本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及LMOD3在制備口腔鱗癌診療制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是由上皮組織惡變而來，是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，占口腔惡性腫瘤的80％以上。目前為止，對口腔鱗狀細胞癌的治療仍然以手術(shù)治療為主，并輔以放射治療和化學(xué)藥物治療。盡管隨著手術(shù)方式的不斷改進以及輔助手段的加強，口腔鱗狀細胞癌的治療效果也逐漸改善，但是其五年生存率仍不足50％。隨著惡性相關(guān)基因研究的不斷深入，腫瘤的基因治療已經(jīng)成為研究惡性腫瘤治療的新熱點。基因治療具有選擇性強、損傷小、對原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶均有效的優(yōu)點，已經(jīng)成為手術(shù)、放療和化療之后的新的有希望的治療手段。

現(xiàn)階段，基因治療主要包括：基因修正、“自殺”基因的應(yīng)用，反義性基因治療以及RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)等。其中RNAi具有高效性、高穩(wěn)定性、以及便利性等優(yōu)點，因此在研究基因功能、抗病毒治療以及抗腫瘤基因治療等方面均得到廣泛的應(yīng)用。RNAi作為腫瘤基因治療的新方法，可以抑制腫瘤細胞中一些基因以及生長因子的異常表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖促進腫瘤細胞的凋亡，在腫瘤的基因治療中具有重要的意義。

RNAi是指具有同源性的雙鏈NRA導(dǎo)致靶mNRA發(fā)生序列特異性降解的現(xiàn)象，是最近幾年發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的一門新興的在轉(zhuǎn)錄水平上的基因阻斷技術(shù)。它是真核生物中基因轉(zhuǎn)錄后沉默作用的重要機制之一。RNAi具有抑制作用強、穩(wěn)定性高、細胞攝取相對容易等優(yōu)點，在基因功能研究、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面均得到廣泛應(yīng)用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，多存在癌基因的過量表達，這種過量表達的癌基因可導(dǎo)致細胞增殖失控或凋亡受限，為腫瘤的基因治療提供了特異的靶向分子。作為基因治療的新工具，將RNAi應(yīng)用于探尋癌癥靶向相關(guān)基因，抑制腫瘤細胞中過量表達的一些因子，使與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因的表達降低從而抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，能夠大大提高腫瘤基因治療的效果，是具有極好前景的腫瘤治療方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種與口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物標志物，從而為口腔鱗癌的診斷和治療提供一種分子手段。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了種LMOD3基因和/或其表達產(chǎn)物或特異性識別LMOD3基因和/或其表達產(chǎn)物試劑的用途，用于制備診斷口腔鱗狀細胞癌的產(chǎn)品。

進一步，所述特異性識別LMOD3基因和/或其表達產(chǎn)物的試劑選自：

特異性擴增LMOD3基因的引物；或

特異性識別LMOD3基因的探針；或

特異性結(jié)合LMOD3編碼的蛋白的抗體或配體。

進一步，所述特異性擴增LMOD3基因的引物對序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明提供了一種診斷口腔鱗狀細胞癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括上面所述的試劑。

進一步，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒或制劑。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測LMOD3基因轉(zhuǎn)錄水平的針對LMOD3基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的LMOD3蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測LMOD3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括LMOD3蛋白的特異性抗體。

進一步，所述試劑盒還包括使用說明書或標簽、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、助劑或溶劑；所述說明書或標簽注明所述試劑盒用于檢測口腔鱗癌。

本發(fā)明提供了一種LMOD3基因或其表達產(chǎn)物的下調(diào)劑的用途，用于制備治療口腔鱗狀細胞癌的藥物組合物。

進一步，所述的LMOD3基因或其表達產(chǎn)物的下調(diào)劑選自：核酸抑制劑、蛋白抑制劑、蛋白水解酶、蛋白結(jié)合分子，其能夠在基因或蛋白水平下調(diào)LMOD3基因或其編碼的蛋白的表達或活性。

進一步，所述LMOD3基因或其表達產(chǎn)物的下調(diào)劑為siRNA。

本發(fā)明提供了一種預(yù)防、緩解或治療口腔鱗狀細胞癌的藥物組合物，所述組合物含有：

(1)如上所述的LMOD3基因或其表達產(chǎn)物的下調(diào)劑；和

(2)藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明提供了一種篩選預(yù)防、緩解或治療口腔鱗狀細胞癌的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：

