本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，且特別涉及一種檢測ABAT基因的引物組合、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

γ-氨基丁酸GABA(γ-aminobutyric acid，GABA；)代謝途徑是廣泛存在于動植物和微生物中的TCA(Tricarboxylic Acid，TCA)循環(huán)一個代謝旁路；該代謝途徑最早在馬鈴薯塊莖中發(fā)現(xiàn)。GABA代謝途徑主要由三個酶組成：谷氨酸脫羧酶GAD(Glutamate decarboxylase，GAD)、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶GABA-T(γ-aminobutyric acid transaminases，GABA-T；在人體中簡寫為ABAT)和琥珀酸半醛脫氫酶SSADH(succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH)。GABA代謝途徑起始于TCA循環(huán)中的α-酮戊二酸α-KG(α-Ketoglutarate，α-KG)經(jīng)谷氨酸脫氫酶GDH(glutamate dehydrogenase，GDH)的催化生成谷氨酸Glu(glutamate，Glu)，谷氨酸經(jīng)線粒體跨膜運輸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中；在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)谷氨酸脫羧酶GAD催化一個非可逆反應(yīng)，生成γ-氨基丁酸GABA，γ-氨基丁酸GABA又經(jīng)線粒體跨膜運輸進(jìn)入線粒體內(nèi)；γ-氨基丁酸GABA經(jīng)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶GABA-T作用，生成琥珀酸半醛SSA(succinic semialdehyde，SSA)；琥珀酸半醛SSA再經(jīng)琥珀酸半醛脫氫酶SSADH(succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH)的催化生成琥珀酸Succinate回到TCA循環(huán)中，而且SSADH催化的這一步反應(yīng)是一個不可逆反應(yīng)。

GABA途徑在動植物和微生物中都發(fā)揮著重要的作用，尤其是與動植物及人類的生長發(fā)育密切相關(guān)。GABA途徑在人體中與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能密切相關(guān)，GABA在脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)；在人體中GABA能通過神經(jīng)活動調(diào)節(jié)降低血壓的作用。GABA途徑能保持大腦中興奮和抑制間的平衡，在大腦線粒體中這一途徑顯得尤為重要。

人體GABA的缺乏和過度累積會導(dǎo)致非特異的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，包括精神運動性阻滯、語言發(fā)育推遲和癲癇等。人體GABA的累積有可能是ABAT基因突變等原因造成，ABAT基因缺失導(dǎo)致GABA代謝受阻而累積，進(jìn)一步影響神經(jīng)系統(tǒng)功能。但是，如果ABAT基因序列本身正常，但是由于ABAT基因甲基化的影響，也會導(dǎo)致ABAT的轉(zhuǎn)錄翻譯異常，進(jìn)而影響GABA的代謝，導(dǎo)致GABA的累積。

目前，市場上幾乎沒有針對ABAT基因的檢測手段，更少有針對ABAT基因序列甲基化和ABAT基因的檢測試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測ABAT基因的引物組合，此引物組合能快速準(zhǔn)確的檢測ABAT基因，且該引物組合沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體結(jié)構(gòu)，反應(yīng)靈敏，擴增片段長度合適；退火溫度合適，無非特異性條帶。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述引物組合在制備用于ABAT基因突變檢測的試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三目的在于提供上述引物組合在制備用于胎兒產(chǎn)前ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應(yīng)用，該試劑盒能方便快捷、準(zhǔn)確、特異性的鑒定ABAT基因，且該試劑盒的成本低廉，適合推廣應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

一種檢測ABAT基因的引物組合，引物組合包括用于擴增SEQ ID NO.1所示的堿基序列的第1-1202位區(qū)段的第一引物對、用于擴增SEQ ID NO.1所示的堿基序列的第913-2414位區(qū)段的第二引物對和用于擴增SEQ ID NO.1所示的堿基序列的第2399-4412位區(qū)段的第三引物對；第一引物對的堿基序列如SEQ ID NO.2-3所示；第二引物對的堿基序列如SEQ ID NO.4-5所示；第三引物對的堿基序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

還包括用于擴增SEQ ID NO.8所示的堿基序列的第1344位－1529位區(qū)段的第四引物對，第四引物對的堿基序列如SEQ ID NO.9-10所示。

還包括用于擴增SEQ ID NO.8所示的堿基序列的第5006位－5403位區(qū)段的第五引物對，第五引物對的堿基序列如SEQ ID NO.11-12所示。

上述的任一項引物組合在制備用于ABAT基因突變檢測的試劑中的應(yīng)用。

上述任一項引物組合在制備用于ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應(yīng)用。

上述的任一項引物組合在制備用于胎兒產(chǎn)前ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應(yīng)用。

