lái)的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。SMN2的主要功能就是對(duì)SMN1的有限補(bǔ)償。95％～98％的患者可以檢測(cè)出SMN1基因的外顯子7發(fā)生純合性缺失(homozygousdeletion)，而另外約2.5％的患者是由點(diǎn)突變所導(dǎo)致。SMA攜帶者只有一個(gè)拷貝的SMN1外顯子7，雖然自己不會(huì)發(fā)病，但如果父母雙方均為攜帶者，那么其子代有25％可能性發(fā)病。所以，對(duì)人SMN1的外顯子7拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)，有助于臨床相關(guān)疾病的診斷以及新生兒SMA出生缺陷預(yù)防；而SMN2外顯子7拷貝數(shù)的檢測(cè)，則有助于判斷SMA患者的嚴(yán)重程度，例如SMN2拷貝數(shù)大于2的患者的病情相對(duì)較輕。目前針對(duì)SMN1/2點(diǎn)突變導(dǎo)致脊髓型肌肉萎縮癥或其攜帶者，有專利(專利號(hào)CN105112541A)在IonTorrent平臺(tái)上采用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)SMN1/2上的點(diǎn)突變，但該二代測(cè)序方法(擴(kuò)增子測(cè)序)由于PCR的偏好性會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序深度不均一，且對(duì)于堿基多聚體(homopolyer)和插入缺失有較高的測(cè)序錯(cuò)誤率，因而不能有效地用來(lái)檢測(cè)SMN1/2的拷貝數(shù)變異。而針對(duì)SMN1外顯子缺失的基因檢測(cè)技術(shù)則包括：PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP，比如文獻(xiàn)vanderSteegeG.etc.Lancet.1995,345:985-986)、變性高效液相色譜分析(DHPLC，專利號(hào)CN1769486A)、多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MLPA)、定量PCR技術(shù)(專利號(hào)CN103789440A、CN104480206A)和三代測(cè)序(專利號(hào)CN104762398A)等。但是，PCR-RFLP只能檢測(cè)純合性缺失，而MLPA和定量PCR技術(shù)對(duì)于存在點(diǎn)突變的樣本會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。而基于三代測(cè)序檢測(cè)SMA拷貝數(shù)方法，目前費(fèi)用較高且通量較小。另外，用于區(qū)分SMN1和SMN2外顯子7的位點(diǎn)相隔較近(小于200bp)，二代測(cè)序技術(shù)的讀長(zhǎng)足以用于涵蓋這些位點(diǎn)以檢測(cè)SMN1和SMN2拷貝數(shù)變化。2017年，F(xiàn)engYM等人基于雜交捕獲和二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種SMN1/2拷貝數(shù)檢測(cè)方法(Genet.Med.,2017,doi:10.1038/gim.2016.215)。該方法基于SMN1/2的測(cè)序深度和同一批次樣本的歸一化處理，根據(jù)外顯子7上的單個(gè)堿基(c.840C>T)區(qū)分SMN1和SMN2，檢測(cè)兩個(gè)基因的拷貝數(shù)變異。由于FengYM的方法僅利用一個(gè)外顯子區(qū)域的差異位點(diǎn)，且只使用同一批次的數(shù)據(jù)對(duì)新樣本進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)，對(duì)于小樣本批次的檢測(cè)準(zhǔn)確度會(huì)有較大的波動(dòng)，且不能有效地利用歷史累積數(shù)據(jù)提高檢測(cè)方法的精確度。本發(fā)明充分利用基因捕獲(genecapture-basedsequencing)的技術(shù)克服擴(kuò)增子測(cè)序(AmpliconSequencing)所帶來(lái)的測(cè)序不均一問(wèn)題，且采用錯(cuò)誤率更低、穩(wěn)定性更好、通量更大的Illumina二代測(cè)序平臺(tái)獲取目標(biāo)基因的序列信息，并結(jié)合自己開(kāi)發(fā)的針對(duì)脊髓型肌肉萎縮癥(SMA)高度同源的兩個(gè)基因(SMN1和SMN2)的獨(dú)特算法流程，可有效的檢測(cè)出SMN1/2的7號(hào)外顯子的純合性缺失、雜合性缺失和拷貝數(shù)的增多。同時(shí)，本發(fā)明對(duì)于SMN1/2的7號(hào)外顯子拷貝數(shù)變化檢測(cè)，有較高的健壯性、敏感性和特異性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于基因捕獲和二代測(cè)序技術(shù)的脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，用于解決現(xiàn)有方法測(cè)序深度不均一、錯(cuò)誤率較高、穩(wěn)定性不好、通量較小等問(wèn)題。