(1)用候選物質(zhì)處理表達或含有LMOD3基因或其編碼的蛋白的體系；和

(2)檢測所述體系中LMOD3基因或其編碼的蛋白的表達或活性。

其中，若所述候選物質(zhì)可降低LMOD3基因或其編碼的蛋白的表達或活性(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該物質(zhì)為預(yù)防、緩解或治療口腔鱗狀細胞癌的潛在物質(zhì)。

進一步，所述的候選物質(zhì)包括(但不限于)：針對LMOD3基因或其表達產(chǎn)物或其上游或下游基因或蛋白設(shè)計的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物等。

本發(fā)明提供了LMOD3基因在制備治療口腔鱗狀細胞癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種抑制細胞增殖的方法，所述方法是將LMOD3基因或其表達產(chǎn)物的下調(diào)劑在體外導(dǎo)入到腫瘤細胞中。

進一步，所述下調(diào)劑包括將針對LMOD3基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了差異性表達的LMOD3與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，提示檢測LMOD3基因表達水平可成為口腔鱗狀細胞癌早期診斷的輔助診斷指標。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了下調(diào)LMOD3基因表達水平可以抑制抑制癌細胞的增殖，降低癌細胞的侵襲率，從而為口腔鱗癌的干預(yù)提供了新途徑。

附圖說明

圖1顯示利用QPCR檢測LMOD3基因在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達情況；

圖2顯示利用QPCR檢測LMOD3基因在口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達情況；

圖3顯示利用QPCR檢測siRNA對LMOD3基因表達的影響；

圖4顯示MTT法檢測LMOD3對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖活性的影響；

圖5顯示利用transwell小室檢測LMOD3基因?qū)谇击[狀細胞癌細胞侵襲的影響。

具體的實施方式

本發(fā)明經(jīng)過深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)了口腔鱗癌組織中LMOD3基因的表達顯著高于正常粘膜組織，并且實驗證明了LMOD3在口腔鱗癌細胞中也呈現(xiàn)高表達，下調(diào)LMOD3的表達水平可以抑制口腔鱗癌細胞的增殖和侵襲，提示LMOD3可作為診斷和治療的靶標應(yīng)用于臨床。

LMOD3蛋白是一種平滑肌蛋白，該蛋白包含三個肌動蛋白結(jié)合域、一個原肌球蛋白結(jié)合域、一個富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域和一個WH2結(jié)構(gòu)域。該蛋白在平滑肌成核反應(yīng)中起催化作用，在骨骼肌肌節(jié)細肌絲的組織中也起著重要的作用。該蛋白的突變會引起桿狀體肌癥。

可用于本發(fā)明的LMOD3多核苷酸或蛋白(多肽)序列包括各種來源和物種的LMOD3，并且包括野生型、突變型的LMOD3，或其活性片段。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述LMOD3來源于人類，一種代表性的人LMOD3的編碼序列或氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明中，術(shù)語“生物標志物”是其在組織或細胞中的表達水平與正?；蚪】导毎蚪M織的表達水平相比發(fā)生改變的任何基因或蛋白。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄或翻譯(即蛋白)水平上檢測生物標記物的表達水平。

在一些實施方案中，在轉(zhuǎn)錄水平上檢測生物標記物的表達水平。利用核酸雜交技術(shù)進行具體DNA和RNA測量的多種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一些方法涉及電泳分離(例如，用于檢測DNA的Southern印跡和用于檢測RNA的Northern印跡)，但是也可以在不利用電泳分離的情況下進行DNA和RNA的測量(例如，通過斑點印跡)?；蚪MDNA(例如，來自人)的Southern印跡可用于篩選限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，以檢測影響本發(fā)明多肽的遺傳病癥的存在?？梢詸z測所有形式的RNA，包括但不限于信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核糖體RNA(rRNA)和轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)。