一種檢測ABAT基因的試劑盒，試劑盒包含上述的檢測ABAT基因的引物組合和/或上述的檢測ABAT基因甲基化的引物組合。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：針對人體ABAT基因表達(dá)序列設(shè)計的引物能快速準(zhǔn)確的檢測該基因，針對ABAT基因序列設(shè)計的甲基化引物，能快速判斷基因的甲基化情況；上述引物組合在胎兒產(chǎn)前檢測及其試劑盒中的應(yīng)用，能幫助檢測快速檢測ABAT基因；上述引物組合在制備ABAT基因檢測試劑盒中的應(yīng)用，具有更廣泛的應(yīng)用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實驗例中的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為本發(fā)明實驗例中的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3為本發(fā)明實驗例中的瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的檢測ABAT的引物組合和檢測ABAT基因甲基化的引物組合及應(yīng)用作進(jìn)一步的說明。

GABA在人體中，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)中，具有重要的作用，如果GABA的水平異常，會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。GABA的水平異常跟編碼γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶ABAT基因異常有關(guān)。當(dāng)ABAT基因存在缺失突變等情況會導(dǎo)致GABA水平的異常。然而，由于表觀遺傳的影響，即使ABAT基因的堿基序列為發(fā)生變化，但是如果序列發(fā)生甲基化，也會導(dǎo)致基因的表達(dá)異常，進(jìn)而影響GABA水平的異常。

因此，發(fā)明人針對上述情況，設(shè)計了針對ABAT基因編碼序列的引物組合和針對ABAT基因甲基化的藥物組合。

一種檢測ABAT基因的引物組合，引物組合包括用于擴增SEQ ID NO.1所示的堿基序列的第1-1202位區(qū)段的第一引物對、用于擴增SEQ ID NO.1所示的堿基序列的第913-2414位區(qū)段的第二引物對和用于擴增SEQ ID NO.1所示的堿基序列的第2399-4412位區(qū)段的第三引物對；第一引物對的堿基序列如SEQ ID NO.2-3所示；第二引物對的堿基序列如SEQ ID NO.4-5所示；第三引物對的堿基序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

該引物組合分為三段且具有交叉重疊的區(qū)段，交叉重疊即不會導(dǎo)致人為的遺漏而導(dǎo)致檢測不準(zhǔn)確；能全面準(zhǔn)確的覆蓋ABAT基因的全長，如果ABAT基因有缺失或者突變的情況，就能通過電泳或者測序的方法，知道具體的缺失或突變的具體位點。

進(jìn)一步地，還包括用于擴增SEQ ID NO.8所示的堿基序列的第1344位－1529位區(qū)段的第四引物對，第四引物對的堿基序列如SEQ ID NO.9-10所示。

進(jìn)一步地，還包括用于擴增SEQ ID NO.8所示的堿基序列的第5006位－5403位區(qū)段的第五引物對，第五引物對的堿基序列如SEQ ID NO.11-12所示。

基因組DNA經(jīng)過重亞硫酸鹽的處理后，通過上述檢測ABAT基因甲基化的引物組合的擴增產(chǎn)物，能夠通過測序和序列比對；如果序列的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，則判斷該堿基未發(fā)生甲基化，如果胞嘧啶為轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，則該點發(fā)生了甲基化。通過此方法能快速的判斷出ABAT基因的甲基化情況。

上述的引物組合在制備用于ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應(yīng)用。

該試劑有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用，能在很大程度上降低胎兒檢測的成本。

上述的引物組合在制備用于胎兒產(chǎn)前ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應(yīng)用。

胎兒產(chǎn)前檢測，更有利于得到健康的胎兒，而且對胎兒的健康狀況有更明確的了解；或者可以提前準(zhǔn)備好對策。

一種檢測ABAT基因的試劑盒，包括上述任一項的引物組合。

進(jìn)一步地，上述試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液、ddH₂O和200μL的PCR反應(yīng)管中一種或多種。

進(jìn)一步地，上述PCR反應(yīng)緩沖液包括Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和溴酚藍(lán)。

