相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2011年5月17日提交的美國臨時專利申請第61/486,817號的優(yōu)先權(quán)，并且是2010年3月29日提交的美國專利申請第12/798,108號的部分繼續(xù)申請，每個申請?zhí)卮艘匀囊玫姆绞讲⑷?。關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明本發(fā)明在小型企業(yè)創(chuàng)新研究(SmallBusinessInnovationResearch；SBIR)計劃所授予的批準(zhǔn)號1R43HG006656-01下通過政府支持而完成。政府對本發(fā)明具有某些權(quán)利。發(fā)明背景特定核酸的檢測是一個用于診斷醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究的重要工具?；蛱结樤囼灝?dāng)前在診斷醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的許多領(lǐng)域中起作用，包括例如識別傳染性生物體，如細(xì)菌和病毒；探查正常基因和突變基因的表達(dá)并識別與疾病或損傷相關(guān)的基因，如致癌基因；在組織移植之前針對相容性將組織分型；匹配組織或血液樣品以供法醫(yī)學(xué)研究，用于對如核事故或流感大爆發(fā)等緊急反應(yīng)情況作出響應(yīng)；確定疾病預(yù)后或病因；以及探索來自不同物種的基因之間的同源性。理想地，基因探針試驗應(yīng)該是靈敏的、特異性的并且容易自動化的。靈敏度(即，低檢測限)的要求已經(jīng)通過開發(fā)可使研究者在分析之前以指數(shù)方式擴(kuò)增特定核酸序列的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction；PCR)和其他擴(kuò)增技術(shù)而大大減低。舉例來說，SNP基因座的多重PCR擴(kuò)增并且隨后與寡核苷酸陣列雜交可以用于同時對幾百個SNP進(jìn)行基因分型。特異性對基因探針試驗來說是一項挑戰(zhàn)。探針與目標(biāo)之間的分子互補程度限定相互作用的特異性。雜交反應(yīng)中探針、目標(biāo)和鹽的組成和濃度以及反應(yīng)溫度和探針長度的變化可能都會改變探針/目標(biāo)相互作用的特異性。有可能在一些情況下區(qū)分完全互補的目標(biāo)與錯配的目標(biāo)，不過這對于使用傳統(tǒng)技術(shù)一般較困難，因為反應(yīng)條件中的較小變化將會改變雜交。用于錯配檢測的技術(shù)包括探針消化試驗，其中錯配產(chǎn)生探針裂解的位點；以及DNA接合試驗，其中單點錯配防止接合。多種酶促和非酶促方法可用于檢測序列變化?；诿傅姆椒ǖ膶嵗↖nvaderTM、寡核苷酸接合試驗(oligonucleotideligationassay；OLA)單堿基延伸法、等位基因PCR以及競爭探針分析(例如通過雜交進(jìn)行的競爭測序)。酶促DNA接合反應(yīng)在本領(lǐng)域中眾所周知并且已經(jīng)被廣泛用于SNP檢測、酶促擴(kuò)增反應(yīng)和DNA修復(fù)。許多非酶促或模板介導(dǎo)的化學(xué)接合方法也可以用于檢測序列變化。這些方法包括化學(xué)接合方法，其利用偶聯(lián)試劑，如N-氰基咪唑、溴化氰和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽。當(dāng)分析RNA以供遺傳研究時的一個廣泛公認(rèn)的問題是RNA本身固有的不穩(wěn)定性。RNA天然地在活的生物體中具有短壽命，因為生物體調(diào)控RNA濃度，由此調(diào)控依賴于RNA的下游過程。還存在許多導(dǎo)致RNA破壞的天然過程。近年來，研究者已耗費相當(dāng)大的努力來開發(fā)用于分析細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法。這一般是通過分析細(xì)胞內(nèi)含物中所存在的特異性mRNA分子的量來實現(xiàn)?；虮磉_(dá)的測量是基于以下潛在假設(shè)：所分析的RNA樣品與體內(nèi)許多轉(zhuǎn)錄物非常類似。因此，在從細(xì)胞中提取之后維持RNA的完整性至關(guān)重要。研究者已經(jīng)認(rèn)識到，不同基因(mRNA)的轉(zhuǎn)錄物具有不同穩(wěn)定性，這意味著在分離程序期間發(fā)生的RNA降解可能不均勻地分布在不同RNA分子當(dāng)中。具有不同降解程度的RNA樣品的一項比較顯示，高達(dá)75％的基于微陣列的差異基因表達(dá)測量可能由于降解偏差而引起。AuerH,LiyanarachchiS,NewsomD,KlisovicMI,MarcucciG,KornackerK(2003),NatureGenetics35:292-293。仍然需要用于有效和特異性的核酸檢測以及用于在從細(xì)胞中提取之后穩(wěn)定RNA的方法和組合物。發(fā)明概要因此，本發(fā)明提供用于非酶促化學(xué)接合反應(yīng)的方法和組合物，其提供快速目標(biāo)檢測并且大大簡化了檢測和測量目標(biāo)核酸的過程。在一個方面，本發(fā)明提供一種檢測樣品中的多個不同目標(biāo)核酸的方法，其中每個目標(biāo)核酸包含與第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和位于第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域上游或下游的第三目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域。這種方法包含以下步驟：(a)提供多個接合襯底，各自包含：目標(biāo)核酸中的一種；包含以下各項的第一組接合探針：(i)包含與一個目標(biāo)核酸序列的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第一探針結(jié)構(gòu)域和5'-接合部分的第一核酸接合探針，以及(ii)包含與一個目標(biāo)核酸序列的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第二探針結(jié)構(gòu)域和3'接合部分的第二核酸接合探針；(b)在不使用接合酶的情況下接合第一接合探針和第二接合探針以形成第一多個接合產(chǎn)物；(c)使包含捕獲部分的目標(biāo)捕獲探針與目標(biāo)核酸的第三目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交以形成目標(biāo)復(fù)合物；(d)使用捕獲部分在表面上捕獲目標(biāo)復(fù)合物；擴(kuò)增接合產(chǎn)物以形成擴(kuò)增子；以及(f)檢測擴(kuò)增子，從而檢測目標(biāo)核酸。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案，目標(biāo)核酸進(jìn)一步包含與第五目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰的第四目標(biāo)結(jié)構(gòu)域；并且多個接合襯底各自進(jìn)一步包含第二組接合探針，所述第二組接合探針包含與第四目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第三核酸接合探針和與第五目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第四核酸接合探針。在這些實施方案中，這種方法進(jìn)一步包含在不存在接合酶的情況下接合第三接合探針和第四接合探針以使得一個目標(biāo)核酸序列包含多個接合產(chǎn)物的步驟，并且檢測步驟(f)包含檢測由多個接合產(chǎn)物產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，目標(biāo)核酸進(jìn)一步包含與第七目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰的第六目標(biāo)結(jié)構(gòu)域；多個接合襯底各自進(jìn)一步包含第三組接合探針，所述第三組接合探針包含與第六目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第五核酸接合探針和與第七目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第六核酸接合探針；并且這種方法進(jìn)一步包含在不存在接合酶的情況下接合第三接合探針和第四接合探針以使得一個目標(biāo)核酸序列包含多重接合產(chǎn)物。在又一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，接合探針中的每一個進(jìn)一步包含引物序列。在又一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，每組接合探針的接合探針中的至少一個進(jìn)一步包含可變間隔區(qū)序列以使得擴(kuò)增子具有目標(biāo)特定長度。在再一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，每組接合探針中僅有一個接合探針包含可變間隔區(qū)序列。在再一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，可變間隔區(qū)序列含于接合探針的探針結(jié)構(gòu)域與引物之間。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，目標(biāo)捕獲探針的捕獲部分包含選自以下各項的成員：捕獲核酸序列、珠粒和結(jié)合搭配物對的結(jié)合搭配物。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，5'接合部分包含DABSYL并且3'接合部分包含硫代磷酸酯。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，3'接合部分包含DABSYL。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，樣品被收集到包含鹽酸胍(guanidiniumhydrochloride,GuHCl)的緩沖液中。在一個示例性實施方案中，樣品為血液。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，目標(biāo)核酸包含DNA或RNA。在又一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，檢測步驟(f)利用選自由以下各項組成的組的技術(shù)：毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜分析、微陣列分析、測序、實時PCR、光學(xué)檢測、熒光檢測、生物發(fā)光檢測、化學(xué)發(fā)光檢測、電化學(xué)檢測、電化學(xué)發(fā)光檢測和側(cè)向流檢測。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，雜交步驟(c)與接合步驟(b)同時進(jìn)行。在另一個方面并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，本發(fā)明提供一種檢測樣品中的多個不同目標(biāo)核酸的方法，其中每個目標(biāo)序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，這種方法包含(a)提供多個接合襯底，各自包含：不同目標(biāo)核酸中的一種；包含以下各項的第一核酸接合探針：與一個目標(biāo)核酸的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第一探針結(jié)構(gòu)域、第一引物序列和5'-接合部分；以及包含以下各項的第二核酸接合探針：與一個目標(biāo)核酸的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第二探針結(jié)構(gòu)域、第二引物序列和3'接合部分。接合探針中的一個包含可變間隔區(qū)序列。這種方法進(jìn)一步包含以下步驟：(b)在不存在接合酶的情況下接合第一接合探針和第二接合探針以形成多個不同接合產(chǎn)物，其中不同接合產(chǎn)物具有不同目標(biāo)特定長度；(c)擴(kuò)增接合產(chǎn)物；以及(d)以不同目標(biāo)長度為基礎(chǔ)檢測不同接合產(chǎn)物的存在。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，目標(biāo)核酸序列為RNA或DNA。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，樣品來源于血液。在又一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，樣品來源于石蠟包埋樣品。在再一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，檢測是通過毛細(xì)管電泳或通過質(zhì)譜分析。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，第一引物中的每一個是相同的并且第二引物中的每一個是相同的。在其他方面并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，本發(fā)明提供一種用于檢測目標(biāo)核酸序列的試劑盒，其中目標(biāo)序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，這種試劑盒包含：(a)包含6MGuHCl的2X裂解緩沖液；(b)包含以下各項的第一接合探針：(i)與第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第一探針結(jié)構(gòu)域，(ii)第一引物序列，以及(iii)5'-接合部分；以及(c)包含以下各項的第二核酸接合探針：(i)與第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第二探針結(jié)構(gòu)域，(ii)第二引物序列；以及(iii)3'接合部分。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，一個或兩個接合探針進(jìn)一步包含可變間隔區(qū)序列。在另一個方面并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，本發(fā)明提供一種檢測樣品中的多個不同目標(biāo)核酸的方法，其中每個目標(biāo)序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，這種方法包含：(a)提供包含以下各項的反應(yīng)混合物：(i)包含血液的目標(biāo)樣品，以及(ii)包含3MGuHCl的1X裂解緩沖液；(b)使反應(yīng)混合物與多個不同探針組接觸，每個探針組包含：(i)包含以下各項的第一接合探針：(1)與一個目標(biāo)核酸的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第一探針結(jié)構(gòu)域，(2)第一引物序列，以及(3)5'-接合部分；以及(iii)包含以下各項的第二核酸接合探針：(1)與一個目標(biāo)核酸的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第二探針結(jié)構(gòu)域，(2)第二引物序列，以及(3)3'接合部分；(d)在不存在接合酶的情況下接合第一接合探針和第二接合探針以形成多個不同接合產(chǎn)物；(e)擴(kuò)增不同接合產(chǎn)物；以及(f)檢測接合產(chǎn)物的存在。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，接合探針進(jìn)一步包含可變間隔區(qū)序列。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，目標(biāo)核酸為RNA。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，第一接合探針和第二接合探針中的一個進(jìn)一步包含結(jié)合搭配物對中的一種，并且在擴(kuò)增之前，添加包含另一個結(jié)合對的珠粒以捕獲接合產(chǎn)物。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，檢測是使用可變間隔區(qū)序列來完成。在另一個方面并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，本發(fā)明提供一種檢測樣品中的多個目標(biāo)RNA序列的方法，其中每個目標(biāo)核酸序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域以及第三目標(biāo)結(jié)構(gòu)域。這種方法包括以下步驟：將樣品收集到緩沖液中以形成穩(wěn)定樣品；根據(jù)上述實施方案中的任一個在穩(wěn)定樣品中進(jìn)行試驗以檢測多個目標(biāo)核酸。在另一個實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，樣品在環(huán)境室溫下穩(wěn)定至少1周。附圖簡述圖1為CLPA-CE試驗的一個實施方案的示意性圖示。圖2為CLPA-MDM試驗的一個實施方案的示意性圖示。圖3為示出2-探針和3-探針CLPA反應(yīng)的一個實施方案的示意性圖示。圖4為可以用于制造具有3'-DABSYL離去基的DNA的DNA合成樹脂的示意性圖示。圖5為CLPA-CE試驗的一個實施方案的工藝流程的示意性圖示。圖6為示出用于CLPA試驗的探針設(shè)計的示意性圖示，其中探針含有尺寸變異性填充序列。圖7示出通過CLPA-CE分析的樣品的電泳分離輪廓。圖8示出CLPA-CE分析中目標(biāo)濃度與峰高之間的線性關(guān)系。圖9示出關(guān)于FFPE組織樣品分析的資料，其比較具有前列腺FFPE組織切片的多種目標(biāo)(對于每個目標(biāo)來說的左側(cè)條)與非目標(biāo)對照(pNTC-對于每個目標(biāo)來說的右側(cè)條)的Luminex信號。圖10為用于將結(jié)合的CLPA探針組與溶液相/未結(jié)合的CLPA探針組分離的目標(biāo)捕獲方法的示意性圖示。圖11為與單個目標(biāo)捕獲探針一起結(jié)合到樣品目標(biāo)上的多重獨特CLPA探針組的示意性圖解。圖12為本發(fā)明的一個實施方案的可能定向的另一個示意性圖解，其可以特別用于評估樣品完整性。圖12A描繪類似于圖11的定向，除了其中捕獲探針在接合探針組的“下游”。CM為捕獲部分。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，CM可以在捕獲探針的3'端或5'端，不過其通常被描繪在3'末端。另外，每個接合探針中不與目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的部分可以含有許多不同功能部分，包括(但不限于)引物結(jié)合結(jié)構(gòu)域、尺寸標(biāo)簽、捕獲序列等，如圖11中所示。圖12A示出接合探針組在目標(biāo)的長度上以約25-30％的增量間隔以供樣品完整性評估的情形。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解并且如下文所描述，不同接合探針組的間距可以視需要而變化。圖12B描繪另一種定向。圖12C描繪可以用于完整性評估或冗余的定向。圖13A-C描繪用于SNP檢測的本發(fā)明實施方案的多個示意圖。發(fā)明詳述除非另有指示，否則本發(fā)明的實施可以采用有機(jī)化學(xué)、聚合物技術(shù)、分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)和描述，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些常規(guī)技術(shù)包括聚合物陣列合成、雜交、接合、噬菌體呈現(xiàn)，以及使用標(biāo)記的雜交檢測?？梢酝ㄟ^參考下文中的實施例來對適合技術(shù)進(jìn)行具體說明。然而，當(dāng)然也可以使用其他等效的常規(guī)程序。這些常規(guī)技術(shù)和描述可以見于標(biāo)準(zhǔn)實驗手冊中，如GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries(第I-IV卷)，UsingAntibodies:ALaboratoryManual，Cells:ALaboratoryManual，PCRPrimer:ALaboratoryManual，以及MolecularCloning:ALaboratoryManual(全部獲自ColdSpringHarborLaboratoryPress)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman,NewYork,Gait,“OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach”1984,IRLPress,London,NelsonandCox(2000)，Lehninger,PrinciplesofBiochemistry第3版,W.H.FreemanPub.,NewYork,N.Y.，以及Berg等人(2002)Biochemistry,第5版,W.H.FreemanPub.,NewYork,N.Y.，所有這些文獻(xiàn)出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。應(yīng)注意，除非上下文另有明確指示，否則如本文中和隨附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(種)(a/an)”和“這個(種)”包括復(fù)數(shù)個(種)指示物。因此，舉例來說，提及“一種聚合酶”是指一種試劑或這些試劑的混合物，并且提及“這種方法”包括提及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等效步驟和方法，等等。除非另有規(guī)定，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。本文中所提及的所有公開案都以引用的方式并入本文中，用于達(dá)成描述和披露公開案中所描述并且可能與目前描述的本發(fā)明結(jié)合使用的裝置、組合物、配制品和方法的目的。在提供值的一個范圍的情況下，應(yīng)了解，除非上下文另有明確指示，否則介于那個范圍的上限與下限之間的每個居中值到下限單位的十分中的一種以及在那個規(guī)定范圍內(nèi)的任何其他規(guī)定值或居中值都涵蓋于本發(fā)明中。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在較小范圍內(nèi)并且也涵蓋于本發(fā)明中，條件為在規(guī)定范圍內(nèi)有任何特定排除的限值。在規(guī)定范圍包括一個或兩個限值的情況下，排除那些所包括的限值中的兩個限值中的任一個的范圍也包括在本發(fā)明中。在以下描述中，闡述眾多具體細(xì)節(jié)以提供本發(fā)明的更充分理解。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)顯而易知，本發(fā)明可以在沒有這些具體細(xì)節(jié)中的一個或多個細(xì)節(jié)的情況下實施。在其他情況下，并未描述本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的熟知特征和程序以避免模糊本發(fā)明。所有數(shù)字標(biāo)示，例如pH值、溫度、時間、濃度和分子量(包括范圍)，都是以0.1的增量(+)或(-)變化的近似值。應(yīng)了解，盡管并不總有明確規(guī)定，但所有數(shù)字標(biāo)示之前都加上術(shù)語“約”。術(shù)語“約”除了“X”的微小增量以外也包括精確值“X”，如“X+0.1”或“X-0.1”。還應(yīng)了解，盡管并不總有明確規(guī)定，但本文所描述的試劑僅為示例性的并且這些試劑的等效物在本領(lǐng)域中是已知的。I.綜述本發(fā)明包括用于檢測樣品中的目標(biāo)核酸的方法和組合物。一般來說，目標(biāo)核酸是通過包括化學(xué)接合步驟的方法來檢測，在這個步驟中，在不使用外源接合酶的情況下接合兩個與目標(biāo)核酸的相鄰結(jié)構(gòu)域雜交的接合探針。本發(fā)明提供了利用兩個或更多個接合探針(在本文中也被稱為“寡核苷酸探針”)的方法，這些接合探針以可逆方式彼此緊密結(jié)合目標(biāo)核酸并且具有互補的反應(yīng)性接合部分。在接合反應(yīng)中，當(dāng)探針已經(jīng)按適當(dāng)定向結(jié)合到目標(biāo)上時，其能夠經(jīng)歷自發(fā)化學(xué)接合反應(yīng)，得到接合寡核苷酸產(chǎn)物，而不依賴于使用接合酶。然后，可以通過按許多不同方式測量接合寡核苷酸產(chǎn)物(在本文中也被稱為“接合產(chǎn)物”)的存在或量來確定所關(guān)注的目標(biāo)的存在。如下文所描述，接合探針可以含有多種額外的功能部分，包括(但不限于)用以輔助接合寡核苷酸產(chǎn)物的識別、定量或檢測的可檢測標(biāo)記，包括例如直接標(biāo)記，如光學(xué)標(biāo)記和電化學(xué)標(biāo)記等，如下文更充分描述；包含核酸序列的可變間隔區(qū)序列或“尺寸標(biāo)簽”，這些核酸序列經(jīng)過定尺寸以對特定目標(biāo)具特異性，以使得檢測具有特定尺寸的接合產(chǎn)物(或由這些接合產(chǎn)物產(chǎn)生的擴(kuò)增子)可以識別特定目標(biāo)核酸序列的存在和/或量。包括在一個或多個接合探針中的另一種任選的功能部分為被設(shè)計成用于在固體支撐物(例如微陣列、微珠粒、納米粒子等)上進(jìn)行后續(xù)捕獲的捕獲部分，其包括(但不限于)結(jié)合搭配物，如生物素、錨定寡核苷酸序列(在本文中也被稱為“錨定序列”或“捕獲序列”)；促進(jìn)接合產(chǎn)物的濃縮或操作的分子柄(molecularhandle)(磁性粒子、寡核苷酸編碼序列)；以及用以有助于經(jīng)由如DNA或RNA聚合酶的酶進(jìn)行接合產(chǎn)物的后續(xù)二次擴(kuò)增的啟動子和引物序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的接合反應(yīng)不需要存在外源添加的接合酶，也不需要額外的酶，不過一些二次反應(yīng)可能依賴于使用酶，如下文所描述的聚合酶。目標(biāo)的擴(kuò)增也可以包括接合產(chǎn)物的周轉(zhuǎn)，其中接合產(chǎn)物對模板或目標(biāo)核酸的親和力與個別的接合探針相比較低或相當(dāng)。因此，在接合雜交探針后，接合產(chǎn)物從目標(biāo)中釋放，從而放出目標(biāo)以充當(dāng)新的接合反應(yīng)的模板。或者，可以進(jìn)行熱循環(huán)以從目標(biāo)序列中移出接合產(chǎn)物并且使新的接合探針雜交以用于另一個接合周期。本發(fā)明提供用于檢測樣品中的一個或多個核酸目標(biāo)的組合物、設(shè)備和方法，包括(但不限于)DNA和RNA目標(biāo)。使用非酶促方法用于核酸目標(biāo)檢測的優(yōu)點包括對非天然DNA類似物結(jié)構(gòu)的靈敏度較低、能夠使用RNA目標(biāo)序列和較低成本以及在變化的條件下穩(wěn)固性較高。