本發(fā)明所述的基因芯片或基因檢測試劑盒可用于檢測包括LMOD3基因在內(nèi)的多個基因(例如，與口腔鱗狀細胞癌相關(guān)的多個基因)的表達水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫檢測試劑盒可用于檢測包括LMOD3蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)(例如與口腔鱗狀細胞癌相關(guān)的多個蛋白質(zhì))的表達水平。將口腔鱗狀細胞癌的多個標志物同時進行檢測，可大大提高口腔鱗狀細胞癌診斷的準確率。

術(shù)語“探針”是指能夠用于測量特定基因的表達情況的分子。示例性探針包括PCR引物以及基因特異性DNA寡核苷酸探針，例如固定于微陣列基底上的微陣列探針、定量核酸酶保護檢驗探針、與分子條形碼連接的探針、以及固定于珠上的探針。

本發(fā)明所用的術(shù)語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。這里，所謂“互補”，只要是雜交即可，可以不是完全互補。根據(jù)雜交條件的嚴謹性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段、組合抗體等，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。

術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。

單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。

“完整抗體”在本文中指包含兩個抗原結(jié)合區(qū)及Fc區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗體具有功能性Fc區(qū)。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)²和Fv片段；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。

本發(fā)明中抗LMOD3蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測樣本中LMOD3蛋白的含量，還可用于預(yù)防和治療口腔鱗癌的特異性制劑，血樣或尿液中LMOD3蛋白的直接測定可以作為腫瘤的輔助診斷和愈后的觀察指標，也可作為腫瘤早期診斷的依據(jù)?？贵w可以通過ELISA、Western Blot印記分析，或者與檢測基團偶聯(lián)，通過化學(xué)發(fā)光、同位素示蹤等方法來檢測。

本發(fā)明中所述的LMOD3基因或其表達產(chǎn)物的下調(diào)劑是指任何可降低LMOD3蛋白的活性、降低LMOD3基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)LMOD3蛋白的表達、減少LMOD3蛋白有效作用時間、或抑制LMOD3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于下調(diào)LMOD3有用的物質(zhì)，從而可用于預(yù)防或治療口腔鱗癌。例如，所述的抑制劑是：核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，蛋白水解酶，蛋白結(jié)合分子，只要其能夠在蛋白或基因水平上下調(diào)LMOD3蛋白或其編碼基因的表達。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的LMOD3的下調(diào)劑是一種LMOD3特異性的小干擾RNA分子(small interfering RNA，SiRNA)。如本文所用，所述的“小干擾RNA”是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾(RNA interference)過程。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。

在篩選有效的siRNA序列時，本發(fā)明人通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計合成了多種siRNA序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染口腔鱗癌細胞系進行驗證，結(jié)果檢測出干擾效果較好的干擾分子，它們分別具有SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12的序列。

作為本發(fā)明的一種可選方式，所述的LMOD3的下調(diào)劑也可以是一種“小發(fā)夾RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小RNA分子，小發(fā)夾RNA能夠通過RNA干擾途徑來抑制基因的表達。如上述，shRNA可以由編碼需要的轉(zhuǎn)錄物的雙鏈DNA模板來表達。編碼需要的轉(zhuǎn)錄物的雙鏈DNA模板被插進一個載體，例如質(zhì)粒或病毒載體，然后在體外或體內(nèi)連接到一個啟動子進行表達。shRNA在真核細胞內(nèi)DICER酶的作用下，可被切割成小干擾RNA分子，從而進入RNAi途徑?！皊hRNA表達載體”是指一些本領(lǐng)域常規(guī)用于構(gòu)建shRNA結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，通常該質(zhì)粒上存在“間隔序列”以及位于“間隔序列”兩邊的多克隆位點或供替換序列，從而人們可以將shRNA(或類似物)相應(yīng)的DNA序列通過正向和反向的方式插入多克隆位點或替換其上的供替換序列，該DNA序列轉(zhuǎn)錄后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的核酸抑制物如siRNA可以化學(xué)合成，也可以通過一個重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達盒轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA之后進行制備。siRNA等核酸抑制物，可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細胞內(nèi)。

基因表達載體包括非病毒載體和病毒載體，其中病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體等。

在本發(fā)明的藥物組合物中，除了除作為有效成分的上述物質(zhì)(多核苷酸、抗體)之外，還能夠含有藥學(xué)上可接受的其它成分。作為這樣的其它成分，包括(但不限于)緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽等。作為緩沖劑，能夠使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等。作為乳化劑，能夠使用阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、西黃芪膠等。作為懸浮劑，能夠使用單硬脂酸甘油、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為穩(wěn)定劑，能夠使用丙二醇、二亞乙基亞硫酸鹽、抗壞血酸等。作為防腐劑，能夠使用疊氮化鈉、苯扎氯銨、對羥苯甲酸、氯丁醇等。

