本申請涉及基因突變檢測領(lǐng)域，具體講，涉及一種檢測人KRAS基因突變的微滴PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
：在腫瘤治療中，傳統(tǒng)化療主要針對細(xì)胞的DNA，這種作用往往缺乏特異性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也“錯殺”了很多正常細(xì)胞。靶向治療和以前的化療完全不同。腫瘤的發(fā)病有多種機(jī)制參與，而這些機(jī)制往往是腫瘤細(xì)胞所特有的。靶向治療就是針對腫瘤發(fā)病機(jī)制中某特有的信號傳導(dǎo)通路或者某一發(fā)病機(jī)制，采用單克隆抗體、小分子物質(zhì)將它打斷，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，而對正常細(xì)胞作用卻很輕微。而靶向藥物通過與腫瘤細(xì)胞的特征性位點(diǎn)結(jié)合，干預(yù)控制腫瘤細(xì)胞生長增殖的基因信號傳導(dǎo)通路；而腫瘤細(xì)胞是有多樣性的，并非所有腫瘤細(xì)胞都具有一樣的特征性位點(diǎn)(因人而異)，因此對于某些特定的靶向藥物，在使用前檢測患者體內(nèi)是否有符合條件的基因，判斷其腫瘤細(xì)胞上是否有符合條件的位點(diǎn)，就可以預(yù)知該藥物是否會奏效，這從臨床上節(jié)省了金錢和時(shí)間。這樣的診斷模式被稱為“個(gè)體化診斷”。對于靶向藥物來說，使用前進(jìn)行“個(gè)體化診斷”是保證安全、有效用藥的必要步驟。RAS基因是人體腫瘤中常見的致癌基因、RAS基因家族由K-ras、H-ras和N-ras組成，基因家族的各成員相互同源性可達(dá)85％。K-ras基因編碼的蛋白質(zhì)是P21蛋白，分子量為21KD，有188-189個(gè)氨基酸組成，也稱之為P21高度相關(guān)蛋白。P21蛋白位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，具有GTP酶活性，參與傳導(dǎo)細(xì)胞增生信號的調(diào)控系統(tǒng)。其激活狀態(tài)為GTP結(jié)合狀態(tài)，失活狀態(tài)為GDP結(jié)合狀態(tài)，其轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒有灾掳┗虻闹饕课皇堑?2、13和61密碼子的突變，其中以第12、13密碼子點(diǎn)突變最常見。該基因的體細(xì)胞突變常見于多種惡性腫瘤，在肺癌患者中的突變率為15-30％，在結(jié)直腸癌患者中為20-50％。大量臨床研究資料證實(shí)，K-ras和B-raf基因突變狀態(tài)與針對EGFR單抗藥物，如Cetuximab(西妥昔單抗)和Panitumumab(帕尼單抗)等的療效有關(guān)。目前K-ras基因突變狀態(tài)的檢測一般都是用組織，但在臨床應(yīng)用中，組織標(biāo)本不易獲取，例如對于在晚期的患者，老年患者、伴有重要臟器功能障礙的患者、合并大量胸腹腔積液等患者無法耐受組織活檢穿刺取樣操作，此外，耐藥是大多數(shù)患者最終難逃的厄運(yùn)。無論是患者自身耐受性的限制，或是因需二次取材所面臨增高的風(fēng)險(xiǎn)和倫理問題，迫切需要尋找方便、快捷、無創(chuàng)的生物分子檢測手段。鑒于此，特提出本申請。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本申請的發(fā)明目的在于提出一種檢測人KRAS基因突變的微滴PCR試劑盒。為了完成本申請的目的，采用的技術(shù)方案為：本申請涉及一種檢測人KRAS基因突變的微滴PCR試劑盒，包括核酸擴(kuò)增試劑和對照品，其中，所述核酸擴(kuò)增試劑包括以下組分，如表1所示：表1：其中，所述用于檢測12、13號密碼子突變的引物和探針為：含有由SEQIDNO：1～SEQIDNO：4、由SEQIDNO：7所示的上游引物；由SEQIDNO：5、由SEQIDNO：8所示的下游引物；由SEQIDNO：6、由SEQIDNO：9所示的探針。優(yōu)選的，SEQIDNO：6所示核苷酸序列的5’端標(biāo)記有FAM、3’端標(biāo)記有BHQ1；SEQIDNO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端標(biāo)記有VIC、3’端標(biāo)記有BHQ1。優(yōu)選的，所述核酸擴(kuò)增試劑中各成分的含量為：濃度為100μmol/L的引物各0.18μl，濃度為100μmol/L的探針各0.035μl。