進(jìn)一步地，Taq DNA聚合酶為高保真的Taq DNA聚合酶。

在進(jìn)行PCR反應(yīng)的時候，使用高保真的Taq DNA聚合酶，能保真擴增的反應(yīng)的時候，擴真的序列保持與模板的一致性。

進(jìn)一步地，檢測ABAT基因的試劑盒還包括重亞硫酸鹽。

使用重亞硫酸鹽處理目的基因片段，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶則保持不變；通過PCR反應(yīng)后，尿嘧啶轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，然后對PCR產(chǎn)物測序；通過比對測序結(jié)果，如果序列的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成了胸腺嘧啶，則該點未甲基化；如果胞嘧啶未發(fā)生轉(zhuǎn)變則堿基發(fā)生了甲基化。通過此方法判斷序列甲基化位點，精確度高，能找到片段中的每一個甲基化位點。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實施例1

本實施例提供檢測ABAT基因的引物組合，包括用于擴增ABAT基因編碼序列mRNA序列的第1-1202位區(qū)段的第一引物對、用于擴增ABAT基因編碼序列mRNA序列的第913-2414位區(qū)段的第二引物對和用于擴增ABAT基因編碼序列mRNA序列的第2399-4412位區(qū)段的第三引物對。第一引物對、第二引物對和第三引物對的序列如表1所示。

上述三對引物組合擴增的片段，覆蓋ABAT基因編碼序列mRNA全長序列。

本實施例提供的檢測ABAT基因編碼序列具體方法，具體如下：

第一部分，細(xì)胞樣本的提取

1取樣，通過羊水穿刺，抽取15-25nL的羊水，1500rpm離心5min，取沉淀；

2培養(yǎng)，將沉淀用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液分別加入到兩個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶中加有F10培養(yǎng)液2.1mL和小牛血清0.9mL，37培訓(xùn)箱靜置培養(yǎng)6-7天；

3富集，用胰蛋白酶處理培養(yǎng)液，然后培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管中，1500rpm離心10min,棄上清液，沉淀的細(xì)胞樣品保存?zhèn)溆茫?/p>

第二部分胎兒細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

1取第一部分獲得細(xì)胞樣品(50-100mg)液氮研磨，研磨過的樣品加入到RNase-free的EP管中，每管用1mL的Trizol處理，靜置5min；

2以12000rpm離心5min，棄沉淀，加入200μL的氯仿-異戊醇，震蕩均勻后，靜置15min；

3以4℃，12000rpm離心10min，吸取上清液至另外的RNase-free的EP管中，加入500μL異丙醇，混勻，-20℃放置25min；

4以4℃，12000rpm離心10min，棄上清；用75％的乙醇(RNase-free)1mL洗滌兩次，晾干；

5加50μL的ddH₂O(RNase-free)溶解得到total RNA，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

6加反轉(zhuǎn)錄酶，dNTP，oligo dT primer，total RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣品。

第三部分ABAT基因編碼序列的擴增

用第二部分第6步獲得的cDNA樣品為模板0.5μL，PCR反應(yīng)Mix反應(yīng)液10μL，引物對0.5μL/0.5μL，ddH₂O 8.5μL，混合均勻；

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸1kb/min(延伸時間)，72℃延伸2min，35個循環(huán)。得到擴增產(chǎn)物，通過電泳觀察結(jié)果。

第一引物對的退火溫度為60℃，延伸時間為80s；第二引物對的退火溫度為55℃，延伸時間為100s；第三引物對的退火溫度為57℃，延伸時間為130s。

表1 ABAT基因檢測引物對

實施例2

本實施例提供的檢測ABAT基因的引物組包含了實施例1提供的引物組合外，還包括用于擴增ABAT基因組序列片段的第1344位－1529位區(qū)段的第四引物對。第四引物對的序列如表1所示。

本實施例提供第四引物對的使用方法，具體如下：

采用實施例1提供的方法制備細(xì)胞樣品

1取細(xì)胞樣品(50-100mg)加血清至1mL，加入等體積的PBS緩沖液，混勻后12000rpm離心5min，棄上清；

2加入667μL的STE，24μL的20％的SDS，37℃水浴1h，加10μL的20mg/mL的蛋白酶K混勻，55℃水浴消化過夜；

3消化的樣品加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，12000rpm離心10min，取上清加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，12000rpm離心10min；

4取上清加入等體積的氯仿：異戊醇，漩渦震蕩，再12000rpm離心10min，重復(fù)一次；

5取上清液加入2倍體積的冰醋酸，1/10體積醋酸鈉水平搖動，直到可見絮狀DNA析出，-20℃處理30min或冰浴15～20min，取出后再次12000rpm離心10min，使DNA沉淀；

