本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測(cè)棉花植株對(duì)黃萎病抗性的方法、一種引物對(duì)、一種檢測(cè)棉花植株對(duì)黃萎病抗性的試劑盒和一種分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

棉花黃萎病是世界性的重大植物病害，常年給棉花生產(chǎn)造成10-15％的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重年份超過(guò)全國(guó)植棉面積的60％，給棉花生產(chǎn)造成沉重打擊。其病原菌隨種子、殘枝敗葉和土壤傳播，菌核在土壤中可存活多年，化學(xué)藥物、耕作栽培等手段對(duì)其無(wú)效，被植物病理界稱為棉花的“癌癥”，成為長(zhǎng)期以來(lái)懸而未決的世界性難題。培育抗病品種被公認(rèn)為是解決棉花黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效的手段，究其一直未能成功的原因是棉花黃萎病的抗性受多個(gè)主效基因共同控制的多基因控制遺傳模式，遺傳機(jī)制較為復(fù)雜(祁偉彥,張永軍,張?zhí)煺?陳捷胤,戴小楓.基于人工病圃篩選和分子標(biāo)記輔助的棉花抗黃萎病育種方法研究與應(yīng)用.分子植物育種,2012,10(5):607-612；蔣鋒,趙君,周雷,郭旺珍,張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病基因的分子標(biāo)記定位.中國(guó)科學(xué),2009,39(9):849-861；葛海燕,汪業(yè)春,郭旺珍,張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病性狀的遺傳及分子標(biāo)記研究.棉花學(xué)報(bào),2008,20(1):19-22；Jiang F,Zhao J,Zhou L,Guo WZ,Zhang TZ.Molecular mapping of Verticillium wilt resistance QTL on chromosomes D7and D9 in upland cotton.Science China SerC-Life Science,2009,52(9):872-884；楊昶,郭旺珍,張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病、纖維品質(zhì)和產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀的QTL定位.分子植物育種,2007,5(6):797-805)，缺乏有效的可用于穩(wěn)定篩選和準(zhǔn)確跟蹤其抗性基因的分子標(biāo)記，鑒定十分困難，導(dǎo)致棉花抗黃萎病育種進(jìn)展緩慢。

早在20世紀(jì)40年代我國(guó)就開始棉花育種，50年代后開展雜交育種，當(dāng)時(shí)棉田病害輕，基本上根據(jù)產(chǎn)量表現(xiàn)選育品種。70年代后棉花枯萎病的發(fā)生逐漸加重，開始了抗枯萎病育種，但育種技術(shù)基本上采用自然感病試驗(yàn)田進(jìn)行抗病性鑒定，由于病原菌不足，田間發(fā)病不均勻，年份間差異大，育種親本和雜交后代材料鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確，材料當(dāng)選或淘汰盲目性較大。90年代后黃萎病發(fā)生漸趨嚴(yán)重，迫切需要培育抗黃萎病品種，但抗病性鑒定與選育仍然采用與抗枯萎病類似的方法，育種效率低，后代材料選擇不準(zhǔn)確，育成品種抗病性差，且抗病品種產(chǎn)量較低。

棉花抗黃萎病分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)已經(jīng)在纖維品種改良、不育系改良等得到應(yīng)用，但是分子標(biāo)記在不同的棉花品種之間的分布存在一定的不規(guī)律性，因此需要更多的分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行互相驗(yàn)證，以便從多個(gè)維度對(duì)棉花植株的抗黃萎病的能力進(jìn)行考察，從而有利于提高棉花育種的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)棉花植株對(duì)黃萎病菌抗性的方法，從而提高棉花育種的效率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)棉花植株對(duì)黃萎病菌抗性的方法，該方法包括：(1)將待測(cè)棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過(guò)濾得到的菌懸液；(2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構(gòu)建的；(3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；(4)分別使用第一引物對(duì)和第二引物對(duì)初篩棉花植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；所述第一引物對(duì)包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物，所述第二引物對(duì)包括如SEQ ID NO:3所示的第二上游引物和如SEQ ID NO:4所示的第二下游引物；如果所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測(cè)棉花植株為抗黃萎病植株。