優(yōu)選的，所述核酸擴(kuò)增試劑中還包括以下組分，如表2所示：表2：編號組分組分中的主要成分2ddPCRMIX3dNTPs、KCl、Tris-HCl、MgCl2、DTT、Taq酶。優(yōu)選的，所述對照品包括，如表3所示：表3：編號組分組分中的主要成分3陰性對照工藝用水4陽性對照質(zhì)粒和細(xì)胞株DNA混合液優(yōu)選的，所述質(zhì)粒和細(xì)胞株DNA混合液中含有：由SEQIDNO：10～SEQIDNO：17所示的突變質(zhì)粒DNA，以及HT-1080細(xì)胞株DNA。優(yōu)選的，所述試劑盒所適用的樣本選自石蠟包埋切片或外周血游離DNA，優(yōu)選的，所述樣本中DNA的濃度小于或等于50ng/μl；更優(yōu)選的，所述樣本中DNA的濃度大于或等于25ng/μl。本申請涉及一種采用微滴PCR檢測人KRAS基因突變的引物和探針，所述引物和探針的序列為：含有由SEQIDNO：1～SEQIDNO：4、由SEQIDNO：7所示的上游引物、由SEQIDNO：5、由SEQIDNO：8所示的下游引物、由SEQIDNO：6、由SEQIDNO：9所示的探針；SEQIDNO：6所示核苷酸序列的5’端標(biāo)記有FAM、3’端標(biāo)記有BHQ1；SEQIDNO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端標(biāo)記有VIC、3’端標(biāo)記有BHQ1。本申請的技術(shù)方案至少具有以下有益的效果：本申請?jiān)噭┖胁捎脭?shù)字PCR技術(shù)，對人類的K-ras基因第12、13密碼子突變狀態(tài)進(jìn)行定量檢測，可用于對結(jié)直腸癌、肺癌等患者石蠟包埋病理切片組織中或外周血游離DNA中的K-ras基因的突變狀態(tài)進(jìn)行檢測，為臨床醫(yī)生選擇腫瘤靶向藥物治療和監(jiān)測提供參考，具有絕對定量、高特異性、準(zhǔn)確性和高靈敏度，主要優(yōu)勢如下：1、高靈敏度、高特異性：檢測復(fù)雜背景下的靶標(biāo)序列靈敏度可達(dá)0.001％，樣本珍貴或者樣本核酸存在降解時(shí)的最佳選擇。在穿刺樣本、胸腹水、外周血中即可完成靶標(biāo)序列的檢測。2、所需樣本量少：200μl血漿、1ml全血、2-3片白片及納克級活檢組織，即可完成檢測。3、分辨率高：能分辨出單個(gè)拷貝的差異，因而特別適合用于低豐度的拷貝數(shù)的檢測。本申請?jiān)噭┖心軝z出在10000拷貝/μl人基因組DNA背景下含0.1％的KRAS基因相關(guān)突變。4、可統(tǒng)計(jì)突變率：真正意義上的絕對定量，通過統(tǒng)計(jì)分析可得出靶點(diǎn)的突變率，從而可實(shí)現(xiàn)對治療效果的動態(tài)追蹤，并實(shí)現(xiàn)對耐藥性發(fā)生的判定。5、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析便捷：每個(gè)微滴的檢測結(jié)果以陰性、陽性判讀，數(shù)據(jù)分析自動化。附圖說明圖1為陽性對照的ddPCR結(jié)果圖；圖2為陰性對照的ddPCR結(jié)果圖；圖3為測試管的的ddPCR結(jié)果圖；圖4為實(shí)施例2中的線性擬合圖。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本申請。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本申請而不用于限制本申請的范圍。具體實(shí)施方式本申請?zhí)岢鲆环N采用ddPCR技術(shù)的檢測試劑盒，該試劑盒所適用的ddPPCR系統(tǒng)包括微滴發(fā)生器和微滴分析儀及其相關(guān)的耗材。微滴發(fā)生器可將待測DNA分區(qū)成20000個(gè)均勻的納升級微滴。將微滴轉(zhuǎn)移至96孔PCR板上，使用熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR擴(kuò)増DNA，在每個(gè)微滴中PCR反應(yīng)都獨(dú)立進(jìn)行。擴(kuò)增后采用微滴分析儀進(jìn)行熒光讀取，逐個(gè)分析樣品中的每個(gè)微滴。微滴被吸入后，管路將分解乳化的微滴，并使它們依次通過一個(gè)雙色光學(xué)檢測系統(tǒng)。有熒光信號的微滴為陽性，沒有熒光信號的微滴為陰性，計(jì)算陽性和陰性微滴的數(shù)量及陽性微滴的比例。最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計(jì)算出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)。