另外，除包含多核苷酸、抗體的標準品之外，也能夠組合附加于多核苷酸、抗體上的標記的檢測中所需要的基質(zhì)、陽性對照、陰性對照、原位雜交等中所使用的對比染色用試劑(DAPI等)、抗體的檢測中所需要的分子(例如，二次抗體、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A)、用于試樣的稀釋、清洗的緩沖液等標準品，制成用于本發(fā)明的方法的試劑盒。在該試劑盒中能夠包括該試劑盒的使用說明書。本發(fā)明也提供用于上述本發(fā)明的方法的試劑盒。

對于臨床使用，將依照本發(fā)明的化合物或其前藥形式配制成藥物組合物，其配制為與其意圖的施用路徑，例如口服、直腸、胃腸外或其它施用模式相容。通常，通過混合活性物質(zhì)與常規(guī)的藥學(xué)可接受稀釋劑或載體來制備藥物配制劑。如本文中所使用的，語言“藥學(xué)可接受載體”意圖包括與藥物施用相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細菌和抗真菌劑、吸收延遲劑等等。藥學(xué)可接受稀釋劑或載體的例子有水、明膠、阿拉伯樹膠、乳糖、微晶纖維素、淀粉、羥基乙酸淀粉鈉、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、滑石、膠體二氧化硅等等。此類介質(zhì)和藥劑對藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域中公知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容，涵蓋其在組合物中的用途。

本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調(diào)節(jié)制劑的pH以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術(shù)語非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達到目標組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過任何途徑給予受體。

本發(fā)明的藥物組合物可以用于補充內(nèi)源性的LMOD3蛋白的缺失或不足，通過提高LMOD3蛋白的表達或增強LMOD3蛋白的功能，從而治療因LMOD3蛋白減少導(dǎo)致的口腔鱗狀細胞癌。

本發(fā)明還包括一種組合藥物，所述組合藥物包括上述的藥物組合物、和含抗腫瘤劑的藥物組合物?？鼓[瘤劑的藥物組合物包括但不限于免疫治療劑如西妥昔單克隆抗體，化學(xué)治療劑或化學(xué)放射性治療劑如卡波鉑或者是一種相關(guān)類別的鉑類藥物、紫杉烷或者是一種類別的紫衫烷，或者是兩者。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療口腔鱗狀細胞癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明中術(shù)語“治療”是指以治愈、改善、穩(wěn)定或預(yù)防疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的對患者進行的醫(yī)學(xué)管理。

本發(fā)明中術(shù)語“樣本”是指從目標患者得到的組合物，其包含細胞和/或其他分子體—將進行特征化和/或識別，例如，根據(jù)物理、生化、化學(xué)和/或生理特征。例如，短語“臨床樣本”或“疾病樣本”及其變體，是指從目標患者獲得的任何樣本，將預(yù)期或已知所述樣本中能夠獲得細胞和/或分子體，例如將被特征化的生物標志物。

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與口腔鱗狀細胞癌相關(guān)的基因標志物

1、樣品收集

各收集6例周圍正常粘膜組織和口腔鱗狀細胞癌組織，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實，所有患者術(shù)前未接受任何形式的治療。手術(shù)切下的樣本于液氮中凍存，患者均知情同意，上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進行操作)

取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進行研磨，按照試劑盒中的說明書提取分離RNA。具體如下：

1)加入Trizol，室溫放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5-10min；

3)12000rpm離心15min，將上層水相移到另一新的離心管中(注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì))，加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10min；

4)12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗滌沉淀(4℃保存)，洗滌沉淀物，振蕩混勻，4℃，12000rpm離心5min；

5)棄去乙醇液體，室溫下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70℃冰箱。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時用Cy3分別標記實驗組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達譜芯片,每張芯片包括45015個寡核苷酸，其中有43376個人基因探針和1639個實驗控制探針。按芯片使用說明書的步驟進行，溫度在65℃，經(jīng)17h 10r/min滾動雜交，37℃洗片。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用Agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動以100％和10％PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用Feature Extraction進行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Bioconductor程序包進行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實驗組和對照組。差異基因篩選標準：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。