具體來說，本文所描述的方法不需要大量樣品準(zhǔn)備工作；即，接合反應(yīng)可以在存在會抑制或鈍化酶促過程的污染物和緩沖液的情況下進(jìn)行以供檢測。舉例來說，可以將血液樣品收集到高度變性的穩(wěn)定緩沖液中，添加探針，并且反應(yīng)在會使酶促過程變性的條件下發(fā)生。這種分析不純樣品中的目標(biāo)核酸、尤其RNA的能力特別可用于以下應(yīng)用：如醫(yī)學(xué)診斷(包括基因表達(dá)譜分析和SNP檢測)、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，以及對因環(huán)境毒素和/或輻射引起的損傷的測試。另外，本發(fā)明的方法和組合物適用于檢測來自樣品的被降解的核酸，包括石蠟包埋樣品，其中固定并包埋入石蠟中的過程使得樣品的核酸降解。另外，本發(fā)明的一個實施方案提供關(guān)于目標(biāo)核酸“完整性”的試驗。就是說，如本領(lǐng)域中所知，對于例如mRNA或固定樣品中的核酸，核酸隨時間而被降解。如圖11和圖12中所示并且如下文更充分描述，本發(fā)明可使用多重接合復(fù)合物來評估樣品的完整性。類似地，對于每個目標(biāo)序列使用這些多重接合復(fù)合物也可以用于通過冗余實現(xiàn)資料和試驗完整性，類似于例如一式兩份或一式三份操作樣品。在其他方面，本發(fā)明提供用以穩(wěn)定樣品中的核酸的緩沖液。這些緩沖液一般包括包含離液陽離子的變性劑，在一個非限制性實施方案中包括鹽酸胍。在本發(fā)明的特定實施方案中，將樣品直接收集到本發(fā)明的緩沖液中，然后在無需從樣品中純化核酸的情況下在那個緩沖液中進(jìn)行接合探針的后續(xù)雜交和接合。在某些實施方案中，首先稀釋收集到緩沖液中的樣品，隨后在無需純化樣品中的目標(biāo)核酸的情況下在那個稀釋樣品中進(jìn)行雜交并接合兩個或更多個接合探針的本文所描述的方法。如上文所論述，使本發(fā)明的接合探針與目標(biāo)核酸雜交，然后在不使用接合酶的情況下接合。在接合之后，可以任選地通過酶促或化學(xué)反應(yīng)擴(kuò)增所產(chǎn)生的新產(chǎn)物(“接合產(chǎn)物”)。在優(yōu)選實施方案中，化學(xué)接合反應(yīng)連接兩個上面具有PCR引物(例如通用PCR引物)位點的探針。另外，在本發(fā)明的一個實施方案中，一個或兩個接合探針含有填充序列或可變間隔區(qū)序列，其被設(shè)計成對于每個探針組(即每個目標(biāo)序列)具有不同長度，從而產(chǎn)生具有目標(biāo)特異性長度的接合產(chǎn)物。在接合之后，現(xiàn)在可以通過PCR以指數(shù)方式擴(kuò)增規(guī)定長度的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，探針可以具有可檢測標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記、電化學(xué)標(biāo)記、磁性珠粒、納米粒子、生物素等)以輔助接合寡核苷酸產(chǎn)物的識別、純化、定量或檢測。探針還可以任選地在其結(jié)構(gòu)中包括：被設(shè)計成用于在固體支撐物(微陣列、微珠粒、納米粒子)上進(jìn)行后續(xù)捕獲的錨定寡核苷酸序列，促進(jìn)接合產(chǎn)物的濃縮或操作的分子柄(磁性粒子、寡核苷酸編碼序列)，以及用以有助于經(jīng)由如DNA或RNA聚合酶的酶進(jìn)行接合產(chǎn)物的后續(xù)二次擴(kuò)增的啟動子序列。本發(fā)明的接合反應(yīng)快速進(jìn)行，對所關(guān)注的目標(biāo)具特異性，并且可以產(chǎn)生針對每個目標(biāo)的多重接合產(chǎn)物拷貝，從而實現(xiàn)可檢測信號的擴(kuò)增(有時在本文中被稱為“產(chǎn)物周轉(zhuǎn)”)。本發(fā)明的接合反應(yīng)不需要存在外源添加的接合酶，也不需要額外的酶，不過一些二次反應(yīng)可能依賴于使用酶，如下文所描述的聚合酶。接合化學(xué)部分可以從許多先前所描述的化學(xué)部分中選擇。優(yōu)選的化學(xué)部分為可以容易地被并入到常規(guī)制造技術(shù)中，在儲存期間穩(wěn)定，并且在并入到經(jīng)過適當(dāng)設(shè)計的接合探針組中時展示出對目標(biāo)特異性接合的較大偏好的化學(xué)部分。另外，對于涉及通過酶進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增的實施方案，產(chǎn)生可以通過酶有效處理的接合產(chǎn)物的接合化學(xué)部分和探針設(shè)計(包括非天然核苷酸類似物)是優(yōu)選的。目標(biāo)的擴(kuò)增還可以包括接合產(chǎn)物的周轉(zhuǎn)，例如通過去穩(wěn)定，其中接合產(chǎn)物對模板或目標(biāo)核酸的親和力與個別的接合探針相比較低或相當(dāng)；或通過在存在過量探針的情況下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)。因此，在接合雜交探針后，接合產(chǎn)物從目標(biāo)中釋放，從而放出目標(biāo)以充當(dāng)新的接合反應(yīng)的模板。在本發(fā)明的其他方面并且如下文進(jìn)一步詳細(xì)論述，本發(fā)明試驗的特異性任選地通過使用目標(biāo)捕獲探針來改善。本發(fā)明的目標(biāo)捕獲探針包括與目標(biāo)核酸上的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域互補的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域和捕獲部分。目標(biāo)捕獲探針不參與與接合探針的接合反應(yīng)，而是被設(shè)計成與接合探針上游或下游的目標(biāo)核酸雜交。目標(biāo)捕獲探針與目標(biāo)核酸的雜交產(chǎn)生目標(biāo)復(fù)合物，其包括目標(biāo)核酸、目標(biāo)捕獲探針以及在目標(biāo)核酸上形成的任何接合產(chǎn)物。然后，可以使目標(biāo)復(fù)合物結(jié)合到表面或襯底(如珠粒)上，并且可以從結(jié)合到表面或襯底上的目標(biāo)復(fù)合物中分離任何未結(jié)合的反應(yīng)物。因此，由于任何后續(xù)擴(kuò)增和/或檢測步驟是對與接合探針成功雜交的目標(biāo)核酸的原始樣品的子組進(jìn)行，故后續(xù)試驗的特異性得到改善。本發(fā)明的上述和其他方面和實施方案進(jìn)一步詳細(xì)描述于以下章節(jié)中。II.樣品在一個方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中目標(biāo)核酸(在本文中也被稱為“目標(biāo)序列”)的存在或不存在的組合物和方法。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，樣品可以包含許多事物，包括(但不限于)體液(包括(但不限于)實際上任何生物體的血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛門和陰道分泌物、汗液和精液，其中哺乳動物樣品是優(yōu)選的并且人類樣品是特別優(yōu)選的)；環(huán)境樣品(包括(但不限于)空氣、農(nóng)業(yè)、水和土壤樣品)；植物材料；生物戰(zhàn)劑樣品；研究樣品(例如，樣品可以是擴(kuò)增反應(yīng)(例如基因組DNA的一般擴(kuò)增)的產(chǎn)物)；經(jīng)過純化的樣品，如經(jīng)過純化的基因組DNA、RNA、蛋白質(zhì)等；原樣品(細(xì)菌、病毒、基因組DNA等)；如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，實際上任何實驗操作都可以對樣品進(jìn)行。一些實施方案利用siRNA和微RNA作為目標(biāo)序列(Zhang等人,JCellPhysiol.(2007)210(2):279-89；Osada等人,Carcinogenesis.(2007)28(1):2-12；以及Mattes等人,AmJRespirCellMolBiol.(2007)36(1):8-12，這些文獻(xiàn)中的每一個出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，并且尤其是關(guān)于目標(biāo)序列的所有教導(dǎo)內(nèi)容)。本發(fā)明的一些實施方案利用來自儲存(例如冷凍和/或存檔)或新鮮組織的樣品。石蠟包埋樣品特別用于許多實施方案中，因為這些樣品可能非常適用于診斷和預(yù)后，這是由于存在與樣品相關(guān)的額外資料。如本文所描述的固定并石蠟包埋的組織樣品是指可儲存或存檔的組織樣品。將大多數(shù)來源于患者的病理樣品以常規(guī)方式固定并石蠟包埋以供組織學(xué)分析和后續(xù)存檔儲存。這些樣品往往不適用于傳統(tǒng)核酸檢測方法，因為這些研究需要核酸樣品的高度完整性，從而可以進(jìn)行核酸表達(dá)的精確測量。石蠟包埋樣品中的基因表達(dá)研究往往被限于通過使用免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行定性監(jiān)測以監(jiān)測蛋白質(zhì)表達(dá)水平。存在許多用于從固定石蠟包埋樣品中純化核酸的技術(shù)，如WO2007/133703中所描述，其全部內(nèi)容出于所有目的以引用的方式并入本文中并且尤其是關(guān)于從石蠟包埋樣品中純化核酸的所有教導(dǎo)內(nèi)容。Foss等人,DiagnosticMolecularPathology,(1994)3:148-155和Paska,C.等人,DiagnosticMolecularPathology,(2004)13:234-240所描述的方法以及可商購的試劑盒，如Ambion的Recoverall總核酸分離試劑盒，都以全文引用的方式包括在內(nèi)。常用方法以經(jīng)由用二甲苯或其他有機(jī)溶劑萃取從組織中去除石蠟的步驟開始，之后用使組織和蛋白質(zhì)裂解并且?guī)椭鷱慕M織中釋放基因組材料的熱和蛋白酶(如蛋白酶K)處理。然后，將所釋放的核酸捕獲于膜上或從溶液中沉淀，洗滌去除雜質(zhì)，并且對于mRNA分離的情況，有時添加DNase處理步驟以使不合需要的DNA降解。如本文進(jìn)一步詳細(xì)論述，目標(biāo)分析物和用于檢測目標(biāo)分析物的接合探針都可以根據(jù)本發(fā)明包含核酸?！昂怂帷被颉肮押塑账帷被蛘Z法等效物在本文中意指至少兩個共價連接在一起的核苷酸。目標(biāo)核酸可以包含DNA或RNA。本發(fā)明的核酸一般將含有磷酸二酯鍵(例如在目標(biāo)序列的情況下)，不過在一些情況下，如下文所概述，包括可以具有交替骨架的核酸類似物(尤其與接合一起使用的標(biāo)記或捕獲探針)，這些骨架包含例如磷酰胺(Beaucage等人,Tetrahedron(1993)49(10):1925和其中的參考文獻(xiàn)；Letsinger,J.Org.Chem.(1970)35:3800；Sprinzl等人,Eur.J.Biochem.(1977)81:579；Letsinger等人,Nucl.AcidsRes.(1986)14:3487；Sawai等人,Chem.Lett.(1984)805；Letsinger等人,J.Am.Chem.Soc.(1988)110:4470；以及Pauwels等人,ChemicaScripta(1986)26:141)、硫代磷酸酯(Mag等人,NucleicAcidsRes.(1991)19:1437；以及美國專利第5,644,048號)、二硫代磷酸酯(Briu等人,J.Am.Chem.Soc.(1989)111:2321)、O-甲基亞磷酰胺鍵(參看Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPress)，以及肽核酸骨架和鍵(參看Egholm,J.Am.Chem.Soc.(1992)114:1895；Meier等人,Chem.Int.Ed.Engl.(1992)31:1008；Nielsen,Nature,(1993)365:566；Carlsson等人,Nature(1996)380:207，所有這些文獻(xiàn)都以全文引用的方式并入本文中)。其他類似物核酸包括具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的那些核酸，其包括鎖核酸(Koshkin等人,J.Am.Chem.Soc.(1998)120:132523)；正性骨架(Denpcy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:6097)；非離子性骨架(美國專利第5,386,023號、第5,637,684號、第5,602,240號、第5,216,141號以及第4,469,863號；Kiedrowshi等人,Angew.Chem.Intl.Ed.English(1991)30:423；Letsinger等人,J.Am.Chem.Soc.(1988)110:4470；Letsinger等人,Nucleoside&Nucleotide(1994)13:1597；第2章和第3章,ASCSymposiumSeries580,Ed.Y.S.Sanghui和P.DanCook編；Mesmaeker等人,Bioorganic&MedicinalChem.Lett.(1994)4:395；Jeffs等人,J.BiomolecularNMR(1994)34:17；Xu等人,TetrahedronLett.(1996)37:743)；以及非核糖骨架，包括美國專利第5,235,033號和第5,034,506號以及第6章和第7章,ASCSymposiumSeries580,Ed.Y.S.Sanghui和P.DanCook編所描述的那些骨架。含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸定義內(nèi)(參看Jenkins等人,Chem.Soc.Rev.(1995)第169-176頁)。幾種核酸類似物描述于Rawls,C&ENews1997年6月2日,第35頁中。所有這些參考文獻(xiàn)都出于所有目的以全文引用的方式明確并入本文中，并且尤其是關(guān)于核酸的所有教導(dǎo)內(nèi)容。可以對核糖-磷酸酯骨架進(jìn)行這些修飾以有助于添加標(biāo)記或其他部分，從而提高或降低在生理環(huán)境中這些分子的穩(wěn)定性和半衰期，等等。舉例來說，在一些情況下，取決于所利用的化學(xué)方法，使用本發(fā)明的接合部分可以產(chǎn)生核酸類似物作為接合產(chǎn)物。舉例來說，如下文的方案1中所示，使用某些接合部分產(chǎn)生磷酸硫酯鍵(phosphothioesterbond)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，所有這些核酸類似物都可以用于本發(fā)明。另外，可以制得天然存在的核酸和類似物的混合物；舉例來說，在接合部分的位點處，可以使用類似物結(jié)構(gòu)?；蛘?，可以制得不同核酸類似物的混合物以及天然存在的核酸和類似物的混合物。核酸類似物可以包括(例如)肽核酸(PNA；WO92/20702，其以全文引用的方式并入本文中)和鎖核酸(LNA；KoshkinAA等人Tetrahedron(1998)54:3607-3630，KoshkinAA等人J.Am.Chem.Soc.(1998)120:13252-13253，WahlestedtC等人PNAS(2000)97:5633-5638，這些文獻(xiàn)中的每一個以全文引用的方式并入本文中)。在一些應(yīng)用中，這種類型的類似物骨架可以展現(xiàn)出改善的雜交動力學(xué)、改善的熱穩(wěn)定性以及改善的對錯配序列的靈敏度。核酸可以是單鏈或雙鏈的(如所指定)，或含有雙鏈或單鏈序列的部分。核酸可以是DNA、基因組和cDNA、RNA或雜交體，其中核酸含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何組合以及堿基的任何組合，包括天然存在的核堿基(尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧碇、鳥嘌呤)和非天然存在的核堿基(肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧碇、異鳥嘌呤、5-甲基胞嘧碇、假異胞嘧碇、2-硫代尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黃嘌呤、N9-(7-脫氮-鳥嘌呤)、N9-(7-脫氮-8-氮雜-鳥嘌呤)和N8-(7-脫氮-8-氮雜-腺嘌呤)、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙炔基-尿嘧啶)，等等。如本文中所用的術(shù)語“核堿基”包含“核苷”和“核苷酸”兩者，以及核酸類似物的單體。因此，舉例來說，肽核酸中各自含有堿基的個別單元在本文中被稱為核堿基。一般促使在單鏈狀態(tài)下不存在于目標(biāo)序列的區(qū)域中的核酸樣品(例如目標(biāo)序列)在檢測或雜交之前在這(這些)區(qū)域中呈單鏈形式。一般來說，可以使用熱或化學(xué)變性促使核酸樣品在目標(biāo)序列的區(qū)域中呈單鏈形式。對于經(jīng)由擴(kuò)增獲得的多核苷酸來說，適合于產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的方法是優(yōu)選的。適合于產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物多核苷酸的擴(kuò)增過程的非限制性實例包括(但不限于)T7RNA聚合酶失控轉(zhuǎn)錄、RCA、不對稱PCR(Bachmann等人,NucleicAcidRes.(1990)18:1309)，以及異步PCR(WO01/94638)。也可以使用通常已知的促使雙鏈多核苷酸的區(qū)域呈單鏈形式的方法，如使用PNA啟子(美國專利第6,265,166號)，從而在多核苷酸上產(chǎn)生單鏈目標(biāo)序列。目標(biāo)核酸如本文進(jìn)一步論述，本發(fā)明提供用于檢測目標(biāo)序列的方法和組合物。“目標(biāo)序列”或“目標(biāo)核酸”或語法等效物在本文中意指單鏈核酸上的核酸序列。目標(biāo)序列可以是基因、調(diào)控序列、基因組DNA、cDNA、RNA(包括mRNA、微RNA和rRNA)的一部分，或其他。如本文中所概述，目標(biāo)序列可以是來自樣品或二次目標(biāo)(如擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物)的目標(biāo)序列，等等。目標(biāo)序列可以具有任何長度，其條件為較長序列具有較大特異性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，互補目標(biāo)序列可以呈現(xiàn)許多形式。舉例來說，目標(biāo)序列可以含于較大核酸序列內(nèi)，即，基因或mRNA的全部或一部分、質(zhì)?；蚧蚪MDNA的限制性片段，以及其他。這些目標(biāo)序列的任何和所有組合都可以充當(dāng)特定試驗中的目標(biāo)核酸。在許多情況下，進(jìn)行多重試驗，其中同時檢測多個目標(biāo)序列，例如用于如下文更充分描述的基因表達(dá)譜分析。一般來說，每個目標(biāo)序列包含多個不同目標(biāo)結(jié)構(gòu)域。每個目標(biāo)序列具有至少一對用于與一組接合探針雜交的接合結(jié)構(gòu)域，或更多對，如下文所描述。舉例來說，樣品目標(biāo)序列的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域可以與第一接合探針雜交，并且目標(biāo)序列中的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域可以與第二接合探針雜交，例如以使得化學(xué)接合部分在空間上足夠接近，從而進(jìn)行自發(fā)化學(xué)接合。一般來說，每對目標(biāo)接合結(jié)構(gòu)域彼此相鄰，即，不存在隔開兩個結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的核苷酸。這可用于目標(biāo)序列的一般檢測(例如使用mRNA作為目標(biāo)序列的基因表達(dá)譜分析)、如下文所論述的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，以及用于單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism；SNP)檢測。對于SNP檢測來說，目標(biāo)序列包含需要得到序列信息的位置，在本文中一般被稱為“檢測位置”。在一些實施方案中，檢測位置是單個核苷酸；而在一些實施方案中，其可以包含多個彼此相連或與由一個或多個核苷酸隔開的核苷酸。如本文中所用的“多個”意指至少兩個。如本文中所用，堿基與雜交體中的檢測位置堿基配對的接合探針的堿基被稱為“詢問位置”。每個樣品目標(biāo)核酸可以另外具有多對接合結(jié)構(gòu)域。就是說，1、2、3或更多組接合探針可以與多重位置處的相同目標(biāo)序列雜交，如圖11或12中一般描繪。如下文更充分概述，針對每個目標(biāo)核酸使用多重接合結(jié)構(gòu)域可以充當(dāng)評估樣品中目標(biāo)核酸(和/或原始樣品)的完整性的基礎(chǔ)。除接合結(jié)構(gòu)域以外，樣品目標(biāo)核酸還可以含有其他結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，本發(fā)明的目標(biāo)核酸包括目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域能夠雜交的目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域。一般來說，如圖11中所描繪并且取決于試驗?zāi)康?，目?biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域可以在目標(biāo)核酸的一個或多個接合結(jié)構(gòu)域的“上游”、“下游”或“之間”。除非有規(guī)定，否則術(shù)語“第一”和“第二”并不意味著關(guān)于目標(biāo)序列的5'-3'定向賦予序列的定向。舉例來說，假定互補目標(biāo)序列呈5'-3'定向，那么第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域可以位于第二結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的5'處，或位于第二結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的3'處。為便于提及并且不具限制性，這些結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域有時被稱為“上游”和“下游”，通常慣例是目標(biāo)序列以5'到3'定向顯示。然而，應(yīng)注意，接合結(jié)構(gòu)域具有使得接合探針組的3'和5'接合部分完全相鄰地(例如沒有介入核堿基)或在連接接合部分的連接子允許接合的一定距離內(nèi)雜交的定向。在一些實施方案中，可以隔開這對目標(biāo)接合結(jié)構(gòu)域。舉例來說，在一些情況下，當(dāng)需要接合擴(kuò)增時，接合探針在由目標(biāo)序列的一個或多個核堿基雜交時可以利用連接子并且被隔開以賦予接合產(chǎn)物雜交不穩(wěn)定性。在其他應(yīng)用中，如下文進(jìn)一步詳細(xì)論述，本發(fā)明的緩沖液用于穩(wěn)定樣品中的核酸、尤其RNA。在本發(fā)明的一些方面，樣品被收集到本發(fā)明的緩沖液中。在其他實施方案中并且如下文進(jìn)一步詳細(xì)論述，這些緩沖液包括變性劑、還原劑、表面活性劑、pH緩沖劑、EDTA中的一種或多種，以及其任何組合。III.緩沖液在一個方面，本發(fā)明提供穩(wěn)定核酸(在本文中也被稱為“樣品核酸”或“目標(biāo)核酸”)的方法和組合物。如本文中所用的“穩(wěn)定”意味著樣品中的核酸甚至在環(huán)境室溫或高于環(huán)境室溫下儲存一段時間時對降解具抗性。在一些實施方案中，本發(fā)明的緩沖液中所含的核酸在室溫或高于室溫下穩(wěn)定約一天到約三個月。穩(wěn)定性可以使用本領(lǐng)域中已知的任何手段來測量，包括如下文進(jìn)一步論述的核酸完整性試驗。在其他實施方案中，如果儲存于緩沖液中的樣品中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％的核酸相比未儲存于緩沖液中的樣品中的那些核酸顯示較少降解，那么包含本發(fā)明的緩沖液中所含的核酸的樣品就被評估為與未儲存于緩沖液中的樣品相比具有較高穩(wěn)定性。在其他實施方案中，如果樣品中至少大部分核酸與未儲存于緩沖液中的樣品相比顯示較少降解，那么樣品就被認(rèn)定為由本發(fā)明的緩沖液穩(wěn)定。RNA樣品的穩(wěn)定性常常是通過用來測量核酸樣品的平均尺寸的毛細(xì)管電泳法來評估。穩(wěn)定樣品將具有長于未穩(wěn)定樣品的平均尺寸。本發(fā)明的另一個方面為與一個或多個目標(biāo)捕獲探針組合的多重接合探針組的用途，其可以用于評估目標(biāo)核酸的平均尺寸，并且通過相關(guān)性來評估目標(biāo)核酸的降解程度。本發(fā)明的緩沖液可以任選地并且以任何組合形式包括變性劑、還原劑、表面活性劑、pH緩沖劑、螯合劑(如EDTA)中的一種或多種，以及其任何組合。如應(yīng)了解，本發(fā)明的緩沖液可以包括屬于相同類別的多種類型的組分，例如，本發(fā)明的緩沖液可以包括一種或多種不同種類的變性劑與一種或多種類型的表面活性劑的組合，等等。本發(fā)明的緩沖液的一個優(yōu)點在于其可以用于穩(wěn)定樣品中的核酸(如RNA)，然后可以根據(jù)本文所描述的方法從緩沖溶液中直接分析樣品。換句話說，可以對含于本發(fā)明的緩沖溶液中的樣品進(jìn)行本文所描述的化學(xué)接合和檢測方法，而無需分離或純化RNA。本發(fā)明的緩沖液的另一個優(yōu)點在于在將樣品收集到緩沖液中之后發(fā)生細(xì)胞裂解，由此不需要額外的裂解步驟從樣品中釋放目標(biāo)核酸。在一個示例性實施方案中，可以將包含RNA的樣品組合于包含鹽酸胍、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、TritonX-100和Tris-HCL的緩沖溶液(pH7.5)中。在另一個實施方案中，可以將包含RNA的樣品組合于包含異硫氰酸胍、EDTA、DTT、TritonX-100和Tris-HCl的緩沖溶液(pH7.5)中。RNA在這些緩沖溶液中穩(wěn)定并且未必需要將RNA與可能增強(qiáng)RNA降解的其他樣品成分分離。在其他實施方案中，本發(fā)明的緩沖液優(yōu)選地包括變性劑、尤其離液陽離子，其通過幫助展開RNA的二級結(jié)構(gòu)而具有提高本文所描述的方法和試驗的反應(yīng)和結(jié)合效率的作用。常用離液分子為鹽酸胍、異硫氰酸胍、甜菜堿或甘氨酸甜菜堿、脲、硫脲和高氯酸鋰。不受理論約束，有效斷開核酸中的三級結(jié)構(gòu)的離液劑是優(yōu)選的，并且還維持核酸目標(biāo)在溶液中的溶解度的離液劑是特別有利的。本發(fā)明的緩沖液、尤其包含離液陽離子的緩沖液的一個優(yōu)點在于緩沖液使樣品的核酸保持于溶液中。這與用于基于血液的測試的運輸系統(tǒng)中所用的其他傳統(tǒng)緩沖液成對比，這些傳統(tǒng)緩沖液傾向于在樣品的核酸(尤其RNA)周圍沉淀/形成陽離子外殼。因為本發(fā)明的緩沖液使核酸保持于溶液中，并且因為本發(fā)明試驗的化學(xué)接合方法不需要酶，所以可以將樣品收集到緩沖液中并且可以添加接合探針(并且在許多實施方案中為目標(biāo)捕獲探針)到樣品中并且形成接合產(chǎn)物。