本申請?zhí)岢鲆环N檢測人KRAS基因突變的微滴PCR試劑盒，包括核酸擴(kuò)增試劑和對照品，其中，核酸擴(kuò)增試劑包括以下組分，具體如表4所示：表4：其中，用于檢測12、13號密碼子突變的引物和探針為：含有由SEQIDNO：1～SEQIDNO：4、由SEQIDNO：7所示的上游引物；由SEQIDNO：5、由SEQIDNO：8所示的下游引物；由SEQIDNO：6、由SEQIDNO：9所示的探針。優(yōu)選的，SEQIDNO：6所示核苷酸序列的5’端標(biāo)記有FAM、3’端標(biāo)記有BHQ1；SEQIDNO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端標(biāo)記有VIC、3’端標(biāo)記有BHQ1。具體的，引物和探針的核苷酸序列具體如表5所示：表5：本申請中的引物采用人工合成的方式制備得到。本申請?jiān)噭┖械暮怂釘U(kuò)增試劑中的ddPCRMIX3反應(yīng)液選用biorad公司產(chǎn)品，貨號186-3028。本申請的試劑盒配合ddPCR微滴發(fā)生油進(jìn)行檢測，ddPCR微滴發(fā)生油可選用biorad公司產(chǎn)品，貨號：1863005。本申請的試劑盒中還含有對照品，其中陰性對照為工藝用水，陽性對照為質(zhì)粒和細(xì)胞株DNA混合液；質(zhì)粒和細(xì)胞株DNA混合液中含有：由SEQIDNO：10～SEQIDNO：17所述的突變質(zhì)粒DNA，以及HT-1080細(xì)胞株DNA。本申請的質(zhì)粒DNA采用PCR擴(kuò)增得到。本申請?jiān)噭┖兄械腍T-1080細(xì)胞株DNA為K-ras陰性，為市售產(chǎn)品。其中，SEQIDNO：10為Kras-G12A突變質(zhì)粒DNA，SEQIDNO：11為Kras-G12R突變質(zhì)粒DNA，SEQIDNO：12為Kras-G12D突變質(zhì)粒DNA，SEQIDNO：13為Kras-G12C突變質(zhì)粒DNA，SEQIDNO：14為Kras-G12S突變質(zhì)粒DNA，SEQIDNO：15為Kras-G12V突變質(zhì)粒DNA，SEQIDNO：16為Kras-G13C突變質(zhì)粒DNA，SEQIDNO：17為Kras-G13D突變質(zhì)粒DNA。本申請的試劑盒所適用的樣本選自石蠟包埋切片或外周血游離DNA，優(yōu)選的，樣本中DNA的濃度小于或等于50ng/μl；更優(yōu)選的，樣本中DNA的濃度大于或等于25ng/μl。本申請的核酸擴(kuò)增試劑中各成分的含量為：濃度為100μmol/L的引物各0.18μl，濃度為100μmol/L的探針各0.035μl。在本申請中，樣本線性(linearityofseriesdilutedsamples)指對高濃度樣本進(jìn)行系列稀釋，得到的檢測濃度對數(shù)值與稀釋比例之間相關(guān)。經(jīng)檢測，本申請的試劑盒線性相關(guān)系數(shù)|r|≥0.980。在本申請中，測量精密度(precisionofmeasurement)指在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測試結(jié)果之間的一致程度。經(jīng)檢測，本申請的試劑盒相應(yīng)的反應(yīng)液中重復(fù)10次，CV值≤5％。經(jīng)檢測，各準(zhǔn)確性質(zhì)控品在本申請?jiān)噭┖邢鄳?yīng)的反應(yīng)液中，檢測結(jié)果陽性符合率為100％。各特異性質(zhì)控品在本申請?jiān)噭┖邢鄳?yīng)的反應(yīng)液中，檢測結(jié)果陰性符合率為100％。本申請?jiān)噭┖心軝z出在10000拷貝/μl的人基因組DNA的背景下含0.1％的KRAS基因相關(guān)突變。本申請還涉及一種采用微滴PCR檢測人KRAS基因突變的引物和探針，引物和探針的序列為：含有由SEQIDNO：1～SEQIDNO：4、由SEQIDNO：7所示的上游引物、由SEQIDNO：5、由SEQIDNO：8所示的下游引物、由SEQIDNO：6、由SEQIDNO：9所示的探針；SEQIDNO：6所示核苷酸序列的5’端標(biāo)記有FAM、3’端標(biāo)記有BHQ1；SEQIDNO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端標(biāo)記有VIC、3’端標(biāo)記有BHQ1。本申請?jiān)噭┖械氖褂梅椒椋?、ddPCR檢測1.1樣本處理：進(jìn)行核酸提取(推薦使用商業(yè)化的試劑盒來提取DNA)得到樣本處理液，作為PCR反應(yīng)模板。