6用70％的乙醇洗滌2次。晾干，加入TE緩沖液溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ABAT基因的基因組序列的擴增

本實施例獲得DNA樣品用重亞硫酸鹽處理，獲得的DNA樣品為模板0.5μL，PCR反應(yīng)Mix反應(yīng)液10μL，引物對0.5μL/0.5μL，ddH₂O8.5μL，混合均勻；

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s(延伸時間)，72℃延伸2min，35個循環(huán)。得到擴增產(chǎn)物。

實施例3

本實施例提供的檢測ABAT基因的引物組包含了實施例1和實施例2提供的引物組合外，還包括用于擴增ABAT基因組序列片段第5006位－5403位區(qū)段的第五引物對。第五引物對的序列如表1所示。第五引物對的退火溫度65℃，延伸30s。

本實施例提供的第五引物對的具體使用方法，參考實施例2提供的使用方法。

實施例4

本實施例提供一種檢測ABAT基因的試劑盒，該試劑盒包括實施例1提供的引物組合。該試劑盒可用于檢測ABAT基因編碼序列，可以檢測胎兒的ABAT基因是否正常和完整。且本實施例提供的試劑盒具有良好的靈敏性和特異性，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。

當(dāng)然，在其他本實施例中，本發(fā)明提供的檢測ABAT基因的試劑盒，還可以包括由Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和溴酚藍(lán)構(gòu)成的PCR反應(yīng)緩沖液、ddH₂O和200μL的PCR反應(yīng)管中的一種或多種。

試劑盒的片段擴增方法參考實施例2的處理方法。

實施例5

本實施例提供一種檢測ABAT基因的試劑盒，該試劑盒包括實施例1和實施例2提供的引物組合。該試劑盒可用于檢測ABAT基因編碼序列，可以檢測胎兒的ABAT基因是否正常和完整，以及ABAT基因的基因組片段序列是否有甲基化現(xiàn)象發(fā)生。且本實施例提供的試劑盒具有良好的靈敏性和特異性，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。

當(dāng)然，在其他本實施例中，本發(fā)明提供的檢測ABAT基因的試劑盒，還可以包括由高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和溴酚藍(lán)構(gòu)成的PCR反應(yīng)緩沖液、ddH2O和200μL的PCR反應(yīng)管中的一種或多種。

試劑盒的中第一至第三引物對的使用方法參考實施例1的使用方法；第四引物對的使用方法參考實施例2的處理方法。

實施例6

本實施例提供一種檢測ABAT基因的試劑盒，該試劑盒包括實施例1、實施例2和實施例3提供的引物組合。該試劑盒可用于檢測ABAT基因編碼序列，可以檢測胎兒的ABAT基因是否正常和完整，以及ABAT基因的基因組片段序列是否有甲基化現(xiàn)象發(fā)生。且本實施例提供的試劑盒具有良好的靈敏性和特異性，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。

當(dāng)然，在其他本實施例中，本發(fā)明提供的檢測ABAT基因的試劑盒，還可以包括由高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺和溴酚藍(lán)構(gòu)成的PCR反應(yīng)緩沖液、ddH₂O、200μL的PCR反應(yīng)管和重亞硫酸鹽中的一種或多種。

試劑盒的中第一至第三引物對的使用方法參考實施例1的使用方法；第四引物對的使用方法參考實施例2的處理方法。擴增加過通過基因測序可以獲得精確的結(jié)果。

實驗例

荀某，26歲，懷孕14周。進(jìn)行了胎兒產(chǎn)前檢查，包括ABAT基因的檢測。

檢測原理：

羊水穿刺，是提取羊水中胎兒的脫落細(xì)胞，提取羊水中胎兒脫落細(xì)胞DNA等遺傳信息，對胎兒進(jìn)行檢查。

本實驗例采用實施例6提供的試劑盒進(jìn)行胎兒ABAT基因的產(chǎn)前檢測。

第一至第三引物對的PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段大小正確，如圖1到圖3所示，圖中M表示DNA的Marker，圖中數(shù)字1-3表示三個平行試驗；圖1中目的片段長度1202bp，圖2中目的片段1501bp，圖3中目的片段2013bp；且第一至第三引物對擴增產(chǎn)物經(jīng)測序無堿基突變。第四和第五引物對的PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)測序無甲基化位點。基于以上結(jié)果，可以判斷出荀某的胎兒ABAT基因表達(dá)正常，出現(xiàn)相應(yīng)疾病的可能性基本排除。

