本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于檢測關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物、基因芯片以及制備方法。

背景技術(shù)：

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種退變性關(guān)節(jié)疾病，涉及關(guān)節(jié)的所有組織，在病變過程中可觀察到關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨及周圍軟組織(肌肉、韌帶等)的結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨失常，傳導(dǎo)應(yīng)力負(fù)荷失常，導(dǎo)致軟骨的生物力學(xué)及生物化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，逐漸發(fā)生軟骨的降解質(zhì)變，最終發(fā)生軟骨變薄、纖維化、糜爛、裂隙、肉眼下潰瘍及全層關(guān)節(jié)面消失等。以往對OA的病因研究多集中于關(guān)節(jié)軟骨的破壞，越來越多的研究表明，軟骨下骨改變在OA發(fā)病過程中起著積極作用，即軟骨下骨硬化與OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，不只是OA發(fā)生的結(jié)果，而且，軟骨下骨的改變有可能先于關(guān)節(jié)軟骨的改變。

關(guān)節(jié)軟骨下骨包括皮質(zhì)終板以及緊靠其下方的骨小梁、血管和小梁間的腔隙。軟骨下骨的基本功能為吸收應(yīng)力、緩沖震蕩和維持關(guān)節(jié)的形狀。在OA病例中，軟骨下骨常出現(xiàn)硬化、囊性化、無菌性壞死等改變。有研究表明軟骨下骨改變可引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨破壞及進(jìn)行性惡化，軟骨下骨硬化可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能失調(diào)及OA發(fā)生。基因芯片是將大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等載體上，再將樣品用熒光染料標(biāo)記制備成探針，與芯片進(jìn)行分子雜交反應(yīng)，檢測雜交信號強(qiáng)度，并經(jīng)計算機(jī)分析和數(shù)據(jù)處理，從而對基因序列和功能進(jìn)行大規(guī)模、高速度、高通量的研究。已有學(xué)者將基因芯片用于骨關(guān)節(jié)炎的研究，報道了利用基因芯片研究OA軟骨或骨組織的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了一系列與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病密切相關(guān)。

骨性關(guān)節(jié)炎是一種退變性關(guān)節(jié)疾病，涉及關(guān)節(jié)的所有組織，在病變過程中可觀察到關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨及周圍軟組織(肌肉、韌帶等)的結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退化，傳導(dǎo)應(yīng)力負(fù)荷失常，導(dǎo)致關(guān)節(jié)的生物力學(xué)及生物化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，逐漸發(fā)生軟骨的降解質(zhì)變，最終發(fā)生軟骨變薄、纖維化、糜爛、裂隙、肉眼下潰瘍及全層關(guān)節(jié)面消失等。據(jù)報道，英、美國有5％-10％成年人患有膝關(guān)節(jié)炎；在我國，流行病學(xué)的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)有癥狀的OA患病率在5.1％-20.8％之間，中國OA患者人數(shù)估計超過1億。這種多因素疾病是引起老年人疼痛和傷殘的首要原因，直接導(dǎo)致了嚴(yán)重的個人與社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，OA的治療尚缺乏治愈的有效手段，常用的治療方法主要是理療、藥物等，到了疾病晚期外科手術(shù)治療是唯一的治療方法。

因此，如何有效地對骨性關(guān)節(jié)炎在發(fā)病前期進(jìn)行早期預(yù)測，進(jìn)而警示潛在患者進(jìn)行提早治療對于骨性關(guān)節(jié)炎的康復(fù)以及減輕病痛是非常關(guān)鍵的，然而目前現(xiàn)在技術(shù)中尚未見對骨性關(guān)節(jié)炎早期預(yù)警的分子生物學(xué)手段，有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物，該標(biāo)志物在關(guān)節(jié)炎患者和正常人之間存在差異性表達(dá)，進(jìn)而可以作為檢測關(guān)節(jié)炎患者的標(biāo)志物。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的標(biāo)志物在制備用于檢測關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的應(yīng)用，以期實現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎檢測方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三目的在于一種基因芯片，該基因芯片通過加載特定的探針序列進(jìn)而可以快速地檢測出機(jī)體中標(biāo)志物。

本發(fā)明的第四目的在于提供一種所述的基因芯片的制備方法，該制備方法，簡單有效，通過參數(shù)優(yōu)化后，可以實現(xiàn)芯片準(zhǔn)確檢測效果。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種檢測關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物，所述標(biāo)志物包括1L1-β，其基因序列號為NM-000576.2。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，該基因在正常人和關(guān)節(jié)炎患者存在差異性表達(dá)，具體的，其呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢，該基因上調(diào)的倍數(shù)較正常人相比，其可以達(dá)到12倍以上，因此，在檢測關(guān)節(jié)炎的過程中，可以通過測定該基因上調(diào)表達(dá)情況進(jìn)而可以判斷出該患者是否是潛在的關(guān)節(jié)炎患者，為潛在患者提供了預(yù)警判斷，以方便患者及早治療，減輕病痛。