為改變雜交條件，然后釋放接合產(chǎn)物或目標(biāo)復(fù)合物以供進(jìn)一步分析，可以簡單地稀釋樣品加上緩沖液以稀釋變性劑并且從而改變雜交條件，由此允許使用本文所描述和本領(lǐng)域中已知的任何方法分析核酸。在其他實施方案中，本發(fā)明的緩沖液具有約5到約8.5的pH值。緩沖溶液更優(yōu)選地具有約6到8的pH值，并且甚至更優(yōu)選地具有約7.3或7.5的pH值。以下章節(jié)進(jìn)一步詳細(xì)論述示例性緩沖液組分。盡管個別地論述這些組分中的每一個，但本發(fā)明涵蓋以下緩沖液組分以及本領(lǐng)域中已知的任何其他組分的任何組合。變性劑在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的緩沖液包括一種或多種變性劑。如本文中所用的變性劑意指用以展開核酸的雙螺旋體同時損失二級和三級結(jié)構(gòu)的任何物質(zhì)。在其他實施方案中，變性劑包含離液陽離子，包括(但不限于)鹽酸胍(GuHCl)和異硫氰酸胍。在其他實施方案中，變性劑為鹽酸胍，其以約1摩爾濃度到約8摩爾濃度的濃度，并且更優(yōu)選地以約2摩爾濃度到約4摩爾濃度的濃度，并且甚至更優(yōu)選地以約3摩爾濃度的濃度存在。在其他實施方案中，本發(fā)明的緩沖液中GuHCl的濃度在約0.2-10、0.5-9、1-8、1.5-7、2-6、2.5-5以及3.0-4.0摩爾濃度的范圍內(nèi)。在其他實施方案中，本發(fā)明的緩沖液中GuHCl的濃度為約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15摩爾濃度。在其他實施方案中，變性劑為異硫氰酸胍，其以約1摩爾濃度到約8摩爾濃度的濃度，并且更優(yōu)選地以約2摩爾濃度到約4摩爾濃度的濃度，并且甚至更優(yōu)選地以約3摩爾濃度的濃度存在。在其他實施方案中，本發(fā)明的緩沖液中異硫氰酸胍的濃度在約0.2-10、0.5-9、1-8、1.5-7、2-6、2.5-5以及3.0-4.0摩爾濃度的范圍內(nèi)。在其他實施方案中，本發(fā)明的緩沖液中異硫氰酸胍的濃度為約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15摩爾濃度。如應(yīng)了解，本領(lǐng)域中已知的其他變性劑可以按類似于上文針對鹽酸胍和異硫氰酸胍所列出的那些濃度的濃度用于本發(fā)明的緩沖液中。在一些實施方案中，例如在使用高濃度的鹽(如胍鹽)的情況下，這些試劑還充當(dāng)裂解劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，一般來說，使用還充當(dāng)細(xì)胞裂解劑的變性劑具有特定用途，不過本發(fā)明還涵蓋使用第一個別裂解步驟，之后添加變性劑。表面活性劑在一些實施方案中，本發(fā)明的緩沖液包括一種或多種表面活性劑。在其他實施方案中，表面活性劑包括(但不限于)TritonX-100和N-十二烷基肌氨酸鈉。在其他實施方案中，表面活性劑以按重量計約0.1％到約5％的濃度存在于本發(fā)明的緩沖液中。在其他實施方案中，表面活性劑以按重量計約0.1％-10％、0.5％-9.5％、1％-9％、1.5％-8.5％、2％-8％、2.5％-7.5％、3％-7％、3.5％-6.5％、4％-6％以及4.5％-5.5％的濃度存在。在優(yōu)選實施方案中，表面活性劑具有約0.5％到約3％的濃度存在。在另一個實施方案中，表面活性劑具有按重量計約1.5％的濃度。ph緩沖劑在一些實施方案中，本發(fā)明的緩沖液包括一種或多種pH緩沖劑。這些pH緩沖劑包括(但不限于)Tris。在其他實施方案中，pH緩沖劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多pH緩沖劑中的一種。一般來說，本發(fā)明中所用的pH緩沖劑包括具有在操作pH的一個pH單位內(nèi)的pKa的試劑。在一些實施方案中，pH緩沖劑以約10mM到約100mM的濃度存在于本發(fā)明的緩沖液中。在優(yōu)選實施方案中，pH緩沖劑具有約20mM到約50mM的濃度，并且更優(yōu)選地具有約30mM的濃度。在其他實施方案中，pH緩沖劑具有約5-150、10-140、15-130、20-120、25-110、30-100、35-90、40-80、45-70以及50-60mM的濃度。還原劑在一些實施方案中，本發(fā)明的緩沖液包括一種或多種還原劑。這些還原劑可以包括(但不限于)二硫蘇糖醇(DTT)和巰基乙醇。在其他實施方案中，還原劑具有約1mM到約100mM的濃度。在優(yōu)選實施方案中，還原劑具有約4mM到約7mM的濃度，并且甚至更優(yōu)選地具有約5mM的濃度。在其他實施方案中，還原劑具有約0.5-10、1-9.5、1.5-9、2-8.5、2.5-8、3-7.5、3.5-7、4-6.5mM的濃度。在其他實施方案中，還原劑具有約1-150、10-140、15-130、20-120、25-110、30-100、35-90、40-80、45-70以及50-60mM的濃度。EDTA在其他實施方案中，本發(fā)明的緩沖液包括濃度為約1mM到約100mM的EDTA。EDTA更優(yōu)選地具有約10mM到約50mM的濃度，并且甚至更優(yōu)選地具有約20mM的濃度。在其他實施方案中，EDTA以約1-150、10-140、15-130、20-120、25-110、30-100、35-90、40-80、45-70以及50-60mM的濃度存在。在其他實施方案中，EDTA具有約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mM的濃度。額外緩沖液組分本發(fā)明的緩沖液可以進(jìn)一步包括本領(lǐng)域中已知的任何額外組分，尤其本領(lǐng)域中已知的用于涉及核酸的反應(yīng)中的組分。額外組分可以包括(但不限于)：佐劑、稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、鹽(包括NaCl和MgCl2)、親脂性溶劑、防腐劑等等。緩沖液組分還可以包括藥用賦形劑和添加劑、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)以及碳水化合物(例如糖，包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生化糖，如醛醇、醛糖酸、酯化糖等等；以及多糖或糖聚合物)，其可以單個地或以組合形式存在，單獨或以組合形式占1-99.99％(按重量或體積計)。示例性蛋白質(zhì)賦形劑包括血清白蛋白，如血清白蛋白(HSA)、重組人白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等等。也可以發(fā)揮緩沖能力的代表性氨基酸/抗體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜(aspartame)等等。碳水化合物賦形劑也預(yù)期處于本發(fā)明的范圍內(nèi)，其實例包括(但不限于)單糖，如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等等；多糖，如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、右旋糖苷、淀粉等等；以及醛醇，如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。本發(fā)明的緩沖液的用途本發(fā)明的緩沖液可以與本文所論述的樣品收集、化學(xué)接合或試驗中的任一個一起使用。在一些實施方案中，含有目標(biāo)核酸的樣品被收集到本發(fā)明的緩沖液中。本發(fā)明的緩沖液的優(yōu)點在于其傾向于穩(wěn)定樣品中所含的核酸。因此，本發(fā)明的緩沖液至少在一定程度上阻止了常常在收集后立即開始發(fā)生(尤其就RNA來說)的降解，從而提供了一組穩(wěn)固的目標(biāo)核酸用于使用本發(fā)明的方法進(jìn)行進(jìn)一步分析的優(yōu)點。在其他實施方案中，在樣品被收集到本發(fā)明的緩沖液中之后，可以將接合探針并且任選地將目標(biāo)捕獲探針(其進(jìn)一步詳細(xì)論述于下文中)直接添加到緩沖液中的樣品中，而無需純化目標(biāo)核酸。在一些實施方案中，首先稀釋緩沖液中的樣品，隨后添加探針(包括接合探針和目標(biāo)捕獲探針)。因為本發(fā)明的接合方法并不依賴于酶，所以接合探針的雜交和接合可以在無需從樣品中純化核酸并且不依賴于使用接合酶的情況下發(fā)生。這進(jìn)一步用來限制在樣品的核酸中發(fā)生的降解。IV.接合探針和化學(xué)接合方法在一個方面，本發(fā)明的接合探針包含任何聚合物質(zhì)，其能夠與核酸目標(biāo)以序列特異性方式相互作用并且具有可使探針經(jīng)歷與具有互補化學(xué)部分的另一種聚合物質(zhì)的自發(fā)化學(xué)接合反應(yīng)的化學(xué)部分。在一個實施方案中，接合探針可以是DNA、RNA、PNA、LNA、前述物質(zhì)的修飾型式和/或上述物質(zhì)的任何雜交體(例如DNA/RNA雜交體、DNA/LNA雜交體、DNA/PNA雜交體)。在一個優(yōu)選實施方案中，接合探針包含DNA或RNA寡核苷酸。本發(fā)明的接合探針經(jīng)過設(shè)計以使得當(dāng)探針在空間上很接近地結(jié)合到目標(biāo)多核苷酸的一部分上時，化學(xué)接合反應(yīng)在探針之間發(fā)生。一般來說，探針包含化學(xué)反應(yīng)性部分(在本文中一般被稱為“接合部分”)并且以特定定向結(jié)合到目標(biāo)多核苷酸上，以使得化學(xué)反應(yīng)性部分在空間上很接近，尤其使得自發(fā)接合反應(yīng)可以在不使用接合酶的情況下發(fā)生。在一個實施方案中，本發(fā)明提供接合探針組，通常是第一接合探針和第二接合探針，不過如本文所描述，一些實施方案利用多于兩個接合探針。另外，如本文中所提到，在一些情況下，完成轉(zhuǎn)移反應(yīng)而非接合；“接合探針”包括“轉(zhuǎn)移探針”。每個接合探針包含核酸部分，在本文中有時被稱為“接合結(jié)構(gòu)域”或“探針結(jié)構(gòu)域”，其實質(zhì)上與目標(biāo)結(jié)構(gòu)域中的一種互補。本發(fā)明的探針被設(shè)計成與目標(biāo)序列互補，以使得目標(biāo)序列與本發(fā)明探針的雜交發(fā)生。如本文所概述，這種互補性不需要是完全的；可能存在許多堿基對錯配，其將干擾目標(biāo)序列與本發(fā)明探針之間的雜交。然而，如果突變數(shù)如此大以致于在甚至最低嚴(yán)格的雜交條件下也無法發(fā)生雜交，那么序列就不是互補序列。因此，“實質(zhì)上互補”在本文中意味著探針與目標(biāo)序列充分互補以在正常反應(yīng)條件下雜交?！耙恢隆毙蛄袨樵诤藟A基的較短序列的長度上存在完全互補的那些序列。在本發(fā)明中可以使用多種雜交條件，包括高等、中等和低等嚴(yán)格條件；參看例如Maniatis等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,1989，和Ausubel等人,ShortProtocolsinMolecularBiology，以引用的方式并入本文中。如本領(lǐng)域中已知，當(dāng)使用非離子性骨架，例如PNA時，雜交條件也可以變化。在本發(fā)明的一個方面，探針的長度經(jīng)過設(shè)計以隨著目標(biāo)序列的長度、所需特異性、反應(yīng)(例如接合或轉(zhuǎn)移)以及雜交和洗滌條件而變化。一般來說，在這個方面，接合探針在約5個到約150個核堿基的范圍內(nèi)，其中約15個到約100個是優(yōu)選的并且約25個到約75個是尤其優(yōu)選的。一般來說，這些長度同等適用于接合探針和轉(zhuǎn)移探針。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在本文中被稱為“CLPA-CE”(其更充分地描述于下文中)，探針長度經(jīng)過設(shè)計以針對每個所關(guān)注的目標(biāo)而變化，從而產(chǎn)生可以基于長度變化來識別并分析的接合產(chǎn)物。本發(fā)明的接合探針被設(shè)計成對多核苷酸目標(biāo)具特異性。這些探針彼此在空間上很接近地結(jié)合到目標(biāo)上并且以化學(xué)反應(yīng)性接合部分在空間上很接近的方式定向。在一個方面，兩個或更多個探針經(jīng)過設(shè)計以結(jié)合目標(biāo)多核苷酸上的毗鄰位點。在一個優(yōu)選實施方案中，兩個探針結(jié)合到目標(biāo)上以使得一個寡核苷酸探針的5'末端的接合部分能夠與另一個探針的3'末端的接合部分相互作用。在優(yōu)選實施方案中，接合部分之間的接合反應(yīng)在不使用外源接合酶的情況下發(fā)生，在本文中也被稱為“化學(xué)接合”。應(yīng)注意，接合探針組由于接合部分的存在而不使用接合酶來接合。在SNP檢測的情況下，一組接合探針可能在一些情況下實際上包含三個或四個或五個不同接合探針，其中一些是等位基因特異性的。“等位基因特異性”探針或引物意指與目標(biāo)序列雜交并且在等位基因之間加以辨別的探針或引物。在這種情況下，舉例來說，當(dāng)SNP為雙等位基因(如圖13中所描繪)時，使用一組三個接合探針，其中兩個在檢測位置處含有不同核苷酸。就是說，如本領(lǐng)域中已知，在接合復(fù)合物的接點處的錯配將導(dǎo)致無接合或接合量減少。因此，取決于探針的定向，檢測位置可以為“上游”探針或下游探針的末端位置(如圖13A和13C中所描繪)。錯配還可以在內(nèi)部定位到探針上并且基于錯配辨別探針的結(jié)合強(qiáng)度或Tm的差異進(jìn)行錯配辨別(如圖13B中所描繪)。在雙等位基因SNP的情況下，兩個探針具有相同探針結(jié)構(gòu)域，除了其中在對應(yīng)于目標(biāo)序列上的詢問位置的檢測位置處的核苷酸是不同的。因此，取決于患者是純合的(T/T或C/C)還是雜合的(T/C或C/T)，探針之間的接合發(fā)生。此外，在本發(fā)明中，一般在錯配檢測接合探針之間存在額外差異，這能夠容易地識別哪個探針被優(yōu)先接合。舉例來說，“A”等位基因探針可以具有15個核苷酸(15聚體)的可變間隔區(qū)序列并且“G”等位基因探針可以具有20個核苷酸(20聚體)的可變間隔區(qū)序列，探針可以具有不同捕獲結(jié)構(gòu)域或標(biāo)記序列，等等。類似地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，三等位基因或四等位基因SNP使用組中的4個(3個探針具有相同目標(biāo)結(jié)構(gòu)域并且一個具有其他目標(biāo)結(jié)構(gòu)域)或5個(4個探針具有相同目標(biāo)結(jié)構(gòu)域并且一個具有其他目標(biāo)結(jié)構(gòu)域)接合探針。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，引物和探針核酸的尺寸可能隨著探針的每個部分和探針的總長度而變化，長度一般從5個到500個核苷酸之間變化。取決于使用和擴(kuò)增技術(shù)，每個部分優(yōu)選地介于10與100之間，介于15與50之間是特別優(yōu)選的，并且10到35是尤其優(yōu)選的。因此，舉例來說，探針的通用引發(fā)位點各自優(yōu)選地具有約15-20個核苷酸長度，其中18是尤其優(yōu)選的。探針的接頭序列優(yōu)選地具有15-25個核苷酸長度，其中20是尤其優(yōu)選的。探針的目標(biāo)特異性部分優(yōu)選地具有15-50個核苷酸長度。另外，引物可以包括額外的擴(kuò)增引發(fā)位點。在一個優(yōu)選實施方案中，額外的擴(kuò)增引發(fā)位點是T7RNA聚合酶引發(fā)位點。許多非酶促或模板介導(dǎo)的化學(xué)接合方法可以根據(jù)本發(fā)明加以使用。這些方法包括利用偶合試劑的化學(xué)接合方法，如N-氰基咪唑、溴化氰以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽。參看Metelev,V.G.等人,Nucleosides&Nucleotides(1999)18:2711；Luebke,K.J.和Dervan,P.B.J.Am.Chem.Soc.(1989)111:8733；以及Shabarova,Z.A.等人,NucleicAcidsResearch(1991)19:4247，這些文獻(xiàn)中的每一個出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，并且尤其是關(guān)于化學(xué)接合的所有教導(dǎo)內(nèi)容。Kool(美國專利第7,033,753號，其以全文引用的方式并入本文中)描述了使用化學(xué)接合和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來檢測遺傳多態(tài)性。這個過程的讀出結(jié)果是基于溶液相中熒光強(qiáng)度的變化。Terbrueggen(美國專利公開第12008/0124810號，其以全文引用的方式并入本文中)描述了使用化學(xué)接合方法、組合物和試劑經(jīng)由微陣列檢測來檢測核酸。其他化學(xué)接合方法使5'-甲苯磺酸酯基或5'-碘基與3'-硫代磷酸酯基反應(yīng)，產(chǎn)生硫原子置換橋連磷酸二酯氧原子中的一種的DNA結(jié)構(gòu)。參看Gryanov,S.M.和Letsinger,R.L.,NucleicAcidsResearch(1993)21:1403；Xu,Y.和Kool,E.T.TetrahedronLetters(1997)38:5595；以及Xu,Y.和Kool,E.T.,NucleicAcidsResearch(1999)27:875，這些文獻(xiàn)中的每一個以全文引用的方式并入本文中。Letsinger等人(美國專利第5,780,613號，其以全文引用的方式并入本文中)先前已經(jīng)描述了相鄰的模板結(jié)合寡核苷酸的不可逆、非酶促、共價自接合，其中一個寡核苷酸具有5'可置換基團(tuán)并且另一個寡核苷酸具有3'硫代磷?；?。描述化學(xué)接合方法的這些參考文獻(xiàn)中的每一個出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，并且尤其是關(guān)于化學(xué)接合的所有教導(dǎo)內(nèi)容。在一個方面，本發(fā)明的接合反應(yīng)包括轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在這個實施方案中，探針與目標(biāo)序列雜交，而不同于寡核苷酸探針接合在一起形成接合產(chǎn)物，發(fā)生核酸引導(dǎo)的分子實體(包括報道分子，如熒光團(tuán)、淬滅劑等等)從一個寡核苷酸探針轉(zhuǎn)移到另一個寡核苷酸探針。這個轉(zhuǎn)移反應(yīng)類似于接合反應(yīng)，然而，代替連接兩個兩個或更多個探針，一個探針接合到轉(zhuǎn)移分子上并且另一個探針“脫離”化學(xué)反應(yīng)。重要的是，類似于接合反應(yīng)，通過使轉(zhuǎn)移探針很接近地結(jié)合到核酸目標(biāo)上來促進(jìn)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，以使得如果探針已經(jīng)與目標(biāo)核酸彼此足夠接近地(例如在相鄰位點處)雜交以使轉(zhuǎn)移反應(yīng)發(fā)生，那么就檢測到明顯信號。在一個方面，本發(fā)明關(guān)于化學(xué)接合方法，其包括在使得第一接合探針和第二接合探針的接合部分能夠自發(fā)反應(yīng)的條件下使至少第一接合探針和第二接合探針結(jié)合到目標(biāo)核酸上以形成“接合襯底”，在不存在外源接合酶的情況下將探針接合在一起；就是說，不添加外源接合酶到反應(yīng)中并且取而代之的是反應(yīng)在不使用接合酶的情況下進(jìn)行。在轉(zhuǎn)移反應(yīng)的情況下，這可以被稱為“接合襯底”或“轉(zhuǎn)移襯底”?！敖雍弦r底”在本文中意指包含至少一個目標(biāo)核酸序列和兩個或更多個接合探針的化學(xué)接合襯底。類似地，在“接合襯底”的定義內(nèi)包括“轉(zhuǎn)移襯底”，其包含至少一個目標(biāo)核酸序列和兩個或更多個轉(zhuǎn)移探針。一旦化學(xué)接合步驟已經(jīng)發(fā)生，反應(yīng)產(chǎn)物有時即被稱為“接合復(fù)合物”，其包含接合探針和這些接合探針仍雜交的目標(biāo)。在本發(fā)明的一些實施方案中，舉例來說，當(dāng)需要額外的特異性時，可以使用多于兩個接合探針，如圖3中一般描繪。在這個實施方案中，“中間”接合探針也可以是相鄰的或由目標(biāo)序列的一個或多個核堿基隔開。在一個優(yōu)選實施方案中，接合反應(yīng)不需要存在接合酶并且在不添加任何(例如外源)接合酶的情況下在結(jié)合探針之間自發(fā)發(fā)生?；瘜W(xué)接合可以在適當(dāng)條件下在不添加任何額外的活化試劑或刺激的情況下自發(fā)發(fā)生?；蛘?，可以使用“活化”劑或外部刺激來促進(jìn)化學(xué)接合反應(yīng)?；罨瘎┑膶嵗?但不限于)碳化二亞胺、溴化氰(BrCN)、咪唑、1-甲基咪唑/碳化二亞胺/胱胺、N-氰基咪唑、二硫蘇糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和其他還原劑，以及外部刺激，如紫外光、熱和/或壓力變化。如本文所概述，本發(fā)明的接合部分可以呈現(xiàn)多種構(gòu)型，這取決于許多因素。本文所描繪的大多數(shù)化學(xué)部分被用于亞磷酰胺反應(yīng)中，這些反應(yīng)一般沿3'到5'方向進(jìn)行。就是說，樹脂含有允許連接分子5'末端的亞磷酰胺的化學(xué)部分。然而，如本領(lǐng)域中已知，亞磷酰胺可以用于沿5'到3'方向進(jìn)行；因此，本發(fā)明包括具有與本文所概述的那些部分相反定向的部分。每組接合探針(或轉(zhuǎn)移探針)含有一組第一接合部分和第二接合部分。這些接合部分對的識別取決于有待使用的接合的化學(xué)部分。另外，如本文所描述，連接子(包括(但不限于)去穩(wěn)定連接子)可以存在于一個或兩個接合探針的探針結(jié)構(gòu)域與接合部分之間。一般來說，為便于論述，本文中的描述可以使用術(shù)語“上游”和“下游”接合探針，不過這并不意味著具限制性。不同組的接合探針可以被設(shè)計成用于本文所描述的任何試驗和方法中。接合探針組可以經(jīng)過設(shè)計以包括針對目標(biāo)核酸的一個或多個目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的接合探針，或不同探針組可以經(jīng)過設(shè)計以檢測不同目標(biāo)核酸。舉例來說，對于在使用兩個接合探針的實施方案中檢測特定目標(biāo)核酸來說，一組接合探針經(jīng)過設(shè)計以使得第一探針(例如“上游探針”)包含針對第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的探針結(jié)構(gòu)域。這組還包括針對第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的第二接合探針(例如“下游探針”)，這個第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域與第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰并且在第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的下游。在一些實施方案中，第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域可以由一個、兩個或三個核苷酸的間隙隔開。這組接合探針由此產(chǎn)生接合產(chǎn)物，這些接合產(chǎn)物可以被檢測以識別接合探針?biāo)槍Φ哪繕?biāo)核酸的存在。在其他實施方案中，不同組的接合探針可以經(jīng)過設(shè)計以檢測不同目標(biāo)核酸。在其他實施方案中，不同組的接合探針可以經(jīng)過設(shè)計以檢測相同目標(biāo)核酸。在這些實施方案中，不同組的接合探針針對相同目標(biāo)核酸的不同結(jié)構(gòu)域，以使得相同目標(biāo)核酸可以具有多重接合產(chǎn)物，這取決于所使用的不同探針組的數(shù)目。如應(yīng)了解，當(dāng)設(shè)計用于使用多于兩個接合探針形成單個接合產(chǎn)物的實施方案中的探針組時，可以使用類似設(shè)計。鹵基離去基化學(xué)部分在本發(fā)明的一個實施方案中，化學(xué)方法是基于5'鹵素離去基技術(shù)，如以下文獻(xiàn)中一般描述的技術(shù)：Gryanov,S.M.和Letsinger,R.L.,(1993)NucleicAcidsResearch,21:1403；Xu,Y.和Kool,E.T.(1997)TetrahedronLetters,38:5595；Xu,Y.和Kool,E.T.,(1999)NucleicAcidsResearch,27:875；Arar等人,(1995),BioConj.Chem.,6:573；Kool,E.T.等人,(2001)NatureBiotechnol19:148；Kool,E.T.等人,(1995)NucleicAcidsRes,23(17):3547；Letsinger等人,美國專利第5,476,930號；Shouten等人,美國專利第6,955,901號；Andersen等人,美國專利第7,153,658號，所有這些文獻(xiàn)都以引用的方式明確并入本文中。在這個實施方案中，第一接合探針在其5'末端包括具有5'離去基的核苷，并且第二接合探針在其3'末端包括具有3'親核基團(tuán)(如3'硫代磷?；?的核苷。5'離去基可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多常見離去基，包括例如鹵基種類(I、Br、Cl)以及如Abe和Kool,J.Am.Chem.Soc.(2004)126:13980-13986所描述的那些基團(tuán)的基團(tuán)，這個文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。在本發(fā)明的這個方面的一個更優(yōu)選實施方案中，第一接合探針具有經(jīng)由柔性連接子連接的5'離去基和具有3'硫代磷?；南掠喂押塑账?。這種構(gòu)型使得反應(yīng)速率顯著增加并且得以針對每個目標(biāo)產(chǎn)生多重接合產(chǎn)物拷貝。關(guān)于多核苷酸模板的5'到3'方向所定義并且作為在這個模板的“上游”側(cè)(即，左側(cè)或5'側(cè))結(jié)合的寡核苷酸的“上游”寡核苷酸包括5'-離去基作為其5'末端。可以利用能夠參與SN2反應(yīng)的任何離去基，這個反應(yīng)涉及硫、硒或碲作為親核試劑。離去基為連接到碳上的原子或基團(tuán)，以使得在碳原子受到經(jīng)過修飾的磷酰基的親核試劑(硫、硒或碲)的親核攻擊時，離去基以陰離子形式離去。適合的離去基包括(但不限于)鹵基，如碘基、溴基或氯基；甲苯磺酸酯基、苯磺酸酯基或?qū)ο趸锦セ灰约癛SO3，其中R為苯基或被一個到五個包含F(xiàn)、Cl、Br、I、烷基(C1到C6)、硝基、氰基、磺酰基和羰基的原子或基團(tuán)取代的苯基，或R為具有一個到六個碳的烷基。離去基優(yōu)選地為碘基，并且上游寡核苷酸的5'末端的核苷在DNA的情況下為5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧核苷。