本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，涉及肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因的檢測。

背景技術(shù)：

肝豆?fàn)詈俗冃?又稱Wilson病，WD)，是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病，可引起銅藍(lán)蛋白合成障礙、膽汁中銅排泄受阻，過量的銅不能排出體外而在體內(nèi)沉積，導(dǎo)致肝硬化、神經(jīng)癥狀、角膜K-F環(huán)、尿銅升高等臨床表現(xiàn)。該疾病的發(fā)病與銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的P型ATP酶(即ATP7B蛋白)功能改變相關(guān)。ATP7B蛋白的編碼基因被定位在13q14.3上，包含21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子，編碼1465個(gè)氨基酸。ATP7B基因的突變表現(xiàn)為少數(shù)幾個(gè)熱點(diǎn)突變?yōu)橹?，伴有廣泛存在的散在突變。國內(nèi)外、國內(nèi)不同地區(qū)、民族間主要熱點(diǎn)突變都存在一定的差異。目前研究表明，亞洲人的突變熱點(diǎn)為Arg778Leu，中國人群中該突變熱點(diǎn)的發(fā)病率也占約70％。由于該疾病為一種隱形遺傳疾病，發(fā)病有一定的隱蔽性，對未有表型的人群進(jìn)行該基因檢測將有助于判斷疾病的發(fā)生概率，在產(chǎn)前診斷中將有格外顯著的意義。

現(xiàn)有技術(shù)中已有大量的檢測ATP7B基因的試劑，如PCR檢測試劑。這些試劑的效果各有差異，導(dǎo)致對疾病的診斷出現(xiàn)不同的結(jié)果。因此，本領(lǐng)域中依然存在尋找有效的檢測試劑的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供ATP7B基因的檢測試劑，使得可以便捷地檢測中國人群中的ATP7B基因突變，從而提早診斷是否存在肝豆?fàn)詈俗冃浴?/p>

在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供檢測ATP7B基因的引物組合，所述引物組合包括：

引物對1：

正向引物F1：gaactctcctccctacttgctgg(SEQ ID NO:1)；

反向引物R1：aacatggtgttcagagaagtg(SEQ ID NO:2)；

引物對2：

正向引物F2：gtgaagagttctgggaaatcag(SEQ ID NO:3)；

反向引物R2：cacaaccaccatatagcccaag(SEQ ID NO:4)。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述引物組合還包括：

引物對3：

正向引物F3：gacaatgaaccctcaccaagagc(SEQ ID NO:5)；

反向引物R3：cgaggtctatacgcagcattcc(SEQ ID NO:6)；

引物對4：

正向引物F4：gagtggcttgtaatccaggtgac(SEQ ID NO:7)；

反向引物R4：gccacacacagcatggaagggag(SEQ ID NO:8)；

引物對5：

正向引物F5：ctgcctcaggagtgtgactatg(SEQ ID NO:9)；

反向引物R5：cacgcccaagtccacgtacctc(SEQ ID NO:10)；

引物對6：

正向引物F6：ggaccatttagaaataaccacagc(SEQ ID NO:11)；

反向引物R6：ctgagagagcggaaggaaggcag(SEQ ID NO:12)。

在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種檢測ATP7B基因的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的引物組合。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括用于PCR反應(yīng)的試劑，如Taq酶、dNTP、Taq酶緩沖液等。

在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種檢測ATP7B基因突變的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的引物組合對基因組進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增結(jié)果與野生型ATP7B基因組進(jìn)行比較。

優(yōu)選地，所述檢測過程中，退火過程為：以52℃，退火30秒；再以48℃，退火30秒。

本發(fā)明提供的引物組合對ATP7B的外顯子3、7、8、12、14和16進(jìn)行了擴(kuò)增，這些擴(kuò)增區(qū)域覆蓋了中國人的90％的已知的與肝豆?fàn)詈俗冃韵嚓P(guān)的ATP7B基因突變類型，有效檢測肝豆?fàn)詈俗冃缘目赡苄浴Ｆ渲型怙@子8和12中突變發(fā)生的頻率最高，以這兩個(gè)外顯子的引物組合進(jìn)行檢測可以篩查出70％的突變可能性。本發(fā)明的引物組合與染色體的結(jié)合性好，擴(kuò)增靈敏度高，檢測的準(zhǔn)確率高；并且本發(fā)明的這些引物對可以以相同的程序進(jìn)行退火反應(yīng)，節(jié)省了檢測操作程序，提高效率。

