交叉參考

本申請要求于2014年8月19日提交的美國臨時申請?zhí)?2/039,207的利益，所述申請通過引用并入本文。

發(fā)明背景

小的非編碼rna在許多生物中充當重要的基因表達調節(jié)劑。he等人，natrevgenetics2004，5（7）:522-31。例如，已在植物和動物，包括人、小鼠、果蠅（drosophila）和秀麗隱桿線蟲（c.elegans）中鑒定了幾百種微小rna（mirna）（bino等人，2004，plosbiol.2（11）:e363）。具體地，已顯示單鏈mirna與不同人類疾病相關，例如生物過程如細胞凋亡、增殖、上皮細胞形態(tài)發(fā)生、神經和肌肉細胞分化中的缺陷，脂肪/膽固醇/葡萄糖穩(wěn)態(tài)和病毒感染相關。參見例如，esquela-kerschera&slackfj，nat.rev.cancer，2006，6（4）:259-69；michael等人，mol.cancerres.，2003，1（12）:882-91；dimmelers&nicoterap，embomol.med.2013，5（2）:180-90。近期發(fā)現(xiàn)提示影響這些過程的許多mirna在循環(huán)系統(tǒng)中是豐富和穩(wěn)定的，這使得mirna和其他類似的調節(jié)性小非編碼rna是用于疾病診斷和鑒定的無價生物標記物，以及潛在的治療靶。brasejc等人，mol.cancer2010，26（9）:306；chen等人，cellres.2008，18（10）:997-1006。

然而，小rna（包括微小rna）由于許多原因而難以檢測和定量。首先，小rna很短；例如，微小rna通常約20個核苷酸長，這大致是常規(guī)pcr引物的長度。這使得pcr擴增非常困難，所述pcr擴增是用于檢測和定量的重要方法。其次，許多小rna密切相關；例如，相同mirna家族的許多成員是非常保守的，并且有時僅相差一個核苷酸。這使得準確分析特定小rna的影響變得困難。

已設計了幾種常規(guī)技術來滿足這種需要，并且所有這些技術都具有許多嚴重的缺點。例如，第一種方法是基于莖環(huán)的rt-pcr。chen等人，nucleicacidsres.2005，33（20）:e179。在該方法中，莖環(huán)形狀的rt引物結合mirna的最后6個核苷酸并生成延長的cdna。然后通過mirna特異性正向引物和通用反向引物擴增該延長的cdna。在rt-pcr期間，推測通過taqman探針確保定量的準確性。然而，使用該方法的缺點是缺乏特異性，因為用戶不能利用解鏈曲線分析來控制特異性。此外，taqman探針結合由rt引物貢獻的序列，其不一定是mirna獨有的。

第二種方法利用對mirna的聚a尾部，并且使用加上標簽的聚t引物用于rt。shi等人，biotechniques2005，39（4）:519-25。然而，使用這種方法的缺點是多方面的。首先，具有共同3'端的小rna可能被錯誤地聚腺苷酸化。其次，聚腺苷酸化的效率是未知的。第三，在小rna端的2'-氧甲基修飾阻斷該多聚腺苷酸化。例如，植物mirna攜帶這種2-氧甲基修飾。因此，存在可以解決這些缺點中的一個或多個的替代系統(tǒng)的相當大的需求。

發(fā)明概述

能夠特異性、準確地和/或廉價地檢測和/或定量小的非編碼rna的有利系統(tǒng)和/或方法將克服上述技術障礙中的一個或多個。這樣的系統(tǒng)和/或方法將極大地促進利用小的非編碼rna用于診斷或其他臨床應用的全部潛力。