6、結(jié)果

與正常粘膜組織相比，LMOD3基因在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達量顯著上調(diào)。

實施例2QPCR測序驗證LMOD3基因的差異表達

1、對LMOD3基因差異表達進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇正常粘膜組織和口腔鱗狀細胞癌組織各80例。

2、RNA提取步驟如實施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

1)配置10μl反應(yīng)體系：

取MgCl₂ 2μl、10×RT Buffer 1μl、無Rnase水 3.75μl、dNTP混合液 1μl、Rnase抑制劑0.25μl、AMV反轉(zhuǎn)錄酶 0.5μl、寡聚dT適配子引物 0.5μl、實驗樣品 1μl混合

2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件進行。

42℃60min，99℃2min，5℃5min。

3)聚合酶鏈反應(yīng)

1)引物設(shè)計

根據(jù)Genebank中LMOD3基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計QPCR擴增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

LMOD3基因：

正向引物為5’-ATCACCACTCTCAACATC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物為5’-CTCAGTTAGCGTCTCATT-3’(SEQ ID NO.4)。

管家基因GAPDH的引物序列為：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)

2)按照表1配制25μl PCR反應(yīng)體系：

正(反)向引物1μl、Takara Ex Taq HS 12.5μl、模板2μl、去離子水8.5μl

3)PCR反應(yīng)條件：94℃4min，(94℃20s，60℃30s、72℃30s)×30個循環(huán)。

以SYBR Green作為熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進行相對定量，每個樣進行3次重復(fù)實驗。

5、統(tǒng)計學(xué)方法

以GAPDH為內(nèi)參，計算口腔鱗狀細胞癌組織與正常粘膜組織熒光定量RT-PCR的實驗結(jié)果，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析，兩者之間的差異采用t檢驗，以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與周圍正常粘膜組織相比，LMOD3基因在口腔鱗狀細胞癌組織中表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實施例3LMOD3基因在口腔鱗狀細胞癌細胞系中的差異表達

1、細胞培養(yǎng)

口腔鱗狀細胞癌細胞系Tca8113、HN13，正常粘膜上皮細胞系HIOEC購自于上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院。

HIOEC的培養(yǎng)基為K-SFM；Tca8113、HN13的培養(yǎng)基為DMEM；以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、細胞總RNA的提取

1)當(dāng)細胞達80-90％融合時終止培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化收集細胞于1.5m1EP管中，每管中加入lm1Trizol緩慢搖動破碎細胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去DNA：每個1.5m1EP管加入0.2ml三氯甲烷，搖晃15s，室溫放置10min。4℃，12000rpm離心15min。

剩余操作步驟同組織中RNA提取過程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實施例2.

4、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常粘膜上皮細胞相比，LMOD3基因在口腔鱗狀細胞癌細胞Tca8113、HN13中表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實施例4LMOD3基因的沉默

1、細胞培養(yǎng)

人口腔鱗狀細胞癌細胞株Tca8113，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、siRNA設(shè)計

針對LMOD3基因的siRNA序列：

陰性對照siRNA序列(siRNA-NC)：

正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.7)，

反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.8)；

siRNA1-LMOD3：

正義鏈為5’-AGAAGUUCUUCUUGAUCUGAA-3’(SEQ ID NO.9)，

反義鏈為5’-CAGAUCAAGAAGAACUUCUCG-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA2-LMOD3：

正義鏈為5’-AAGAGAUUUAUGAUUGAAGUU-3’(SEQ ID NO.11)，

反義鏈為5’-CUUCAAUCAUAAAUCUCUUGU-3’(SEQ ID NO.12)；

將細胞按4×10⁴/孔接種到六孔細胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中細胞培養(yǎng)24h，在無雙抗、含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購自于Invitrogen公司)的說明書轉(zhuǎn)染。

將實驗分為三組：對照組(Tca8113)、陰性對照組(siRNA-NC)和實驗組(siRNA1-LMOD3、siRNA2-LMOD3)，其中陰性對照組siRNA與LMOD3基因的序列無同源性，濃度為20nM/孔，同時分別進行轉(zhuǎn)染。