綜上所述，本發(fā)明實施例的檢測ABAT基因的引物組合、檢測ABAT基因甲基化的引物組合以及檢測ABAT基因的試劑盒能準(zhǔn)確的檢測ABAT基因的轉(zhuǎn)錄、甲基化等，節(jié)約時間。結(jié)果正確可靠。幫助孕婦家庭控制風(fēng)險。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島松良基因科技有限公司

<120> 一種檢測ABAT基因的引物組合、試劑盒及應(yīng)用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4412

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gtgatcaccc tcattacctc ttctgggccc cctgtggacc tgcgttgacc cagcatgggc 60

tacaatgggg gagttgggta atcgctcccg ttgcatcctg tttctgtctg aaaacccttg 120

tctttctgaa tccatctttc agtctctcac attctgtctt tcccctcctc cttcaccttc 180

cctccgtccc tctcccttgc gcacttgccg ggtaccagct gagtgcatcc ttttcccaaa 240

cctgctctgc ttccaagggg cccttttctg tctcctccac ctgtccccat gttttgggga 300

ctgcctggaa atccgggaca ccctcctgag gagggagctg gtgcccaacg gcacctctta 360

ggatgaaccc agccagctgc gttcctggcc tctgcagaat ggcatacaga aggcatttta 420

agcaagcgag ctgagctcgc cgcaggactc cgactaccag gcaccggtgg cagcacgcaa 480

agggtgtccc tgtccctcaa ggggtcatgg cctccatgtt gctcgcccag cgcctggcct 540

gcagcttcca gcacagctac cgcctgctgg tgcctggatc cagacacatt agtcaagctg 600

cagccaaagt cgacgttgaa tttgattatg atgggcctct gatgaagacg gaagtcccag 660

ggcctagatc tcaggagtta atgaaacagc tgaatataat tcagaatgca gaggctgtgc 720

attttttctg caattacgaa gagagccgag gcaattacct ggttgatgtg gacggcaacc 780

gaatgctgga tctttattcc cagatctcct ctgtccccat aggttacagc caccccgccc 840

tgctgaaact catccaacag cctcaaaatg cgagcatgtt tgtcaacaga cccgccctcg 900

gaatcctgcc tccggagaac tttgtggaga agctccggca gtccttgctc tcggtggctc 960

ccaaagggat gtcccagctc atcaccatgg cctgcggctc ctgctccaat gaaaacgcct 1020

taaagaccat cttcatgtgg taccggagca aggaaagagg gcagaggggc ttctcccagg 1080

aggagctgga gacgtgcatg attaaccagg cccctggctg ccccgactac agcatcctct 1140

ccttcatggg cgcgttccat gggaggacca tgggttgctt agcgaccacg cactctaaag 1200

ccattcacaa gatcgacatc ccttcctttg actggcccat cgcaccgttc ccacggctga 1260

aataccctct ggaagagttt gtgaaagaga accaacagga ggaggcccgc tgtctggaag 1320

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tggagcccat ccagtccgag ggtggagaca accacgcatc cgatgacttc tttcggaagc 1440

tgagagacat cgccaggaag catggctgcg ccttcttggt ggacgaggtc cagaccggag 1500

gaggctgcac gggcaagttc tgggcccatg agcactgggg cctggatgac ccagcagacg 1560

tgatgacctt cagcaagaag atgatgactg ggggcttctt ccacaaggag gagttcaggc 1620

ctaatgctcc ctaccggatc ttcaacacct ggctggggga cccgtccaag aacctgttgc 1680

tggctgaggt catcaacatc atcaagcggg aggacctgct aaataatgca gcccatgccg 1740

ggaaggccct gctcacagga ctgctggacc tccaggcccg gtacccccag ttcatcagca 1800

gggtgagagg acgaggcacc ttttgctcct tcgatactcc cgatgattcc atacggaata 1860

agctcatttt aattgccaga aacaaaggtg tggtgttggg tggctgtggt gacaaatcca 1920

ttcgtttccg tcccacgctg gtcttcaggg atcaccacgc tcacctgttc ctcaatattt 1980

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cagaggtgaa tgcacagtga agggtgattt gtggggaggg agcatttttg gtggtcttgg 2160

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cattggttta agcccagaga tcctgcttga gccctggact catcttggga agggccatgg 2280

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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tttcttgcat tagaagaaat ggttcatatg ggccaggcac agtggcccac acctgtaata 3720

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