再一方面，本發(fā)明提供了一種引物對(duì)，其中，該引物對(duì)包括第一引物對(duì)和第二引物對(duì)，所述第一引物對(duì)包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物，所述第二引物對(duì)包括如SEQ ID NO:3所示的第二上游引物和如SEQ ID NO:4所示的第二下游引物。

再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)棉花植株對(duì)黃萎病菌抗性的試劑盒，其中，該試劑盒含有PCR試劑和如上所述的引物對(duì)。

再一方面，本發(fā)明還提供了一種分子標(biāo)記，其中，該分子標(biāo)記包括抗病分子標(biāo)記核酸和感病分子標(biāo)記核酸，所述抗病分子標(biāo)記核酸包括如SEQ ID NO:5所示的左側(cè)抗病位點(diǎn)核酸和SEQ ID NO:6所示的右側(cè)抗病位點(diǎn)核酸；所述感病分子標(biāo)記核酸包括如SEQ ID NO:7所示的左側(cè)抗病位點(diǎn)核酸和SEQ ID NO:8所示的右側(cè)抗病位點(diǎn)核酸。

通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)棉花植株對(duì)黃萎病菌抗性進(jìn)行方便、快速地檢測(cè)，由此提高了棉花育種的效率。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是12種棉種材料的第一擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。

圖2是12種棉種材料的第二擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)棉花植株對(duì)黃萎病菌抗性的方法，該方法包括：(1)將待測(cè)棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過(guò)濾得到的菌懸液；(2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構(gòu)建的；(3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；(4)分別使用第一引物對(duì)和第二引物對(duì)初篩棉花植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；所述第一引物對(duì)包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物，所述第二引物對(duì)包括如SEQ ID NO:3所示的第二上游引物和如SEQ ID NO:4所示的第二下游引物；如果所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測(cè)棉花植株為抗黃萎病植株。

其中，進(jìn)一步地，如果所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:7所示的核酸且所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:8所示的核酸，則指示待測(cè)棉花植株為黃萎病易感植株。

其中，所述PCR擴(kuò)增的條件可以包括：變性溫度為93.5-94.5℃；退火溫度為54.5-55.5℃。

其中，所述PCR擴(kuò)增的條件還可以包括：PCR循環(huán)數(shù)為28-32輪。

其中，制備浸種液時(shí)，相對(duì)于每重量份的死于黃萎病的棉花植株的組織，水的用量可以為4-6重量份。

其中，用浸種液浸泡種子時(shí)，相對(duì)于每重量份的種子，浸種液的用量可以為1-3重量份。

其中，用浸種液浸泡種子的時(shí)間可以為5-8小時(shí)。

其中，構(gòu)建病圃時(shí)，相對(duì)于每平方米的土壤，死于黃萎病的棉花植株的組織的摻入量可以為1-5kg。

其中，待測(cè)棉花植株的基因組DNA可以通過(guò)常規(guī)的DNA提取方法從待測(cè)棉花植株中提取得到。

再一方面，本發(fā)明提供了一種引物對(duì)，其中，該引物對(duì)包括第一引物對(duì)和第二引物對(duì)，所述第一引物對(duì)包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物，所述第二引物對(duì)包括如SEQ ID NO:3所示的第二上游引物和如SEQ ID NO:4所示的第二下游引物。

其中，上述引物對(duì)中的各種引物可以通過(guò)常規(guī)的DNA引物合成方法合成得到，上述引物對(duì)中的各種引物可以分開獨(dú)立存放。

再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)棉花植株對(duì)黃萎病菌抗性的試劑盒，其中，該試劑盒含有PCR試劑和如上所述的引物對(duì)。