相應地，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法、組合物、反應混合物、試劑盒和/或系統(tǒng)。這些方法、組合物、反應混合物、試劑盒和/或系統(tǒng)可特別用于檢測短核酸。在一個方面，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法，所述方法包括使樣品在反應混合物中在產生關于靶多核苷酸區(qū)域的完全序列的條件下經歷核酸擴增反應，其中所述反應混合物包含：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列d和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a與靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）環(huán)引物的序列b與靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；和（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸從5'至3'延伸環(huán)引物的序列b，所述靶多核苷酸充當用于模板引導的引物延伸的模板，以產生靶多核苷酸的互補序列。

在一個實施方案中，所述方法還包括在反向引物和任選正向引物存在下，擴增樣品中關于靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列，其中反向引物和正向引物顯示出與擴增產物和環(huán)引物的序列互補性。在一些實施方案中，正向引物與接頭序列中的序列特異性雜交。在一些實施方案中，反向引物與序列特異性雜交，所述序列與相對于序列a'或b'為5'的靶多核苷酸的一部分互補。在一些實施方案中，所述方法進一步包括檢測產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的核酸擴增產物。在一些實施方案中，檢測步驟包括檢測來自反應混合物中與產物具有序列互補性的探針的信號。在一些實施方案中，序列a為長度2nt至約10nt，并且序列b為長度2nt至約10nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度為約5nt至約20nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度足以與靶多核苷酸特異性雜交，以實現(xiàn)環(huán)引物的延伸。在一些實施方案中，當最佳比對時，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少80%互補。在一些實施方案中，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少90%互補。在一些實施方案中，序列a'的3'端在序列b'的1nt至約5nt內。在一些實施方案中，接頭序列包含選自下述的一種或多種序列元件：一種或多種條形碼序列、一種或多種限制性酶識別序列、一種或多種寡核苷酸探針結合序列或其互補體、一種或多種測序引物退火序列或其互補體、以及這些序列的組合。在一些實施方案中，接頭序列包含多種不同環(huán)引物共有的通用序列。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法，所述方法包括使樣品在產生關于靶多核苷酸區(qū)域的完全序列的條件下，經歷具有環(huán)引物、正向引物、反向引物和聚合酶的核酸擴增反應，其中所述反應混合物包含：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列d和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a與靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）序列b與靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸從5'至3'延伸環(huán)引物的序列b，所述靶多核苷酸充當用于模板引導的引物延伸的模板，以產生靶多核苷酸的互補序列；（c）反向引物，其顯示出與相對于序列a'或b'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其與和環(huán)引物互補的序列特異性雜交。在一個實施方案中，所述方法進一步包括檢測核酸擴增的產物。在一些實施方案中，檢測步驟包括檢測來自反應混合物中與產物具有序列互補性的探針的信號。在一些實施方案中，序列a為長度2nt至約10nt，并且序列b為長度2nt至約10nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度為約5nt至約20nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度足以與靶多核苷酸特異性雜交，以實現(xiàn)環(huán)引物的延伸。在一些實施方案中，當最佳比對時，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少80%互補。在一些實施方案中，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少90%互補。在一些實施方案中，序列a'的3'端在序列b'的1nt至約5nt內。在一些實施方案中，接頭序列包含選自下述的一種或多種序列元件：一種或多種條形碼序列、一種或多種限制性酶識別序列、一種或多種寡核苷酸探針結合序列或其互補體、一種或多種測序引物退火序列或其互補體、以及這些序列的組合。在一些實施方案中，接頭序列包含多種不同環(huán)引物共有的通用序列。

在一些實施方案中，所述方法包括在單一反應混合物中在產生關于靶多核苷酸區(qū)域的完全序列的條件下，產生關于靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列，其中所述反應混合物包含：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列d和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a與靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）序列b與靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸從5'至3'延伸環(huán)引物的序列b，所述靶多核苷酸充當用于模板引導的引物延伸的模板，以產生靶多核苷酸的互補序列；（c）反向引物，其顯示出與相對于序列a'或b'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其與和環(huán)引物互補的序列特異性雜交。