3、QPCR檢測LMOD3基因的轉(zhuǎn)錄水平

3.1細胞總RNA的提取

具體步驟同實施例3。

3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。

3.3QPCR擴增步驟同實施例2。

4、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，干擾LMOD3基因表達組與對照組之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，陰性對照組、陽性對照組以及siRNA2-LMOD3組，siRNA1-LMOD3組能夠顯著降低LMOD3基因的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

實施例5ELISA檢測Tca8113細胞中LMOD3的蛋白表達

應(yīng)用雙抗體夾心酶標免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析法測定Tca8113細胞上清中LMOD3蛋白水平。RNA干擾后第六天，分別收集三組Tca8113細胞的上清液，按照ELISA試劑盒操作流程定量檢測腫瘤細胞上清液中LMOD3的濃度。

1、配置濃度為70000pg/ml的標準品，10倍稀釋后，再進行2倍倍比稀釋，共有7個稀釋度。

2、加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?0μl，余孔分別加不同濃度梯度的標準品和待測樣品各50μl。輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋，37℃反應(yīng)2h。

3、棄去液體，晾干。每孔加200μl VEGF-C結(jié)合物。37℃，120min后，棄去孔內(nèi)液體，晾干，PBS洗板3次。

4、依序每孔加底物溶液200μl，37℃避光顯色30min。

5、依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)。

6、用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。所有標準品和待測樣品的OD值均需減去零孔的OD值以得到校正值。

7、計算樣品的實際濃度。

8、結(jié)果如下表1所示，siRNA沉默Tca8113細胞的LMOD3基因，LMOD3的蛋白含量也相應(yīng)降低，說明沉默LMOD3基因可以抑制LMOD3基因的表達。

表1ELISA檢測不同組別細胞中的LMOD3蛋白的表達

實施例6MTT法檢測Tca8113細胞增殖活性

應(yīng)用MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium，甲基噻唑基四唑)法檢測LMOD3基因沉默后對Tca8113細胞增殖活性的影響。

1、細胞培養(yǎng)將Tca8113細胞按1×10³/孔接種于96孔板，每孔100μ1，37℃，5％CO₂孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)。

2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。

3、MTT檢測

1)分別于轉(zhuǎn)染1～7天時，棄掉各孔培養(yǎng)基，加入MTT(5mg/ml)20μl。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h。

2)吸去混合液，每孔加入DMSO 200μl，震蕩10min使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫儀上測490nm處的光吸收值，記錄結(jié)果。

4、以時間為橫軸，光吸收值(OD)為縱軸繪制細胞生長曲線。

5、結(jié)果：

結(jié)果如圖4所示，與對照相比，轉(zhuǎn)染siRNA1-LMOD3組的細胞增殖顯著降低。

實施例7Transwell細胞體外侵襲實驗

RNA干擾后第六天收集不同組別的Tca8113細胞，重懸于培養(yǎng)液中，使細胞終濃度為2×10⁶/ml，吸取100μl細胞懸液加入Transwell小室中。應(yīng)用Transwell小室方法觀察LMOD3基因沉默對Tca8113細胞侵襲性的影響。

1、將Matrigel(4μg/μl)放入4℃融化，準備冰盒(冰浴環(huán)境)。Matrigel用DMEM稀釋8倍后使用。在Transwell小室濾膜(8μm孔徑)的外表面涂8μg人纖粘連蛋白，置超凈臺內(nèi)風(fēng)干。

2、在6孔Transwell小室濾膜的內(nèi)表面鋪以100μ1/孔的Matrigel膠，37℃、5％CO₂孵箱內(nèi)孵育1h，形成一個基質(zhì)屏障層備用。

3、在6孔板每孔內(nèi)加入含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液2.5m1。

4、收集對數(shù)生長期的細胞，重懸于培養(yǎng)液中，終濃度為2×10⁶/ml。

5、將細胞懸液加入Transwell小室中，每孔100μ1，將小室浸于6孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃、5％CO₂孵箱內(nèi)孵育24h。

