本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及一種采用懸浮芯片系統，結合等位基因特異性引物延伸(Allele Specific Primer Extension,ASPE)PCR方法針對與4種殺菌劑抗藥性相關的灰霉抗藥位點多重檢測技術。

背景技術：

灰霉病(Grey mould)是一種重要的世界性植物真菌病害，由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)侵染所致。該病菌寄主范圍廣泛，危害多種蔬菜、經濟作物、糧食作物、觀賞性植物?；移咸焰咭驯涣袨槭澜缡笳婢『χ?。由于目前缺少抗病品種，對于灰霉病的防治主要采取施用大量化肥及農藥的方法，造成環(huán)境污染、土壤破壞、抗藥菌株頻現等諸多問題。防治灰霉病的殺菌劑類型主要包括苯并咪唑類、N-苯氨基甲酸酯類、二甲酰亞胺類、甾醇生物合成抑制劑類、醌氧化抑制劑類、琥珀酸脫氫酶抑制劑類、苯氨基嘧啶類、吡咯類等。由于灰霉病菌生活周期短、產孢量大、病害傳播快，加上長時間和普遍使用單一類型殺菌劑和不合理的施藥技術而導致灰霉病菌已對某些常規(guī)殺菌劑普遍產生了抗藥性，甚至產生了多重抗性。

目前已報道的灰霉抗藥位點的分子檢測方法只能針對一種殺菌劑進行檢測，因此這些分子檢測方法已經不足以滿足農業(yè)生產的需要，目前迫切需要一種快速、簡便、高通量的檢測方法，實現對多種殺菌劑抗性突變的同時檢測。該方法的建立將大大縮減田間抗藥菌株鑒定時間，減少工作量，對于灰霉病菌的抗藥性的早期監(jiān)測將具有重大意義。

該發(fā)明需要克服的難點包括：1、設計四對能夠同時擴增與4種殺菌劑的抗藥性相關的四個基因片斷，片斷必須包含抗藥突變位點在內，并且片段大小必須保證后期采用瓊脂糖凝膠電泳檢測時四個條帶能夠區(qū)分開；2、摸索四重PCR擴增條件，使四個基因片斷擴增效率相似；3、四重PCR的引物不能影響后期目標產物與磁珠的特異性雜交；4、設計多重ASPE PCR的8條引物，使其能夠在保證擴增特異性的前提下盡量提高產物與磁珠的雜交信號值。5、設計與每條ASPE PCR引物5’端相連接的anti-TAG序列，進而確定偶聯有TAG序列的磁珠編號。

技術實現要素：
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本發(fā)明的目的是采用懸浮芯系統，并結合多重PCR及多重ASPE PCR方法，針對與抗苯并咪唑類殺菌劑、二甲酰亞胺類殺菌劑、甾醇生物合成抑制劑、琥珀酸脫氫酶類抑制劑相關的4個目標基因(BenA、SdhB、BcOS1、erg27)的4種灰葡萄孢菌抗藥位點，建立一種同時檢測BenA-E198(GAG)、BenA-198A(GCG)、SdhB-H272(CAC)、SdhB-272Y(TAC)、BcOS1-I365(ATC)、BcOS1-365S(AGC)、erg27-F412(TTC)、erg27-412S(TCC)八種基因型的高通量檢測方法。本發(fā)明公布了8條四重PCR引物序列SEQ ID NO:1-8、PCR反應體系及反應程序。公布了8條多重ASPE PCR引物序列SEQ ID NO:9-16、PCR反應體系及反應程序。

本發(fā)明是針對灰葡萄孢菌四類殺菌劑抗藥相關位點首次建立的一種高通量檢測方法。

本發(fā)明突出的優(yōu)點是：(1)通量高：可同時檢測與4種殺菌劑的抗藥性相關的突變位點，共涉及8種基因型；(2)所需樣本量少：只需一份樣本量，僅需0.1ng灰葡萄孢基因組DNA即可同時檢測8種基因型；(3)重復性好，不同批次間試驗結果的變異系數小于10％；(4)靈敏度高，在灰葡萄孢野生型基因組DNA的背景下，最低能夠檢測到0.45‰的突變基因型；(5)特異性好，各基因型所對應的ASPE反應產物與檢測其它基因型的磁珠上偶聯的探針之間無交叉反應；(6)檢測結果由Bio-Plex系統直接給出，直觀明了，無需后續(xù)瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟。