在一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中少數(shù)等位基因的存在的方法，所述少數(shù)等位基因是與在單個堿基位置處更豐富的相應等位基因不同的序列變體?？稍谙嗤姆磻虿煌姆磻袡z測不同的等位基因，其中使用對于等位基因之一特異性的環(huán)引物檢測每個等位基因。在一個實施方案中，所述方法包括使樣品在反應混合物中在擴增少數(shù)等位基因和包含序列變體的更豐富的等位基因的區(qū)域的條件下，經歷使用一對環(huán)引物的核酸擴增反應，其中反應混合物包含：（a）第一環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'到3'定向的序列a1、接頭序列d1和序列b1；其中所述第一環(huán)引物經由下述與少數(shù)等位基因特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a1與少數(shù)等位基因上的序列a1'之間的序列互補性，和（ii）環(huán)引物的序列b1與少數(shù)等位基因上的序列b1'之間的序列互補性，其中序列a1'和序列b1'在少數(shù)等位基因上5'至3'定向；（b）第二環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a2、接頭序列d2和序列b2；其中所述第二環(huán)引物經由下述與更豐富的等位基因特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a2與更豐富的等位基因上的序列a2'之間的序列互補性，和（ii）環(huán)引物的序列b2與少數(shù)等位基因上的序列b2'之間的序列互補性，其中序列a2'和序列b2'在更豐富的等位基因上的5'至3'定向；和（c）聚合酶，其將第一和第二環(huán)引物的序列b1和序列b2沿分別的等位基因從5'延伸至3'，所述等位基因充當模板引導的引物延伸的模板，以產生分別的等位基因的互補序列。在另一個實施方案中，所述方法包括使樣品的一部分在反應混合物中在擴增少數(shù)等位基因和包含序列變體的更豐富的等位基因的區(qū)域的條件下，經歷使用一對環(huán)引物的核酸擴增反應；其中第一反應混合物包含第一環(huán)引物和聚合酶，第二反應混合物包含第二環(huán)引物和聚合酶，并且進一步地其中：（a）第一環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'到3'定向的序列a1、接頭序列d1和序列b1；其中所述第一環(huán)引物經由下述與少數(shù)等位基因特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a1與少數(shù)等位基因上的序列a1'之間的序列互補性，和（ii）環(huán)引物的序列b1與少數(shù)等位基因上的序列b1'之間的序列互補性，其中序列a1'和序列b1'在少數(shù)等位基因上5'至3'定向；（b）第二環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a2、接頭序列d2和序列b2；其中所述第二環(huán)引物經由下述與更豐富的等位基因特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a2與更豐富的等位基因上的序列a2'之間的序列互補性，和（ii）環(huán)引物的序列b2與少數(shù)等位基因上的序列b2'之間的序列互補性，其中序列a2'和序列b2'在更豐富的等位基因上的5'至3'定向；和（c）聚合酶，其將第一或第二環(huán)引物的序列b1或序列b2沿分別的等位基因從5'延伸至3'，所述等位基因充當模板引導的引物延伸的模板，以產生分別的等位基因的互補序列。在一些實施方案中，兩個等位基因在其上不同的單堿基位置由a1/a2或b1/b2跨越。在一些實施方案中，兩個等位基因在兩個位置不同，其中一個位置由a1/a2跨越，并且第二位置由b1/b2跨越。d1的序列可以與d2的序列相同或不同。當d1和d2的序列不同時，第一和第二環(huán)引物的擴增產物可以被選擇性擴增和/或檢測。使用所述一對環(huán)引物產生的擴增產物的擴增和檢測可以根據(jù)本文所述的任何合適的方法執(zhí)行。

在實踐本文公開的任何方法中，靶多核苷酸可以是dna分子。在一些實施方案中，靶多核苷酸是rna分子。在一些實施方案中，靶多核苷酸是非編碼rna分子。在一些實施方案中，非編碼rna分子選自：成熟微小rna分子、前體微小rna分子、初級微小rna分子、sirna分子、pirna分子、piwirna、lncrna、rrna和shrna分子。在一些實施方案中，靶多核苷酸長度小于100nt。在一些實施方案中，靶多核苷酸長度小于50nt。