6、將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定1分鐘。

7、HE染色：蘇木精染色3min，水洗；伊紅染色10～30s，水洗。并用棉簽擦掉未穿過膜的細胞。

8、顯微鏡下觀察、照相并計數(shù)侵襲細胞數(shù)，每膜計數(shù)上下左右中5個不同視野的透過細胞數(shù)，計算平均值。每組平行設(shè)3個濾膜。

9、數(shù)據(jù)處理

用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示。多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

10、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，細胞在transwell小室中培養(yǎng)24h后，相比其他組細胞，siRNA1-LMOD3組聚碳酸酯膜下室面的細胞數(shù)顯著減少。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120> LMOD3在制備口腔鱗癌診療制劑中的應(yīng)用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgtcagagc acagcagaaa ttcagatcaa gaagaacttc tcgatgagga gattaatgaa 60

gatgaaatct tggccaactt gtctgctgaa gaactgaaag aactgcagtc ggaaatggaa 120

gtcatggccc ctgaccccag ccttcccgtg ggaatgattc agaaagatca aactgacaag 180

ccaccgacag gaaacttcaa tcataaatct cttgttgatt atatgtattg ggaaaaggca 240

tccaggcgca tgctggaaga ggaacgagtt cctgtcacct ttgtgaaatc cgaggaaaag 300

actcaagaag agcatgaaga aatagaaaaa cgtaataaaa atatggccca gtatttaaaa 360

gaaaagctca ataatgaaat agttgcaaat aaaagagaat caaagggcag cagcaatatc 420

caagaaacag atgaagaaga tgaagaagaa gaagatgatg atgatgacga cgaaggagaa 480

gatgatggtg aagagagtga agaaacgaac agagaagagg aaggcaaagc aaaggaacaa 540

attagaaatt gtgagaacaa ctgccagcag gtaactgaca aagcattcaa agaacagaga 600

gacagaccag aggcccaaga acaaagtgag aaaaaaatat cgaaattaga tcctaagaag 660

ttagctctag acaccagctt tttgaaggta agtacaaggc cttcaggaaa ccagacagac 720

ctggatggga gcttgaggag agttaggaaa aatgatcctg acatgaagga actcaacctg 780

aacaacattg aaaacatccc caaagaaatg ttactggact ttgtcaatgc aatgaagaaa 840

aacaagcaca tcaaaacatt cagtttagcc aatgtgggtg cagatgagaa tgtagcattt 900

gccttggcta acatgttgcg tgaaaataga agcatcacca ctctcaacat cgagtccaat 960

ttcatcacag gtaaagggat tgtggccatc atgaggtgtc tccagtttaa tgagacgcta 1020

actgagcttc ggtttcacaa tcagaggcac atgttgggtc accatgctga aatggaaata 1080

gccaggcttt tgaaggcaaa caacactctc ctgaagatgg gctaccattt tgagcttccg 1140

ggtcccagaa tggtggtcac taatctgctc accaggaatc aggataaaca aaggcagaaa 1200

cgacaggaag agcaaaaaca gcagcaactc aaggaacaga agaagctgat agccatgtta 1260

gagaatgggt tggggctgcc ccctgggatg tgggagctgt tgggaggacc caagccagat 1320

tccagaatgc aggaattctt ccagccaccg ccacctcggc ctcccaaccc ccaaaatgtc 1380

ccctttagtc aacgcagtga aatgatgaaa aagccatcgc aggccccgaa gtacaggaca 1440

gaccctgact ccttccgggt ggtgaagctg aagagaatcc agcgcaaatc tcggatgccg 1500

gaagccagag aaccacccga gaaaaccaac ctcaaagatg tcatcaaaac gctcaagcca 1560

gtgccgagaa acaggccacc cccattggtg gaaatcactc ccagagatca gctgctaaac 1620

gacattcgtc acagcagtgt cgcctatctt aaacctgtgc aactgccaaa agaactggcg 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Ser Glu His Ser Arg Asn Ser Asp Gln Glu Glu Leu Leu Asp Glu

1 5 10 15

Glu Ile Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ala Asn Leu Ser Ala Glu Glu Leu