其中，所述PCR試劑可以包括耐高溫DNA聚合酶、dNTP和PCR緩沖溶液。

再一方面，本發(fā)明還提供了一種分子標(biāo)記，其中，該分子標(biāo)記包括抗病分子標(biāo)記核酸和感病分子標(biāo)記核酸，所述抗病分子標(biāo)記核酸包括如SEQ ID NO:5所示的左側(cè)抗病位點(diǎn)核酸和SEQ ID NO:6所示的右側(cè)抗病位點(diǎn)核酸；所述感病分子標(biāo)記核酸包括如SEQ ID NO:7所示的左側(cè)抗病位點(diǎn)核酸和SEQ ID NO:8所示的右側(cè)抗病位點(diǎn)核酸。

本發(fā)明可通過(guò)檢測(cè)分子標(biāo)記對(duì)棉花植株對(duì)黃萎病菌的抗性進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，淘汰病圃篩選過(guò)程中雖不發(fā)病但仍為感病的植株，減少人力物力的浪費(fèi)，提高育種效率。

以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

收集12種棉種材料，按照文獻(xiàn)(張興華，棉花抗枯、黃萎病研究進(jìn)展及其抗性鑒定方法，江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008,20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，鑒定它們的抗病性，結(jié)果如表1中所列，其中，感病種質(zhì)5份，在表1的感黃萎病材料一欄表示為“S”；抗病種質(zhì)7份，在表1的抗黃萎病材料一欄表示為“R”。

按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法，分離每份種質(zhì)的基因組DNA。以每份種質(zhì)的基因組DNA為模板，采用正向引物如SEQ ID NO:1所示(5'-ATATAAACGATAACACAACGGTA-3')且反向引物如SEQ ID NO:2所示(5'-ATGGCACACAAAGTGACATGA-3')的第一引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，變性溫度為94℃；退火溫度為55℃：PCR循環(huán)數(shù)為30輪；分別得到每份材料的第一擴(kuò)增產(chǎn)物。

以每份種質(zhì)的基因組DNA為模板，采用正向引物如SEQ ID NO:3所示(5'-GCTATTTACTGCTGTTTTACTGC-3')且反向引物如SEQ ID NO:4所示(5'-ACATTTTTTTCAACAAACTTGTG-3')的第二引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，變性溫度為94℃；退火溫度為55℃：PCR循環(huán)數(shù)為30輪；分別得到每份材料的第二擴(kuò)增產(chǎn)物。

按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法，將第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)；圖1是12種棉種材料的第一擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖2是12種棉種材料的第二擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；將12種棉種材料的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果如表1所示。

表1

表1的結(jié)果證明：如果第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測(cè)棉花植株為抗黃萎病植株；如果第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:7所示的核酸或者第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:8所示的核酸，則指示待測(cè)棉花植株為感黃萎病植株。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，待測(cè)的棉花植株為軍棉1號(hào)棉花品種和海島棉7124棉花品種的F2代種子。軍棉1號(hào)棉花品種和海島棉7124棉花品種的F2代種子對(duì)黃萎病的抗性是事先不知道的。

將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用等重量的水浸泡48小時(shí)，過(guò)濾得到含有黃萎病致病菌的浸種液。

軍棉1號(hào)棉花品種和海島棉7124棉花品種的F2代種子浸泡于上述含有黃萎病致病菌的浸種液中24小時(shí)，得到浸泡后的種子，其中，相對(duì)于每重量份的種子，浸種液的用量為5重量份。

將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，摻入土壤中，相對(duì)于每平方米的土壤，死于黃萎病的棉花植株的組織的摻入量為3kg，構(gòu)建病圃。將浸泡后的種子種植于病圃中，共長(zhǎng)出197株棉苗，但僅有36株存活并最終收獲種子，其余均死于黃萎病，得到36個(gè)抗黃萎病的棉花植株，分別記錄為初篩棉花植株1-36。