在另一個方面，本發(fā)明提供了基于一對環(huán)引物的單核變異的測試，所述一對環(huán)引物在序列a和b中的一個堿基位置中不同，使得一個識別靶序列的一個等位基因，并且另一個識別靶序列的不同等位基因。環(huán)引物在環(huán)序列d中也不同，并且可以被選擇性擴增和/或檢測。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的組合物，所述組合物包含環(huán)引物、正向引物和反向引物，其中：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）序列a和靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）序列b和靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）反向引物，其顯示出與相對于序列a'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（c）正向引物，其與接頭序列中的序列特異性雜交。在一個實施方案中，組合物進一步包含與通過反向引物或正向引物的延伸產生的靶多核苷酸的互補序列具有序列互補性的檢測探針。在一些實施方案中，序列a為長度2nt至約10nt，并且序列b為長度2nt至約10nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度為約5nt至約20nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度足以與靶多核苷酸特異性雜交，以實現(xiàn)環(huán)引物的延伸。在一些實施方案中，當最佳比對時，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少80%互補。在一些實施方案中，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少90%互補。在一些實施方案中，序列a'的3'端在序列b'的1nt至約5nt內。在一些實施方案中，靶多核苷酸可以是dna分子。在一些實施方案中，靶多核苷酸是rna分子。在一些實施方案中，當用于主題組合物中時，靶多核苷酸是非編碼rna分子。在一些實施方案中，非編碼rna分子選自：成熟微小rna分子、前體微小rna分子、初級微小rna分子、sirna分子、pirna分子、piwirna、lncrna、rrna和shrna分子。在一些實施方案中，接頭序列包含選自下述的一種或多種序列元件：一種或多種條形碼序列、一種或多種限制性酶識別序列、一種或多種寡核苷酸探針結合序列或其互補體、一種或多種測序引物退火序列或其互補體、以及這些序列的組合。在一些實施方案中，接頭序列包含多種不同環(huán)引物共有的通用序列。

在一些實施方案中，用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的組合物在容器中。在一些實施方案中，容器是孔、板、管、室、流動池或芯片。在一些實施方案中，用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的組合物是脫水形式。在一些實施方案中，用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的組合物是試劑盒的形式。在一些實施方案中，本公開內容提供了使用試劑盒形式的組合物用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法，所述方法包括在包含靶多核苷酸、環(huán)引物、正向引物、反向引物和聚合酶的反應混合物中執(zhí)行核酸擴增反應，以獲得可檢測量的擴增子，其中所述靶多核苷酸長度小于約100nt。在一些實施方案中，使用試劑盒形式的組合物用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法進一步包括在包含靶多核苷酸、環(huán)引物、正向引物、反向引物和聚合酶的反應混合物中執(zhí)行核酸擴增反應，以獲得可檢測量的擴增子，其中所述靶多核苷酸長度小于約100nt，并且擴增反應具有小于30的循環(huán)閾值（ct）。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的反應混合物，所述反應混合物包含環(huán)引物、正向引物、反向引物和聚合酶，其中：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）序列a和靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）序列b和靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）反向引物，其顯示與相對于序列a'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（c）正向引物，其與接頭序列中的序列特異性雜交。在一個實施方案中，反應混合物進一步包含與通過反向引物或正向引物的延伸產生的靶多核苷酸的互補序列具有序列互補性的檢測探針。在一些實施方案中，序列a為長度2nt至約10nt，并且序列b為長度2nt至約10nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度為約5nt至約20nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度足以與靶多核苷酸特異性雜交，以實現(xiàn)環(huán)引物的延伸。在一些實施方案中，當最佳比對時，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少80%互補。在一些實施方案中，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少90%互補。在一些實施方案中，序列a'的3'端在序列b'的1nt至約5nt內。在一些實施方案中，靶多核苷酸是dna分子。在一些實施方案中，靶多核苷酸是rna分子。在一些實施方案中，當用于主題組合物中時，靶多核苷酸是非編碼rna分子。在一些實施方案中，非編碼rna分子選自：成熟微小rna分子、前體微小rna分子、初級微小rna分子、sirna分子、pirna分子、piwirna、lncrna、rrna和shrna分子。在一些實施方案中，接頭序列包含選自下述的一種或多種序列元件：一種或多種條形碼序列、一種或多種限制性酶識別序列、一種或多種寡核苷酸探針結合序列或其互補體、一種或多種測序引物退火序列或其互補體、以及這些序列的組合。在一些實施方案中，接頭序列包含多種不同環(huán)引物共有的通用序列。

