本發(fā)明屬于畜牧業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種牛卷毛基因快速篩選的引物、方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

皮膚組織是動(dòng)物自我保護(hù)免受外物侵?jǐn)_機(jī)體的一道天然屏障，皮膚的形成促使了毛囊的發(fā)生發(fā)育，而毛發(fā)是由皮膚組織中毛囊所產(chǎn)生的角質(zhì)化產(chǎn)物。毛發(fā)纖維的形成受毛囊表皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用調(diào)控，并且只在毛發(fā)生長周期的初期發(fā)生，而在退行期停止，最后在休止期靜止。毛發(fā)的表型特征包括毛發(fā)的長度、密度、形狀及顏色則會(huì)隨著動(dòng)物機(jī)體的不同部位表現(xiàn)出不同的特征。不同物種，或同一物種不同種屬其被毛表型差異較大，具體表現(xiàn)在毛發(fā)的色澤、長度、細(xì)度、密度、品質(zhì)、形態(tài)結(jié)構(gòu)(卷曲與否)等等。

毛發(fā)形態(tài)中的卷曲狀況通常可利用直毛(straight hair)、卷毛(curly hair)和波浪形卷毛(wavy hair)詞語進(jìn)行描述。由于種屬差異，動(dòng)物被毛的分子調(diào)控機(jī)制也較為復(fù)雜，不同基因或信號(hào)分子都可能會(huì)調(diào)控這一表型性狀。波浪形毛發(fā)以圍繞于副皮質(zhì)巨原纖維周圍的正皮質(zhì)和仲皮質(zhì)巨原纖維間的相互交織為特征，隨著毛發(fā)卷曲程度的增加，仲皮質(zhì)就會(huì)消失，并形成正皮質(zhì)細(xì)胞。

KRT是keratin intermediate filament的縮寫形式，又可寫為KRT-IF(角蛋白中間絲蛋白)，是角蛋白家族的重要成員，是形成毛發(fā)、角和指甲的主要成分。角蛋白是多種氨基酸聚成的多聚長鏈物，其一級(jí)結(jié)構(gòu)分為主鏈和側(cè)鏈，主鏈通過肽鍵連結(jié)構(gòu)成的多縮氨酸鏈，側(cè)鏈由20多種不同α氮基酸構(gòu)成；各鏈的半胱氨酸中SH氧化形成二硫鍵，使肽鍵之間形成穩(wěn)定交互網(wǎng)絡(luò)，側(cè)鏈的種類和性質(zhì)決定了角蛋白整體的物理和化學(xué)性質(zhì)。角蛋白分子間作用形式隨R基的不同而異，主要有氫鍵、鹽式鍵和二硫鍵，其中以二硫鍵為主要作用形式[Eckhart L,2008]。KRT-IF有I型(酸性)和II型(堿性)兩種類型，KRT27基因?qū)儆贗型基因。I型KRT-IF基因含有4～5kb個(gè)堿基對(duì)，有8個(gè)外顯子。對(duì)貓的KRT71基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，存在一個(gè)600BP的特異單倍型與貓的卷毛性狀顯著性相關(guān)[Barbara Gandolfi,2012]。在雷克斯小鼠中，KRT71基因剪切位點(diǎn)的一個(gè)7bp的缺失，能夠?qū)е滦∈竺l(fā)成波浪狀卷曲[Takashi KURAMOTO,2010]。在人上，KRT71基因外顯子1處存在c.422T>G的雜合突變，導(dǎo)致編碼氨基酸賴氨酸突變?yōu)樘於０?，最終使人患常染色體顯性綿毛癥(Autosomal-dominant woolly hair,ADWH)[Yutaka Shimomura,2010]。

養(yǎng)牛業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中，卷曲毛發(fā)的牛更易寄生蜱蟲及其他寄生蟲，從而導(dǎo)致牛的生長發(fā)育遲緩，產(chǎn)奶量和繁殖性能下降等，影響其經(jīng)濟(jì)效益。因此，能夠早期、快速、準(zhǔn)確的鑒定犢牛成年后的毛發(fā)卷曲情況，從而有針對(duì)性的選擇牛只，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。同時(shí)毛發(fā)卷曲作為一種表型信息，是一種可利用的遺傳標(biāo)記，通過分子手段并且結(jié)合系譜分析開發(fā)一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、可靠性強(qiáng)的檢測(cè)攜帶者試劑盒，對(duì)于牛分子育種來說具有實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了提供一種牛卷毛基因快速篩選的引物、方法及試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案：