本發(fā)明的目的是這樣實現的：

一種基于懸浮芯片系統針對灰葡萄孢菌抗藥相關位點的多重檢測方法，其特征在于共分五步：第一步，四重聚合酶鏈式反應(4-plex PCR)。為了能夠以灰葡萄孢菌基因組DNA為模板，在同一反應體系中同時擴增包含抗藥突變位點在內的BenA、SdhB、BcOS1、erg27四個基因片段，本發(fā)明針對引物序列、引物濃度、四重PCR反應退火溫度等條件進行了摸索，在保證特異性、四個基因條帶大小可區(qū)分性、四個條帶擴增效率相似、后期與其它磁珠間無非特異性雜交的條件下，最終確定了SEQ ID NO:1-8共計四對引物序列，引物濃度分別為0.05μM、0.05μM、0.4μM、0.4μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM。PCR反應程序為94℃5min；94℃30sec，54℃30sec，72℃25sec共35個循環(huán)；72℃10min；4℃保存。第二步，ExoSAP-IT處理四重PCR產物，以去除多余的引物及脫氧核苷酸(dNTP)。反應體系及程序如下：將第一步7.5μl多重PCR產物與3μl ExoSAP-IT混合，37℃反應30min，80℃反應15min，4℃保存；第三步，多重等位基因特異性擴增(ASPE)反應。該步反應以第二步中的反應產物為模板，加入dATP、dGTP、dTTP和生物素標記的dCTP，反應體系中共包括8條特異性TAG-ASPE檢測引物SEQ ID NO:9-16，最終該步反應的產物會帶有生物素標記；第四步，將8種偶聯有anti-TAG序列的熒光編碼微球混合，不同熒光編碼微球上偶聯的anti-TAG序列特異的與ASPE反應產物的TAG序列雜交，反應體系中加入的鏈酶親和素-藻紅蛋白(SAPE)，能夠識別微球捕獲的PCR產物上的生物素標記；第五步，BIO-RAD公司的Bio-Plex 200系統區(qū)分不同顏色的微球并且檢測復合物發(fā)出的熒光，從而確定目標物的基因型，以此達到高通量的檢測目的。檢測結果以平均熒光強度(MFI)展示。

附圖說明

圖1，懸浮芯片方法的特異性檢測結果。每個目標反應產物與其它磁珠之間均無交叉反應。

圖2，懸浮芯片技術所需最低基因組DNA濃度。多重PCR的初始模板量分別為0.01ng、0.1ng、1ng、10ng，由結果可知，該技術所需基因組最低濃度為0.1ng。

具體實施方式

懸浮芯片技術應用于一株田間抗苯并咪唑類灰葡萄孢菌株的BenA-E198(GAG)、BenA-198A(GCG)、SdhB-H272(CAC)、SdhB-272Y(TAC)、BcOS1-I365(ATC)、BcOS1-365S(AGC)、erg27-F412(TTC)、erg27-412S(TCC)八種基因型的高通量檢測。

第一步，以該菌株的基因組DNA或不含模板的無菌水為模板，采用四對引物，在同一反應體系中同時擴增包含抗藥突變位點在內的BenA、SdhB、BcOS1、erg27四個基因片段，樣品及空白對照均為兩個重復。25μl反應體系如表1所示：

表1多重PCR反應體系

PCR反應程序：94℃5min；94℃30sec，54℃30sec，72℃25sec共35個循環(huán)；72℃10min；4℃保存直至使用。

第二步，ExoSAP-IT處理四重PCR產物，以去除多余的引物及脫氧核苷酸(dNTP)。反應體系及程序如下：將第一步7.5μl多重PCR產物與3μl ExoSAP-IT混合，37℃反應30min，80℃反應15min，4℃保存直至使用；

第三步，以第二步中的反應產物為模板，加入dATP、dGTP、dTTP和生物素標記的dCTP，反應體系中共包括8條特異性TAG-ASPE檢測引物，每條引物對應一種基因型，且引物的5’端各連接有一段唯一的TAG序列，3’端與模板完全互補配對時，反應能夠進行，相反，當3’端與模板不能完全互補配對時，反應不能進行，由此來區(qū)分不同的突變類型；最終該步反應的產物會帶有生物素標記。2×ASPE PCR mix配制如表2所示。

表2 2×ASPE PCR mix(2倍的ASPE PCR預混液)配制體系

ASPE PCR反應體系如下表3所示。

表3ASPE PCR反應體系

PCR反應程序：96℃2min；94℃30sec，54℃1min，72℃2min共40個循環(huán)；4℃保存直至使用。

上述反應產物與微球雜交并上機檢測。反應步驟如下:

1.選擇合適的8種微球，渦旋重懸；

2.按照每種微球2500個/反應混合；

3.用2×Tm雜交buffer(2倍的Tm雜交緩沖液)(0.4M NaCl,0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)稀釋/富集各種Magplex-TAG微球混合液100個/ul，渦旋混勻，超聲20s；

4.各孔加入25ul混合微球；

5.向對應孔中加入5ul ASPE反應物，20ul ddH₂O；

6.用MicroSeal A film覆蓋防止蒸發(fā)，PCR儀中反應：96℃90s,37℃1hour；

7.將反應混合液加入預洗96孔濾板中；

8.用75ul 1×Tm雜交buffer(1倍的Tm雜交緩沖液)(0.2M NaCl,0.1M Tris,0.08％Triton X-100,pH8.0)重懸微球，真空抽濾，去除1×Tm buffer；

9.重復8；

10.用包含2ug/ml SAPE的75ul 1×TM雜交buffer(含有0.1％BSA)重懸微球；

11.37℃15min；

12.Bio-Plex 200系統檢測(室溫50ul)，區(qū)分不同顏色的微球并且檢測復合物發(fā)出的熒光，從而確定目標物的基因型，以此達到高通量的檢測目的。檢測結果以平均熒光強度(MFI)展示。

上述試驗的檢測結果如表4所示：

表4田間灰葡萄孢菌檢測結果

根據表4中的MFI信號值，該株田間灰葡萄孢菌株的基因型為BenA-198A，SdhB-H272，BcOS1-I365和erg27-F412。