適合的5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧核苷的實例包括(但不限于)5'-脫氧-5'-碘胸苷(5'-I-T)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧胞苷(5'-I-dC)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧腺苷(5'-I-dA)、5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮-2'-脫氧腺苷(5'-I-3-脫氮-dA)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧鳥苷(5'-I-dG)和5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮-2'-脫氧鳥苷(5'-I-3-脫氮-dG)，以及其亞磷酰胺衍生物(見圖2)。在RNA寡核苷酸的情況下，適合的5'-脫氧-5'-碘核苷的類似實例包括(但不限于)5'-脫氧-5'-碘尿嘧啶(5'-I-U)、5'-脫氧-5'-碘胞苷(5'-I-C)、5'-脫氧-5'-碘腺苷(5'-I-A)、5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮腺苷(5'-I-3-脫氮-A)、5'-脫氧-5'-碘鳥苷(5'-I-G)和5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮鳥苷(5'-I-3-脫氮-G)，以及其亞磷酰胺衍生物。在一個優(yōu)選實施方案中，上游接合探針含有2'-脫氧核糖核苷酸，除了其中包含5'離去基的在5'末端的經(jīng)過修飾的核苷酸為核糖核苷酸。上游核苷酸的這個實施方案是有利的，因為倒數(shù)第二的2'-脫氧核糖核苷酸與末端5'核糖核苷酸之間的鍵容易使用堿而裂解。這可得以潛在地再使用例如結(jié)合到固體支撐物上的寡核苷酸探針，如下文更詳細(xì)描述。根據(jù)下文更充分描述的CLPA試驗，“上游”探針的5'離去基最優(yōu)選地為DABSYL。結(jié)合到上游寡核苷酸的“下游”(即，3')的多核苷酸模板上的“下游”寡核苷酸在其3'末端包括具有連接到3'羥基上的硫代磷酸酯基(即，“3'-硫代磷酸酯基”)、硒代磷酸酯基(即，“3'-硒代磷酸酯基”)或碲代磷酸酯基(即，“3'-碲代磷酸酯基”)的核苷。用于自接合的化學(xué)部分由此為硫介導(dǎo)、硒介導(dǎo)或碲介導(dǎo)的。自接合得到含有5'橋連磷酸硫酯(--O--P(O)(O-)--S--)、磷酸硒酯(--O--P(O)(O-)--Se--)或磷酸碲酯(--O--P(O)(O-)--Te--)的接合產(chǎn)物，如由構(gòu)成下游寡核苷酸的3'末端的基團(tuán)所指示。這種非天然的非手性橋連二酯定位于兩個相鄰核苷酸之間并且代替了天然存在的5'橋連磷酸二酯。令人驚訝的是，硒介導(dǎo)的接合比硫介導(dǎo)的接合快3到4倍，并且含硒接合產(chǎn)物非常穩(wěn)定，不過Se--P鍵的鍵強(qiáng)度較低。此外，預(yù)期橋連磷酸硒酯以及橋連磷酸碲酯可以在非常溫和的條件下選擇性地被銀或汞離子裂解(參看Mag等人,NucleicAcidsRes.(1991)19:14371441)。在一個實施方案中，下游寡核苷酸含有2'-脫氧核糖核苷酸，除了其中包含3'硫代磷酸酯、硒代磷酸酯或碲代磷酸酯的在3'末端的經(jīng)過修飾的核苷酸為核糖核苷酸。上游核苷酸的這個實施方案是有利的，因為倒數(shù)第二的2'-脫氧核糖核苷酸與末端核糖核苷酸之間的鍵容易使用堿而裂解，從而可潛在地再使用例如結(jié)合到固體支撐物上的寡核苷酸探針。根據(jù)如下文更充分描述的CLPA試驗，“下游”探針最優(yōu)選地在其3'末端包括3'-硫代磷酸酯。應(yīng)注意，“上游”和“下游”寡核苷酸可以任選地構(gòu)成單個寡核苷酸的兩個末端，在這種情況下，接合得到環(huán)形接合產(chǎn)物。線性前體寡核苷酸的5'和3'末端的結(jié)合區(qū)必須由足以使得5'和3'結(jié)合區(qū)結(jié)合到多核苷酸目標(biāo)上的許多介入核苷酸連接。本發(fā)明所提供的組合物包括5'-脫氧-5-'碘-2'-脫氧核苷，例如5'-脫氧-5'-碘胸苷(5'-I-T)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧胞苷(5'-I-dC)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧腺苷(5'-I-dA)、5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮-2'-脫氧腺苷(5'-I-3-脫氮-dA)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧鳥苷(5'-I-dG)和5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮-2'-脫氧鳥苷(5'-I-3-脫氮-dG)和其亞磷酰胺衍生物，以及在5'末端包含本發(fā)明的5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧核苷的寡核苷酸。本發(fā)明所提供的組合物進(jìn)一步包括5'-脫氧-5'-碘核苷，如5'-脫氧-5'-碘尿嘧啶(5'-I-U)、5'-脫氧-5'-碘胞苷(5'-I-C)、5'-脫氧-5'-碘腺苷(5'-I-A)、5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮腺苷(5'-I-3-脫氮-A)、5'-脫氧-5'-碘鳥苷(5'-I-G)和5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮鳥苷(5'-I-3-脫氮-G)和其亞磷酰胺衍生物，以及在5'末端包含本發(fā)明的5'-脫氧-5'-碘核苷的寡核苷酸。本發(fā)明還包括包含3'-硒代磷酸酯基或3'-碲代磷酸酯基的核苷，以及在3'末端包含含3'-硒代磷酸酯基或3'-碲代磷酸酯基的核苷的寡核苷酸。含有這些類別的經(jīng)過修飾的核苷中的任一種或兩種的寡核苷酸也包括在本發(fā)明中，制造各種核苷和寡核苷酸的方法一樣包括在內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明在5'或3'末端的任一個末端或兩個末端經(jīng)過修飾的寡核苷酸任選地(但不必須)包括可檢測標(biāo)記，優(yōu)選地為放射性標(biāo)記、熒光能量供體或受體基團(tuán)、準(zhǔn)分子標(biāo)記或其任何組合。另外，在一些情況下，取代基也可以是保護(hù)基(有時在本文中被稱為“PG”)。適合的保護(hù)基將取決于有待被保護(hù)的原子和部分將暴露的條件。已知多種保護(hù)基；舉例來說，DMT被頻繁用作亞磷酰胺化學(xué)中的保護(hù)基(如圖中所描繪)；然而，在這些實施方案中，DMT可以被其他保護(hù)基置換。多種保護(hù)基是適合的；參看例如Greene'sProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，關(guān)于保護(hù)基和相關(guān)化學(xué)的內(nèi)容以引用的方式并入本文中?！巴榛被蛘Z法等效物在本文中意指直鏈或支鏈烷基，其中直鏈烷基是優(yōu)選的。如果有分支的話，那么其可以在一個或多個位置處分支，并且除非有規(guī)定，否則可以在任何位置處分支。烷基可以在約1個到約30個碳原子(C1-C30)的范圍內(nèi)，其中一個優(yōu)選實施方案利用約1個到約20個碳原子(C1-C20)，其中約C1到約C12到約C15是優(yōu)選的，并且C1到C5是特別優(yōu)選的，不過在一些實施方案中，烷基可以大得多。在烷基的定義內(nèi)還包括環(huán)烷基，如C5和C6環(huán)，以及具有氮、氧、硫或磷的雜環(huán)。烷基還包括雜烷基，其中硫、氧、氮和硅雜原子是優(yōu)選的。烷基包括經(jīng)過取代的烷基?！敖?jīng)過取代的烷基”在本文中意指進(jìn)一步包含一個或多個如上文所定義的取代部分“R”的烷基?！鞍被被蛘Z法等效物在本文中意指NH2、--NHR和--NR2基團(tuán)，其中R如本文所定義。在一些實施方案中，舉例來說，在肽接合反應(yīng)的情況下，伯胺和仲胺具有特定用途，其中伯胺一般顯示出較快的反應(yīng)速率?！跋趸痹诒疚闹幸庵?-NO2基團(tuán)?！昂虿糠帧痹诒疚闹幸庵负辛蛟拥幕衔?，包括(但不限于)硫雜、硫代和磺基化合物、硫醇(--SH和--SR)以及硫醚(--RSR--)。一種特定類型的含硫部分為硫酯(-(CO)-S-)，通常以經(jīng)過取代的硫酯(-(CO)-SR)形式存在?！昂撞糠帧痹诒疚闹幸庵负辛椎幕衔?，包括(但不限于)膦和磷酸酯?！昂璨糠帧痹诒疚闹幸庵负泄璧幕衔??！懊选痹诒疚闹幸庵?-O--R基團(tuán)。優(yōu)選的醚包括烷氧基，其中--O--(CH2)2CH3和--O--(CH2)4CH3是優(yōu)選的。“酯”在本文中意指--COOR基團(tuán)?！胞u素”在本文中意指溴、碘、氯或氟。優(yōu)選的經(jīng)過取代的烷基為部分或完全鹵化的烷基，如CF3等等?！叭痹诒疚闹幸庵?-RCOH基團(tuán)?！按肌痹诒疚闹幸庵?-OH基團(tuán)和烷醇--ROH?！磅０被痹诒疚闹幸庵?-RCONH--或RCONR--基團(tuán)?！耙叶肌痹诒疚闹幸庵?-(O--CH2--CH2)n--基團(tuán)，不過亞乙基的每個碳原子也可以被單取代或雙取代，即，--(O--CR2--CR2)n--，其中R如上文所描述。具有其他代替氧的雜原子的乙二醇衍生物(即，--(N--CH2--CH2)n--或--(S--CH2--CH2)n--，或具有取代基)也是優(yōu)選的。另外，在一些實施方案中，R基團(tuán)可以是官能團(tuán)，包括淬滅劑、去穩(wěn)定部分和熒光團(tuán)(如下文所定義)。在這個實施方案中具有特定用途的熒光團(tuán)包括(但不限于)熒光素和其衍生物、TAMRA(四甲基-6-羧基羅丹明)、Alexa染料和花青染料(例如Cy3和Cy5)。淬滅劑部分或分子在本領(lǐng)域中是已知的，并且一般為芳香族多環(huán)化合物，其可以滅活另一個分子的激發(fā)態(tài)。熒光團(tuán)-淬滅劑對在本領(lǐng)域中眾所周知。適合的淬滅劑部分包括(但不限于)Dabsyl(二甲氨基(偶氮苯)磺酰基)Dabcyl(二甲氨基(偶氮苯)羰基)、Eclipse淬滅劑(GlenResearchCatalog)，以及獲自BiosearchTechnologies的黑洞淬滅劑(BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)。制造具有鹵基離去基的探針的方法在本領(lǐng)域中是已知的；參看例如Abe等人,ProcNatlAcadSciUSA(2006)103(2):263-8；Silverman等人,NucleicAcidsRes.(2005)33(15):4978-86；Cuppolletti等人,BioconjugChem.(2005)16(3):528-34；Sando等人,JAmChemSoc.(2004)4；126(4):1081-7；Sando等人,NucleicAcidsResSuppl.(2002)2:121-2；Sando等人,JAmChemSoc.(2002)124(10):2096-7；Xu等人,NatBiotechnol.(2001)19(2):148-52；Xu等人,NucleicAcidsRes.(1998)26(13):3159-64；Moran等人,ProcNatlAcadSciUSA(1997)94(20):10506-11；Kool,美國專利第7,033,753號；Kool,美國專利第6,670,193號；Kool,美國專利第6,479,650號；Kool,美國專利第6,218,108號；Kool,美國專利第6,140,480號；Kool,美國專利第6,077,668號；Kool,美國專利第5,808,036號；Kool,美國專利第5,714,320號；Kool,美國專利第5,683,874號；Kool,美國專利第5,674,683號；以及Kool,美國專利第5,514,546號，這些文獻(xiàn)中的每一個以全文引用的方式并入本文中。親核試劑接合部分在一些實施方案中，本發(fā)明的接合探針包含含親核試劑(例如胺)的接合部分。包含硫醇和胺的接合部分在某些反應(yīng)中具有特定用途。一般來說，親核試劑接合部分可以包括多種潛在的氨基、硫醇化合物，只要親核試劑接合部分含有接近伯氨基或仲氨基的硫醇基并且相對定位使得在S到N?；D(zhuǎn)移期間可以實現(xiàn)至少5或6元環(huán)過渡態(tài)即可。因此，包含1,2或1,3胺硫醇基的親核試劑接合分子具有特定用途。伯胺可用于反應(yīng)時間很重要的一些實施方案中，因為伯胺的反應(yīng)時間一般比仲胺快，不過仲胺可用于有助于如下文所論述的去穩(wěn)定的?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)中。氨基與硫醇基之間的碳可以被非氫R基團(tuán)取代，不過一般每個碳僅利用一個非氫R基團(tuán)。另外，相鄰的R基團(tuán)可以連接在一起形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其包括經(jīng)過取代和未經(jīng)取代的環(huán)烷基和芳基，包括雜環(huán)烷基和雜芳基以及其經(jīng)過取代和未經(jīng)取代的衍生物。在使用1,2氨基硫醇基并且連接相鄰的R基團(tuán)的情況下，一般優(yōu)選的是，相鄰的R基團(tuán)形成環(huán)烷基(包括雜環(huán)烷基和其經(jīng)過取代的衍生物)而不是芳基。在這個實施方案中，對于產(chǎn)生鏈的4個σ鍵縮短用于去穩(wěn)定來說，置換接合部分依賴于?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)。連接子在許多實施方案中，連接子(有時在本文中被示為“L”或“-(連接子)n-”)(其中n為0或1)可以任選地在多個位置處包括于接合探針內(nèi)。適合的連接子包括烷基和芳基，包括雜烷基和雜芳基，以及這些基團(tuán)的經(jīng)過取代的衍生物。在一些情況下，舉例來說，當(dāng)完成原生肽接合反應(yīng)時，連接子可以基于氨基酸和/或含有酰胺鍵。如本文所描述，一些連接子可使接合探針由一個或多個核堿基隔開，從而在接合產(chǎn)物內(nèi)形成無堿基位點，其充當(dāng)如下文所描述的去穩(wěn)定部分。去穩(wěn)定部分根據(jù)本發(fā)明的一個方面，需要在沒有酶的輔助下針對每個目標(biāo)分子產(chǎn)生多重接合產(chǎn)物拷貝。一種實現(xiàn)這個目標(biāo)的方式涉及在化學(xué)接合反應(yīng)之后接合產(chǎn)物與目標(biāo)解離以允許新的探針組結(jié)合到目標(biāo)上。為增加接合產(chǎn)物周轉(zhuǎn)，需要有增加產(chǎn)物與目標(biāo)分子解離的探針設(shè)計、儀器和化學(xué)接合反應(yīng)的化學(xué)部分。適合的去穩(wěn)定部分論述于下文中并且包括(但不限于)使得寡核苷酸與其目標(biāo)位點的總結(jié)合能降低的分子實體。潛在的實例包括(但不限于)烷基鏈、帶電復(fù)合物以及環(huán)結(jié)構(gòu)。先前的工作已經(jīng)顯示，一種實現(xiàn)產(chǎn)物解離并且增加產(chǎn)物周轉(zhuǎn)的方式為使反應(yīng)混合物“熱循環(huán)”。熱循環(huán)為改變反應(yīng)溫度以促成所要結(jié)果的過程。熱循環(huán)最常采用以下形式：短暫地升高反應(yīng)混合物的溫度以使得反應(yīng)溫度高于接合產(chǎn)物的熔化溫度持續(xù)一段短暫的時間，從而促使產(chǎn)物與目標(biāo)解離。冷卻后，一組新的探針能夠結(jié)合目標(biāo)，并且經(jīng)歷另一個接合反應(yīng)。已經(jīng)廣泛實施這種熱循環(huán)程序用于酶促反應(yīng)，如PCR。雖然熱循環(huán)是一種實現(xiàn)產(chǎn)物周轉(zhuǎn)的方式，但有可能設(shè)計探針以使得在沒有熱循環(huán)的情況下存在顯著產(chǎn)物周轉(zhuǎn)。幫助降低接合產(chǎn)物的熔化溫度的探針設(shè)計和接合化學(xué)部分通過減少反應(yīng)周期的產(chǎn)物抑制來增加產(chǎn)物周轉(zhuǎn)。因此，在一個方面，探針經(jīng)過設(shè)計以包括在探針接合之后用以使接合產(chǎn)物與目標(biāo)序列的雜交失去穩(wěn)定的要素(例如去穩(wěn)定部分)。因此，接合襯底在接合之后解離，使得接合產(chǎn)物周轉(zhuǎn)，例如，包含兩個接合探針的接合產(chǎn)物與目標(biāo)序列解除雜交，從而放出目標(biāo)序列用于與另一個探針組雜交。另外，增加游離(例如未雜交)接合探針的濃度還可以幫助驅(qū)使平衡朝向從目標(biāo)序列釋放接合產(chǎn)物(或轉(zhuǎn)移產(chǎn)物)發(fā)展。因此，本發(fā)明的一些實施方案使用高于目標(biāo)1,000,000倍的探針濃度，而在其他實施方案中，探針高于目標(biāo)10,000到100倍。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，增加游離探針的濃度可以單獨使用，或與本文所概述的用以實現(xiàn)產(chǎn)物周轉(zhuǎn)(例如擴(kuò)增)的任何實施方案一起使用。雖然增加探針濃度可以使得產(chǎn)物周轉(zhuǎn)增加，但其也可能導(dǎo)致顯著偏離目標(biāo)的反應(yīng)，如探針?biāo)夂头悄繕?biāo)介導(dǎo)的接合。在一個方面，探針要素包括降低接合產(chǎn)物的熔化溫度的結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，探針要素經(jīng)過設(shè)計以與不相鄰的目標(biāo)核堿基雜交，例如，在兩個雜交而未接合的探針之間存在“間隙”。一般來說，這是通過使用一個或兩個介于探針結(jié)構(gòu)域與接合部分之間的連接子來完成。就是說，在第一探針結(jié)構(gòu)域與第一接合部分之間可能存在連接子，在第二探針結(jié)構(gòu)域與第二接合部分之間可能存在連接子，或這兩種情況都有。在一些實施方案中，間隙包含單個核堿基，不過如有需要也可以利用更多個核堿基。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在反應(yīng)動力學(xué)與連接子長度之間可能有折衷；如果連接子的長度如此長以致于引起接合的接觸在動力學(xué)上是不利的，那么可能就需要較短連接子。然而，在一些情況下，當(dāng)動力學(xué)并不重要時，間隙和所得連接子的長度可能較長，以允許跨越1到10個核堿基的間隙。一般來說，在這個實施方案中，重要的是，連接子的長度大致對應(yīng)于間隙中核堿基的數(shù)目。在本發(fā)明的這個實施方案的另一個方面，與目標(biāo)序列相比在接合產(chǎn)物中形成無堿基位點用以使雙鏈體失去穩(wěn)定。舉例來說，Abe和Kool(J.Am.Chem.Soc.(2004)126:13980-13986)比較了當(dāng)兩種不同8聚體寡核苷酸探針(Bu42和DT40)與相同7聚體探針(Thio4)接合時的周轉(zhuǎn)。當(dāng)Thio4與DT40接合時，形成具有接近原生的DNA結(jié)構(gòu)的連續(xù)15聚體寡核苷酸探針，其應(yīng)與DNA目標(biāo)完全匹配。然而，當(dāng)Thio4與Bu42接合時，形成15聚體寡核苷酸探針，但當(dāng)探針結(jié)合到目標(biāo)上時，其在烷烴連接子所跨越的中間部分具有無堿基位點。這兩個探針在結(jié)合到目標(biāo)上時的熔化溫度(Tm)的比較顯示出熔化溫度存在約12℃的差異(Bu42的58.5℃對比DT40的70.7℃)。熔化溫度的這個12℃的差異使得在25℃下當(dāng)探針組(10,000倍過量，10μM濃度)與目標(biāo)(1nM)相比以大過量存在時產(chǎn)物周轉(zhuǎn)增加約10倍(91.6-Bu42對比8.2DT40)。類似地，Dose等人(Dose2006)顯示出對于兩個一致序列來說，經(jīng)過化學(xué)接合的PNA探針的Tm降低4℃(53℃對比57℃)怎樣使得產(chǎn)物周轉(zhuǎn)增加約4倍。近期工作已經(jīng)展示了使用基于化學(xué)接合的淬滅自接合(QuenchedAuto-Ligation；QUAL)探針以在細(xì)菌和人類細(xì)胞內(nèi)部監(jiān)測RNA表達(dá)并檢測單堿基錯配(WO2004/0101011，其以引用的方式并入本文中)。在一個實施方案中，去穩(wěn)定部分是基于去除穩(wěn)定化部分。就是說，如果接合探針含有穩(wěn)定其與目標(biāo)雜交的部分，那么在接合并釋放穩(wěn)定化部分之后，接合產(chǎn)物的穩(wěn)定性就下降。因此，一種用于減少產(chǎn)物抑制的一般方案為開發(fā)在初始化學(xué)接合反應(yīng)的過程期間或在接合后的二次反應(yīng)之后釋放分子實體(如小溝結(jié)合分子)的探針。取決于寡核苷酸序列，小溝結(jié)合物，如Kutyavin(Kutyavin1997和Kutyavin2000)所描述的二氫吡咯并吲哚三肽(DPI3)，當(dāng)與寡核苷酸探針的末端結(jié)合時可以使雙鏈體核酸的Tm增加至多40℃。相比之下，DPI3的未連接型式僅僅使相同雙鏈體的Tm增加2℃左右。因此，小溝結(jié)合物可以用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的結(jié)合強(qiáng)度的探針組，然而，如果在反應(yīng)過程期間釋放小溝結(jié)合物，那么結(jié)合增強(qiáng)程度受損并且接合產(chǎn)物相對于小溝結(jié)合物仍連接的探針將顯示出Tm降低。適合的小溝結(jié)合分子包括(但不限于)二氫吡咯并吲哚三肽(DPI3)、偏端霉素A和吡咯-咪唑聚酰胺(Gottesfeld,J.M.等人,J.Mol.Biol.(2001)309:615-629)。除了小溝結(jié)合分子以外，拴系的嵌入物和相關(guān)分子也可以顯著增加寡核苷酸雙鏈體的熔化溫度，并且這種穩(wěn)定化在未栓系狀態(tài)中顯著較低(Dogan等人,J.Am.ChemSoc.(2004)126:4762-4763和Narayanan等人,NucleicAcidsResearch,(2004)32:2901-2911)。類似地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，連接有能夠形成三螺旋體的寡核苷酸片段(DNA、PNA、LNA等等)的探針可以充當(dāng)穩(wěn)定化部分，其在釋放后，使得接合產(chǎn)物與目標(biāo)序列的穩(wěn)定性降低(Pooga,M等人,BiomolecularEngineering(2001)17:183-192)。另一種通過降低接合產(chǎn)物的結(jié)合強(qiáng)度來減少產(chǎn)物抑制的一般方案為在接合點并入無堿基位點。這種方法先前已經(jīng)由Abe(J.Am.Chem.Soc.(2004)126:13980-13986)展示，然而，還可能設(shè)計出二次探針重排以經(jīng)由使接合探針與目標(biāo)之間的對準(zhǔn)發(fā)生變形來進(jìn)一步放大Tm的降低。舉例來說，Dose等人(Org.Letters(2005)7:204365-4368)使PNA堿基之間的間距從理想的12個σ鍵變到13個的接合后重排怎樣使得Tm降低4℃。干擾產(chǎn)物與目標(biāo)結(jié)合或使寡核苷酸堿基損失的較大重排和二次反應(yīng)可以進(jìn)一步降低Tm。本發(fā)明提供用于在重排期間使得鏈縮短至多4個σ鍵的接合反應(yīng)的方法和組合物，其與使用Dose所描述的化學(xué)方法進(jìn)行1個堿基擴(kuò)充相比應(yīng)對重排后的Tm具有顯著影響。這種化學(xué)方法是基于先前已經(jīng)描述的酰基轉(zhuǎn)移助劑(Offer等人,JAmChemSoc.(2002)124(17):4642-6)。在完成鏈縮短之后，產(chǎn)生能夠經(jīng)歷與個別分子或與本身進(jìn)行的另一個反應(yīng)的游離硫醇。舉例來說，這種硫醇可以與內(nèi)部硫酯反應(yīng)以使寡核苷酸重度扭結(jié)并由此進(jìn)一步降低接合產(chǎn)物結(jié)合到目標(biāo)上的能力。因此，在這個實施方案中，釋放將經(jīng)歷與接合產(chǎn)物進(jìn)行的第二個反應(yīng)的官能團(tuán)的接合反應(yīng)可以降低接合產(chǎn)物與目標(biāo)序列雜交的穩(wěn)定性?？勺冮g隔區(qū)序列除了目標(biāo)結(jié)構(gòu)域、接合部分和任選的連接子以外，一個或多個本發(fā)明的接合探針可以具有可變間隔區(qū)序列(也被稱為“填充序列”)。這些可變間隔區(qū)序列在本文進(jìn)一步詳細(xì)描述的CLPA-CE試驗中具有特定用途。就是說，可變間隔區(qū)序列可以充當(dāng)一種類型的“標(biāo)記”或“條碼”以當(dāng)例如使用毛細(xì)管電泳(CE)以長度為基礎(chǔ)檢測產(chǎn)物時識別目標(biāo)序列?？勺冮g隔區(qū)序列為接合探針的可以具有不同長度的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，這些不同長度將對接合探針的其他結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域(例如探針結(jié)構(gòu)域)能夠雜交的特定目標(biāo)序列具特異性，以使得由含有填充序列的接合探針接合產(chǎn)生的接合產(chǎn)物的長度為目標(biāo)特異性長度。因此，由這些接合產(chǎn)物產(chǎn)生的任何擴(kuò)增子也將具有目標(biāo)特異性長度。在其他實施方案中，可變間隔區(qū)序列經(jīng)過設(shè)計以促使所有接合產(chǎn)物都具有類似長度，從而有助于后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的效率。在一些實施方案中，接合探針對中僅有一個接合探針包含可變間隔區(qū)序列。在其他實施方案中，兩個接合探針都包含可變間隔區(qū)序列。在使用三個或更多個接合探針的實施方案中，一個或多個形成特定接合產(chǎn)物的接合探針可以含有可變間隔區(qū)序列，不過在這個實施方案中，一般來說，一個或兩個末端探針含有可變間隔區(qū)序列。在其他實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，可變間隔區(qū)序列含于接合探針中實質(zhì)上與目標(biāo)核酸的任何其他結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域以及樣品中的任何目標(biāo)核酸都不互補的區(qū)域內(nèi)。在其他實施方案中，接合探針(如下文進(jìn)一步詳細(xì)論述)含有引物序列。根據(jù)上述實施方案中的任一個，可變間隔區(qū)序列在一些實施方案中含于探針結(jié)構(gòu)域(接合探針中與目標(biāo)序列雜交的區(qū)域)與引物序列之間，以使得擴(kuò)增子含有可變間隔區(qū)序列。在其他方面，本發(fā)明的可變間隔區(qū)序列包括核酸，如DNA或RNA?？勺冮g隔區(qū)序列還可以包括脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸的組合?？勺冮g隔區(qū)序列可以進(jìn)一步包括核苷酸類似物、連接子，或本文所論述的任選地存在于本發(fā)明的接合探針和/或目標(biāo)捕獲探針中的任何額外部分。