為此，本發(fā)明還提供該基于基因捕獲和二代測(cè)序技術(shù)的脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，用于解決SMN1和SMN2基因高度同源性以及外顯子拷貝數(shù)變化多樣性問(wèn)題。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：在本發(fā)明的一方面，提供本發(fā)明公開(kāi)了一種基于基因捕獲和二代測(cè)序技術(shù)的脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，包括捕獲探針，所述捕獲探針由以下4個(gè)主要探針和相關(guān)對(duì)照探針組成；4個(gè)主要探針為：用于捕獲SMN2基因外顯子7的探針一，其序列如SEQIDNO:1所示；用于捕獲SMN2基因外顯子7的探針二，其序列如SEQIDNO:2所示；用于捕獲SMN1基因外顯子7的探針三，其序列如SEQIDNO:3所示；用于捕獲SMN1基因外顯子7的探針?biāo)?，其序列如SEQIDNO:4所示；所述捕獲探針對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲，測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)分析估算SMN1基因和SMN2基因外顯子7的拷貝數(shù)。所述相關(guān)對(duì)照探針可以為安捷倫ClearSeq探針組(一種捕獲試劑)或定制化的探針組等本領(lǐng)域常用對(duì)照探針。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述數(shù)據(jù)分析包括將測(cè)序讀段使用比對(duì)軟件比對(duì)到人參考基因組、去除重復(fù)序列、去除比對(duì)結(jié)果不可信的讀段，計(jì)算Z-score，根據(jù)Z-score值來(lái)估算SMN1基因和SMN2基因外顯子7的拷貝數(shù)。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述去除重復(fù)序列具體使用Picard去除PCR擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生的重復(fù)序列。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述比對(duì)結(jié)果不可信的讀段為不涵蓋任何一個(gè)如下所述用于區(qū)分分配到SMN1和SMN2外顯子7的位點(diǎn)的讀段：染色體chr5，坐標(biāo)69372304，SMN2基因，外顯子7上游44bp，核苷酸A；染色體chr5，坐標(biāo)69372353，SMN2基因，外顯子7，核苷酸T；染色體chr5，坐標(biāo)69372501，SMN2基因，外顯子7下游100bp，核苷酸G；染色體chr5，坐標(biāo)70247724，SMN1基因，外顯子7上游44bp，核苷酸G；染色體chr5，坐標(biāo)70247773，SMN1基因，外顯子7，核苷酸C；染色體chr5，坐標(biāo)70247921，SMN1基因，外顯子7下游100bp，核苷酸A。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述計(jì)算Z-score具體包括如下步驟：步驟1，計(jì)算覆蓋深度：將目標(biāo)捕獲區(qū)域劃分為固定長(zhǎng)度的區(qū)間，并計(jì)算每個(gè)區(qū)間的平均覆蓋深度；所述覆蓋深度是指分配至所述區(qū)間的讀段數(shù)目與該區(qū)間大小的比值；步驟2，標(biāo)準(zhǔn)化覆蓋深度：標(biāo)準(zhǔn)化是相對(duì)于同一個(gè)樣本所有區(qū)間(SMN1和SMN2外顯子7和其它相關(guān)對(duì)照探針?biāo)东@的區(qū)間)進(jìn)行計(jì)算的，公式如下：步驟3，GC(鳥嘌呤胞嘧啶)含量矯正：去除由于GC含量差異而造成的測(cè)序結(jié)果偏差，公式如下：步驟4，計(jì)算Z-score：對(duì)于一批樣本中的每個(gè)樣本，按如下公式計(jì)算Z-score：其中，Zi，j表示第j個(gè)樣本的外顯子i的Z-score值，normRD′i，j為第j個(gè)樣本外顯子i經(jīng)步驟3計(jì)算得到的覆蓋深度，和SD(normRD′i)分別為該批樣本外顯子i校正后覆蓋深度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述根據(jù)Z-score值來(lái)估算SMN1基因和SMN2基因外顯子7的拷貝數(shù)具體為：基于表型已知樣本，習(xí)得SMN1基因和SMN2基因外顯子7拷貝數(shù)和計(jì)算得到的Z-score之間的關(guān)系：copynumber＝f(Z)根據(jù)該關(guān)系，估算待測(cè)樣本的SMN1基因和SMN2基因外顯子7的拷貝數(shù)。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述SMN1基因拷貝數(shù)判斷形式如下：所述SMN2基因拷貝數(shù)判斷形式如下：如上為基于已有數(shù)據(jù)訓(xùn)練得到的閾值，作為缺省值；隨著數(shù)據(jù)的累積，進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，提供檢測(cè)準(zhǔn)確度。