本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于檢測(cè)B-RAF基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：B-raf基因全名為鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌(V-raf)致癌同源體B1，定位于人染色體7q34，其具有功能的編碼區(qū)由2150對(duì)堿基組成，編碼MAPK通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，該酶將信號(hào)從Ras轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEK1/2，從而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件。B-raf基因突變能激活ERK信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，防止細(xì)胞凋亡。約70％的惡性黑色素瘤和15％的結(jié)腸癌中存在體細(xì)胞B-raf基因錯(cuò)義突變。B-raf基因作為raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成員，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。正常的B-raf蛋白的功能是傳遞來(lái)自細(xì)胞膜的信號(hào)。B-raf蛋白通常只在需要傳遞信號(hào)時(shí)保持活性狀態(tài)。然而，突變的B-raf則一直保持活性狀態(tài)，并因此干擾了細(xì)胞信號(hào)傳遞鏈的正常功能，引起細(xì)胞的異常。利用B-raf基因在臨床上可對(duì)腫瘤(包括癌前病變)進(jìn)行診斷，預(yù)后評(píng)估和治療。通過(guò)檢測(cè)基因突變來(lái)推測(cè)腫瘤所處的階段和分化的程度，從而對(duì)病情和預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。隨著現(xiàn)在醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展，已開(kāi)發(fā)出針對(duì)腫瘤病變的多種阻斷細(xì)胞信號(hào)通路的藥物，但是在使用這些藥物時(shí)需要確保該信號(hào)通路的下游信號(hào)分子沒(méi)有發(fā)生激活突變，而這往往正是現(xiàn)在醫(yī)療行業(yè)需面對(duì)的問(wèn)題，急需一種快速、簡(jiǎn)便、安全、高靈敏、高通量和低成本的B-raf基因突變檢測(cè)來(lái)輔助這些藥物的臨床運(yùn)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種用于檢測(cè)B-RAF基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種用于檢測(cè)B-RAF基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，包括：B引物組、E-4引物組、B檢測(cè)探針、E-4檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；B檢測(cè)探針和E-4檢測(cè)探針的5’端均修飾有第一熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端均修飾有第一熒光猝滅基團(tuán)；內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的序列與E-4檢測(cè)探針的序列相同，其5’端修飾有與第一熒光報(bào)告基團(tuán)不同的第二熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端均修飾有第二熒光猝滅基團(tuán)；其中，B引物組由正向引物B-M-F和反向引物B-M-R組成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；E-4引物組由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R組成，依次包括如SEQIDNO03和04所示的序列；該多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的每一反應(yīng)體系的組成如下：B引物組B檢測(cè)探針和/或E-4檢測(cè)探針E-4引物組內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針1×PCR緩沖液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；該多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的每一反應(yīng)體系的反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個(gè)循環(huán)；后30個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述B檢測(cè)探針為B-P-C，包括如SEQIDNO05所示的序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述E-4檢測(cè)探針為E-4-P，所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為E-4-I，均包括如SEQIDNO06所示的序列。上述物及探針具體序列如下表所示：進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第一熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述第一熒光猝滅基團(tuán)為BHQ，所述第二熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX、ROX或VIC，第二熒光猝滅基團(tuán)為BHQ。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明的試劑盒適合于患者在進(jìn)入個(gè)體化靶向治療療程之前使用?？蔀榛颊邆€(gè)體用藥提供用藥科學(xué)依據(jù)，降低治療風(fēng)險(xiǎn)以及患者負(fù)擔(dān)。2、本發(fā)明以人類B-RAF基因突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)象，通過(guò)特異引物的優(yōu)化組合以及熒光探針，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速地同時(shí)檢測(cè)B-RAF基因突變，而且檢測(cè)突變的能力高。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例2的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)程序圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中多重?zé)晒釶CR檢測(cè)B-RAF基因V600E突變陰性對(duì)照樣品檢測(cè)曲線圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中多重?zé)晒釶CR檢測(cè)B-RAF基因V600E突變的樣品檢測(cè)曲線圖。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。