一般來說，對于同時檢測多重目標(biāo)序列的多重試驗來說，可變間隔區(qū)序列經(jīng)過設(shè)計以使得接合產(chǎn)物或(在擴(kuò)增反應(yīng)在接合步驟之后進(jìn)行的情況下)由每個接合產(chǎn)物所得的擴(kuò)增子中的任一個或兩者具有與樣品中的其他接合產(chǎn)物或擴(kuò)增子不同的核苷酸長度。就是說，來自一個目標(biāo)核酸的擴(kuò)增子將與來自不同目標(biāo)核酸的擴(kuò)增子具有不同長度。類似地，當(dāng)多重接合探針組用于單個目標(biāo)(如圖6和11中所示)時，每個接合產(chǎn)物和/或擴(kuò)增子將具有不同長度，從而允許檢測不同產(chǎn)物。可變間隔區(qū)序列的不同長度將取決于檢測系統(tǒng)的靈敏度。對于完善的毛細(xì)管電泳(CE)系統(tǒng)，如由LifeTechnologies制造的GeneticAnalyzer系統(tǒng)或由BeckmanCoulter制造的PACE系統(tǒng)，接合產(chǎn)物和/或擴(kuò)增子可以加以分離并且由此在其長度差異少到一個核苷酸時也可以被檢測出。具有較低尺寸分辨率的其他CE系統(tǒng)可能需要5到100個堿基對的長度差異，這取決于分辨率。一般來說，較高分辨率的CE系統(tǒng)需要較長的分離通道長度并且往往需要較長的分離時間。此外，變性毛細(xì)管電泳系統(tǒng)傾向于比非變性系統(tǒng)具有較好分辨率。一般來說，可變間隔區(qū)序列經(jīng)過設(shè)計以產(chǎn)生1到100個堿基范圍內(nèi)的核苷酸差異，其中5到20個堿基是優(yōu)選的?？梢允褂酶蟪叽绮町?，但往往需要額外成本或減少可以在單個測試中組合的可能接合探針的數(shù)目。另外，可變間隔區(qū)序列可以與其他標(biāo)記聯(lián)合使用以擴(kuò)充可以使用的不同“條碼”的數(shù)目。就是說，可變間隔區(qū)序列的長度可以通過將其用第二標(biāo)記編碼而進(jìn)行“再使用”；舉例來說，一個含有20個核苷酸的可變間隔區(qū)序列的擴(kuò)增子可以使用具有第一色彩的熒光標(biāo)記，并且另一個含有20聚體間隔區(qū)序列的擴(kuò)增子可以使用具有不同色彩的熒光標(biāo)記。這些具有相同尺寸的擴(kuò)增子可以使用多通道CE儀器同時檢測，這個儀器可以識別具有不同波長(色彩)產(chǎn)物的擴(kuò)增子，如法醫(yī)學(xué)中通常所實施的那樣。接合探針的額外功能部分除了目標(biāo)結(jié)構(gòu)域、接合部分和任選的連接子以外，一個或多個本發(fā)明的接合探針可以具有額外的功能部分，包括(但不限于)啟動子和引物序列(或其補體，取決于試驗)、標(biāo)記(包括標(biāo)記探針結(jié)合序列)以及捕獲或錨定序列。在許多實施方案中，接合探針經(jīng)過構(gòu)筑以含有必需的引發(fā)位點用于后續(xù)擴(kuò)增方案。在一個優(yōu)選實施方案中，引發(fā)位點為通用引發(fā)位點?！巴ㄓ靡l(fā)位點”或“通用引發(fā)序列”在本文中意指將結(jié)合引物用于擴(kuò)增的探針的序列。在一個優(yōu)選實施方案中，使用一個通用引發(fā)序列或位點。在這個實施方案中，優(yōu)選的通用引發(fā)序列為RNA聚合酶T7序列，其可使T7RNA聚合酶制造接頭序列的RNA拷貝，如下文所概述。關(guān)于使用T7RNA聚合酶的額外披露見于美國專利第6,291,170號、第5,891,636號、第5,716,785號、第5,545,522號、第5,922,553號、第6,225,060號和第5,514,545號中，所有這些專利都以引用的方式明確并入本文中。在一個優(yōu)選實施方案中，舉例來說，當(dāng)使用需要兩個引物的擴(kuò)增方法(如PCR)時，每個探針優(yōu)選地包含上游通用引發(fā)位點(UUP)和下游通用引發(fā)位點(DUP)。此外，“上游”和“下游”并不意味著傳達(dá)特定的5'-3'定向，并且將取決于系統(tǒng)的定向。優(yōu)選地，在探針組中僅僅使用單個UUP序列和單個DUP序列，不過如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，不同試驗或不同多路分析可以利用多個通用引發(fā)序列。在一些實施方案中，探針組可以包含不同通用引發(fā)序列。另外，通用引發(fā)位點優(yōu)選地位于目標(biāo)探針(或接合探針)的5'端和3'端，因為只有被引發(fā)序列側(cè)接的序列才會得到擴(kuò)增。另外，針對特定試驗和宿主基因組一般選擇盡可能獨特的通用引發(fā)序列以確保試驗的特異性。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，可以使用引發(fā)序列/引物組；即，一個反應(yīng)可以利用500個具有第一引發(fā)序列或序列組的目標(biāo)探針和額外的500個具有第二序列或序列組的探針。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，當(dāng)使用兩個引發(fā)序列時，兩個引發(fā)位點的定向一般是不同的。就是說，一個PCR引物將與第一引發(fā)位點直接雜交，而另一個PCR引物將與第二引發(fā)位點的補體雜交。換句話說，第一引發(fā)位點呈有義定向，并且第二引發(fā)位點呈反義定向。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，一般來說，可以進(jìn)行高度多重性的反應(yīng)，其中所有通用引發(fā)位點對于所有反應(yīng)都是相同的?；蛘撸梢酝瑫r或依序使用通用引發(fā)位點和相應(yīng)探針“組”。通用引發(fā)位點用于擴(kuò)增經(jīng)過修飾的探針以形成多個擴(kuò)增子，然后按本文所概述的多種方式檢測這些擴(kuò)增子。在優(yōu)選實施方案中，一個通用引發(fā)位點為T7位點。在一些實施方案中，這個引發(fā)位點充當(dāng)RNA分析的模板。在一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)同時檢測多重目標(biāo)時，反應(yīng)中的所有寡核苷酸接合探針組都經(jīng)過設(shè)計以含有一致的啟動子或引物對結(jié)合位點，以使得在接合和純化之后，在適當(dāng)情況下，可以使用相同酶和/或相同引物同時擴(kuò)增所有接合產(chǎn)物。換句話說，在涉及檢測多重目標(biāo)核酸的實施方案中，含有針對不同目標(biāo)核酸序列的接合探針的不同接合探針組在一些實施方案中可以具有一致的啟動子或引物對結(jié)合位點(例如“通用”引物結(jié)合位點)，以便可以使用相同酶和/或引物擴(kuò)增由這些接合探針的雜交和接合產(chǎn)生的接合產(chǎn)物。在一個實施方案中，一個或多個接合探針包含啟動子序列。在采用啟動子序列的實施方案中，啟動子序列或其補體將具有足夠長度以允許適當(dāng)聚合酶與其相互作用。具有足夠長度供聚合酶相互作用的序列的詳細(xì)描述可以見于SambrookandRussell以及其他文獻(xiàn)中，這個文獻(xiàn)出于所有目的特此以引用的方式并入，并且尤其是關(guān)于聚合酶的啟動子序列的教導(dǎo)內(nèi)容。在某些實施方案中，擴(kuò)增方法包含至少一個擴(kuò)增周期，例如(但不限于)以下連續(xù)程序：聚合酶與啟動子相互作用；按模板依賴性方式使用聚合酶合成一條核苷酸鏈；以及使新形成的核酸雙鏈體變性以分離這些鏈。在另一個實施方案中，一個或兩個接合探針包含引物序列。如下文所概述，本發(fā)明的接合產(chǎn)物可以用于額外的反應(yīng)中，如酶促擴(kuò)增反應(yīng)。在一個實施方案中，接合探針包括引物序列，其經(jīng)過設(shè)計以允許一定水平的額外擴(kuò)增。如本文中所用的術(shù)語“引物”是指天然存在的呈經(jīng)過純化的限制性消化形式或以合成方式產(chǎn)生的核苷酸序列，其在置于一定條件下時能夠用作核酸序列合成的起始點，在這些條件下誘導(dǎo)與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成，即，在不同三磷酸核苷酸和聚合酶存在下、在適當(dāng)緩沖液中(“緩沖液”包括pH、離子強(qiáng)度、輔因子等等)以及在適合溫度下。可以例如通過添加甲基、生物素或或地高辛(digoxigenin)部分、熒光標(biāo)簽或通過使用放射性核苷酸來修飾引物的一個或多個核苷酸。引物序列不需要反映模板的精確序列。舉例來說，非互補核苷酸片段可以連接到引物的5'末端，而引物序列的其余部分實質(zhì)上與目標(biāo)鏈互補。通過使用幾個引發(fā)序列和引物，第一接合產(chǎn)物可以充當(dāng)額外接合產(chǎn)物的模板。這些引物序列可以充當(dāng)PCR反應(yīng)的引發(fā)位點，這些PCR反應(yīng)可以用于擴(kuò)增接合產(chǎn)物。除了PCR反應(yīng)以外，其他擴(kuò)增方法也可以利用引發(fā)序列，包括(但不限于)接合酶鏈反應(yīng)、InvaderTM、通過切口平移(nicktranslation；NICK)進(jìn)行的位置擴(kuò)增、引物延伸/切口平移，以及本領(lǐng)域中已知的其他方法。如本文中所用的“擴(kuò)增”是指特定核酸的拷貝數(shù)增加。在擴(kuò)增反應(yīng)中體外制造的特定核酸的拷貝被稱為“擴(kuò)增子”或“擴(kuò)增產(chǎn)物”。擴(kuò)增還可以通過第二接合反應(yīng)發(fā)生，其中引物位點充當(dāng)一組新的接合探針的雜交位點，這組新的接合探針可能包含或可能不包含與產(chǎn)生原始接合產(chǎn)物的第一組接合探針一致的序列。目標(biāo)序列由此通過在后續(xù)擴(kuò)增周期中擴(kuò)增接合產(chǎn)物而以指數(shù)方式擴(kuò)增。在本發(fā)明的這個方面的另一個實施方案中，引物序列用于嵌套接合反應(yīng)。在這些嵌套接合反應(yīng)中，使用本文所描述的方法來完成第一接合反應(yīng)，以使得接合產(chǎn)物可以例如通過使用生物素化引物捕獲到所需鏈上并且捕獲到涂有抗生蛋白鏈菌素的珠粒(尤其磁性珠粒)上。在捕獲接合產(chǎn)物之后，通過在從連接到捕獲珠粒、探針等等的接合產(chǎn)物末端(即，下游)部分去除的接合產(chǎn)物段內(nèi)接合探針與引物序列雜交來完成第二接合反應(yīng)。至少一個用于二次接合反應(yīng)的引物序列將位于與接合探針互補的接合產(chǎn)物區(qū)域內(nèi)，這個接合探針不是包括錨定或捕獲序列的接合探針。來自這個第二接合反應(yīng)的接合產(chǎn)物將由此必定僅由從第一化學(xué)結(jié)合成功形成的那些序列產(chǎn)生，由此去除了來自擴(kuò)增反應(yīng)的任何“假陽性”。在另一個實施方案中，二次反應(yīng)中所用的引物序列可以是其他類型的擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR)的引物位點。在一個實施方案中，一個或多個接合探針包含錨定序列。“錨定序列”在本文中意指接合探針中允許接合產(chǎn)物連接到支撐物上以達(dá)成檢測目的的組分。適合的檢測手段包括連接有適當(dāng)捕獲部分的支撐物。一般來說，這種連接將經(jīng)由錨定序列與捕獲探針雜交而發(fā)生，這個捕獲探針實質(zhì)上與錨定序列互補。在一個優(yōu)選實施方案中，一個探針進(jìn)一步包含“錨定”序列(有時在本領(lǐng)域中和本文中被稱為“郵碼”或“條碼”或“接頭”)。接頭有助于探針固定以允許使用“通用陣列”。就是說，產(chǎn)生含有捕獲探針的陣列(固相或液相陣列)，這些捕獲探針對目標(biāo)不具特異性，而是對個別(優(yōu)選地)人工接頭序列具特異性。因此，“接頭序列”為一般不是原產(chǎn)自目標(biāo)序列(即，是外源的)，但添加或連接到目標(biāo)序列上的核酸。應(yīng)注意，在這個背景下，“目標(biāo)序列”可以包括初級樣品目標(biāo)序列，或可以為衍生目標(biāo)，如本文所概述的反應(yīng)的反應(yīng)物或產(chǎn)物；因此，舉例來說，目標(biāo)序列可以是PCR產(chǎn)物、OLA反應(yīng)中的第一接合探針或接合探針，等等。術(shù)語“條碼”、“接頭”、“地址”、“標(biāo)簽”和“郵碼”已經(jīng)全部被用于描述添加到擴(kuò)增子中以允許分離核酸片段庫的人工序列。接頭的一個優(yōu)選形式為雜交接頭。在這個實施方案中，選擇接頭以允許與陣列表面上的互補捕獲探針雜交。接頭充當(dāng)探針的獨特識別符并由此充當(dāng)目標(biāo)序列的獨特識別符。一般來說，陣列上的接頭和相應(yīng)捕獲探針組經(jīng)過開發(fā)以使得與彼此和反應(yīng)混合物的其他組分的交叉雜交減到最少，這些其他組分包括目標(biāo)序列和在目標(biāo)序列外部的較大核酸序列上的序列(例如，基因組DNA內(nèi)的序列)。接頭的其他形式為可以使用質(zhì)譜法分離的質(zhì)量標(biāo)簽、可以基于電泳遷移率分離的電泳標(biāo)簽，等等。一些接頭序列概述于2001年8月27日提交的美國專利序號09/940,185中，這個專利特此以全文引用的方式并入。優(yōu)選的接頭為滿足以下標(biāo)準(zhǔn)的那些接頭。這些接頭并不存在于基因組(優(yōu)選地為人類基因組)中，并且其不具有不合需要的結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾環(huán)。在一個實施方案中，使用接頭序列得以產(chǎn)生更“通用”的表面；即，可以制造一個包含一組有限的捕獲探針的標(biāo)準(zhǔn)陣列并且被用于任何應(yīng)用中。最終用戶可以通過設(shè)計不同的可溶目標(biāo)探針來定制這個陣列，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，這個設(shè)計一般較簡單并且成本較低。在一個優(yōu)選實施方案中，制造不同并且通常是人工的捕獲探針的陣列；即，捕獲探針不與已知目標(biāo)序列具有互補性。然后，可以將錨定序列并入到目標(biāo)探針中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，取決于所需的結(jié)合“強(qiáng)度”和所需不同錨定的數(shù)目，錨定序列的長度將變化。在一個優(yōu)選實施方案中，接頭序列在約6個到約500個堿基對長度的范圍內(nèi)，其中約8到約100是優(yōu)選的，并且約10到約25是特別優(yōu)選的。在一個優(yōu)選實施方案中，接頭序列獨特地識別目標(biāo)探針?biāo)Y(jié)合的目標(biāo)分析物。就是說，雖然接頭序列不需要本身結(jié)合到目標(biāo)分析物上，但系統(tǒng)可以通過檢測接頭的存在來識別目標(biāo)分析物。因此，在結(jié)合或雜交試驗和洗滌之后，擴(kuò)增包括接頭的探針，然后，對接頭的檢測充當(dāng)目標(biāo)核酸的存在的指示。在一個實施方案中，接頭包括識別符區(qū)域和與如上文所描述的通用陣列上的捕獲探針互補的區(qū)域。在這個實施方案中，擴(kuò)增子與通用陣列上的捕獲探針雜交。在與接頭序列所互補的探針雜交之后完成接頭的檢測。優(yōu)選地，探針如本文所描述加標(biāo)記。一般來說，類似于可變間隔區(qū)序列，獨特接頭序列被用于每個獨特目標(biāo)分析物。就是說，特定接頭序列的解析或檢測得以識別含有那個接頭序列的目標(biāo)探針?biāo)Y(jié)合的目標(biāo)分析物。然而，如本文所論述，在一些情況下，有可能“再使用”接頭序列并且多于一個目標(biāo)分析物共享接頭序列。在一個優(yōu)選實施方案中，接頭含有指示特定目標(biāo)分子的不同序列或特性。就是說，每個接頭獨特地識別目標(biāo)序列。如上文所描述，擴(kuò)增接頭以形成擴(kuò)增子。檢測接頭作為目標(biāo)分析物(即，特定目標(biāo)核酸)的存在的指示。在本發(fā)明的這個方面的一個實施方案中，上游寡核苷酸經(jīng)過設(shè)計以具有額外的核苷酸區(qū)段，這個核苷酸區(qū)段并不結(jié)合到所關(guān)注的目標(biāo)上，但將被用于隨后在某種適合的固體支撐物或裝置上捕獲接合產(chǎn)物。在本發(fā)明的這個方面的一個優(yōu)選實施方案中，下游寡核苷酸具有連接到其上的可檢測標(biāo)記，以使得在接合之后，所得產(chǎn)物將在其3'末端含有用于固體支撐物的捕獲序列并且在其5'末端含有可檢測標(biāo)記，并且只有接合產(chǎn)物才會含有捕獲序列和標(biāo)記。在尤其關(guān)于多重目標(biāo)檢測的本發(fā)明的另一個方面，探針組的每個上游探針可以經(jīng)過設(shè)計以在其3'末端具有對應(yīng)于DNA陣列上的不同位置的獨特序列(在本文中也被稱為“錨定序列”)。探針組的每個下游探針可以任選地含有與其他下游探針一致的可檢測標(biāo)記，但含有對應(yīng)于其相應(yīng)的目標(biāo)的獨特目標(biāo)結(jié)合序列。在與DNA陣列雜交之后，將僅可觀測到具有地址序列(上游探針)和標(biāo)記(下游探針)的接合探針。在本發(fā)明的另一個方面，可檢測標(biāo)記可以連接到上游探針上并且捕獲序列可以為下游探針的一部分，以使得接合產(chǎn)物將具有更多地朝向接合產(chǎn)物的3'末端的可檢測標(biāo)記和朝向接合產(chǎn)物的5'末端的捕獲序列。經(jīng)由考慮合成的簡易性以及將用于隨后檢測接合反應(yīng)產(chǎn)物的裝置的特征來最佳地確定精確構(gòu)型。錨定序列可以具有核酸和非核酸部分。因此，舉例來說，柔性連接子(如烷基)，包括聚乙二醇連接子，可以用于提供錨定序列的核酸部分與支撐物表面之間的空間。這在接合產(chǎn)物很大時可能尤其適用。另外，在一些情況下，可以使用對應(yīng)于“通用陣列”的捕獲探針的錨定序列組。如本領(lǐng)域中已知，陣列可以用作為捕獲探針的一般合成序列制成，這些捕獲探針被設(shè)計成與所分析的樣品的目標(biāo)序列不互補，而與接合探針組的陣列結(jié)合序列互補。這些“通用陣列”可以用于多種類型的樣品和診斷測試，因為探針的相同陣列結(jié)合序列可以被再使用/與不同目標(biāo)識別序列配對。在一個實施方案中，一個或多個接合探針包含標(biāo)記?！皹?biāo)記”或“加標(biāo)記”在本文中意味著化合物具有至少一個所連接的要素、同位素或化學(xué)化合物以能夠檢測這種化合物，例如促使接合探針或接合或轉(zhuǎn)移產(chǎn)物可使用已知檢測方法檢測，例如電子、光譜、光化學(xué)或電化學(xué)發(fā)光方法。一般來說，標(biāo)記屬于以下三類：a)同位素標(biāo)記，其可以是放射性同位素或重同位素；b)磁性、電性、熱標(biāo)記；以及c)有色或發(fā)光染料；不過標(biāo)記同樣包括酶和粒子，如磁性粒子。染料可以是發(fā)色團(tuán)或磷，但優(yōu)選地為熒光染料，這些熒光染料由于其強(qiáng)信號而提供良好的信噪比。用于本發(fā)明的適合染料包括(但不限于)熒光稀土配合物(包括銪和鋱的那些配合物)、熒光素、異硫氰酸熒光素、羧基熒光素(FAM)、二氯三嗪胺熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、傘形酮、曙紅、赤蘚紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠、Cy3、Cy5、芪、熒光黃、瀑布藍(lán).TM.、德克薩斯紅、alexa染料、丹磺酰氯、藻紅蛋白、綠色熒光蛋白和其波長偏移變異體、氟硼吡咯(bodipy)，以及本領(lǐng)域中已知的其他染料，如Haugland,MolecularProbesHandbook,(Eugene,Oreg.)第6版；TheSynthegencatalog(Houston,Tex.),Lakowicz,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,第2版,PlenumPressNewYork(1999)中所描述的那些染料，以及RichardP.Haugland所編的第6版MolecularProbesHandbook中所描述的其他染料，這些文獻(xiàn)以引用的方式明確并入本文中。額外的標(biāo)記包括如美國專利序號09/315,584中所描述的納米晶體或Q點，這個專利以引用的方式明確并入本文中。在一個優(yōu)選實施方案中，標(biāo)記為作為結(jié)合搭配物對的一部分的次級標(biāo)記。舉例來說，標(biāo)記可以是半抗原或抗原，其將結(jié)合其結(jié)合搭配物。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)合搭配物可以連接到固體支撐物上以允許分離延伸的引物和非延伸的引物。舉例來說，適合結(jié)合搭配物對包括(但不限于)：抗原(如蛋白質(zhì)(包括肽))和抗體(包括其片段(FAb等等))；蛋白質(zhì)和小分子，包括生物素/抗生蛋白鏈菌素；酶和襯底或抑制劑；其他蛋白質(zhì)--蛋白質(zhì)相互作用對；受體-配體；以及碳水化合物和其結(jié)合搭配物。核酸--核酸結(jié)合蛋白對也適用。一般來說，較小的對連接到NTP上以供并入到引物中。優(yōu)選的結(jié)合搭配物對包括(但不限于)生物素(或亞氨基-生物素)和抗生蛋白鏈菌素、地高辛和Ab，以及ProlinxTM試劑。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)合搭配物對包含生物素或亞氨基-生物素和抗生蛋白鏈菌素。亞氨基-生物素特別優(yōu)選地作為來自pH4.0緩沖液中的抗生蛋白鏈菌素的亞氨基-生物素解離物，而生物素需要苛刻的變性劑(例如pH1.5的6M鹽酸胍或95℃下的90％甲酰胺)。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)合搭配物對包含初級檢測標(biāo)記(例如，連接到接合探針上)和將特異性地結(jié)合到初級檢測標(biāo)記上的抗體。“特異性地結(jié)合”在本文中意味著搭配物以足以區(qū)分這個對與系統(tǒng)的其他組分或污染物的特異性進(jìn)行結(jié)合。結(jié)合應(yīng)足以在試驗條件下保持結(jié)合狀態(tài)，包括用以去除非特異性結(jié)合的洗滌步驟。在一些實施方案中，這個對的解離常數(shù)將小于約10-4到10-6M-1，其中小于約10-5到10-9M-1是優(yōu)選的并且10-9M-1是特別優(yōu)選的。在一個優(yōu)選實施方案中，次級標(biāo)記為可化學(xué)修飾的部分。在這個實施方案中，將包含反應(yīng)性官能團(tuán)的標(biāo)記并入到核酸中。然后，可以將官能團(tuán)隨后用初級標(biāo)記加標(biāo)記。適合的官能團(tuán)包括(但不限于)氨基、羧基、馬來酰亞胺基、橋氧基和硫醇基，其中氨基和硫醇基是特別優(yōu)選的。舉例來說，可以例如使用如本領(lǐng)域中已知的連接子將含有氨基的初級標(biāo)記連接到包含氨基的次級標(biāo)記上；例如，如眾所周知的同雙功能或異雙功能連接子(參看1994PierceChemicalCompanycatalog,technicalsectiononcross-linkers,第155200頁，其以引用的方式并入本文中)。在這個實施方案中，標(biāo)記還可以是標(biāo)記探針結(jié)合序列或其補體?！皹?biāo)記探針”在本文中意指實質(zhì)上與結(jié)合序列互補并且一般直接加標(biāo)記的核酸。本發(fā)明的組合物一般使用已知合成技術(shù)制得。一般來說，基于標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)的方法在本發(fā)明的一個方面具有特定用途，不過如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，多種核酸合成反應(yīng)是已知的。添加熒光團(tuán)和淬滅劑的間隔同樣眾所周知。VI.目標(biāo)捕獲探針在某些方面并且根據(jù)本文所論述的接合探針的任何描述，本發(fā)明進(jìn)一步包括目標(biāo)捕獲探針的用途。這些目標(biāo)捕獲探針一般不參與接合探針的化學(xué)接合反應(yīng)，并且適用于增加試驗的特異性。如本文進(jìn)一步描述，目標(biāo)捕獲探針與如本文所描述由接合探針形成的接合產(chǎn)物上游或下游的目標(biāo)核酸雜交。目標(biāo)捕獲探針與目標(biāo)核酸雜交形成包含目標(biāo)核酸、一個或多個接合產(chǎn)物和目標(biāo)捕獲探針的目標(biāo)復(fù)合物。目標(biāo)捕獲探針含有可以用于在固體支撐物或珠粒上捕獲目標(biāo)復(fù)合物的捕獲部分。在捕獲于支撐物或珠粒上之后，去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后，對目標(biāo)復(fù)合物(在本文中也被稱為“捕獲復(fù)合物”)和/或接合產(chǎn)物進(jìn)行分析或進(jìn)行擴(kuò)增(如PCR)。一般來說，本發(fā)明的目標(biāo)捕獲探針含有與捕獲部分雜交的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域以及可以用于選擇性地捕獲通過雜交或其他相互作用結(jié)合到目標(biāo)捕獲物上的復(fù)合物/分子的額外捕獲部分。在一些實施方案中，捕獲部分可以是捕獲核酸序列、珠粒，或結(jié)合搭配物對的結(jié)合搭配物(如生物素，然后可以用其結(jié)合搭配物抗生蛋白鏈菌素加以捕獲)。目標(biāo)捕獲探針經(jīng)過設(shè)計以在與核酸的目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的接合探針上游或下游雜交。在某些實施方案中，目標(biāo)捕獲探針將在距接合探針預(yù)定距離內(nèi)雜交。如本文所論述，本發(fā)明的方法包括兩個或更多個接合探針與目標(biāo)核酸的目標(biāo)結(jié)構(gòu)域在使得接合探針在不添加接合酶的情況下自發(fā)經(jīng)歷化學(xué)接合的條件下雜交。在使用目標(biāo)捕獲探針連同接合探針的本發(fā)明的實施方案中，應(yīng)了解，目標(biāo)捕獲探針可以在一個或多個接合探針的雜交之前、之后或同時與目標(biāo)核酸雜交。類似地，目標(biāo)捕獲探針的雜交還可以在接合探針的自發(fā)接合之前、之后或同時發(fā)生。在某些實施方案中，多重目標(biāo)捕獲探針被應(yīng)用于目標(biāo)核酸。如應(yīng)了解，這些多重捕獲探針可以經(jīng)過設(shè)計以與沿著目標(biāo)長度的任何點雜交。在目標(biāo)核酸上形成單個接合產(chǎn)物的實施方案中，多重接合探針可以用于側(cè)接任一側(cè)上的接合產(chǎn)物。這個實施方案在質(zhì)量控制或核酸完整性評估方面具有特定用途，因為在使用多重目標(biāo)捕獲探針時甚至?xí)东@降解的目標(biāo)核酸的可能性增加。在目標(biāo)核酸上形成多重接合產(chǎn)物的實施方案中，多重目標(biāo)捕獲探針也可以與目標(biāo)核酸雜交。如上文所論述，這些多重目標(biāo)捕獲探針可以經(jīng)過設(shè)計以在沿著目標(biāo)核酸長度的不同點處雜交。在一些實施方案中，目標(biāo)捕獲探針經(jīng)過設(shè)計以在目標(biāo)核酸的3'、5'末端處或接近3'、5'末端處或在3'和5'末端處雜交。在其他實施方案中，目標(biāo)捕獲探針經(jīng)過設(shè)計以與在目標(biāo)核酸上形成的不同接合產(chǎn)物上游、下游和/或之間插入的區(qū)域雜交。VII.試驗和檢測方法在示例性方面，本發(fā)明提供檢測樣品中的多個不同目標(biāo)核酸的方法。這些目標(biāo)核酸包括至少第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，其中第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域彼此相鄰。