在本發(fā)明的另一方面，提供一種使用上述試劑盒檢測(cè)脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因拷貝數(shù)的方法，該方法不包括疾病的診斷方法，該方法包括如下步驟：1)從樣本中提取DNA和打斷；2)目標(biāo)區(qū)域捕獲：采用所述捕獲探針對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲，磁珠分離富集，PCR進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；3)測(cè)序；4)通過(guò)數(shù)據(jù)分析估算脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因的拷貝數(shù)。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟1)中，所述樣本是血液或唾液；所述打斷采用超聲波對(duì)提取的DNA進(jìn)行打斷，打斷后末端補(bǔ)平并磷酸化，兩側(cè)加上接頭。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟3)中，所述測(cè)序具體為：測(cè)序文庫(kù)的DNA片段被雜交到測(cè)序儀的流動(dòng)槽(flowcell)上并以之為模板生長(zhǎng)DNA簇，然后用IlluminaHiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：1)本發(fā)明充分利用基因捕獲(capture-based)的技術(shù)克服擴(kuò)增子測(cè)序(AmpliconSequencing)所帶來(lái)的測(cè)序不均一問(wèn)題。2)本發(fā)明采用了Illumina二代測(cè)序平臺(tái)，使得獲得的目標(biāo)基因序列信息錯(cuò)誤率更低、穩(wěn)定性更好、通量更大。3)本發(fā)明通過(guò)捕獲測(cè)序結(jié)合數(shù)據(jù)分析檢測(cè)SMN1和SMN2外顯子7拷貝數(shù)變異(缺失、正常、增加)，不受檢測(cè)區(qū)域堿基突變的影響，結(jié)果健壯性更好。4)針對(duì)SMN1和SMN2外顯子7及其上下游三個(gè)差異堿基設(shè)計(jì)捕獲探針，可更可信地將測(cè)序讀段分配到相應(yīng)的基因，使得結(jié)果特異性更強(qiáng)。5)基于Z-score的檢測(cè)SMN1和SMN2外顯子7拷貝數(shù)的方法，可有效利用歷史累積數(shù)據(jù)，提高檢測(cè)敏感性。6)本發(fā)明公開(kāi)的基于二代捕獲測(cè)序的拷貝數(shù)檢測(cè)方法，可以便捷地和其它基于捕獲測(cè)序的點(diǎn)突變或插入缺失檢測(cè)方法進(jìn)行整合，減少取樣量。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中SMN1基因和SMN2基因外顯子7及其上下游示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中SMN1和SMN2的外顯子7及其上下游每個(gè)堿基的覆蓋情況示意圖。三個(gè)差異堿基都有較好的測(cè)序覆蓋深度。圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中參考樣本的SMN1/2外顯子7的Z-score值聯(lián)合分布示意圖。細(xì)直線、細(xì)虛線、粗直線、粗細(xì)線分別表示用于判斷純合性缺、雜合性缺失、拷貝數(shù)正常、拷貝數(shù)增加(≥3)的Z-score值取值范圍。三角形(▲)表示一個(gè)實(shí)施方案中SMN1外顯子7發(fā)生雜合性缺失，而SMN2外顯子7拷貝數(shù)正常。圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中參考樣本的SMN1基因外顯子的Z-score值分布示意圖。細(xì)直線、細(xì)虛線、粗直線、粗細(xì)線分別表示用于判斷純合性缺、雜合性缺失、拷貝數(shù)正常、拷貝數(shù)增加(≥3)的Z-score值取值范圍。圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中參考樣本的SMN2基因外顯子的Z-score值分布示意圖。細(xì)直線、細(xì)虛線、粗直線、粗細(xì)線分別表示用于判斷純合性缺、雜合性缺失、拷貝數(shù)正常、拷貝數(shù)增加(≥3)的Z-score值取值范圍。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但這些實(shí)施例只是用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1樣本測(cè)序(從樣品中獲得多核苷酸片段的序列信息)通過(guò)如下幾個(gè)步驟對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序：1)DNA提取和打斷。所用樣本可以是血液也可以是唾液。DNA提取、純化，采用超聲波對(duì)提取的DNA進(jìn)行打斷，末端補(bǔ)平并磷酸化，兩側(cè)加上接頭。2)目標(biāo)區(qū)域捕獲。