一種用于檢測(cè)B-RAF基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，包括：B引物組、E-4引物組、B檢測(cè)探針、E-4檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；B檢測(cè)探針和E-4檢測(cè)探針的5’端均修飾有第一熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端均修飾有第一熒光猝滅基團(tuán)；內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的序列與E-4檢測(cè)探針的序列相同，其5’端修飾有與第一熒光報(bào)告基團(tuán)不同的第二熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端均修飾有第二熒光猝滅基團(tuán)；優(yōu)選的，所述第一熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述第一熒光猝滅基團(tuán)為BHQ，所述第二熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX、ROX或VIC，第二熒光猝滅基團(tuán)為BHQ，其中，B引物組由正向引物B-M-F和反向引物B-M-R組成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；E-4引物組由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R組成，依次包括如SEQIDNO03和04所示的序列；該多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的每一反應(yīng)體系的組成如下：B引物組B檢測(cè)探針和/或E-4檢測(cè)探針E-4引物組內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針1×PCR緩沖液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；該多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的每一反應(yīng)體系的反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個(gè)循環(huán)；后30個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。所述B檢測(cè)探針為B-P-C，包括如SEQIDNO05所示的序列。所述E-4檢測(cè)探針為E-4-P，所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為E-4-I，均包括如SEQIDNO06所示的序列。上述物及探針具體序列如下表所示：名稱序列B-M-FGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAB-M-RCTCAGCAGCATCTCAGGE-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATGGTCCTAE-4-RCTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCTGTB-P-CCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGE-4-PTGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAE-4-ITGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGA實(shí)施例1本實(shí)施例以人類B-RAF基因V600的V600E突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)象，通過(guò)特異引物的優(yōu)化組合以及熒光探針，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速地同時(shí)檢測(cè)V600E突變，而且檢測(cè)突變的能力高達(dá)1％。野生型細(xì)胞系H460的基因組DNA為野生型模板，以V600E突變質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照模板，以上述用于檢測(cè)B-RAF基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，最終以達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)(本實(shí)施例中的第一熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，第二熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC、ROX或HEX，第一和第二熒光猝滅基團(tuán)均為BHQ)。上述多重?zé)晒釶CR檢測(cè)的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：序號(hào)物料物料濃度用量(μL)11×PCR緩沖液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54B-M-F50mM25B-M-R50mM0.16B-P-C-FAM50mM0.17E-4-F50mM0.18E-4-R50mM0.19內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針50mM0.110Taq酶5U0.511H2O純化水18.912DNA模板2ng/ul513總體積50以上試劑組分：1×PCR緩沖液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購(gòu)自中國(guó)大連寶生物公司。上述多重?zé)晒釶CR檢測(cè)的反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個(gè)循環(huán)，后30個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)。上述檢測(cè)第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)的Ct值，是采用Mx3000P熒光PCR擴(kuò)增儀或Mx3005P熒光PCR擴(kuò)增儀或ABI7500熒光PCR擴(kuò)增儀。，一次可檢測(cè)96份樣品(包括陰陽(yáng)性對(duì)照)。根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果：檢測(cè)反應(yīng)體系的第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)熒光強(qiáng)度，以第二熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值(Ct＞18)時(shí)表明上樣DNA量在允許范圍內(nèi)，第一熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)結(jié)果可信；以第一熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽(yáng)性判斷的標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為0或30：陰性；Ct小于30：陽(yáng)性。實(shí)施例2本實(shí)施例中以B-RAF基因熱點(diǎn)突變V600上的V600E突變?yōu)槔齺?lái)分析本發(fā)明的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)B-RAF基因V600的V600E突變的方法。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系3株和1個(gè)質(zhì)粒，分別為H460(B-RAF基因野生型)、293T(B-RAF基因野生型)、SW480(B-RAF基因野生型)和V600E突變質(zhì)粒；45份健康的無(wú)償獻(xiàn)血者全血樣品、45份臨床肺癌樣品(包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血)。利用上述熒光PCR檢測(cè)B-RAF基因V600上的V600E突變的方法包括以下步驟：(1)樣品處理和模板提取質(zhì)控：樣品適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標(biāo)本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說(shuō)明。蠟塊樣品切成5～8μm切片，取5片，或已經(jīng)制成的5～8μm切片取5片，經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟后，使用Qiagen公司石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說(shuō)明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說(shuō)明。