20 25 30

Lys Glu Leu Gln Ser Glu Met Glu Val Met Ala Pro Asp Pro Ser Leu

35 40 45

Pro Val Gly Met Ile Gln Lys Asp Gln Thr Asp Lys Pro Pro Thr Gly

50 55 60

Asn Phe Asn His Lys Ser Leu Val Asp Tyr Met Tyr Trp Glu Lys Ala

65 70 75 80

Ser Arg Arg Met Leu Glu Glu Glu Arg Val Pro Val Thr Phe Val Lys

85 90 95

Ser Glu Glu Lys Thr Gln Glu Glu His Glu Glu Ile Glu Lys Arg Asn

100 105 110

Lys Asn Met Ala Gln Tyr Leu Lys Glu Lys Leu Asn Asn Glu Ile Val

115 120 125

Ala Asn Lys Arg Glu Ser Lys Gly Ser Ser Asn Ile Gln Glu Thr Asp

130 135 140

Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Gly Glu

145 150 155 160

Asp Asp Gly Glu Glu Ser Glu Glu Thr Asn Arg Glu Glu Glu Gly Lys

165 170 175

Ala Lys Glu Gln Ile Arg Asn Cys Glu Asn Asn Cys Gln Gln Val Thr

180 185 190

Asp Lys Ala Phe Lys Glu Gln Arg Asp Arg Pro Glu Ala Gln Glu Gln

195 200 205

Ser Glu Lys Lys Ile Ser Lys Leu Asp Pro Lys Lys Leu Ala Leu Asp

210 215 220

Thr Ser Phe Leu Lys Val Ser Thr Arg Pro Ser Gly Asn Gln Thr Asp

225 230 235 240

Leu Asp Gly Ser Leu Arg Arg Val Arg Lys Asn Asp Pro Asp Met Lys

245 250 255

Glu Leu Asn Leu Asn Asn Ile Glu Asn Ile Pro Lys Glu Met Leu Leu

260 265 270

Asp Phe Val Asn Ala Met Lys Lys Asn Lys His Ile Lys Thr Phe Ser

275 280 285

Leu Ala Asn Val Gly Ala Asp Glu Asn Val Ala Phe Ala Leu Ala Asn

290 295 300

Met Leu Arg Glu Asn Arg Ser Ile Thr Thr Leu Asn Ile Glu Ser Asn

305 310 315 320

Phe Ile Thr Gly Lys Gly Ile Val Ala Ile Met Arg Cys Leu Gln Phe

325 330 335

Asn Glu Thr Leu Thr Glu Leu Arg Phe His Asn Gln Arg His Met Leu

340 345 350

Gly His His Ala Glu Met Glu Ile Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asn Asn

355 360 365

Thr Leu Leu Lys Met Gly Tyr His Phe Glu Leu Pro Gly Pro Arg Met

370 375 380

Val Val Thr Asn Leu Leu Thr Arg Asn Gln Asp Lys Gln Arg Gln Lys

385 390 395 400

Arg Gln Glu Glu Gln Lys Gln Gln Gln Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu

405 410 415

Ile Ala Met Leu Glu Asn Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Met Trp Glu

420 425 430

Leu Leu Gly Gly Pro Lys Pro Asp Ser Arg Met Gln Glu Phe Phe Gln

435 440 445

Pro Pro Pro Pro Arg Pro Pro Asn Pro Gln Asn Val Pro Phe Ser Gln

450 455 460

Arg Ser Glu Met Met Lys Lys Pro Ser Gln Ala Pro Lys Tyr Arg Thr

465 470 475 480

Asp Pro Asp Ser Phe Arg Val Val Lys Leu Lys Arg Ile Gln Arg Lys

485 490 495

Ser Arg Met Pro Glu Ala Arg Glu Pro Pro Glu Lys Thr Asn Leu Lys

500 505 510

Asp Val Ile Lys Thr Leu Lys Pro Val Pro Arg Asn Arg Pro Pro Pro

515 520 525

Leu Val Glu Ile Thr Pro Arg Asp Gln Leu Leu Asn Asp Ile Arg His

530 535 540

Ser Ser Val Ala Tyr Leu Lys Pro Val Gln Leu Pro Lys Glu Leu Ala

545 550 555 560

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcaccactc tcaacatc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcagttagc gtctcatt 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

agaaguucuu cuugaucuga a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

cagaucaaga agaacuucuc g 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

aagagauuua ugauugaagu u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

cuucaaucau aaaucucuug u 21