可選的，所述標(biāo)志物還包括C16orf35或1L-8，其基因序列號分別為NM-012075.1和NM-000584.2。

另外，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，上述基因在關(guān)節(jié)炎患者和正常人之間也存在不同程度的差異表達(dá)，其分別交正常人相比，上調(diào)表達(dá)的倍數(shù)均高于6倍以上(小于12倍)，因此其也可以單獨(dú)或者經(jīng)過與1L1-β組合作為檢測關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物。

鑒于上述的標(biāo)志物在檢測關(guān)節(jié)炎方面效果，其作為制備用于檢測關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的應(yīng)用也理應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，具體的，這些產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交芯片或高通量測序平臺檢測所述標(biāo)志物基因表達(dá)以診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品。

本發(fā)明還提供了一種基因芯片，所述基因芯片負(fù)載有能夠特異性檢測權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物的探針片段。所述基因芯片還負(fù)載有能夠特異性檢測NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008或NM_001007612的探針；該6種基因其在關(guān)節(jié)炎患者和正常人之間存在至少2倍以上(6倍以下)的上調(diào)表達(dá)，因此本發(fā)明提供的基因芯片中還可以負(fù)載有檢測這些基因的探針序列，以期通過輔助檢測方式提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一種所述的基因芯片的制備方法，包括以下步驟：

1)、制備芯片載體；

2)、將用于特異性檢測標(biāo)志物的寡核苷酸片段固定在所述芯片載體上。

為了實現(xiàn)芯片快速高效地制備，本發(fā)明對上述的制備方法進(jìn)行優(yōu)化，可選的，在步驟1)中，具體包括：

空白載體清洗干凈，浸泡于含0.5-0.8％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(體積含量)的且質(zhì)量濃度為90-94％的丙酮中5-6分鐘，再用95-96％的丙酮(質(zhì)量濃度)清洗3-5次后于50-60℃干燥40-50分鐘，得到氨基修飾的載體；

所述載體包括玻片或尼龍膜。

尼龍膜表面多孔、具有滲透性，優(yōu)點是可以重復(fù)使用。玻璃基片，其表面無滲透作用，加樣量低，在芯片制備過程中易除去非特異性雜交產(chǎn)物，可以平行分析樣品。

可選的，在步驟2)中，具體包括：

氨基修飾的載體用0.25-0.4％苯異二硫氰酸酯(質(zhì)量濃度)處理1.5-1.8小時；再用含體積含量為1.5-1.8％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-異氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡5-8分鐘，然后用體積比為1:1的甲醇和丙酮洗5-8分鐘后儲存于真空干燥器中干燥；

采用點樣儀將5’端氨基修飾的寡核苷酸探針片段固定在干燥后的載體上。

上述方法處理的玻片與氨基修飾的探針結(jié)合效果好。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)、提供了一種可以有效檢測關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物，為關(guān)節(jié)炎的早期預(yù)警檢測提供了便利；另外，該標(biāo)志物也為關(guān)節(jié)炎檢測的臨床研究提供基礎(chǔ)資料。

(2)、提供了一種關(guān)節(jié)炎檢測的新工具，通過基因芯片對該標(biāo)志物進(jìn)行快速檢測，再通過軟件分析，確定這些標(biāo)志基因的差異表達(dá)情況判定該機(jī)體是否患有關(guān)節(jié)炎。

(3)、對于基因芯片的制備方法進(jìn)行了優(yōu)選，載體選擇得當(dāng)，并且對載體進(jìn)行了特殊的處理，使得點樣后的載體中，探針能夠牢固地固定在載體上，提高芯片的使用效果。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明制備廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明提供了一種檢測關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物，該標(biāo)志物包括1L1-β9(其基因序列號為NM-000576.2)，并且優(yōu)選的，該標(biāo)志物還可以為C16orf35或1L-8，其基因序列號分別為NM-012075.1和NM-000584.2。上述的幾種基因在關(guān)節(jié)炎患者和正常人之間均存在不同程度的差異性上調(diào)表達(dá)，因此可以通過檢測上述幾種基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)從而預(yù)判個體是否患有關(guān)節(jié)炎。進(jìn)一步地，為了提供便利，本申請還提供了可以檢測上述基因的基因芯片，所述基因芯片負(fù)載有能夠特異性檢測上述標(biāo)志物的探針片段。優(yōu)選的，所述基因芯片還負(fù)載有能夠特異性檢測NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008或NM_001007612的探針。

接下來，通過對基因芯片的具體制備方法舉出具體的實施例以說明本申請的詳細(xì)技術(shù)方案。

實施例1

制備芯片載體；

空白玻片載體清洗干凈，浸泡于含0.5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且質(zhì)量濃度為90％的丙酮中5分鐘，再用95％的丙酮清洗3次后于50℃干燥50分鐘，得到氨基修飾的載體；

將用于特異性檢測標(biāo)志物的寡核苷酸片段固定在所述芯片載體上。

氨基修飾的玻片用0.25％苯異二硫氰酸酯處理1.8小時；再用含1.5％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-異氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡5分鐘，然后用體積比為1:1的甲醇和丙酮洗5分鐘后儲存于真空干燥器中干燥；