本方法使用專門設(shè)計(jì)的捕獲探針對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲，磁珠分離富集，PCR進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。此處，目標(biāo)區(qū)域包括SMN1/2和其它一些基因的外顯子及其上下游一定范圍內(nèi)的堿基。其中，SMN1/2外顯子7的目標(biāo)捕獲區(qū)域和相應(yīng)探針序列如表1所述，圖1顯示了SMN1基因和SMN2基因外顯子7及其上下游的三個(gè)差異堿基，同時(shí)，還顯示了捕獲區(qū)域的相關(guān)測(cè)序深度。表1.SMN1和SMN2外顯子7的目標(biāo)捕獲區(qū)域和相應(yīng)探針序列信息在本實(shí)施例中，對(duì)照探針如表2所示。其它實(shí)施過(guò)程中，對(duì)照探針不局限于此。表2.本實(shí)施例采用的對(duì)照探針3)測(cè)序。測(cè)序文庫(kù)的DNA片段被雜交到測(cè)序儀的流動(dòng)槽(flowcell)上并以之為模板生長(zhǎng)DNA簇，然后在IlluminaHiSeq平臺(tái)(Illumina高通量測(cè)序平臺(tái))上進(jìn)行150bp雙端測(cè)序。實(shí)施例2通過(guò)數(shù)據(jù)分析估算脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因的拷貝數(shù)。本發(fā)明的數(shù)據(jù)分析涉及以下幾個(gè)步驟：步驟A，將測(cè)序讀段(reads)使用比對(duì)軟件(BWA軟件，版本：0.7.12)比對(duì)到人參考基因組(hg19)。步驟B，去除重復(fù)序列。使用Picard(一種基本序列處理工具，版本2.8)去除PCR擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生的重復(fù)序列(PCRduplicatereads)。步驟C，去除比對(duì)結(jié)果不可信的讀段。此處，比對(duì)結(jié)果不可信是指：由于SMN1和SMN2高度同源，雖然比對(duì)軟件將一個(gè)讀段分配到其中一個(gè)基因的外顯子7，但實(shí)際上該讀段既可以被分配到SMN1，也可以分配到SMN2。對(duì)于被分配到SMN1/2外顯子7的讀段，本發(fā)明剔除那些不涵蓋任何一個(gè)如表3所述位點(diǎn)的讀段。圖1展示了這些位點(diǎn)的相對(duì)位置。表3.用于區(qū)分分配到SMN1和SMN2外顯子7的讀段的位點(diǎn)。染色體坐標(biāo)基因外顯子堿基chr569372304SMN2外顯子7上游44bpAchr569372353SMN2外顯子7Tchr569372501SMN2外顯子7下游100bpGchr570247724SMN1外顯子7上游44bpGchr570247773SMN1外顯子7Cchr570247921SMN1外顯子7下游100bpA步驟D，計(jì)算覆蓋深度(readdepth)。將目標(biāo)捕獲區(qū)域劃分為固定長(zhǎng)度的區(qū)間，并利用BEDtools(一種基本序列處理工具，版本：2.26)計(jì)算每個(gè)區(qū)間的平均覆蓋深度。此處，覆蓋深度是指分配至所述區(qū)間的讀段數(shù)目與該區(qū)間大小的比值。SMN1/2外顯子7及其上下游每個(gè)堿基的覆蓋深度如圖2所示。步驟E，標(biāo)準(zhǔn)化覆蓋深度。此處，標(biāo)準(zhǔn)化是相對(duì)于同一個(gè)樣本所有區(qū)間(SMN1和SMN2外顯子7和其它相關(guān)對(duì)照探針?biāo)东@的區(qū)間)進(jìn)行計(jì)算的。公式如下：步驟F，GC(鳥嘌呤胞嘧啶)含量矯正。本發(fā)明進(jìn)一步去除由于GC含量差異而造成的測(cè)序結(jié)果偏差。公式如下：步驟G，計(jì)算Z-score(標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù))。對(duì)于一批樣本中的每個(gè)樣本，按如下公式計(jì)算Z-score。其中，Zi，j表示第j個(gè)樣本的外顯子i的Z-score值，normRD′i，j為第j個(gè)樣本外顯子i經(jīng)步驟F計(jì)算得到的覆蓋深度，和SD(normRD′i)分別為該批樣本外顯子i校正后覆蓋深度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。步驟H，估計(jì)SMN1/2外顯子7的拷貝數(shù)。此處，基于表型已知樣本，習(xí)得SMN1/2外顯子7拷貝數(shù)和步驟G計(jì)算得到的Z-score之間的關(guān)系：copynumber＝f(Z)基于已建立好的SMN1/2外顯子7拷貝數(shù)和Z-score之間的上述關(guān)系，估算待分析樣本SMN1/2外顯子7的拷貝數(shù)。在本實(shí)施例中，預(yù)測(cè)值如圖3三角形所示，待測(cè)樣本SMN1和SMN2外顯子7的Z-score值分別為-2.61和-0.93，可判斷為SMN1外顯子7發(fā)生雜合性缺失，SMN2外顯子7拷貝數(shù)正常。步驟H中所述關(guān)系，參考圖3、圖4和圖5，SMN1拷貝數(shù)判斷形式如下：SMN2拷貝數(shù)判斷形式如下：如上為基于已有數(shù)據(jù)訓(xùn)練得到的閾值，可作為缺省值。