目標(biāo)核酸還可以包括作為目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域的第三結(jié)構(gòu)域，并且那個目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域位于第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域上游或下游(即，5'或3')。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的試驗包括提供接合襯底的步驟，這些接合襯底包括上文所論述的包含目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)核酸。這些接合襯底各自進(jìn)一步包括包含第一核酸接合探針和第二核酸接合探針的第一組接合探針。第一核酸接合探針與目標(biāo)核酸序列的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交，并且第二核酸接合探針與目標(biāo)核酸序列的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交。在這些實施方案中，第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域在第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域上游。第一核酸接合探針進(jìn)一步包括5'接合部分并且第二核酸接合探針進(jìn)一步包括3'接合部分。由于第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域彼此相鄰，因此兩個與目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的接合探針的接合部分彼此相鄰并且能夠在不使用接合酶的情況下經(jīng)歷接合以形成接合產(chǎn)物。本發(fā)明的實施方案進(jìn)一步包括使目標(biāo)捕獲探針與目標(biāo)核酸的第三目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域雜交形成目標(biāo)復(fù)合物。目標(biāo)復(fù)合物由此包含目標(biāo)核酸、與第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第一接合探針、與第二接合結(jié)構(gòu)域雜交的第二接合探針，以及與第三目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域雜交的目標(biāo)捕獲探針。目標(biāo)捕獲探針包含捕獲部分，其能夠?qū)⒛繕?biāo)復(fù)合物捕獲于表面或襯底(如珠粒)上。捕獲目標(biāo)復(fù)合物可以用于分離目標(biāo)復(fù)合物與未結(jié)合的目標(biāo)核酸和接合探針，換句話說，目標(biāo)捕獲探針的使用提供一種分離在上面已經(jīng)成功形成接合產(chǎn)物的那些目標(biāo)核酸的方式。本發(fā)明的試驗可以進(jìn)一步包括擴(kuò)增由不同接合襯底形成的接合產(chǎn)物以形成擴(kuò)增子，然后檢測這些擴(kuò)增子以檢測目標(biāo)核酸。如應(yīng)了解，本發(fā)明的試驗可以利用針對多重目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的多組接合探針。舉例來說，核酸可以進(jìn)一步包括與第五目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰的第四目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，并且接合襯底進(jìn)一步包括第二組接合探針，這第二組接合探針包括與第四目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第三接合探針和與第五目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第四接合探針。如同上文所論述的第一接合探針和第二接合探針一樣，第三接合探針和第四接合探針在不使用接合酶的情況下接合，并且由此目標(biāo)核酸包含多重接合產(chǎn)物。目標(biāo)捕獲探針可以再次與目標(biāo)核酸雜交以形成包含多重接合產(chǎn)物、目標(biāo)核酸和目標(biāo)捕獲探針的目標(biāo)復(fù)合物。如上文所論述，可以在表面上捕獲這些目標(biāo)復(fù)合物，并且在一些實施方案中可以擴(kuò)增多重接合產(chǎn)物以形成擴(kuò)增子，然后可以對這些擴(kuò)增子進(jìn)行檢測。類似地，目標(biāo)核酸可以進(jìn)一步包括與第七目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰的第六目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，并且含有第五接合探針和第六接合探針的第三組接合探針可以分別與第六目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第七目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交。如同本文所論述的任何接合探針一樣，第五接合探針和第六接合探針在不使用接合酶的情況下接合，由此產(chǎn)生包含多重接合產(chǎn)物(即，由第一接合探針和第二接合探針接合形成的接合產(chǎn)物和/或由第三接合探針和第四接合探針形成的接合產(chǎn)物)的目標(biāo)核酸。如應(yīng)了解，目標(biāo)核酸可以含有許多目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，并且由此許多接合探針組可以用于根據(jù)本發(fā)明在那個目標(biāo)核酸上形成接合產(chǎn)物。包含多重接合產(chǎn)物的上述目標(biāo)核酸中的任一個可以進(jìn)一步與一個或多個目標(biāo)捕獲探針雜交形成目標(biāo)復(fù)合物。然后，可以在襯底上捕獲那些目標(biāo)復(fù)合物。然后，使用本領(lǐng)域中已知和本文所論述的方法擴(kuò)增目標(biāo)復(fù)合物的接合產(chǎn)物以形成擴(kuò)增子，然后對那些擴(kuò)增子進(jìn)行檢測以識別和/或定量目標(biāo)核酸的存在。在某些實施方案中，根據(jù)本文所描述的任何方法形成的接合產(chǎn)物并未經(jīng)過擴(kuò)增，取而代之的是使用本文所描述的任何方法直接進(jìn)行檢測。在檢測接合或轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物之前，可能存在額外的擴(kuò)增反應(yīng)?？梢允褂枚螖U(kuò)增反應(yīng)來增強(qiáng)目標(biāo)序列檢測的信號；例如，通過增加針對每個目標(biāo)拷貝所產(chǎn)生的接合產(chǎn)物的數(shù)目。在一個實施方案中，可以對接合產(chǎn)物進(jìn)行許多標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增反應(yīng)，包括(但不限于)鏈置換擴(kuò)增(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、接合擴(kuò)增和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；包括許多PCR變化形式，包括“定量競爭PCR”或“QC-PCR”、“任意引物PCR”或“AP-PCR”、“免疫-PCR”、“Alu-PCR”、“PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性”或“PCR-SSCP”、“反轉(zhuǎn)錄酶PCR”或“RT-PCR”、“生物素捕獲PCR”、“小載體(vectorette)PCR”、“鍋柄PCR”和“PCR選擇性cDNA消減”，以及其他。在一個實施方案中，擴(kuò)增技術(shù)不是PCR。根據(jù)某些實施方案，可以使用接合技術(shù)，如間隙填充接合，包括(但不限于)間隙填充OLA和LCR、橋連寡核苷酸接合、FEN-LCR和修正接合(correctionligation)。這些技術(shù)的描述可以見于美國專利第5,185,243號、公開歐洲專利申請EP320308和EP439182、公開PCT專利申請WO90/01069、公開PCT專利申請案WO02/02823和美國專利申請案序號09/898,323以及其他文獻(xiàn)中。除了標(biāo)準(zhǔn)酶促擴(kuò)增反應(yīng)以外，還有可能設(shè)計出最初產(chǎn)生的接合產(chǎn)物本身可以作為二次化學(xué)接合反應(yīng)的目標(biāo)的探針方案。此外，可以對起始樣品核酸進(jìn)行“預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)”以產(chǎn)生更多目標(biāo)序列用于化學(xué)反應(yīng)接合。舉例來說，可以進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，利用本發(fā)明的方法和組合物的試驗取決于所需應(yīng)用可以采用多種配置，并且可以包括原位試驗(類似于FISH)、基于溶液的試驗(例如轉(zhuǎn)移/去除熒光團(tuán)和/或淬滅劑)以及異相試驗(例如利用固體支撐物進(jìn)行操作、去除和/或檢測，如使用高密度陣列)。另外，試驗可以包括額外的反應(yīng)，如目標(biāo)序列的預(yù)擴(kuò)增和在接合已經(jīng)發(fā)生之后的二次擴(kuò)增反應(yīng)，如本文所概述。如本文所描述，關(guān)于本發(fā)明的這個方面的試驗可能依賴于信號的增強(qiáng)，例如熒光或化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)生。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，依賴于這些信號的降低的試驗也是有可能的。在一個實施方案中，類似于FISH反應(yīng)，試驗反應(yīng)“原位”進(jìn)行(在各種試驗格局中也被稱為“體外”和/或“離體”，這取決于樣品)。由于不需要添加外源酶，因此可以將試劑添加到細(xì)胞(活的、電穿孔的、固定的，等等)中，如組織學(xué)樣品中，用于確定目標(biāo)序列，尤其與疾病狀態(tài)或其他病狀相關(guān)的那些目標(biāo)序列的存在。另外，可以進(jìn)行“體外”試驗，其中從樣品中提取目標(biāo)序列?？梢蕴幚順悠?例如對于石蠟包埋樣品來說，可以制備這種樣品)，添加試劑并且使反應(yīng)進(jìn)行，其中檢測是遵循本領(lǐng)域中所做的那樣。在一些實施方案中，使用固體支撐物檢測接合產(chǎn)物(在本文中也被稱為“接合的產(chǎn)物”)。舉例來說，使用錨定探針/捕獲探針雜交或其他結(jié)合技術(shù)，例如使用結(jié)合搭配物對(例如生物素和抗生蛋白鏈菌素)使接合產(chǎn)物連接到珠粒中。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)移反應(yīng)使得生物素部分從第一接合探針轉(zhuǎn)移到包含標(biāo)記的第二接合探針。使包含抗生蛋白鏈菌素的珠粒與樣品接觸，并且例如使用FACS技術(shù)檢查珠粒中標(biāo)記的存在。在其他實施方案中，使用異相試驗檢測接合產(chǎn)物。就是說，反應(yīng)在溶液中完成并且將產(chǎn)物添加到固體支撐物(如陣列或珠粒)上。一般來說，一個接合探針包含錨定序列或結(jié)合對搭配物(例如生物素、半抗原等等)，并且另一個包含標(biāo)記(例如熒光團(tuán)、標(biāo)記探針結(jié)合序列等等)。將接合產(chǎn)物添加到固體支撐物上，并且任選地洗滌這個支撐物。在這個實施方案中，只有接合產(chǎn)物才會被捕獲并加標(biāo)記。在本發(fā)明的另一個方面，一個寡核苷酸探針連接有磁性珠粒或某種其他標(biāo)記(生物素)，這可使接合產(chǎn)物的操作變?nèi)菀?。磁性珠?；驑?biāo)記可以連接到如本文所概述使用許多構(gòu)型的上游或下游探針上。如本文所描述，還可以進(jìn)行二次反應(yīng)，其中添加額外的功能部分(例如錨定序列、引物、標(biāo)記等等)。類似地，如本文所描述可以進(jìn)行二次擴(kuò)增反應(yīng)。檢測系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括光學(xué)試驗(包括熒光和化學(xué)發(fā)光試驗)、酶促試驗、加放射性標(biāo)記、表面等離子共振、磁阻、懸臂偏轉(zhuǎn)、測序、表面等離子共振等等。在一些實施方案中，接合產(chǎn)物可以用于額外的試驗技術(shù)中，舉例來說，如2006/0068378(特此以引用的方式并入)中所描述，接合產(chǎn)物可以充當(dāng)光散射粒子(如膠體)之間的連接子，從而在接合產(chǎn)物存在下引起色彩變化。在一些實施方案中，檢測系統(tǒng)可以包括在樣品收集管內(nèi)；舉例來說，血液收集裝置可以具有并入到管或裝置中的試驗以允許檢測病原體或疾病。PCT申請WO95/15971、PCT/US96/09769、PCT/US97/09739、PCTUS99/01705、WO96/40712和WO98/20162(所有這些文獻(xiàn)都以全文引用的方式明確并入本文中)描述了包含含有電子轉(zhuǎn)移部分(包括電極)的核酸的新穎組合物，由此允許進(jìn)行核酸雜交的新穎檢測方法。一種較為突出的技術(shù)涉及使用DNA陣列(Marshall等人,NatBiotechnol.(1998)16(1):27-31)，尤其對于涉及同時測量眾多核酸目標(biāo)的應(yīng)用。DNA陣列最常用于基因表達(dá)監(jiān)測，其中同時測量1到100,000個核酸目標(biāo)(mRNA)的相對濃度。DNA陣列是小型裝置，其中核酸錨定探針在制造時以獨特而已知的模式連接到表面上(Marshall等人,NatBiotechnol.(1998)16(1):27-31)或可以在較晚的時間(例如，在珠粒陣列的情況下)被精確譯解(Steemers等人,NatBiotechnol.(2000)18(1):91-4；以及Yang等人,GenomeRes.(2001)11(11):1888-98)。在一系列上游處理步驟之后，使所關(guān)注的樣品與DNA陣列接觸，樣品中的核酸目標(biāo)與表面上的錨定寡核苷酸雜交，并且確定樣品中目標(biāo)核酸的身份并常常確定其濃度。當(dāng)前使用的許多核酸檢測方法具有阻礙其廣泛應(yīng)用的特征和/或局限性。舉例來說，在DNA微陣列的情況下，在使樣品與微陣列接觸之前，通常必須對樣品進(jìn)行一系列處理步驟。雖然這些步驟取決于陣列制造商和/或用于讀取陣列的技術(shù)(熒光、電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光、磁阻、懸臂偏轉(zhuǎn)、表面等離子共振)而變化，但這些處理步驟通常屬于一些一般類別：核酸分離和純化、酶促擴(kuò)增、可檢測標(biāo)記并入以及擴(kuò)增后清除。其他常用步驟為樣品濃縮、擴(kuò)增目標(biāo)片段化以減小核酸目標(biāo)的平均尺寸，以及核酸外切酶消化以使PCR擴(kuò)增目標(biāo)轉(zhuǎn)化成單鏈物質(zhì)。在使DNA陣列與樣品接觸之前對許多上游處理步驟的需要可能顯著增加通過這些方法檢測核酸目標(biāo)的時間和成本。這還可能顯著牽涉到所獲資料的質(zhì)量。舉例來說，一些擴(kuò)增程序?qū)δ繕?biāo)降解非常敏感并且在輸入核酸材料未被完好保存的情況下表現(xiàn)不佳(Foss等人,DiagnMolPathol.(1994)3(3):148-55)。可以消除或減小上游處理步驟的數(shù)目和/或復(fù)雜性的技術(shù)可以顯著降低成本并且改善由DNA陣列測試獲得的結(jié)果的質(zhì)量。一種減少上游處理步驟的方法涉及使用接合反應(yīng)來增加信號強(qiáng)度并改善特異性。如上文所概述，試驗可以按多種方式運作。在利用在固體支撐物上進(jìn)行檢測的試驗中，存在多種可用于本發(fā)明的固體支撐物，包括陣列。在一些實施方案中，固體支撐物(如珠粒)可用于本發(fā)明。舉例來說，如上文所概述可以使用結(jié)合搭配物對(一個在接合產(chǎn)物上并且一個在珠粒上)來去除未接合的反應(yīng)物。在這個實施方案中，磁性珠粒是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的一些實施方案中，捕獲探針連接到固體支撐物上以供檢測。舉例來說，捕獲探針可以連接到珠粒上以供使用任何適合技術(shù)(例如FACS)進(jìn)行后續(xù)分析。類似地，可以使用如下文所描述的珠粒陣列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供陣列，每個陣列位置至少包含共價連接的核酸探針，一般被稱為“捕獲探針”。“陣列”在本文中意指在陣列格局中的多個核酸探針；陣列的尺寸將取決于組合物和陣列的最終用途?？梢灾圃旌屑s2個到成千個不同捕獲配體的陣列。一般來說，對于基于電極的試驗來說，取決于電極的尺寸以及陣列的最終用途，陣列將包含2個到多達(dá)100,000個或更多個。優(yōu)選范圍是約2到約10,000，其中約5到約1000是優(yōu)選的，并且約10到約100是特別優(yōu)選的。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物可以不呈陣列格局；就是說，對于一些實施方案來說，同樣可以制得包含單個捕獲探針的組合物。另外，在一些陣列中，可以使用不同或相同組合物的多重襯底。因此，舉例來說，大陣列可以包含多個較小襯底。核酸陣列在本領(lǐng)域中是已知的，并且可以按許多方式分類；包括有序陣列(例如能夠在離散位點處解析化學(xué))和隨機(jī)陣列(例如珠粒陣列)。有序陣列包括(但不限于)使用光刻技術(shù)(例如Affymetrix)、點樣技術(shù)(Synteni和其他)、印刷技術(shù)(HewlettPackard和Rosetta)、電極陣列、三維“凝膠墊”陣列以及液體陣列制造的那些。在一個優(yōu)選實施方案中，陣列存在于襯底上。“襯底”或“固體支撐物”或其他語法等效物在本文中意指可以經(jīng)過修飾以含有適于連接或締合核酸的離散個別位點的任何材料。襯底可以包含多種材料，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，包括(但不限于)玻璃、塑料、聚合物、金屬、非金屬、陶瓷和有機(jī)物。當(dāng)固體支撐物為珠粒時，可能存在多種襯底，包括(但不限于)磁性材料、玻璃、硅、右旋糖苷和塑料。如應(yīng)了解并且也如上文所論述，可以使用許多檢測方法來檢測根據(jù)本發(fā)明形成的接合產(chǎn)物(或接合產(chǎn)物的擴(kuò)增子)的存在并對其定量。這些檢測方法可以用于本文所論述的任何試驗中的任何接合產(chǎn)物(或其擴(kuò)增子)。這些檢測方法包括(但不限于)：毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜分析、微陣列分析、測序、實時PCR、光學(xué)檢測、熒光檢測、生物發(fā)光檢測、化學(xué)發(fā)光檢測、電化學(xué)檢測、電化學(xué)發(fā)光檢測和側(cè)向流檢測。除了上文所描述的試驗以外，用于本發(fā)明的特異性試驗包括化學(xué)接合依賴性探針擴(kuò)增(CLPA)試驗，其進(jìn)一步詳細(xì)論述于下文中。化學(xué)接合依賴性探針擴(kuò)增(CLPA)在一些方面，本發(fā)明關(guān)于化學(xué)接合依賴性探針擴(kuò)增(CLPA)技術(shù)。CLPA基于目標(biāo)特異性接合探針的化學(xué)接合以形成接合產(chǎn)物。這種接合產(chǎn)物隨后充當(dāng)酶促擴(kuò)增反應(yīng)的模板以產(chǎn)生擴(kuò)增子，隨后使用任何適合手段分析這些擴(kuò)增子，這些手段包括(但不限于)如上文所論述的那些檢測方法：毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜分析、微陣列分析、測序、實時PCR、光學(xué)檢測、熒光檢測、生物發(fā)光檢測、化學(xué)發(fā)光檢測、電化學(xué)檢測、電化學(xué)發(fā)光檢測和側(cè)向流檢測。CLPA可以用于達(dá)成多種目的，包括(但不限于)分析復(fù)雜基因標(biāo)志圖案。與利用酶促接合反應(yīng)的其他技術(shù)，如DASL(Bibikova,M.等人,AmericanJournalofPathology,(2004),165:5,1799-1807)和MLPA(Schouten,美國專利6,955,901)不同，CLPA使用化學(xué)接合反應(yīng)。在一個實施方案中，CLPA試驗包含使用兩個或更多個并有反應(yīng)性部分的接合探針，這些反應(yīng)性部分在適當(dāng)定位于目標(biāo)序列上時可以自接合。在一個優(yōu)選實施方案中，第一探針上的3'-硫代磷酸酯部分與第二探針上的5'-DABSYL離去基反應(yīng)(見以下方案I)。方案1：3'硫代磷酸酯寡核苷酸(S-探針)與5'DABSYL修飾的寡核苷酸(L-探針)之間的化學(xué)接合反應(yīng)5'-DABSYL基團(tuán)比其他部分(例如碘)反應(yīng)約快四倍，并且還簡化了在合成期間探針的純化。CLPA具有優(yōu)于其他基于序列的雜交技術(shù)的幾個獨特優(yōu)點。第一，CLPA可以直接應(yīng)用于RNA分析而無需預(yù)先制造DNA拷貝。第二，CLPA對樣品污染物相對不太敏感并且可以直接應(yīng)用于不純樣品，包括身體的樣品，如血液、尿液、唾液和糞便。第三，CLPA相比其他已知方法涉及較少步驟，從而減少獲得結(jié)果所需的時間。此外，CLPA探針可以干式儲存，并且經(jīng)過適當(dāng)設(shè)計的系統(tǒng)將自發(fā)反應(yīng)以在互補目標(biāo)序列存在下連接兩個或更多個寡核苷酸?；瘜W(xué)接合反應(yīng)顯示出極佳的序列選擇性并且可以用于辨別單核苷酸多態(tài)性。與酶促接合方法顯著不同，CLPA顯示出對DNA和RNA目標(biāo)幾乎相同的反應(yīng)性，如下文更充分描述，這促使CLPA比其他已知系統(tǒng)更有效，并且擴(kuò)大了可以利用CLPA的應(yīng)用范圍。有利地，CLPA試驗減少了檢測目標(biāo)核酸所需的步驟的數(shù)目，這提供了實現(xiàn)時間段顯著縮短的結(jié)果的可能性。舉例來說，標(biāo)準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-多重接合酶依賴性探針接合(MLPA)的一般工藝流程涉及以下步驟：1.分離總RNA。2.使用反轉(zhuǎn)錄酶制造cDNA拷貝。3.使MLPA探針組與cDNA目標(biāo)雜交整夜。4.添加DNA接合酶以連接目標(biāo)結(jié)合的探針。5.擴(kuò)增接合探針，例如使用Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且對PCR引物加熒光標(biāo)記。6.分析樣品，例如通過CE。與標(biāo)準(zhǔn)RT-MLPA不同，CLPA能夠直接對細(xì)胞和血液裂解物以及RNA目標(biāo)進(jìn)行分析，而不需要涉及分離RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以在接合前制造cDNA拷貝的步驟。這縮短了獲得結(jié)果的時間并且提供了一種實現(xiàn)更快分析的手段。在其他實施方案中，本發(fā)明的CLPA方法是對福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織進(jìn)行。在其他實施方案中，首先使FFPE組織經(jīng)受化學(xué)變性劑處理以使組織裂解，然后對其進(jìn)行本文所描述的任何CLPA方法。在其他實施方案中，在應(yīng)用CLPA方法之前，使用蛋白酶K和/或超聲處理來進(jìn)一步處理FFPE組織。在本發(fā)明的其他實施方案中，通過用較高探針濃度推動雜交反應(yīng)來進(jìn)一步促進(jìn)較快反應(yīng)時間。因此，舉例來說，可以將輸入探針組以相對高的濃度并入到CLPA反應(yīng)中，例如，比MLPA反應(yīng)中典型使用的那些濃度約高100倍。提高探針濃度顯著減少雜交步驟所需的時間，典型地從整夜減到約15分鐘到約1小時之間。一般將CLPA探針以對于每個探針250納摩爾濃度(nM)到0.01pM(皮摩爾濃度)的濃度并入到反應(yīng)中。一般來說，濃度介于約1nM到約1pM之間。在選擇探針濃度時應(yīng)考慮的因素包括特定試驗和所分析的目標(biāo)。S-探針或硫代磷酸酯或親核試劑探針以及L-探針或含離去基或DABSYL的探針以等于或超過目標(biāo)濃度的濃度并入。S-探針和L-探針的總濃度可以達(dá)到高達(dá)10微摩爾濃度(uM)。作為一個非限制性實例，對于每個S和L探針的1nM×250個CLPA探針對將等于500nm(每個探針1nm×每對2個探針×250個目標(biāo))，對于每個探針的10nM將意味著5uM的總濃度。目標(biāo)濃度通常在約10微克總RNA到約10納克的范圍內(nèi)，但其可以少到單個基因拷貝。當(dāng)使用較高探針濃度時，一般優(yōu)選地在擴(kuò)增之前并入純化步驟，尤其對于高度多重性的分析(例如大于約5個目標(biāo))來說。在本發(fā)明的這個方面的一個實施方案中，可以采用基于固體支撐物的捕獲方法，包括膜捕獲、磁性珠粒捕獲和/或粒子捕獲。在一個優(yōu)選實施方案中，在接合之后并且在酶促擴(kuò)增之前采用生物素/抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒純化方案。在一些情況下，可以將磁性粒子直接添加到擴(kuò)增主混合物中，而不干擾后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。在其他情況下，優(yōu)選地從珠粒中釋放被捕獲的寡核苷酸，并且隨后在不存在捕獲粒子或表面的情況下擴(kuò)增所釋放的寡核苷酸溶液。在一個優(yōu)選實施方案中，CLPA涉及一組探針與核酸目標(biāo)序列雜交，以使得這些探針可以在不添加接合酶的情況下經(jīng)歷自接合。在產(chǎn)生接合產(chǎn)物之后，一般使用擴(kuò)增以有助于產(chǎn)物的檢測和分析。出于這個目的，探針經(jīng)過設(shè)計以并有PCR引物，例如通用PCR引物。在一個優(yōu)選實施方案中，直到反應(yīng)的接合部分完成之后才添加通用引物，并且在表面捕獲純化(例如，借助于目標(biāo)捕獲探針，其進(jìn)一步詳細(xì)描述于本文中)之后添加引物連同聚合酶，常常作為PCR主混合物的一部分。CLPA探針具有反應(yīng)性部分，其經(jīng)過定位以使得當(dāng)CLPA探針結(jié)合到核酸目標(biāo)上時，這些反應(yīng)性部分處于緊密空間定向中并且能夠在不添加接合酶的情況下經(jīng)歷接合反應(yīng)。在一個優(yōu)選實施方案中，選擇化學(xué)接合部分以得到可以通過擴(kuò)增酶有效擴(kuò)增的接合反應(yīng)產(chǎn)物，在優(yōu)選實施方案中，擴(kuò)增酶為DNA聚合酶，但還可以包括其他酶，如RNA聚合酶。不受理論約束，產(chǎn)生更接近類似于據(jù)知能夠通過DNA和RNA聚合酶擴(kuò)增的襯底的反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)接合化學(xué)部分和探針組設(shè)計更有可能得到可以用于CLPA試驗中的有效探針組。