提取36個(gè)初篩棉花植株的DNA，采用正向引物如SEQ ID NO:1所示(5'-ATATAAACGATAACACAACGGTA-3')且反向引物如SEQ ID NO:2所示(5'-ATGGCACACAAAGTGACATGA-3')的第一引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到每份材料的第一擴(kuò)增產(chǎn)物，并且采用正向引物如SEQ ID NO:3所示(5'-GCTATTTACTGCTGTTTTACTGC-3')且反向引物如SEQ ID NO:4所示(5'-ACATTTTTTTCAACAAACTTGTG-3')的第二引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到每份材料的第二擴(kuò)增產(chǎn)物，將第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，待測(cè)植株1-4、6、8-10、12-17、19-33和36第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:5所示的核酸且第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，而待測(cè)植株5、7、11、18、34和35的第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:7所示的核酸且第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:8所示的核酸。

根據(jù)上述結(jié)果，指示待測(cè)植株1-4、6、8-10、12-17、19-33和36為黃萎病抗病植株，而植株5、7、11、18、34和35為黃萎病感病植株。

對(duì)比例1

按照文獻(xiàn)(張興華，棉花抗枯、黃萎病研究進(jìn)展及其抗性鑒定方法，江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008,20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，對(duì)實(shí)施例2的初篩棉花植株1-36的種子種植后進(jìn)行再次抗病性鑒定，植株1-4、6、8-10、12-17、19-33和36的黃萎病情指數(shù)均小于20，為抗黃萎病棉花植株，而植株5、7、11、18、34和35的黃萎病情指數(shù)均大于40，為黃萎病感病植株，與實(shí)施例2的指示結(jié)果相同。

通過(guò)實(shí)施例2和對(duì)比例1比較可見，本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)棉花植株對(duì)黃萎病抗性的準(zhǔn)確的檢測(cè)。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說(shuō)明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所

<120> 分子標(biāo)記和引物對(duì)以及檢測(cè)棉花植株對(duì)黃萎病菌抗性的方法和試劑盒

<130> 1014CAAS

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 1

atataaacga taacacaacg gta 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 2

atggcacaca aagtgacatg a 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 3

gctatttact gctgttttac tgc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 4

acattttttt caacaaactt gtg 23

<210> 5

<211> 251

<212> DNA

<213> Gossypium sp.

<400> 5

atataaacga taacacaacg gtaacatcta gaatatagaa tttatcaacg gttattagct 60

ttccatgtaa atgtttgaat agccttatgt taccatacat atatatatat atatatatat 120

ataatgatgc taaatttata ataataataa aatatctcac caaaacaact cataaacacc 180

attagtatta acaataataa agtttaacta atgaaaaaaa gttataataa tcatgtcact 240

ttgtgtgcca t 251

<210> 6

<211> 217

<212> DNA

<213> Gossypium sp.

<400> 6

gctatttact gctgttttac tgctattttg ttattatatt attattatta ttattttatt 60

attattattt agatagtata taactcttat tttattgtta attttgctac tattttagag 120

tcatttgttt tctaaattac aactatttta gtgttattta ggtataaaga catattcaat 180

atgttgaata ttaacacaag tttgttgaaa aaaatgt 217

<210> 7

<211> 241

<212> DNA

<213> Gossypium sp.

<400> 7

atataaacga taacacaacg gtaacatcta gaatatagaa tttatcaacg gttattagct 60

ttccatgtaa atgtttgaat agccttatgt taccatacat atatatatat ataatgatgc 120

taaatttata ataataataa aatatctcac caaaacaact cataaacacc attagtatta 180

acaataataa agtttaacta atgaaaaaaa gttataataa tcatgtcact ttgtgtgcca 240

t 241

<210> 8

<211> 194

<212> DNA

<213> Gossypium sp.

<400> 8

gctatttact gctgttttac tgctattttg ttttattatt attatttaga tagtatataa 60

ctcttatttt attgttaatt ttgctactat tttagagtca tttgttttct aaattacaac 120

tattttagtg ttatttaggt ataaagacat attcaatatg ttgaatatta acacaagttt 180

gttgaaaaaa atgt 194