隨著數(shù)據(jù)的累積，可以進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，提供檢測(cè)準(zhǔn)確度。更新參考樣本數(shù)據(jù)庫(kù)：使用現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)手段(MLPA、qPCR等)進(jìn)一步確認(rèn)待測(cè)樣本的SMN1/2拷貝數(shù)后，將其添加到參考樣本數(shù)據(jù)庫(kù)中，并更新上述判斷閾值，供下次使用。序列表<110>明碼（上海）生物科技有限公司<120>一種基于基因捕獲和二代測(cè)序技術(shù)的脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒及方法<130>HJ17-12937<160>37<170>PatentInversion3.5<210>1<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>1cuccuuaauuuaaggaaugugagcaccuuccuucuuuuugauuuugucuaaaacccugua60aggaaaauaaaggaaguuaaaaaaaauagcuauauagauauagauagcuauauauagaua120<210>2<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>2uuccacaaaccauaaaguuuuacaaaaguaagauucacuuucauaaugcuggcagacuua60cuccuuaauuuaaggaaugugagcaccuuccuucuuuuugauuuugucuaaaacccugua120<210>3<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>3cuccuuaauuuaaggaaugugagcaccuuccuucuuuuugauuuugucugaaacccugua60aggaaaauaaaggaaguuaaaaaaaauagcuauauagacauagauagcuauauauagaua120<210>4<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>4uuccacaaaccauaaaguuuuacaaaaguaagauucacuuucauaaugcuggcagacuua60cuccuuaauuuaaggaaugugagcaccuuccuucuuuuugauuuugucugaaacccugua120<210>5<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>5ccccuggagauggaaguaccccaggcaccuauacagcccuucuauagcucuccagaacug60uggaucagcucucucccaaguaagugagacuuuaucuuucuugcucggucuucugcuucu120<210>6<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>6agugugggcaauugcagugugggcaacugcagcccggaggcaguguggcccaaaacugaa60ccccuggagauggaaguaccccaggcaccuauacagcccuucuauagcucuccagaacug120<210>7<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>7ugugguaccccugucugcucaccauaugcuuuuguuuuagguucucccauggcgccagcc60agugugggcaauugcagugugggcaacugcagcccggaggcaguguggcccaaaacugaa120<210>8<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>8cuuccagucaaguggauggcuccagaagcccuguuugauagaguauacacucaucagagu60gaugugugaguaacucucuuuucucuggcuuuuuccugggcuugagcugcaaaaauacug120<210>9<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>9aagauaaauucuuuuaaauauauuuaguuuuugcauuuuccucuacauuugcaggggcgg60cuuccagucaaguggauggcuccagaagcccuguuugauagaguauacacucaucagagu120<210>10<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>10gaaccauucaagagcuggacagauuugccaaucagauucucagcuauggagcggaacugg60augcugaccacccugugaguccauggcccguaggaugagauuuuuucagugccucuccuc120<210>11<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>11guucugccaaucuguacucaggacguugccuucucuguguuucagugcccugguucccaa60gaaccauucaagagcuggacagauuugccaaucagauucucagcuauggagcggaacugg120<210>12<