附圖說明

圖1：外顯子8擴(kuò)增產(chǎn)物；

圖2：外顯子12擴(kuò)增產(chǎn)物；

圖3：外顯子3擴(kuò)增產(chǎn)物；

圖4：外顯子7擴(kuò)增產(chǎn)物；

圖5：外顯子14擴(kuò)增產(chǎn)物；

圖6：外顯子16擴(kuò)增產(chǎn)物；

各圖中，marker從上到下分別表示1000、700、500、400、300、200和100bp，泳道1～4分別表示退火溫度為48℃、50℃、52℃以及52℃和48℃組合的擴(kuò)增結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合具體實(shí)施方式說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不限于此。如果沒有其它明確說明，以下具體實(shí)施例中所使用的方法均是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全知道如何實(shí)現(xiàn)這些方法并獲得相應(yīng)的結(jié)果；所使用的試劑和儀器都是常規(guī)試劑和儀器，可以從普通的商購?fù)緩街蝎@得。

實(shí)施例1：PCR引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)ATP7B基因組序列(參見NG_008806.1)，針對中國人突變高發(fā)外顯子3、7、8、12、14和16設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。引物設(shè)計(jì)原則根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》的要求設(shè)計(jì)，同時(shí)還要兼顧不同引物對之間的二級結(jié)構(gòu)和結(jié)合可能性，以及各引物對的退火溫度。設(shè)計(jì)的各外顯子對應(yīng)的引物和反應(yīng)溫度分別如表1所示：

表1：外顯子及其對應(yīng)的引物序列

其中，F(xiàn)代表正向引物，R代表反向引物。

實(shí)施例2：引物擴(kuò)增效果驗(yàn)證

取已鑒定為正常ATP7B基因的血液樣本進(jìn)行效果驗(yàn)證，血液樣本按照常規(guī)的處理方式處理，以用于PCR反應(yīng)。

按照表2的反應(yīng)體系配制反應(yīng)液，每個(gè)外顯子各2管，分別為實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組，其中陰性對照組的模板為水。

表2：反應(yīng)體系

由于各引物對的退火溫度不一，分別設(shè)置幾個(gè)退火溫度進(jìn)行驗(yàn)證，包括48℃、50℃、52℃以及52℃和48℃組合。具體程序?yàn)椋?5℃5min，(95℃1min，退火1min(其中52℃和48℃組合的退火方式為52℃30s然后48℃30s)，72℃1min)40個(gè)循環(huán)，72℃延伸3min。

獲得的產(chǎn)物通過PCR電泳以及測序驗(yàn)證PCR引物效果。根據(jù)圖1～圖6的結(jié)果顯示，本發(fā)明的6對引物均能夠特異性地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)條帶，擴(kuò)增結(jié)果正確(陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果未示出)。每對引物在各自的退火溫度下均有最好的結(jié)果；然而52℃和48℃組合的退火程序?qū)τ诿繉σ锒裕浣Y(jié)果與各自確定的退火溫度的結(jié)果幾乎一樣。為方便實(shí)驗(yàn)，將采用組合退火溫度的方式進(jìn)行檢測。

實(shí)施例3：PCR引物擴(kuò)增檢測肝豆?fàn)詈俗冃圆∪说腁TP7B基因

從臨床收集已確定突變型的肝豆?fàn)詈俗冃圆∪藰颖竞驼颖竟?09例，利用PCR方法使用實(shí)施例1中的引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的體系和條件如實(shí)施例2所示，采用組合退火溫度退火。對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行序列分析和比對，檢測是否存在基因變異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用本發(fā)明的引物進(jìn)行擴(kuò)增，從109例樣本中發(fā)現(xiàn)了38例Arg778Leu突變、10例Pro992Leu突變、2例Arg952Lys突變和1例Arg919Gly突變。這個(gè)結(jié)果與已確定的結(jié)果一致，說明本發(fā)明的PCR引物能夠有效檢測ATP7B基因突變，準(zhǔn)確率高。并且這幾個(gè)外顯子以相同的程序進(jìn)行檢測，有效提高了擴(kuò)增效率，節(jié)省檢測時(shí)間。

序列表

<110> 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120> 檢測肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因的引物組合和方法

<130> Y161265-OI

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F1

<400> 1

gaactctcct ccctacttgc tgg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R1

<400> 2

aacatggtgt tcagagaagt g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F2

<400> 3

gtgaagagtt ctgggaaatc ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R2

<400> 4

cacaaccacc atatagccca ag 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F3

<400> 5

gacaatgaac cctcaccaag agc 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R3

<400> 6

cgaggtctat acgcagcatt cc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F4

<400> 7

gagtggcttg taatccaggt gac 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R4

<400> 8

gccacacaca gcatggaagg gag 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F5

<400> 9

ctgcctcagg agtgtgacta tg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R5

<400> 10

cacgcccaag tccacgtacc tc 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物F6

<400> 11

ggaccattta gaaataacca cagc 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物R6

<400> 12

ctgagagagc ggaaggaagg cag 23