尤其優(yōu)選的反應(yīng)化學(xué)部分為得到如方案1中所說明的接近類似于原生DNA的反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)部分，方案1涉及3'-硫代磷酸酯與5'DABSYL離去基之間的反應(yīng)。在另一個優(yōu)選實施方案中，探針組包含3'-二硫代磷酸酯(Miller,G.P.等人,BioorganicandMedicinalChemistry,(2008)16:56-64，其特此以全文引用的方式并入并且尤其是關(guān)于探針和3'-二硫代磷酸酯化學(xué)部分的所有教導(dǎo)內(nèi)容)和5'-DABSYL離去基。本發(fā)明的CLPA探針還可以并有填充序列(在本文中也被稱為可變間隔區(qū)序列)以調(diào)整接合產(chǎn)物的長度。填充序列的長度可以對接合探針?biāo)槍Φ哪繕?biāo)序列具特異性，由此提供一種有助于分析接合產(chǎn)物的便利手段。填充序列可以位于任一個或兩個探針上。在利用3'-硫代磷酸酯探針的實施方案中，填充序列在優(yōu)選實施方案中被并入到這個探針(在本文中也被稱為“S探針”)上。也如上文所論述，填充序列可以位于接合探針中與目標(biāo)核酸不互補的區(qū)域中，或填充序列可以位于至少部分重疊與目標(biāo)核酸的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域互補的區(qū)域中。在其他實施方案中，填充序列位于引物序列與探針結(jié)構(gòu)域之間。在本發(fā)明的其他實施方案(CLPA-CE)中，填充序列的長度有變化以產(chǎn)生一個或多個可變長度接合產(chǎn)物，其提供了基于長度變化檢測和識別特異性目標(biāo)序列的基礎(chǔ)。在一個優(yōu)選實施方案中，通過毛細(xì)管電泳(CE)分析可變長度接合產(chǎn)物。一般來說，填充序列被包括在內(nèi)以使得不同接合產(chǎn)物的長度在至少1個堿基對到約10個堿基對的范圍內(nèi)變化；優(yōu)選地為1個堿基對到4個堿基對。在一個優(yōu)選實施方案中，不同接合產(chǎn)物的長度從約80bp到約400bp之間變化；優(yōu)選地在約100bp到約300bp的范圍內(nèi)；更優(yōu)選地在約100bp到約200bp的范圍內(nèi)。在其他實施方案中，填充序列具有一定長度以使得接合產(chǎn)物的長度為約5-1000、10-950、15-900、20-850、25-800、30-750、35-700、40-650、50-600、55-550、60-500、65-450、70-400、75-350、80-300、85-250、90-200、95-150個堿基對。在一些實施方案中，CLPA探針可以進(jìn)一步含有其他任選的要素以有助于分析和檢測接合產(chǎn)物。這些要素包括上文在關(guān)于接合探針對的章節(jié)中所論述的任何要素。舉例來說，對于在本文中被稱為CLPA-MDM(并且進(jìn)一步詳細(xì)論述于下文中)的實施方案，至少一個用于并入陣列結(jié)合序列的接合探針優(yōu)選地結(jié)合到微陣列平臺上的適當(dāng)捕獲序列上。對于CLPA-MDM來說，不同CLPA反應(yīng)產(chǎn)物不是通過尺寸差異，而是通過陣列結(jié)合序列中的差異來分離。在這個實施方案中，陣列結(jié)合序列的序列有變化以使得每個CLPA探針將結(jié)合到DNA微陣列上的獨特位點上。CLPA-MDM中陣列結(jié)合序列的長度通常從15個到150個堿基之間變化，更特別地為20到80個堿基，并且最特別地為25到50個堿基。在其他實施方案中，CLPA探針優(yōu)選地還包括有助于純化和/或分析的其他要素，包括(但不限于)標(biāo)記，如熒光標(biāo)記，和半抗原部分，例如用于純化或檢測接合產(chǎn)物的生物素。舉例來說，并有生物素的探針和/或接合產(chǎn)物可以在包括珠粒的任何適合的抗生蛋白/抗生蛋白鏈菌素平臺上進(jìn)行純化。雖然生物素/抗生蛋白捕獲系統(tǒng)是優(yōu)選的，但還可以使用其他半抗原系統(tǒng)(例如地高辛(DIG)加標(biāo)記)，雜交/寡核苷酸捕獲一樣可以。當(dāng)需要在較晚的階段從珠粒中釋放捕獲產(chǎn)物時，雜交/寡核苷酸捕獲是一種優(yōu)選的方法。除了磁性珠粒以外，還可以使用抗半抗原標(biāo)記的支撐物(濾紙、多孔過濾器、表面捕獲)。CLPA探針加標(biāo)記可以在任一個探針上的末端或內(nèi)部進(jìn)行。優(yōu)選地，將生物素并入到硫代磷酸酯(S-探針)上的5'末端。在一個優(yōu)選實施方案中，CLPA探針組由2個具有互補的反應(yīng)性基團(tuán)的寡核苷酸探針組成(圖1和2)。在另一個實施方案中，CLPA探針組可以由3個或更多個彼此相鄰地結(jié)合到目標(biāo)上的探針組成。在3-探針CLPA反應(yīng)的一個優(yōu)選實施方案中，外部探針經(jīng)過設(shè)計以含有酶促擴(kuò)增引物結(jié)合位點，并且內(nèi)部探針經(jīng)過設(shè)計以跨越其他探針之間的目標(biāo)區(qū)域。在一個更優(yōu)選的實施方案中，外部探針具有不互補的反應(yīng)性基團(tuán)，以使得其在不存在內(nèi)部(中間)探針的情況下不能彼此反應(yīng)(圖3)。在一些情況下，兩個外部探針可以具有類似的反應(yīng)性部分，除了其中一個基團(tuán)在一個探針的5'末端和另一個探針的3'末端，并且L-探針化學(xué)部分除了在探針上的定位外也可比彼此類似。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，與用于2-探針CLPA系統(tǒng)的探針相比，可能需要不同化學(xué)試劑和過程來制造用于3-探針CLPA反應(yīng)的探針。在3-探針CLPA系統(tǒng)的一個優(yōu)選實施方案中，一個外部探針含有3'硫代磷酸酯(3'S-探針)，另一個外部探針含有5'-硫代磷酸酯(5'-S-探針)，并且中心探針含有3'-DABSYL和5'-DABSYL離去基。5'-DABSYL離去基探針的制造先前已有報道(Sando等人,J.Am.Chem.Soc.,(2002),124(10)2096-2097)。我們最近開發(fā)了一種新的DNA合成試劑，其允許常規(guī)并入3'-DABSYL離去基(見圖4)。在其他實施方案中并且根據(jù)本文所描述的任何CLPA方法，試驗可以在本發(fā)明的緩沖液存在下進(jìn)行。這些緩沖液詳細(xì)描述于上文中，并且緩沖液組分的任何組合都可以用于本發(fā)明的CLPA方法中。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的CLPA方法，包括下文所描述的目標(biāo)捕獲CLPA、CLPA-CE和CLPA-MDM方法，是在本發(fā)明的緩沖液中進(jìn)行，包括包含含離液陽離子(如鹽酸胍)的變性劑的緩沖液。目標(biāo)捕獲CLPA在其他實施方案中，利用兩個或更多個接合探針的CLPA試驗可以與在上游或下游結(jié)合到相同核酸目標(biāo)上的CLPA探針組上的目標(biāo)捕獲探針組合。這個目標(biāo)捕獲探針含有捕獲部分(其可以包括(但不限于)半抗原、珠粒、寡核苷酸捕獲序列等等)，這個捕獲部分可以用于選擇性地捕獲通過雜交或其他相互作用結(jié)合到目標(biāo)捕獲物上的復(fù)合物/分子(圖10)。目標(biāo)捕獲探針可以與本文所論述的CLPA的任何實施方案一起使用。也如上文進(jìn)一步詳細(xì)論述，多于一個目標(biāo)捕獲探針可以應(yīng)用于目標(biāo)核酸。這些多重目標(biāo)捕獲探針可以經(jīng)過設(shè)計以通過在目標(biāo)核酸的3'和5'末端處或接近3'和5'末端處結(jié)合或通過將目標(biāo)捕獲探針插入多重接合產(chǎn)物之間來側(cè)接一個或多個接合產(chǎn)物。如下文進(jìn)一步詳細(xì)論述，多重目標(biāo)捕獲探針可以用于評估目標(biāo)核酸(尤其RNA)的質(zhì)量/完整性的方法中。CLPA-CE在一個方面，本發(fā)明提供了使用含有可變間隔區(qū)序列的接合探針產(chǎn)生接合產(chǎn)物的方法，并且然后使用毛細(xì)管電泳檢測那些接合產(chǎn)物。在某些實施方案中，首先使用本領(lǐng)域中已知的任何方法(包括PCR)擴(kuò)增接合產(chǎn)物以產(chǎn)生擴(kuò)增子，然后使用毛細(xì)管電泳檢測這些擴(kuò)增子。在其他實施方案中，通過在篩分介質(zhì)上進(jìn)行尺寸差異毛細(xì)管電泳(CE)或通過平板凝膠電泳來檢測接合產(chǎn)物和/或擴(kuò)增子。圖1中提供CLPA-CE的示意性圖示。在這個圖中所描繪的實施方案中，通過任何適當(dāng)手段使血液樣品經(jīng)受細(xì)胞裂解，這些手段包括(但不限于)化學(xué)、機(jī)械或滲透性細(xì)胞裂解。優(yōu)選地使用化學(xué)裂解。在化學(xué)裂解之后，應(yīng)用針對目標(biāo)核酸的探針。圖6提供了用于CLPA-CE分析的探針組設(shè)計的一般示意性圖示。在這個實例中，S探針經(jīng)過設(shè)計以包括用于接合產(chǎn)物的后續(xù)擴(kuò)增的通用PCR引物。S探針還包括被設(shè)計成具有與特異性目標(biāo)序列相關(guān)聯(lián)的長度的填充序列。S探針還包括與目標(biāo)核酸的目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的目標(biāo)結(jié)合序列(在本文中也被稱為“探針結(jié)構(gòu)域”)，這個目標(biāo)核酸包含與填充序列相關(guān)聯(lián)的目標(biāo)序列。如應(yīng)了解，一組探針可以含有多個全部針對相同目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的S探針，或這組可以含有針對不同目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的S探針的混合物。同樣地，L-探針包括與目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的目標(biāo)結(jié)合序列，這個目標(biāo)結(jié)構(gòu)域與S探針?biāo)Y(jié)合的目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰。在這個實施方案中，L-探針還包括通用引物。在其他實施方案中，一個或兩個探針用熒光團(tuán)(FAM、Cy3、Cy5等等)加標(biāo)記，然而，其也可以在不加熒光標(biāo)記的情況下進(jìn)行檢測。在一些實施方案中，加標(biāo)記是通過使用加熒光標(biāo)記的PCR引物來實現(xiàn)。在圖6中所描繪的CLPA-CE探針的實施方案中，S探針還包括在5'末端的生物素部分以有助于未接合探針的純化和去除。如圖1中所示，在S-探針和L-探針與目標(biāo)核酸雜交之后，探針經(jīng)歷自發(fā)化學(xué)接合以產(chǎn)生接合產(chǎn)物。在根據(jù)圖1的一些實施方案中，使用珠粒純化步驟來去除未接合探針，不過未接合探針的去除并不是CLPA-CE方法的所有實施方案的必需步驟。在接合和任選地去除未接合探針之后，擴(kuò)增接合產(chǎn)物。在接合探針含有通用引物序列的實施方案中，通用PCR引物對用于產(chǎn)生擴(kuò)增子。在利用其他類型的引物序列的實施方案中，互補引物對可以用于產(chǎn)生擴(kuò)增子。由于一個(或在一些實施方案中為兩個)接合探針中可變間隔區(qū)序列的存在，擴(kuò)增子具有對應(yīng)于特異性目標(biāo)核酸的獨特長度。然后，使用毛細(xì)管電泳分析來分析那些擴(kuò)增子，并且每個峰的相對強(qiáng)度對應(yīng)于相對表達(dá)(圖1和圖7)。在替代實施方案中，其他適合的尺寸分離技術(shù)可以用于確定樣品中的目標(biāo)核酸表達(dá)。在其他實施方案中并且根據(jù)上述實施方案中的任一個，CLPA-CE方法包括使目標(biāo)捕獲探針與目標(biāo)核酸雜交的步驟。然后，在接合產(chǎn)物擴(kuò)增之前，通過目標(biāo)捕獲探針的捕獲部分在表面或襯底上捕獲包含目標(biāo)捕獲探針、目標(biāo)核酸和接合產(chǎn)物的所得目標(biāo)復(fù)合物。在其他實施方案中，去除未結(jié)合的目標(biāo)核酸和接合探針，只留下目標(biāo)復(fù)合物和接合產(chǎn)物。然后，根據(jù)本文所描述的任何方法擴(kuò)增并分析接合產(chǎn)物。在一些實施方案中，在使用本領(lǐng)域中已知的方法擴(kuò)增之前，從目標(biāo)復(fù)合物中移出接合產(chǎn)物，包括加熱和添加變性劑或其他試劑來改變雜交條件。CLPA-MDM在本發(fā)明的這個方面的另一個實施方案中，通過微陣列分析(CLPA-MDM)分析/檢測CLPA接合產(chǎn)物。圖2中提供CLPA-MDM的示意性圖示。CLPA-MDM與CLPA-CE的不同之處至少有以下方面。首先，探針組的設(shè)計不同。舉例來說，圖2中描繪CLPA-MDM探針組的一般圖示。如同CLPA-CE探針一樣，CLPA-MDM探針組可以包括用于接合產(chǎn)物擴(kuò)增的通用引物。其還包括目標(biāo)特異性序列，以及用于酶依賴性接合的接合部分。另外，CLPA-MDM探針還可以包括填充序列，然而，這個填充序列的目的在于將CLPA-MDM的尺寸調(diào)整到相同長度以為了使酶促擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)化。擴(kuò)增子尺寸的規(guī)格化并不是必需的，但可以提供關(guān)于擴(kuò)增效率的優(yōu)點。CLPA-CE與CLPA-MDM探針組的設(shè)計之間的第二個差異在于后者包括用于與適當(dāng)微陣列平臺一起使用的獨特陣列結(jié)合序列。關(guān)于本發(fā)明的CLPA-MDM方面，微陣列結(jié)合位點(ABS序列)被并入到探針設(shè)計中用于與“通用”微陣列平臺一起使用以供檢測。與CLPA-CE系統(tǒng)類似，探針優(yōu)選地用熒光團(tuán)加標(biāo)記，例如通過使用加熒光標(biāo)記的PCR引物?；蛘撸e例來說，夾心試驗加標(biāo)記技術(shù)可以用于最后讀出。夾心試驗涉及設(shè)計出具有代替填充序列或除填充序列以外的常見(一般)標(biāo)記結(jié)合位點(LBS)的探針并且使用將在陣列雜交步驟期間結(jié)合到這個位點上的二次探針。這種方法在需要用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(如辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的寡核苷酸)或用電化學(xué)檢測系統(tǒng)標(biāo)記陣列時尤其適用。一般來說，采用平面微陣列(例如點樣于玻璃載片或電路板上的微陣列)用于讀出。然而，還可以使用珠粒微陣列，例如可獲自Luminex和Illumina的那些珠粒微陣列(例如LuminexxMAP/xtag)。核酸質(zhì)量評估在某些方面，在用以評估核酸質(zhì)量的方法中使用相對于目標(biāo)捕獲探針在核酸目標(biāo)上的結(jié)合位置不同的多重CLPA探針組(圖11)。在圖11中所描繪的實施方案中，目標(biāo)捕獲探針與目標(biāo)核酸的一個末端雜交，并且使用由針對目標(biāo)核酸的不同目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的不同探針組產(chǎn)生的多重接合產(chǎn)物來產(chǎn)生包含目標(biāo)捕獲探針和多重接合產(chǎn)物的目標(biāo)復(fù)合物。在這些方面，由不同接合產(chǎn)物得到的信號的差異提供核酸目標(biāo)的質(zhì)量評估。舉例來說，通過測量與距目標(biāo)捕獲探針較遠(yuǎn)(例如300-1000bp遠(yuǎn))的CLPA探針組相比，由位于目標(biāo)捕獲探針最近處(例如距目標(biāo)捕獲探針1-100bp遠(yuǎn))的獨特CLPA探針組得到的捕獲效率/信號的差異，有可能推斷出核酸目標(biāo)的片段化或降解程度。在其他示例性實施方案中，對于不同CLPA探針組所產(chǎn)生的信號的相對比提供一種關(guān)于特定核酸目標(biāo)的降解程度的量度。在其他實施方案中，接合探針組經(jīng)過設(shè)計以使得其針對與目標(biāo)捕獲探針?biāo)s交的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域相距已知距離的目標(biāo)結(jié)構(gòu)域。在這些實施方案中，通過目標(biāo)捕獲探針上的捕獲部分在表面或襯底上捕獲包含目標(biāo)捕獲探針、接合產(chǎn)物和目標(biāo)核酸的目標(biāo)復(fù)合物，并且使未結(jié)合的目標(biāo)核酸和接合探針與被捕獲的目標(biāo)復(fù)合物分離。然后，與多重不同探針組相關(guān)的信號的相對比提供了樣品中的目標(biāo)核酸中所存在的降解量的指示，并且接合產(chǎn)物與目標(biāo)捕獲探針之間的已知距離提供了一種用于定量目標(biāo)核酸中的降解的“分子尺”。舉例來說，關(guān)于圖11，如果在一個示例性實施方案中，樣品中的大多數(shù)目標(biāo)核酸在位于CLPA組2和CLPA組3所雜交的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域中降解，那么由CLPA組1和2得到的信號將相對大于由CLPA組3得到的信號。信號之間的這種相對比提供了樣品中目標(biāo)核酸的長度和完整性的指示。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，不同探針組的間距將取決于原始目標(biāo)的尺寸和希望得到的信息。間距可以是相對等距的(例如3個探針組的使用大致相隔總長度的30％)，或可以根據(jù)需要聚集成群。在其他實施方案中，多重目標(biāo)捕獲探針用于核酸目標(biāo)的質(zhì)量評估。如本文進(jìn)一步論述，不同目標(biāo)捕獲探針可以經(jīng)過設(shè)計以在接近目標(biāo)核酸的末端處或在目標(biāo)核酸的末端處雜交，并且還可以或替代地經(jīng)過設(shè)計以在不同接合產(chǎn)物之間雜交。在一些實施方案中，兩個目標(biāo)捕獲探針經(jīng)過設(shè)計以與一個或多個接合產(chǎn)物上游和下游的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域雜交。兩個不同捕獲探針的使用可以幫助確保甚至在高度降解的樣品中，包含接合產(chǎn)物的所有目標(biāo)復(fù)合物都被有效捕獲于表面或襯底上并且在接合產(chǎn)物擴(kuò)增之前與未結(jié)合的目標(biāo)核酸和接合探針分離。關(guān)于降解的信息適用于評估樣品中所含的核酸并且更具體地說是RNA的質(zhì)量。這種技術(shù)尤其適用于評估福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織樣品和樣品降解的風(fēng)險較高的其他樣品中的RNA的質(zhì)量。如上文所論述，捕獲效率的差異可以通過測量信號的相對比來間接確定。這種方法可以與微陣列、CE、測序、實時PCR和其他核酸分析方法組合以根據(jù)上文所描述的任何方法進(jìn)一步評估目標(biāo)核酸。VIII.硬件在本發(fā)明的一個方面，與Liu(2006)所描述的那些類似的流體裝置用于使本發(fā)明中所描述的方法自動化。參看例如美國專利第6,942,771號，其關(guān)于組件的內(nèi)容以引用的方式并入本文中，包括(但不限于)筒、裝置、泵、孔、反應(yīng)室和檢測室。流體裝置還可以包括磁性粒子捕獲區(qū)、分離過濾器和樹脂，包括細(xì)胞分離膜(即，獲自Pall的LeukotrapTM)。這個裝置可以包括用于在實時PCR擴(kuò)增期間產(chǎn)生的熒光信號的筒內(nèi)成像的檢測室(即，SYBRgreen,Taqman,MolecularBeacons)，以及用于反應(yīng)產(chǎn)物(擴(kuò)增子和接合產(chǎn)物)的裝置上分離和檢測的毛細(xì)管電泳通道。在一個優(yōu)選實施方案中，毛細(xì)管電泳通道可以在塑料襯底上模制并且填充有篩分聚合物介質(zhì)(獲自AppliedBiosystems的POP-7TM)。含有非篩分介質(zhì)的通道也可以與經(jīng)過適當(dāng)設(shè)計的探針組一起使用。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的裝置包含液體處理組件，包括用于在每個工作站或工作站組上加載和卸載流體的組件。液體處理系統(tǒng)可以包括包含許多組件的機(jī)器人系統(tǒng)。另外，本文所概述的任何或所有步驟都可以被自動化；因此，舉例來說，系統(tǒng)可以被完全或部分自動化。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，存在多種可以使用的組件，包括(但不限于)一個或多個機(jī)器人臂；用于定位微量板的板處理機(jī)；具有筒和/或帽的固持器；用以移走并替換非交叉污染板上的孔的蓋子的自動化蓋或帽處理機(jī)；用于使用一次性吸頭進(jìn)行樣品分配的吸頭總成；用于樣品分配的可洗吸頭總成；96孔加載塊；經(jīng)過冷卻的試劑架；微量滴定板移液管位置(任選地經(jīng)過冷卻)；板和尖端的堆疊塔；以及計算機(jī)系統(tǒng)。完全機(jī)器人或微流體系統(tǒng)包括自動化液體、粒子、細(xì)胞和生物體處理，包括高通量移液以進(jìn)行篩選應(yīng)用的所有步驟。這包括液體、粒子、細(xì)胞和生物體操作，如抽吸、分配、混合、稀釋、洗滌、精確體積轉(zhuǎn)移；回收和棄去移液管吸頭；以及從單次樣品抽吸中反復(fù)吸移相同體積用于多次遞送。這些操作是無交叉污染的液體、粒子、細(xì)胞和生物體轉(zhuǎn)移。這個儀器執(zhí)行微量板樣品到過濾器、膜和/或子板的自動復(fù)制、高密度轉(zhuǎn)移、全板連續(xù)稀釋以及大容量操作。在一個優(yōu)選實施方案中，使用對試驗組分具特異性的化學(xué)衍生的粒子、板、筒、管、磁性粒子或其他固相基質(zhì)。微量板、管或任何固相基質(zhì)的結(jié)合表面包括非極性表面、高極性表面、用以促進(jìn)共價結(jié)合的修飾右旋糖苷涂層、抗體涂層、用以結(jié)合融合蛋白或肽的親和介質(zhì)、表面固定蛋白(如重組蛋白A或G)、核苷酸樹脂或涂層，并且其他親和基質(zhì)適用于本發(fā)明。在一個優(yōu)選實施方案中，用于多孔板、多管、固持器、筒、小型管、深孔板、微量離心管(microfugetube)、冷凍小瓶、方孔板、過濾器、芯片、光纖、珠粒以及其他固相基質(zhì)的平臺或具有多種容積的平臺被容納于可升級模塊化平臺上以為實現(xiàn)額外容量。這個模塊化平臺包括變速定軌振蕩器，以及用于源樣品的多位置工作臺、樣品和試劑稀釋、試驗板、樣品和試劑儲罐、移液管吸頭以及活性洗滌工作站。在一個優(yōu)選實施方案中，溫度循環(huán)器和溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)用于穩(wěn)定熱交換器(如控制塊或平臺)的溫度以提供從0℃到100℃孵育樣品的精確溫度控制；這和工作站溫度控制器一起或代替工作站溫度控制器。在一個優(yōu)選實施方案中，具有單個或多個磁性探針、親和探針或移液管的可拆卸移液頭(單通道或多通道)自動操作液體、粒子、細(xì)胞和生物體。多孔或多管磁性分離器或平臺以單個或多個樣品格局操作液體、粒子、細(xì)胞和生物體。在一些實施方案中，儀器將包括檢測器，其可以是多種不同檢測器，這取決于標(biāo)記和試驗。在一個優(yōu)選實施方案中，適用的檢測器包括具有多重?zé)晒馔ǖ赖娘@微鏡；用以提供熒光、電化學(xué)和/或電性阻抗分析儀、具有單波長和雙波長端點以及動力學(xué)性能的紫外和可見分光光度檢測、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、發(fā)光、淬滅、雙光子激發(fā)和強(qiáng)度重新分布的板讀取器；用以捕獲資料和圖像并將其轉(zhuǎn)換成可定量格式的CCD相機(jī)；毛細(xì)管電泳系統(tǒng)；質(zhì)譜儀；以及計算機(jī)工作臺。這些儀器可以在無菌層流或通風(fēng)櫥中裝配，或被密封于自備式系統(tǒng)中，用于在多孔板或管中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物生長和轉(zhuǎn)化以及用于危險操作?；罴?xì)胞可以在受控生長條件下生長，對于活細(xì)胞試驗的時序，溫度、濕度和氣體受控制。細(xì)胞的自動轉(zhuǎn)化和自動集落采集器可以有助于所需細(xì)胞的快速篩選。流式細(xì)胞測量術(shù)或毛細(xì)管電泳格局可以用于磁性珠粒和其他珠粒、粒子、細(xì)胞和生物體的個別捕獲。靈活的硬件和軟件可使儀器適用于多重應(yīng)用。軟件程序模塊可以進(jìn)行方法的創(chuàng)建、修改和運行。系統(tǒng)診斷模塊可以進(jìn)行儀器對準(zhǔn)、正確連接和電動機(jī)操作。定制工具、實驗室器皿以及液體、粒子、細(xì)胞和生物體轉(zhuǎn)移模式可使不同應(yīng)用得以進(jìn)行。資料庫可以進(jìn)行方法和參數(shù)儲存。機(jī)器人和計算機(jī)介面可使儀器之間通信。在一個優(yōu)選實施方案中，機(jī)器人設(shè)備包括與存儲器和一組輸入/輸出裝置(例如鍵盤、鼠標(biāo)、監(jiān)控器、打印機(jī)等等)通過匯流排通信的中央處理單元。此外，如下文所概述，這個中央處理單元可以和本發(fā)明的多路裝置的CPU一起或代替本發(fā)明的多路裝置的CPU。中央處理單元、存儲器、輸入/輸出裝置和匯流排之間的一般交互在本領(lǐng)域中是已知的。因此，取決于將要運作的實驗，將多種不同程序儲存于CPU存儲器中。這些機(jī)器人流體處理系統(tǒng)可以利用許多不同試劑，包括緩沖劑、試劑、樣品、洗滌劑、試驗組分(如標(biāo)記探針)等等。IX.全過程本發(fā)明方面的一個獨特優(yōu)點為將樣品(尤其用于RNA檢測)收集到穩(wěn)定緩沖液中的能力，這種穩(wěn)定緩沖液允許a)在測試之前的較長時間樣品不會降解(特別用于RNA的試驗中，因為RNA在傳統(tǒng)條件下非?？焖俚亟到?，以及b)能夠在收集緩沖液中運作試驗而不需要其他純化步驟從混合物中去除妨礙酶促試驗運作的組分，如高變性鹽濃度。將如血液等樣品直接收集到同時使細(xì)胞裂解并使RNA穩(wěn)定較長時間(例如幾天到幾周或更長時間)的緩沖液中的能力允許在試驗處理之前進(jìn)行遠(yuǎn)程收集和時間延遲。另外，這些方法由此避免了處理的任何特殊條件，例如避免熱暴露和/或冷鏈處理。舉例來說，可以收集樣品并使用普通郵件郵寄，并且在無需額外步驟的情況下進(jìn)行測試。此外，在所收集的樣品中直接試驗的能力為優(yōu)于使用樣品準(zhǔn)備步驟來純化用于傳統(tǒng)的基于酶的試驗的樣品的一個明顯益處。在其他實施方案中，在一個地理位置將樣品收集到穩(wěn)定緩沖液中，然后可以運輸?shù)讲煌乩砦恢茫蟾鶕?jù)本文所論述的本發(fā)明的任何方面和實施方案對樣品進(jìn)行試驗。換句話說，如上文所論述，本發(fā)明提供得到穩(wěn)定樣品的方法和組合物，可以在一個地理位置收集這種穩(wěn)定樣品，然后在不同地理位置對其進(jìn)行如本文所論述的化學(xué)接合方法和試驗。X.試劑盒在本發(fā)明的另一個方面，產(chǎn)生一種用于常規(guī)檢測一組預(yù)定核酸目標(biāo)的試劑盒，其利用如本文所描述的探針、技術(shù)、方法和化學(xué)接合反應(yīng)作為檢測過程的一部分。