提取完的核酸建議立即進(jìn)行檢測，否則于-20℃以下保存。1.2擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備：從試劑盒中取出相應(yīng)的ddPCR反應(yīng)液，室溫融化并混勻后，2000rpm離心10s，均按如下配制每個(gè)測試的PCR預(yù)混液：4μlddPCR+10μlddPCRMIX3，將上述配制好的PCR預(yù)混液，分別按每管14μl的量，分裝于各PCR管內(nèi)。1.3加樣：取出試劑盒中對照品以及步驟1獲得的樣本處理液，室溫融化并混勻后，2000rpm離心10s。分別取6μl，加至裝有上述PCR預(yù)混液的PCR管中。每個(gè)反應(yīng)體系的總體積為20μl。將蓋緊PCR管蓋，2000rpm離心10s后，進(jìn)行微滴制備。1.4制備微滴：將8個(gè)20μl反應(yīng)體系加入到DG8cartridge中間一排的8個(gè)孔內(nèi)。在DG8cartridge最底一排8個(gè)孔中各加入70μlddPCR微滴發(fā)生油，蓋上膠墊，將DG8cartridge輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開始生成微滴。微滴生成于cartridge最上面一排孔內(nèi)，將生成的微滴(大約為35～45μl)轉(zhuǎn)移到96孔板中。1.5封膜微滴轉(zhuǎn)入96孔板內(nèi)后，用預(yù)熱好的PX1熱封儀對其進(jìn)行封膜；封好膜之后應(yīng)該在30分鐘內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)，或者放于4℃冰箱4小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行PCR。1.6PCR擴(kuò)增：95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40個(gè)循環(huán)；98℃，10min；4℃，5min，反應(yīng)體系設(shè)為40μl，升降溫速度≤2℃/s。1.7微滴讀?。合却蜷_電腦，再打開DropletReader電源，將之前完成PCR的96孔板放入plateholder，平穩(wěn)放入微滴讀取儀中打開QuantaSoft軟件，對96孔板中樣品信息進(jìn)行Setup，完成后即可進(jìn)行Run。其中：Supermix選擇“ddPCRSupermixforprobes”；DyeSet選擇“FAM/VIC”。1.8結(jié)果分析：檢測完成后，點(diǎn)擊“2DAmplitude”查看通道1和通道2聚類圖。點(diǎn)擊“AutoAnalyze”重設(shè)閾值；手工指定閾值：使用閾值十字線指定整個(gè)點(diǎn)圖的分類區(qū)域，以陽性對照組和陰性對照組的ddPCR結(jié)果作為對照，其中，陽性對照組的ddPCR結(jié)果如圖1所示，陰性對照組的ddPCR結(jié)果如圖2所示；根據(jù)陽性對照組和陰性對照組的液滴熒光信號的分布，劃定測試管的微滴信號閾值，如圖3所示。2、結(jié)果判定2.1突變百分比的計(jì)算方式如表6所示：表6：突變拷貝數(shù)Ch1基因組DNA拷貝數(shù)Ch2突變比例計(jì)算Ch1/Ch22.2有效性判定：1)微滴生成有效性判斷：每個(gè)反應(yīng)管的total微滴數(shù)≥8000，若total微滴數(shù)＜8000個(gè)，該反應(yīng)孔的微滴生成不理想，需重新進(jìn)行微滴生成。2)陰性對照有效性判定：“ch1+”區(qū)的點(diǎn)＜3個(gè)且落在“ch2+”區(qū)的點(diǎn)＜5個(gè)。3)陽性對照有效性判定：突變比例≥0.1％且落在“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)≥3個(gè)。2.3結(jié)果判定：A.定性結(jié)果判定：1)若樣本落在“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)≥3個(gè)，則判定K-ras基因有相關(guān)位點(diǎn)突變。2)若樣本落在“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)＜3個(gè)，且樣本的突變比例≥0.1％，判定K-ras基因相關(guān)位點(diǎn)突變疑似陽性，需重新檢測。3)若落在“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)＜3個(gè)，樣本的突變比例＜0.1％且總基因組DNA拷貝數(shù)≥50拷貝，則判定K-ras基因無相關(guān)突變或低于最低檢測極限。