每次提取全血200μl，血漿、血清以及胸腔積液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH8.0)，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH8.0)調(diào)整DNA濃度到100ng/μl或2ng/μl作為PCR擴(kuò)增的模板。(2)用本發(fā)明的多重?zé)晒釶CR試劑盒(本實(shí)施例中的第一熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，第二熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC、ROX或HEX，第一和第二熒光猝滅基團(tuán)均為BHQ)對(duì)步驟(1)所得的模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)，配制反應(yīng)體系：所述熒光PCR的反應(yīng)條件如圖1所示：95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個(gè)循環(huán)。(3)檢測(cè)：采用Mx3000P實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀(StrataGene公司)后30個(gè)循環(huán)退火階段檢測(cè)第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)，一次可以檢測(cè)92份樣品(包括陰陽(yáng)性對(duì)照)。結(jié)果判斷：根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果：檢測(cè)反應(yīng)體系的第一熒光報(bào)告基團(tuán)和第二熒光報(bào)告基團(tuán)熒光強(qiáng)度，以第二熒光報(bào)告基團(tuán)信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值(Ct＞18)時(shí)表明上樣DNA量在允許范圍內(nèi)，第一熒光報(bào)告基團(tuán)信號(hào)結(jié)果可信；以第一熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽(yáng)性判斷的標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為0或30：陰性；Ct小于30：陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果具體如圖2和圖3所示。前述45份健康獻(xiàn)血者全血樣品以及細(xì)胞系H460(B-RAF基因野生型)、293T(B-RAF基因野生型)、SW480(B-RAF基因野生型)，V600E突變質(zhì)粒經(jīng)本發(fā)明的體系檢測(cè)，只有V600E突變質(zhì)粒有熒光信號(hào)，其他樣品無(wú)熒光信號(hào)，進(jìn)一步證明了熒光PCR的特異性。靈敏度分析：將突變型V600E突變質(zhì)粒從10的4次方連續(xù)10倍梯度稀釋，分別為10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反應(yīng)加入5μLDNA。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光PCR方法的靈敏度高，5拷貝DNA基因組即可檢出。選擇性能力分析：固定每次PCR反應(yīng)總DNA用量，100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。先將V600E突變質(zhì)粒DNA和野生型細(xì)胞系(H460)DNA濃度都調(diào)整為20ng/μL和2ng/μL。這樣每個(gè)反應(yīng)加5μL模板即為100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。按下述方法配置模擬DNA模板。A：50％即為10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA。B：30％取A液60μL后混入40μL10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA，震蕩混均。C：20％取A液40μL后混入60μL10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA，震蕩混均。D：15％取B液50μL后混入50μL10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA，震蕩混均。E：10％取C液50μL后混入50μL10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA，震蕩混均。F：5％取E液50μL后混入50μL10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA，震蕩混均。G：1％取F液20μL后混入80μL10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA，震蕩混均。H：0.5％取G液50μL后混入50μL10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA，震蕩混均。I：0.1％取H液20μL后混入80μL10的3次方V600E突變細(xì)胞DNA，震蕩混均。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光PCR方法的選擇性檢測(cè)能力為在10ng總DNA中可以檢出5拷貝的突變DNA，檢測(cè)能力為1％。重復(fù)性試驗(yàn)：每個(gè)反應(yīng)分別加入突變V600E質(zhì)粒DNA10ng、1ng和100pg，重復(fù)10次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，10次Ct值相差不到0.1個(gè)循環(huán)。收集手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本，全血和血漿標(biāo)本以及胸水標(biāo)本共45例，其中30組織樣品，5例血漿，5例胸水，5例全血。其中男性31例，女性14例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。對(duì)于V600的V600E突變，本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果完全一致：45例樣品中有12例發(fā)生V600的V600E突變，33例均為野生型。本發(fā)明多重?zé)晒釶CR反應(yīng)就可以同時(shí)檢測(cè)B-RAF外顯子V600V600E突變，檢測(cè)時(shí)間僅需90min，因此本發(fā)明準(zhǔn)、簡(jiǎn)單、快捷可滿足突變的快速診斷。而且，多重?zé)晒釶CR方法和傳統(tǒng)測(cè)序方法結(jié)果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度和選擇性檢測(cè)能力高于傳統(tǒng)測(cè)序方法，10ng樣品DNA中含1％的突變DNA即可檢出。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。<110>廈門(mén)飛朔生物技術(shù)有限公司<120>一種用于檢測(cè)B-RAF基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒<160>6<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1gtgattttggtctagctacaga22<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2ctcagcagcatctcagg17<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3gactctgaagatgtacctatggtccta27<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4cttcttgctaagtcctgagcctgt24<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5cccatcagtttgaacagttgtctgg25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>6tgtgatttgccttctagaacagtaga26當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3