這種試劑盒可以包含探針、目標(biāo)序列、說明書、緩沖液和/或其他試驗組分。在另一個方面，本發(fā)明提供用于穩(wěn)定和檢測或定量樣品中的RNA的試劑盒，其包含含變性劑的緩沖溶液、第一接合探針和第二接合探針。在一個優(yōu)選實施方案中，變性劑選自由以下各項組成的組：鹽酸胍和異硫氰酸胍。在一個更優(yōu)選的實施方案中，緩沖溶液進(jìn)一步包含EDTA、還原劑、表面活性劑和pH緩沖劑。在特別優(yōu)選的實施方案中，還原劑選自由以下各項組成的組：DTT和巰基乙醇。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，表面活性劑選自由以下各項組成的組：TritonX-100和N-十二烷基肌氨酸鈉。在其他方面，本發(fā)明提供用于檢測目標(biāo)核酸序列的試劑盒，其中那個目標(biāo)序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域。這些試劑盒可以包括：包含6MGuHCl的2x裂解緩沖液和至少一組接合探針，其中那個至少一組接合探針包括：包括與目標(biāo)核酸序列的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第一探針結(jié)構(gòu)域的第一接合探針和包括與目標(biāo)核酸序列的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第二探針結(jié)構(gòu)域的第二接合探針。如上文進(jìn)一步論述，本發(fā)明的試劑盒中所包括的接合探針可以包括其他功能部分，包括填充序列、引物序列和錨定序列，以及其任何組合。實施例實施例1：五個目標(biāo)的定量多重檢測使用組合于一個反應(yīng)中的五(5)個DNA目標(biāo)模擬物(對應(yīng)于MOAP1(SEQIDNO:5)、PCNA(SEQIDNO:9)、DDB2(SEQIDNO:12)、BBC3(SEQIDNO:16)和BAX(SEQIDNO:19)基因的部分)在其相應(yīng)的CLPA探針(表1)(S探針和L探針，各自為1nM)存在下進(jìn)行多重CLPA反應(yīng)。如表2中所示匯集不同濃度的目標(biāo)模擬物。在50℃下將目標(biāo)模擬物、S探針和L探針于PCR緩沖液(1XPCR緩沖液為1.5mMMgCL2、50mMKCl、10mMTris-HClpH8.3)中孵育1小時。將每個反應(yīng)混合物的1μl等分試樣用作模板以使用DynamoSYBRgreenPCR混合物在通用引物(SEQIDNO1和2，300nM)存在下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對樣品進(jìn)行PCR循環(huán)，持續(xù)27個周期(95℃15分鐘，繼之以95℃(10秒)、60℃(24秒)、72℃(10秒)的27個周期)。在PCR擴(kuò)增之后，使樣品變性且注射到ABI3130DNA測序儀(毛細(xì)管電泳儀器)中。由ABI得到的對于3個樣品的CE跡線以及PCNA的峰值對比目標(biāo)模擬物濃度的繪圖示于圖7中，并且PCNA信號的線性反應(yīng)隨輸入濃度而變的繪圖示于圖8中。表1.探針和目標(biāo)序列信息*Luminex產(chǎn)品插頁MagTAG-Plex微球體L＝DABSYL接合部分S＝硫代磷酸酯部分表2.樣品濃度樣品目標(biāo)模擬物濃度1所有目標(biāo)模擬物的最終濃度為10pM2MOAP1、DDB2和BBC3為10pM，PCNA為5pM，并且BAX為2pM3MOAP1、DDB2和BBC3為10pM，PCNA為1pM，并且BAX為0.5pM實施例2：使用MOAP1和DDB2DNA和RNA目標(biāo)模擬物的CLPA反應(yīng)如表3中所呈現(xiàn)，使用MOAP1和DDB2基因的DNA或RNA目標(biāo)模擬物以及被設(shè)計成以序列為目標(biāo)的CLPA探針組一式兩份制備反應(yīng)物。探針編號指的是表1中的SEQIDNO。以表4中所示的濃度和體積添加試劑。在0.2mLPCR管中將個別的S-探針、L-探針和目標(biāo)模擬物加熱到50℃維持60分鐘，之后使用2.5μlCLPA反應(yīng)物作為具有40個擴(kuò)增周期的實時PCR反應(yīng)中的模板。將實時PCR數(shù)據(jù)對一式兩份樣品取平均值并且呈現(xiàn)于表3中(Ct值欄)。觀測到RNA與DNA目標(biāo)模擬物之間的Ct值的差異最小，從而指示在RNA和DNA襯底上具有類似探針接合效率。表3.CLPA探針組表4.試劑表-實施例1*1XPCR緩沖液為1.5mMMgCL2、50mMKCl、10mMTris-HClpH8.3實施例3：在裂解緩沖液和裂解的血液中對DDB2RNA轉(zhuǎn)錄物的直接分析使用獲自Ambion的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒和獲自O(shè)rigene的cDNA載體質(zhì)粒(SC122547)制備DDB2信使RNA(mRNA)。使用獲自Invitrogen的PicoGreenRNA試驗試劑盒測定mRNA的濃度。用加入到水中或全血中的不同濃度的DDB2mRNA轉(zhuǎn)錄物測試DDB2探針組(表5)。反應(yīng)混合物組分列于表5中。樣品1-4由在水中的10ng、1ng、0.1ng和0.01ngDDB2轉(zhuǎn)錄物組成，并且樣品5-8由加入到全血中的相同濃度范圍組成。遵循類似反應(yīng)方案，除了其中添加蛋白酶K到血液樣品中以減少蛋白質(zhì)凝固。程序如下：以表5和表6中的濃度和體積添加試劑。RNA轉(zhuǎn)錄物在后續(xù)加熱步驟之前一旦與緩沖液組合即穩(wěn)定，并且可以在這個緩沖溶液中儲存幾天，而不會觀測到RNA的任何顯著降解。將S-探針、mRNA轉(zhuǎn)錄物、鹽酸胍裂解緩沖液和水(樣品1-4)或全血(樣品5-8)加熱到80℃維持5分鐘，然后將其移到55℃加熱塊上。添加L-探針、洗滌緩沖液、抗生蛋白鏈菌素珠粒和蛋白酶K，并且在55℃下孵育反應(yīng)物60分鐘。從加熱塊上移走樣品，并且使用dynalMPC96S磁性捕獲板捕獲磁性珠粒。去除上清液并且用洗滌緩沖液洗滌珠粒3次。將DyNamoSYBRgreenPCR主混合物(25ul，1x)和通用引物(SEQIDNO1和2，300nM)添加到珠粒中，并且使用StratageneMX4000實時PCR儀器對樣品進(jìn)行熱循環(huán)，持續(xù)30個周期(95℃維持15分鐘，95℃(10秒)、60℃(24秒)、72℃(10秒)的30個周期)。記錄Ct值并且將擴(kuò)增的樣品注射到AgilentBioanalyzer2100中以校驗擴(kuò)增子的長度。所有擴(kuò)增子都顯示出正確的尺寸(約96bp)并且性能對于血液和水樣品來說是相當(dāng)?shù)?，從而展示了在裂解的血液中直接分析RNA的能力。結(jié)果概述于下表7中。在額外實驗中顯示，RNA轉(zhuǎn)錄物在初始加熱步驟之前儲存于緩沖溶液中的時間長度(從幾分鐘到幾小時并且甚至長達(dá)幾天)不會顯著改變表7中所概述的結(jié)果。表5.CLPA探針組。樣品識別符L-探針(1nM)S-探針(1nM)RNA轉(zhuǎn)錄物1-8DDB2SEQIDNO:10SEQIDNO:11Origene質(zhì)粒SC122547表6.DDB2反應(yīng)混合物。a)GuHCL裂解緩沖液(1X)為3MGUHCL、20mMEDTA、5mMDTT、1.5％Triton、30mMTrispH7.2)。b)洗滌緩沖液為100mMTris(pH7.4)、0.01％Triton。表7.水對比血液的結(jié)果概述試驗DDB2濃度Ct值樣品110ng13.5水21ng17水30.1ng20.2水40.01ng24水510ng13.5血液61ng16血液70.1ng19.2血液80.01ng23.5血液實施例4：3-探針CLPA-CE試驗如表8中所呈現(xiàn)，使用DNA目標(biāo)模擬物探針SEQIDNO24和3-探針CLPA探針組(SEQIDNO20、21和22)一式兩份制備反應(yīng)物。探針編號指的是表1中的SEQIDNO。以表9中的濃度和體積添加試劑。在0.2mLPCR管中將S-探針、L-探針和目標(biāo)模擬物立即加熱到50℃維持60分鐘，之后使用2.5μlCLPA反應(yīng)物作為具有25個擴(kuò)增周期的DynamoSYBRgreenPCR反應(yīng)中的模板。將實時PCR數(shù)據(jù)對一式兩份樣品取平均值并且呈現(xiàn)于表8中(Ct值欄)。然后，經(jīng)由AgilentBioanalyzer2100分析每個反應(yīng)的1μl樣品以確定反應(yīng)產(chǎn)物的尺寸。表8.CLPA探針組探針濃度為1nM；目標(biāo)模擬物濃度為10pM。表9.試劑表-實施例4*1XPCR緩沖液為1.5mMMgCL2、50mMKCl、10mMTris-HClpH8.3實施例5：mRNA的多重實時CLPA檢測向0.2mlPCR管中添加4組CLPA試劑，其經(jīng)過工程改造以對于不同色彩雙重標(biāo)記的探針具有獨特結(jié)合位點。如表10和表11所指示制備反應(yīng)物。CLPA探針組和雙重標(biāo)記的探針對應(yīng)于表1中的SEQIDNO25到36。將S和失控轉(zhuǎn)錄物mRNA(GAPDH、PCNA和DDB2)添加到2X裂解緩沖液中(GuHCL裂解緩沖液(1X)為3MGUHCL、20mMEDTA、5mMDTT、1.5％Triton、30mMTrispH7.2)。mRNA轉(zhuǎn)錄物在后續(xù)加熱步驟之前一旦與緩沖液組合即穩(wěn)定，并且可以在這個緩沖溶液中儲存幾天，而不會觀測到RNA的任何顯著降解。然后，將溶液加熱到80℃維持5分鐘。在冰上冷卻樣品，并且添加抗生蛋白鏈菌素涂布的磁性珠粒(DYNALM-270)和L-探針。在50℃下加熱樣品1小時。在DYNALMPC板上捕獲磁性珠粒并且用洗滌緩沖液洗滌兩次。再捕獲珠粒，并且添加dynamoPCR1x主混合物與4個不同雙重標(biāo)記的探針和通用PCR引物(25ul總體積)。使用StratageneMX4000實時PCR儀器對樣品進(jìn)行熱循環(huán)，持續(xù)30個周期(95℃維持15分鐘，95℃(10秒)、60℃(24秒)、72℃(10秒)的30個周期)，使用適當(dāng)濾波器監(jiān)測FAM、CalFluororange560、CalFluorRed610和Quasar670通道中的熒光。記錄針對每個通道所觀測到的Ct值并且在表10中指示。表10.實施例5中所使用的多重試劑。表11.實施例5中所使用的額外試劑GuHCL裂解緩沖液(2X)12.5μlS-探針(各0.25nM儲備液)5μlmRNA(250ngtRNA+/-mRNA)5μl水2.5μl在80℃下加熱5分鐘，在冰上冷卻水18μlL-探針(各0.25nm儲備液)5μl珠粒2μl總計50μl在50℃下孵育1小時實施例6：福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)CLPA試驗方案：1.將含有400pM每個S探針(序列ID47、49、51、53和55)和25ulTE緩沖液的25ulCLPA裂解緩沖液(6MGuHCl、40mMEDTA、10mMDTT、3％TritonX-100、100mMTrispH7.5)添加到200ulPCR管中。2.使用切片機(jī)刀片(Leica,RM2155)將福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織塊切成5微米的厚度并且固定在病理學(xué)玻璃載片上。從玻璃載片上刮下具有2mm×5mm×5μm的適當(dāng)尺寸的FFPE樣品并且添加到PCR管中。3.在55℃下在水浴超聲發(fā)生器(BransonUltrasonics)中于50Hz下對含有FFPE樣品和裂解緩沖液的PCR管超聲處理5分鐘。4.從超聲處理浴中移出管，并且在混合下添加40ul蛋白酶K溶液(2.5mg/ml)和10ulL-探針溶液(每個探針1nM，序列ID46、48、50、52和54)。5.在55℃下將管孵育3小時。6.從加熱塊上移走樣品，并且使用臺式搖擺轉(zhuǎn)子離心機(jī)使樣品以3000rpm離心1分鐘。7.僅僅將上清液轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。8.添加2.0ulInvitrogen/DynalM-270抗生蛋白鏈菌素涂布的磁性珠粒，混合并孵育樣品5分鐘。9.使用DynalMPC96-S磁性板捕獲珠粒，并且去除上清液。10.用200ul洗滌緩沖液(100mMtris緩沖液，pH7.0)洗滌珠粒2次。11.棄去最終洗滌液，并且使珠粒再懸浮于10ulDynamoF-450Taq聚合酶主混合物(Finnzymes)和10ulPCR引物組(各600nM，序列ID56和23)中。12.然后，根據(jù)以下方案對樣品進(jìn)行熱循環(huán)：95℃10分鐘勻變；28個PCR周期：94℃維持10秒；60℃維持20秒；72℃維持20秒。13.在熱循環(huán)完成時，將1ul核酸外切酶添加到每個PCR反應(yīng)管中，并且在37℃下孵育樣品20分鐘，之后在95C下孵育2分鐘。14.從每個孔中移出2.5ulPCR反應(yīng)物并且添加到22.5ulLuminex珠?；旌衔镏小uminex珠?；旌衔镏苽淙缦?。針對每個反應(yīng)組合每組2500個微球體(珠粒66、63、68、12和72)。在1.1xTm雜交緩沖液中通過渦旋和超聲處理約20秒將MagPlex-TAG微球體混合物稀釋/濃縮到每uL每個微球體組有111個。15.然后使用熱混合器于攪拌下在95℃下孵育樣品1.5分鐘，然后在37℃下孵育1小時。16.通過在1xTm緩沖液(0.2MNaCl、0.1MTris、0.08％TritonX-100，pH8.0)中將SAPE稀釋到10ug/mL來制備報道體混合物。17.添加100ul報道體混合物到每個孔中。緩緩混合。18.在37℃下孵育15分鐘。19.然后，根據(jù)制造商的方案在Luminex儀器上運作MagTag試驗。結(jié)果示于圖9中。實施例7：目標(biāo)捕獲CLPA血液試驗在0.2mlPCR管中，將25ul全血與25ul2xGuHCl裂解緩沖液混合。使樣品短暫渦旋。向這個管中添加25ul含有2.0nM目標(biāo)捕獲探針(TC)和2.0nMS-探針的溶液。將溶液混合并加熱到80℃維持5分鐘，然后冷卻到55℃。在55℃下，添加50ul含有1.0nML-探針和2mg/ml蛋白酶K的溶液。S-探針、L-探針和TC探針序列列于表1中，序列ID37-45。將溶液混合并加熱到55℃維持30分鐘。30分鐘后，添加2ulM-270抗生蛋白鏈菌素涂布的磁性珠粒。通過緩緩移液將樣品混合，之后在55℃下孵育5分鐘以上。從熱血中移出樣品并且立即放置到96孔磁選機(jī)板(Dynal)上。15秒后，完全去除上清液。用180ul洗滌緩沖液(100mMtris緩沖液，pH7.4，0.01％triton)洗滌珠粒3次。去除緩沖液，并且添加含有300nM引物1和2中的每一個的PCR混合物。對樣品進(jìn)行熱循環(huán)，持續(xù)28個周期(95℃2分鐘，94℃(10秒)、60℃(20秒)和72℃(20秒)的28個周期)。在熱循環(huán)之后，將2.0ulPCR產(chǎn)物與1ulABIGenescan600V2尺寸標(biāo)準(zhǔn)物和17ul甲酰胺混合。將樣品加熱到95℃維持5分鐘，然后放置在ABI3500毛細(xì)管電泳儀器上以供分析。在CE跡線上在110-200個堿基對范圍內(nèi)僅僅觀測到3個峰?；虺叽绶甯?RFU)MRPS513730000PCNA14628000CDR21874000表13：實施例7的結(jié)果本說明書提供了本發(fā)明所描述的技術(shù)的示例性方面的方法、系統(tǒng)和/或結(jié)構(gòu)以及其用途的全面描述。盡管上文已經(jīng)在某種程度上具體地描述或參考一個或多個個別方面描述這種技術(shù)的多個方面，但本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離其技術(shù)的精神或范圍的情況下可以對所披露的方面作出眾多變更。因為在不背離本發(fā)明所描述的技術(shù)的精神和范圍的情況下可以獲得許多方面，所以適當(dāng)范圍處于上文所附的權(quán)利要求書中。因此涵蓋其他方面。此外，應(yīng)了解，除非另有明確要求或權(quán)利要求書的語言固有地必需要有特定順序，否則任何操作都可以按任何順序進(jìn)行。上述描述中所含和隨附圖式中所示的所有事項都打算被解釋為只是特定方面的說明并且不限于所示出的實施方案。除非上下文另外明確表明或有明確規(guī)定，否則本文所提供的任何濃度值一般都按照混合值或百分比給出，而不考慮在添加混合物的特定組分之時或之后發(fā)生的任何轉(zhuǎn)化。對于尚未明確并入本文中來說，本披露中所提到的所有公開參考文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。在不背離如以上權(quán)利要求書中所定義的本發(fā)明技術(shù)的基本要素的情況下可以作出細(xì)節(jié)或結(jié)構(gòu)的改變。本發(fā)明的實施方案如下：實施方案1.一種檢測樣品中的多個不同目標(biāo)核酸的方法，其中每個目標(biāo)核酸包含與第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和位于所述第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域上游或下游的第三目標(biāo)捕獲結(jié)構(gòu)域，所述方法包含：(a)提供多個接合襯底，各自包含：(i)所述目標(biāo)核酸中的一種；(ii)第一組接合探針，包含：(A)第一核酸接合探針，包含：(1)與所述一個目標(biāo)核酸序列的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第一探針結(jié)構(gòu)域；(2)5'-接合部分；以及(B)第二核酸接合探針，包含：(1)與所述一個目標(biāo)核酸序列的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第二探針結(jié)構(gòu)域；以及(2)3'接合部分；(b)在不使用接合酶的情況下接合所述第一接合探針和第二接合探針以形成第一多個接合產(chǎn)物；(c)使包含捕獲部分的目標(biāo)捕獲探針與所述目標(biāo)核酸的所述第三目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交以形成目標(biāo)復(fù)合物；(d)使用所述捕獲部分在表面上捕獲所述目標(biāo)復(fù)合物；(e)擴(kuò)增所述接合產(chǎn)物以形成擴(kuò)增子；(f)檢測所述擴(kuò)增子，從而檢測所述目標(biāo)核酸。實施方案2.根據(jù)實施方案1所述的方法，其中：所述目標(biāo)核酸進(jìn)一步包含與第五目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰的第四目標(biāo)結(jié)構(gòu)域；所述多個接合襯底各自進(jìn)一步包含第二組接合探針，所述第二組接合探針包含與所述第四目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第三核酸接合探針和與所述第五目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第四核酸接合探針；所述方法進(jìn)一步包含在不存在接合酶的情況下接合所述第三接合探針和第四接合探針以使得所述一個目標(biāo)核酸序列包含多重接合產(chǎn)物；并且所述檢測步驟(f)包含檢測由所述多重接合產(chǎn)物產(chǎn)生的擴(kuò)增子。實施方案3.根據(jù)實施方案2所述的方法，其中所述目標(biāo)核酸進(jìn)一步包含與第七目標(biāo)結(jié)構(gòu)域相鄰的第六目標(biāo)結(jié)構(gòu)域；所述多個接合襯底各自進(jìn)一步包含第三組接合探針，所述第三組接合探針包含與所述第六目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第五核酸接合探針和與所述第七目標(biāo)結(jié)構(gòu)域雜交的第六核酸接合探針；所述方法進(jìn)一步包含在不存在接合酶的情況下接合所述第三接合探針和第四接合探針以使得所述一個目標(biāo)核酸序列包含多重接合產(chǎn)物。實施方案4.根據(jù)實施方案1至3所述的方法，其中所述接合探針中的每一個進(jìn)一步包含引物序列。實施方案5.根據(jù)實施方案1至4所述的方法，其中每組接合探針的所述接合探針中的至少一個進(jìn)一步包含可變間隔區(qū)序列以使得所述擴(kuò)增子具有目標(biāo)特定長度。實施方案6.根據(jù)實施方案1至5所述的方法，其中每組接合探針中僅有一個接合探針包含所述可變間隔區(qū)序列。實施方案7.根據(jù)實施方案5至6所述的方法，其中所述可變間隔區(qū)序列含于所述接合探針的所述探針結(jié)構(gòu)域與所述引物之間。實施方案8.根據(jù)實施方案1至7所述的方法，其中所述目標(biāo)捕獲探針的所述捕獲部分包含選自以下各項的成員：捕獲核酸序列、珠粒和結(jié)合搭配物對的結(jié)合搭配物。實施方案9.根據(jù)實施方案1至8所述的方法，其中所述5'接合部分包含DABSYL并且所述3'接合部分包含硫代磷酸酯。實施方案10.根據(jù)實施方案1至9所述的方法，其中所述3'接合部分包含DABSYL。實施方案11.根據(jù)實施方案1至10所述的方法，其中所述樣品被收集到包含鹽酸胍(GuHCl)的緩沖液中。實施方案12.根據(jù)實施方案11所述的方法，其中所述樣品為血液。實施方案13.根據(jù)實施方案1至12所述的方法，其中所述目標(biāo)核酸包含DNA或RNA。實施方案14.根據(jù)實施方案1至13所述的方法，其中所述檢測步驟(f)利用選自由以下各項組成的組的技術(shù)：毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜分析、微陣列分析、測序、實時PCR、光學(xué)檢測、熒光檢測、生物發(fā)光檢測、化學(xué)發(fā)光檢測、電化學(xué)檢測、電化學(xué)發(fā)光檢測和側(cè)向流檢測。實施方案15.根據(jù)實施方案1至14所述的方法，其中所述雜交步驟(c)與所述接合步驟(b)同時進(jìn)行。實施方案16.一種檢測樣品中的多個不同目標(biāo)核酸的方法，其中每個目標(biāo)序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，所述方法包含：a)提供多個接合襯底，各自包含：i)所述不同目標(biāo)核酸中的一種；ii)第一核酸接合探針，包含：1)與所述一個目標(biāo)核酸的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第一探針結(jié)構(gòu)域；2)第一引物序列；以及3)5'-接合部分；以及iii)第二核酸接合探針，包含：1)與所述一個目標(biāo)核酸的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第二探針結(jié)構(gòu)域；2)第二引物序列；以及3)3'接合部分；其中所述接合探針中的一個包含可變間隔區(qū)序列；以及b)在不存在接合酶的情況下接合所述第一接合探針和第二接合探針以形成多個不同接合產(chǎn)物，其中不同接合產(chǎn)物具有不同目標(biāo)特定長度；c)擴(kuò)增所述接合產(chǎn)物；以及d)以所述不同目標(biāo)長度為基礎(chǔ)檢測所述不同接合產(chǎn)物的存在。實施方案17.根據(jù)實施方案16所述的方法，其中所述目標(biāo)核酸序列為RNA。實施方案18.根據(jù)實施方案16所述的方法，其中所述核酸目標(biāo)序列為DNA。實施方案19.根據(jù)實施方案16、17或18所述的方法，其中所述樣品來源于血液。實施方案20.根據(jù)實施方案16、17或18所述的方法，其中所述樣品來源于石蠟包埋樣品。實施方案21.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述檢測是通過毛細(xì)管電泳。實施方案22.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述檢測是通過質(zhì)譜分析。實施方案23.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述第一引物中的每一個是相同的并且所述第二引物中的每一個是相同的。實施方案24.一種用于檢測目標(biāo)核酸序列的試劑盒，其中所述目標(biāo)序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，所述試劑盒包含：a)包含6MGuHCl的2X裂解緩沖液；b)第一接合探針，包含：i)與所述第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第一探針結(jié)構(gòu)域；ii)第一引物序列；以及III)5'-接合部分；以及c)第二核酸接合探針，包含：i)與所述第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第二探針結(jié)構(gòu)域；ii)第二引物序列；以及iii)3'接合部分。實施方案25.根據(jù)實施方案24所述的試劑盒，其中所述接合探針中的一個進(jìn)一步包含可變間隔區(qū)序列。實施方案26.一種檢測樣品中的多個不同目標(biāo)核酸的方法，其中每個目標(biāo)序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，所述方法包含：a)提供包含以下各項的反應(yīng)混合物：i)包含血液的目標(biāo)樣品；以及ii)包含3MGuHCl的1X裂解緩沖液；b)使所述反應(yīng)混合物與多個不同探針組接觸，每個探針組包含：i)第一接合探針，包含：1)與所述一個目標(biāo)核酸的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第一探針結(jié)構(gòu)域；2)第一引物序列；以及3)5'-接合部分；以及iii)第二核酸接合探針，包含：1)與所述一個目標(biāo)核酸的第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域互補的第二探針結(jié)構(gòu)域；2)第二引物序列；以及3)3'接合部分；c)在不存在接合酶的情況下接合所述第一接合探針和第二接合探針以形成多個不同接合產(chǎn)物；d)擴(kuò)增所述不同接合產(chǎn)物；以及e)檢測所述接合產(chǎn)物的存在。實施方案27.根據(jù)實施方案26所述的方法，其中所述接合探針中的一個進(jìn)一步包含可變間隔區(qū)序列。實施方案28.根據(jù)實施方案26或27所述的方法，其中所述目標(biāo)核酸為RNA。實施方案29.根據(jù)實施方案27或28所述的方法，其中所述第一接合探針和第二接合探針中的一個進(jìn)一步包含結(jié)合搭配物對中的一種，并且在所述擴(kuò)增之前，添加包含另一個結(jié)合對的珠粒以捕獲所述接合產(chǎn)物。實施方案30.根據(jù)實施方案27、28或29所述的方法，其中所述檢測是使用所述可變間隔區(qū)序列來完成。實施方案31.一種檢測樣品中的多個目標(biāo)RNA序列的方法，其中每個目標(biāo)核酸序列包含相鄰的第一目標(biāo)結(jié)構(gòu)域和第二目標(biāo)結(jié)構(gòu)域以及第三目標(biāo)結(jié)構(gòu)域，所述方法包含：(a)將樣品收集到緩沖液中以形成穩(wěn)定樣品；(b)根據(jù)實施方案1在所述穩(wěn)定樣品中進(jìn)行試驗以檢測所述多個目標(biāo)核酸。實施方案32.根據(jù)實施方案31所述的方法，其中所述樣品在環(huán)境室溫下穩(wěn)定至少1周。當(dāng)前第1頁1 2 3