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>12ggagcugccacugccaucggggacccuccaaaugucauuauuguuuccaaccaagagcug60aggaagaugguacguaccagcaugcuaggguugcuuccaguaaacgcacaccuccacuua120<210>13<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>13gugcucaaccuugauccaagacaaguccugauugcagaagugaucuucacaaacauugga60ggagcugccacugccaucggggacccuccaaaugucauuauuguuuccaaccaagagcug120<210>14<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>14uucacgauguguauagugggacuacuuucauuuuccuccauuugugacagguugugugag60gugcucaaccuugauccaagacaaguccugauugcagaagugaucuucacaaacauugga120<210>15<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>15cuuuucaauuaagcccaauuucacuguaaauuaccucuuuaaaaugaugacuuauuuauu60uuuuagauauuaaugacugccuuggccagugucagaaugacgccuccugucggguaugua120<210>16<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>16aguauugggcauuugggguguacauggaagcuacauccccaccucugaagaaggcguuuu60cauagaguugagucagacauccugugacagaaccauaaaaauuaauuugcgauaauucau120<210>17<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>17aacuugcuggaagaaaacugaauagcaaacaccuuggguggaaugugcaccucaucuggc60aguauugggcauuugggguguacauggaagcuacauccccaccucugaagaaggcguuuu120<210>18<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>18aaaaacagcuucuccaauaaugaaauaccaacuuuuaccuuuucuccaugucauugauug60aacuugcuggaagaaaacugaauagcaaacaccuuggguggaaugugcaccucaucuggc120<210>19<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>19uucuggacacacucuucaugguaaaacuuuccacacaaggguagaaggcaccuuuuaaca60ucuuccccacucugcuuacauacaaaacagguauggauuccugagaagccaaaagaagau120<210>20<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>20guuauacagauguggagggagcaccggaagcccuuguucugcauaacaguggguggguac60uucuggacacacucuucaugguaaaacuuuccacacaaggguagaaggcaccuuuuaaca120<210>21<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>21ccacauaagaaauccauaccuuuagaugcagaaacauuggcuggauuagcagcaugacag60guuauacagauguggagggagcaccggaagcccuuguucugcauaacaguggguggguac120<210>22<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>22cuuauuaaugaauauccauguucaugugaugcagaugggacuagcacacaauguaagauc60aaaauuaauguaagucuuauaauuuuauucaaguuauaugacaaaaauuuaauuuaaaag120<210>23<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>23ugcuuuaacaucuacuuauuugaaaauguaauucuaauucuguguuucaggugcacagaa60cuuauuaaugaauauccauguucaugugaugcagaugggacuagcacacaauguaagauc120<210>24<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>24aguugaaagccaugucucuguuggguagucggaaccaacuggcuagagcuguucugaauc60caaacccuauggacuucuguacaaaagauuuacugacuacaacaucugagagaauuguga120<210>25<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