一種牛卷毛基因快速篩選的引物，以KRT27基因g.41636961C>G位點(diǎn)突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)象而設(shè)計(jì)的上游引物KRT27F序列為：SEQ ID NO.1，下游引物KRT27R序列為：SEQ ID NO.2。

一種牛卷毛基因快速篩選的方法，包括使用上述引物的步驟。

一種牛卷毛基因快速篩選的方法，其步驟如下：DNA提取：采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA；PCR擴(kuò)增反應(yīng)：使用上述的引物對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物用Takara限制酶AvaII進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；判斷結(jié)果。

所述的判斷結(jié)果具體為：酶切后凝膠檢測(cè)酶切DNA片段為469bp的待測(cè)牛為無卷毛基因牛；酶切后DNA片段為195bp、274bp和469bp的檢測(cè)牛為卷毛基因雜合子牛。

優(yōu)選：所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板DNA(100ng/μl)1μl，上游引物KRT27F、下游引物KRT27R各(10μmol/L)0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，用雙蒸水(ddH₂O)補(bǔ)至25μl；

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃變性4min；然后94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，這一步共35個(gè)循環(huán)；72℃保持10min；10℃保存。

優(yōu)選：所述酶切反應(yīng)采用30μl AvaII酶切反應(yīng)體系為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl；Buffer 2μl；Takara限制酶AvaII1μl；ddH₂O 17μl，酶切反應(yīng)條件為：30℃消化60min。

優(yōu)選：酶切片段用質(zhì)量濃度為2.0％瓊脂糖凝膠電泳。

一種牛卷毛基因快速篩選的試劑盒，包括以KRT27基因g.41636961C>G位點(diǎn)突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)象而設(shè)計(jì)的上游引物KRT27F序列為：SEQ ID NO.1，下游引物KRT27R序列為：SEQ ID NO.2，Taq PCR MasterMix，Takara限制酶AvaII，Takara緩沖液。

優(yōu)選：一種牛卷毛基因快速篩選的試劑盒：上下游引物KRT27F和下游引物KRT27R(10μmol/L)；2×Taq PCR MasterMix；U/μL TakaraAvaII；10×Takara緩沖液；ddH₂O；2000bp DNA Ladder Marker。

其中2×Taq PCR MasterMix(含染料)是由Taq DNA Polymerase(0.05units/μl)、MgCl₂(4mM)、dNTPs(0.4mM)構(gòu)成。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)荷斯坦牛、西門塔爾牛、南陽牛、新疆褐牛、魯西黃牛共計(jì)5個(gè)品種48個(gè)個(gè)體的KRT27基因第1外顯子進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)4處SNP，分別為g.41637129C>T、g.41637058G>C、g.41637074G>C、g.41636961C>G。將測(cè)序序列所得SNPs及單倍型組合與卷毛表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)g.41636961C>G位點(diǎn)只在西門塔爾牛中出現(xiàn)，且與卷毛表型一一對(duì)應(yīng)。

本發(fā)明根據(jù)角蛋白中間絲蛋白KRT27基因(NCBI參考序列AC_000176)g.41636961C>G位點(diǎn)突變，產(chǎn)生了AvaII限制性酶切位點(diǎn)的原理，從而建立起篩查牛卷毛基因攜帶者的PCR-RFLP方法。通過分析后設(shè)計(jì)針對(duì)含有突變位點(diǎn)的引物，特異性擴(kuò)增出469bp的牛KRT27基因含有上述位點(diǎn)的片段，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶AvaII酶切，擴(kuò)增片段中不含有AvaII酶切位點(diǎn)的為無卷毛基因牛(CC型)，經(jīng)凝膠電泳后產(chǎn)生DNA片段為469bp；含有一個(gè)AvaII酶切位點(diǎn)的為卷毛基因雜合子牛(GC型)，經(jīng)凝膠電泳后產(chǎn)生DNA片段為195bp、274bp、469bp。