4)若落在“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)＜3個(gè)，樣本的突變比例＜0.1％且總基因組DNA拷貝數(shù)＜50拷貝，則提示加入的DNA質(zhì)量不佳或者含有PCR抑制劑，需要重新提取DNA后或重新取樣后再做。5)重新檢測的結(jié)果，若樣本落在“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)≥3個(gè)，則判定K-ras基因有相關(guān)位點(diǎn)突變。反之，判定K-ras基因無相關(guān)突變或低于最低檢測極限。注意：若樣本需檢測0.1％的相關(guān)突變，則建議進(jìn)入體系的基因組DNA的量不小于10000拷貝/μl。B.定量結(jié)果判定：在標(biāo)本K-ras基因相關(guān)突變點(diǎn)判為陽性且樣本的突變比例≥1％時(shí)，根據(jù)突變百分比的計(jì)算公式獲得定量結(jié)果。實(shí)施例1一種檢測人KRAS基因突變的微滴PCR試劑盒，其組成如表7所示：表7：本實(shí)施例中微滴PCR試劑盒各組分的包裝及含量如表8所示：表8：實(shí)施例2：本申請?jiān)噭┖械臉颖揪€性檢測1、準(zhǔn)備線性質(zhì)控品選用K-ras基因G12D突變質(zhì)粒DNA(SEQIDNO：12)和K-ras陰性的HT-1080細(xì)胞株基因組DNA按比例混合，總基因組DNA濃度5000拷貝/μl，突變比例為27％，上述樣本作為本申請實(shí)施例1試劑盒的樣本線性質(zhì)控品L1，然后用5000拷貝/μl的K-ras陰性的HT-1080細(xì)胞株基因組DNA以3倍梯度將L1樣本進(jìn)行系列稀釋，分別得到線性質(zhì)控品L2、L3和L4，制成線性質(zhì)控品。具體如表9所示：表9：2、擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備：從試劑盒中取出KRAS(exon18)ddPCR反應(yīng)液，室溫融化并混勻后，2000rpm離心10s，均按如下配制每個(gè)測試的PCR預(yù)混液：4μlddPCR+10μlddPCRMIX3，將上述配制好的PCR預(yù)混液，分別按每管14μl的量，分裝于各PCR管內(nèi)。3、加樣：將線性質(zhì)控品分別取6μl，加至裝有上述PCR預(yù)混液的PCR管中；陰性、陽性對照品分別取6μl，加至裝有上述PCR預(yù)混液的PCR管中；每個(gè)反應(yīng)體系的總體積為20μl；將蓋緊PCR管蓋，2000rpm離心10s后，進(jìn)行微滴制備。4、制備微滴：將4個(gè)20μl反應(yīng)體系加入到DG8cartridge中間一排的4個(gè)孔內(nèi)，在DG8cartridge最底一排4個(gè)孔中各加入70μlddPCR微滴發(fā)生油，蓋上膠墊，將DG8cartridge輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開始生成微滴；微滴生成于cartridge最上面一排孔內(nèi)，將生成的微滴(大約為35～45μl)轉(zhuǎn)移到96孔板中。5、封膜：微滴轉(zhuǎn)入96孔板內(nèi)后，用預(yù)熱好的PX1熱封儀對其進(jìn)行封膜，可采用的運(yùn)行程序?yàn)椋?80℃，5s，無需顛倒方向二次封膜；封好膜之后在30分鐘內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)。6、PCR擴(kuò)增：95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40個(gè)循環(huán)；98℃，10min；4℃，5min，反應(yīng)體系設(shè)為40μl，升降溫速度≤2℃/s。7、微滴讀?。合却蜷_電腦，再打開DropletReader電源，在使用前需預(yù)熱至少30分鐘，將之前完成PCR的96孔板放入plateholder，平穩(wěn)放入微滴讀取儀中，打開QuantaSoft軟件，對96孔板中樣品信息進(jìn)行Setup，完成后即可進(jìn)行Run。其中：Supermix選擇“ddPCRSupermixforprobes”；DyeSet選擇“FAM/VIC”。8、結(jié)果：檢測完成后，點(diǎn)擊“2DAmplitude”查看通道1和通道2聚類圖。點(diǎn)擊“AutoAnalyze”重設(shè)閾值；手工指定閾值：使用閾值十字線指定整個(gè)點(diǎn)圖的分類區(qū)域，以陽性對照組和陰性對照組的ddPCR結(jié)果作為對照，根據(jù)液滴熒光信號的分布，劃定微滴信號閾值。