>25ccaauuuaaacgaacuugugaauuguauuguaaucaguucucugguaacuacacaaagga60aguugaaagccaugucucuguuggguagucggaaccaacuggcuagagcuguucugaauc120<210>26<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>26uagugcguaaugggaaaacugaguguuaccuuuccauccagacucaagagaacuuuccgg60ccaauuuaaacgaacuugugaauuguauuguaaucaguucucugguaacuacacaaagga120<210>27<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>27aucuugaaggggaccgcaauggaggagcaaagaagaagaacuuuuuuaaacugaacaaua60aaagguaacuagcuuguuucauuuucauaguuuacauaguugcgagauuugaguaauuua120<210>28<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>28gcgcgccugaggcucaugcauuuggcuaaugagcugcgguuucucuucaggucggaaugg60aucuugaaggggaccgcaauggaggagcaaagaagaagaacuuuuuuaaacugaacaaua120<210>29<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>29uacagcaucuaaggcaagcugaaugcucuccaucaaucaugauauuagagacuguauuuu60auauaugacgacuuaagcuaaacuccuaaguaccugaaaugaauuaaauuaauaauuuuu120<210>30<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>30uagcguggaucacacucaccaaaaaacaaaaacgccuuaauguucagcuuuuccugaauu60uacagcaucuaaggcaagcugaaugcucuccaucaaucaugauauuagagacuguauuuu120<210>31<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>31cuggagacuuggugaguuguucaaguccuuugguuuccacgaaggaagacauuucaaaac60uuuuauuucuuucugaguuaagcaacaacaaaacaaaaaaggggaaggugagaaauacaa120<210>32<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>32gacuucagcuguguucauucugcagucauucgucaaaucaaggauacucuacaaauucca60cuggagacuuggugaguuguucaaguccuuugguuuccacgaaggaagacauuucaaaac120<210>33<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>33uagaaaugaugacauaacagauggaaaucccaaauugacuuugggauuaaucuggacaau60aauuuugcacuuucagguaagcccaaauuuucuuaauuucagcaucuaauugcuaguuuu120<210>34<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>34uugauaaacaguugguuuuaucucuucuucacauucaaaacaggugaaauuagugaauau60uagaaaugaugacauaacagauggaaaucccaaauugacuuugggauuaaucuggacaau120<210>35<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>35acuguaagaagaaauacggcguggcuugggaaaaguacugucagcgugugcccuaccgua60uauuuccauacaucuacuaaugcucuucuggcuuuucuacaaaauacuccugcaauucca120<210>36<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>36auuucuacauaauuuauuucaccauguugcuuguccaccgagaagcucgugacgaguacc60acuguaagaagaaauacggcguggcuugggaaaaguacugucagcgugugcccuaccgua120<210>37<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>37auaaaaauaucuaauacuguguacuauuauuauccacagguuuuaaccacauucugccuu60auuucuacauaauuuauuucaccauguugcuuguccaccgagaagcucgugacgaguacc120當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3