本發(fā)明篩查方法操作簡(jiǎn)單、快捷、費(fèi)用低廉、可靠性高。同時(shí)根據(jù)篩查方法開發(fā)出相應(yīng)地檢測(cè)試劑盒，使操作更加簡(jiǎn)單化、快速、靈敏、可靠性強(qiáng)，一般生產(chǎn)中常規(guī)實(shí)驗(yàn)室都有條件完成，這一發(fā)明可以對(duì)牛只毛發(fā)卷曲情況進(jìn)行早期鑒定，降低寄生蟲患病幾率，預(yù)防寄生蟲傳染病，從而提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)毛發(fā)表型一種明顯的表型性狀，可作為分子標(biāo)記，對(duì)牛育種提供指導(dǎo)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的實(shí)施例1的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的1％瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是不同PCR退火溫度下，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3是本發(fā)明的實(shí)施例1的KRT27基因分型的2％瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，1：Maker，2：無卷毛基因牛，3：卷毛基因牛，4：卷毛基因牛，5：無卷毛基因牛，6：Maker；

圖4是本發(fā)明的實(shí)施例2的無卷毛基因牛KRT27基因測(cè)序圖；

圖5是本發(fā)明的實(shí)施例2的卷毛基因攜帶牛KRT27基因測(cè)序圖；

圖6是卷毛基因攜帶牛的表型性狀圖；

圖7是無卷毛基因牛的表型性狀圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

1.1采用酚-氯仿抽提法從牛血液中提取基因組DNA，DNA樣品被稀釋成50ng/μL備用。實(shí)驗(yàn)牛共75頭，包括阿勒泰白頭牛18頭，南陽牛20頭，新疆褐牛17頭，魯西黃牛20頭。

1.2根據(jù)Genbank登錄號(hào)為AC_000176.1(41631641..41637275)的KRT27的基因序列，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增牛KRT27基因片段。KRT基因外顯子1共計(jì)443bp，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)注意擴(kuò)增片段長度大于443bp，引物長度為15-30bp，GC含量為40％-60％，Tm在55-80℃之間，同時(shí)避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。綜上所述，設(shè)計(jì)用于KRT基因擴(kuò)增專用引物一對(duì)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度469bp，引物長度20bp，前引物GC含量55％，后引物GC含量50％，Tm值60度，無產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)，特異性良好，可用于KRT27基因擴(kuò)增。

所設(shè)計(jì)引物序列為：

KRT27F上游引物序列為：SEQ ID NO.1：

5'-GAGCGTGCGCTTTTCTTCTG-3'

KRT27R下游引物序列為：SEQ ID NO.2：

5'-TAAACCTCACGGCACTGTGT-3'

1.3 Tm值確定

退火溫度(Tm)為引物和模板結(jié)合時(shí)候的溫度參數(shù)，它是影響PCR特異性的重要因素。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。所設(shè)計(jì)的KRT27擴(kuò)增引物的Tm值為56℃，需要對(duì)其進(jìn)行Tm值摸索，以便找到最佳溫度，既能保證目的序列有效退火，又減少非特異性結(jié)合。采用溫度梯度法，分別設(shè)置Tm值為54℃、56℃、60℃、62℃、64℃、66℃，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，Tm值54-60℃時(shí)，出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，其中60℃時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶最為明亮清晰，溫度超過60℃，PCR不能擴(kuò)增成功(圖2)。故選擇60℃為KRT27擴(kuò)增引物退火溫度。

1.4根據(jù)上述設(shè)計(jì)的檢測(cè)牛卷毛基因攜帶者的引物，利用以下步驟擴(kuò)增牛KRT27基因片段，擴(kuò)增的片段用質(zhì)量濃度為1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

(1)使用25μl的PCR反應(yīng)體系:DNA模板(60ng/μl)1μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，ddH₂O4.5μl。

(2)PCR反應(yīng)條件：94℃變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，這一步共35個(gè)循環(huán)；72℃保持10min；10℃保存。

(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)：5μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入loading buffer 5μl，混合后進(jìn)行電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為，1-6個(gè)泳道為牛DNA樣品檢測(cè)結(jié)果，均擴(kuò)增出單一的條帶，大小為469bp，與目的的片段大小一致。

1.5對(duì)PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序：經(jīng)過測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，KRT27基因第1外顯子處存在3處SNP，分別為：g.41637129C>T、g.41637058G>C、g.41636961C>G。