檢測得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表10所示。表10：以理論突變比例對數(shù)值為Y，檢測突變比例對數(shù)值為X，進(jìn)行線性擬合，計(jì)算其線性相關(guān)系數(shù)r＝0.99，如圖4所示；結(jié)果符合“線性相關(guān)系數(shù)|r|≥0.980”的要求。實(shí)施例3：本申請?jiān)噭┖械臏?zhǔn)確性檢測1、制備準(zhǔn)確性質(zhì)控品選取檢定合格的K-ras陽性的細(xì)胞株基因組DNA和突變質(zhì)粒DNA，與K-ras陰性的HT-1080細(xì)胞株基因組DNA按比例混合后，組成本申請實(shí)施例1試劑盒的準(zhǔn)確性質(zhì)控品。具體如表11所示：表11：2、其他步驟同實(shí)施例2；檢測得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表12所示：表12：由表12的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各準(zhǔn)確性質(zhì)控品在相應(yīng)的反應(yīng)液中，檢測結(jié)果陽性符合率為100％。實(shí)施例4：本申請?jiān)噭┖械姆治鎏禺愋詸z測1、制備分析特異性質(zhì)控品選取檢定合格的K-ras基因?yàn)橐吧偷臐舛葹?000拷貝/μl肺癌和腸癌病人的石蠟切片的基因組DNA各1份，組成本申請實(shí)施例1試劑盒的特異性質(zhì)控品。其中，石蠟切片的基因組DNA通過測序驗(yàn)證正確。具體如表13所示：表13：編號標(biāo)本種類K-ras-N1K-ras陰性的肺癌基因組DNA，稀釋至1000拷貝/μl；K-ras-N2K-ras陰性的腸癌基因組DNA，稀釋至1000拷貝/μl。2、其他步驟同實(shí)施例2；檢測得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表14所示：表14：由表14的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各特異性質(zhì)控品在相應(yīng)的反應(yīng)液中，檢測結(jié)果陽性符合率為100％。實(shí)施例5：本申請?jiān)噭┖械木芏葯z測1、制備精密度質(zhì)控品選取線性質(zhì)控品L3，作為本申請實(shí)施例1試劑盒的精密度質(zhì)控品，具體如表12所示；表15：2、其他步驟同實(shí)施例2；用相應(yīng)的反應(yīng)液重復(fù)檢測10次，檢測得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表16所示：表16：由表16的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，用相應(yīng)的反應(yīng)液重復(fù)檢測10次，CV值≤5％。實(shí)施例6：本申請?jiān)噭┖械淖畹蜋z測量檢測1、制備最低檢測量質(zhì)控品選用K-ras基因G12D突變質(zhì)粒DNA(SEQIDNO：12)和K-ras陰性的HT-1080細(xì)胞株基因組DNA按比例混合，總基因組DNA濃度10000拷貝/μl，突變比例為0.1％的標(biāo)本，作為本申請實(shí)施例1試劑盒的檢測限質(zhì)控品。具體如表17所示；表17：2、其他步驟同實(shí)施例2；檢測得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表18所示：表18：由表18的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各最低檢測量質(zhì)控品在相應(yīng)的反應(yīng)液中，本申請?jiān)噭┖心軝z出在10000拷貝/μl的人基因組DNA的背景下含0.1％的KRAS基因相關(guān)突變。本申請雖然以較佳實(shí)施例公開如上，但并不是用來限定權(quán)利要求，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本申請構(gòu)思的前提下，都可以做出若干可能的變動和修改，因此本申請的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以本申請權(quán)利要求所界定的范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3