采用點樣儀將5’端氨基修飾的寡核苷酸探針片段(可特異性識別1L1-β)固定在干燥后的玻片上。

實施例2

空白玻片載體清洗干凈，浸泡于含0.5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且質(zhì)量濃度為90％的丙酮中5分鐘，再用95％的丙酮清洗3次后于60℃干燥50分鐘，得到氨基修飾的載體；

氨基修飾的玻片用0.25％苯異二硫氰酸酯處理1.8小時；再用含1.8％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-異氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡8分鐘，然后用體積比為1:1的甲醇和丙酮洗8分鐘后儲存于真空干燥器中干燥；

采用點樣儀將5’端氨基修飾的寡核苷酸探針(可特異性識別C16orf35和1L-8)片段固定在干燥后的玻片上。

實施例3

空白尼龍膜載體清洗干凈，浸泡于含0.8％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且質(zhì)量濃度為94％的丙酮中6分鐘，再用96％的丙酮清洗5次后于60℃干燥40分鐘，得到氨基修飾的載體；

氨基修飾的尼龍膜載體用0.4％苯異二硫氰酸酯處理1.5小時；再用含1.8％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-異氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡5分鐘，然后用體積比為1:1的甲醇和丙酮洗5分鐘后儲存于真空干燥器中干燥；

采用點樣儀將5’端氨基修飾的寡核苷酸探針片段(能夠特異性檢測NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008和NM_001007612)固定在干燥后的玻片上。

實施例4

空白尼龍膜載體清洗干凈，浸泡于含0.7％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且質(zhì)量濃度為92％的丙酮中5分鐘，再用95％的丙酮清洗4次后于55℃干燥45分鐘，得到氨基修飾的載體；

氨基修飾的尼龍膜載體用0.3％苯異二硫氰酸酯處理1.7小時；再用含1.6％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-異氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡7分鐘，然后用體積比為1:1的甲醇和丙酮洗7分鐘后儲存于真空干燥器中干燥；

采用點樣儀將5’端氨基修飾的寡核苷酸探針片段(可特異性低識別1L1-β)固定在干燥后的玻片上。

實施例5

空白尼龍載體清洗干凈，浸泡于含0.55％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的且質(zhì)量濃度為93％的丙酮中5分鐘，再用95％的丙酮清洗5數(shù)次后于60℃干燥50分鐘，得到氨基修飾的載體；

氨基修飾的白尼龍載體用0.35％苯異二硫氰酸酯處理1.6小時；再用含1.8％的1-[3-(三甲氧基硅)丙基]-1-(4-異氰苯基)硫脲的95％的丙酮浸泡5分鐘，然后用體積比為1:1的甲醇和丙酮洗6分鐘后儲存于真空干燥器中干燥；

采用點樣儀將5’端氨基修飾的寡核苷酸探針片段(可特異性檢測1L1-β、C16orf35、1L-8、NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008和NM_001007612)固定在干燥后的玻片上。

試驗例

基因芯片檢測：5例RA患者和3名健康志愿者采取外周靜脈血3ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC。Trizol法提取總RNA，1％瓊脂糖電泳鑒定RNA完整性。

采用Illumina RNA Amplification Kit將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和線性擴(kuò)增。

具體步驟如下：每個樣品取200ng RNA，以RNAase-free水成11微升體系，加入9微升反轉(zhuǎn)錄母液，合成cDNA。過純化柱清洗純化cDNA后，將純化的cDNA加入10微升轉(zhuǎn)錄母液，體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA。過純化柱純化cRNA。每個樣本上樣量為1500ng cRNA，與雜交混合液混合后加入實施例1-5的基因芯片(每個患者對應(yīng)一個實施例)，55℃反應(yīng)16-22h，清洗后用封閉緩沖液封閉。用Streptavidin-Cy3染色，反應(yīng)后的芯片進(jìn)行掃描。Bead Studio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，挑選RA組與健康志愿者組比較目的基因的上調(diào)情況。統(tǒng)計結(jié)果如下表1所示。

表1試驗例1檢測結(jié)果

通過以上結(jié)果看以看出，關(guān)節(jié)炎患者與正常人之間的結(jié)果中，上述所列的幾種基因之間明顯存在規(guī)律性地差異上調(diào)情況。其中，1L1-β基因在患者中均存在上調(diào)12倍以上的情形，而C16orf35或1L-8則上調(diào)6倍以上，其他基因的上調(diào)倍數(shù)均在6倍以下，因此上述所有的基因均可以作為檢測關(guān)節(jié)炎患者的標(biāo)志物，檢測結(jié)果主要基于其與正常人之間的上調(diào)倍數(shù)而定，1L1-β上調(diào)12倍以上；或者C16orf35或1L-8上調(diào)6倍以上，12倍以下；或者NM-001356、NM_031560、NM_031757、NP_001102853、NM_001014008或NM_001007612上調(diào)2倍以上，6倍以下即可定性為關(guān)節(jié)炎患者，進(jìn)而為患者的早期診斷起到預(yù)警效果，進(jìn)一步地幫助患者及早治療，減輕病痛。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。