1.6基因分型：基因分型結(jié)果如下表1所示。

表1.牛KRT27基因g.41637129C>T分型結(jié)果

表2.牛KRT27基因g.41637058G>C分型結(jié)果

表3.牛KRT27基因g.41636961C>G分型結(jié)果

1.7 SNP位點(diǎn)與卷毛表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析

對(duì)所得SNP位點(diǎn)及其組合單倍型與卷毛表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，未能發(fā)現(xiàn)與卷毛表型一一對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)及單倍型。

實(shí)施例2

2.1采用酚-氯仿抽提法從23頭西門塔爾牛的血液中提取基因組DNA。利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增牛KRT27基因片段，所用的引物序列為：

上游引物序列為：SEQ ID NO.1：

5'-GAGCGTGCGCTTTTCTTCTG-3'

下游引物序列為：SEQ ID NO.2：

5'-TAAACCTCACGGCACTGTGT-3'

2.2根據(jù)上述設(shè)計(jì)的檢測(cè)牛卷毛基因攜帶者的引物，利用以下步驟擴(kuò)增牛KRT27基因片段，擴(kuò)增的片段用質(zhì)量濃度為1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

(1)采用25μl的PCR反應(yīng)體系:DNA(100ng/μl)1μl，上，下游引物(10μmol/L)各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，用雙蒸水(ddH₂O)補(bǔ)至25μl。

(2)PCR反應(yīng)條件：94℃變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，這一步共35個(gè)循環(huán)；72℃保持10min；4℃保存。

(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)：5μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加上loading buffer，混合后進(jìn)行電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為，1-6個(gè)泳道為牛DNA樣品檢測(cè)結(jié)果，均擴(kuò)增出單一的條帶，大小為469bp，與預(yù)期的片段大小一致。

2.3利用擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。對(duì)擴(kuò)增的23頭西門塔爾牛的KRT27基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，存在一處SNP(g.41636961C>G)，僅存在于西門塔爾牛中。

2.4基因型與表型關(guān)聯(lián)分析：對(duì)擴(kuò)增的西門塔爾牛KRT基因的SNP位點(diǎn)g.41636961C>G進(jìn)行直接測(cè)序后，與卷毛表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)：16頭牛的KRT27基因片段測(cè)序的峰圖為單峰，且擴(kuò)增片段的第274位堿基為C，表明KRT27基因型是CC型(圖4)，對(duì)應(yīng)個(gè)體表型為無卷毛牛(圖7)；7頭牛的KRT27基因片段測(cè)序的峰圖第274位堿基測(cè)序峰圖為套峰，測(cè)序堿基為C，表明KRT27基因型是GC型(圖5)，對(duì)應(yīng)個(gè)體表型為卷毛牛(圖6)。g.41636961C>G位點(diǎn)基因型與個(gè)體表型一一對(duì)應(yīng)。基因分型及表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如下表3所示。

表3.西門塔爾牛g.41636961C>G分型結(jié)果

2.5 PCR產(chǎn)物酶切分型

(1)選擇合適限制性內(nèi)切酶

對(duì)KRT27基因擴(kuò)增片274bp處存在突變g.41636961C>G進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變導(dǎo)致擴(kuò)增片段274-278bp處的核苷酸序列由CGACC突變?yōu)镚GACC。使用生物學(xué)軟件Primer Premier5.0對(duì)該處突變進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Takara限制酶AvaII(識(shí)別序列GGTCC)可特異性識(shí)別該位點(diǎn)，且酶切位點(diǎn)單一，內(nèi)切酶的產(chǎn)物的粘端與平端可以互相連接。

(2)酶切反應(yīng)體系

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，選用合適的反應(yīng)體系，如反應(yīng)體系濃度過高，溶液黏度過大，酶不能有效擴(kuò)散，酶切效果不會(huì)好。濃度過低，也會(huì)影響酶活性。本方法采用30μl酶切，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl；Buffer 2μl；Takara限制酶AvaII 1μl；ddH₂O 17μl。30℃，酶切60min。

(3)凝膠電泳檢測(cè)

用質(zhì)量濃度為2％凝膠對(duì)酶切后DNA 15μl進(jìn)行電泳檢測(cè)；電壓100V；時(shí)間30min。

2.6酶切分型及結(jié)果分析。共對(duì)23頭西門塔爾牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型發(fā)現(xiàn)，有16頭牛酶切后凝膠檢測(cè)DNA片段為469bp，為無卷毛基因牛；7頭牛酶切后DNA片段為195bp、274bp和469bp，為卷毛牛(圖3)。

上述雖然對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。