在一些實施方案中，用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的反應混合物在容器中。在一些實施方案中，容器是孔、板、管、室、流動池或芯片。在一些實施方案中，用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的反應混合物是脫水形式。在一些實施方案中，用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的反應混合物是試劑盒的形式。

在一些實施方案中，使用主題試劑盒的方法包括在包含靶多核苷酸、環(huán)引物、正向引物、反向引物和聚合酶的反應混合物中執(zhí)行核酸擴增反應，以獲得可檢測量的擴增子，其中所述靶多核苷酸長度小于約100nt。在一些實施方案中，靶多核苷酸長度小于約100nt，并且擴增反應具有小于30的循環(huán)閾值（ct）。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的靶多核苷酸的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：（a）配置為接收客戶請求以對樣品執(zhí)行檢測反應的計算機；（b）在權利要求37的反應混合物中執(zhí)行核酸擴增反應以產生擴增產物的擴增系統(tǒng)；和（c）報告生成器，其向接收者發(fā)送報告，其中所述報告含有檢測對應于所述擴增產物的量的檢測信號的結果。在一個實施方案中，接收方是客戶。在一些實施方案中，計算機可讀介質包括代碼，所述代碼在由一個或多個處理器執(zhí)行后，實施檢測樣品中的靶多核苷酸的方法，所述方法包括：（a）接收客戶請求，對樣品執(zhí)行檢測反應；（b）在權利要求40的反應混合物中執(zhí)行核酸擴增反應，以產生擴增產物；和（c）生成含有檢測對應于擴增產物的量的檢測信號的結果的報告。

在公開內容的各個方面的任一個中，環(huán)引物的接頭序列可以包含發(fā)夾結構。

本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、試劑盒和/或系統(tǒng)可用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列。足以實現(xiàn)第一引物延伸和隨后擴增兩者的試劑可以同時或在不同時間添加。在其他實施方案中，第一引物延伸反應的產物可以全部或部分、稀釋或未稀釋地轉移到在其中進行擴增過程的分開容器中。合適容器的非限制性實例包括微量離心管、錐形管、薄壁管、條管、多孔板、微流體裝置和微陣列。在一些實施方案中，關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列或其擴增產物可用于檢測和/或定量起始材料中的靶多核苷酸。主題方法和裝置可特別用于檢測遺傳相關性、診斷、預后和/或診斷。

通過引用并入

本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請通過引用并入本文，其程度如同每個個別出版物、專利或專利申請被具體且個別指出通過引用并入。

附圖簡述

在所附權利要求中特別闡述了本發(fā)明的新穎特征。通過參考下述詳述將獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好理解，所述詳述闡述了利用本發(fā)明的原理的舉例說明性實施方案以及附圖，在所述附圖中：

圖1顯示了本公開內容的互補序列擴增方案的示例性示意圖。

圖2顯示了根據(jù)本公開內容的實施方案，通過特異性引物生成的逆轉錄（rt）產出的示例性毛細管電泳（ce）分析。

圖3顯示了根據(jù)本公開內容的實施方案，通過具有不同濃度的引物的qpcr的rt產物的示例性擴增。

圖4顯示了根據(jù)本公開內容的實施方案，在42℃或37℃下由特異性引物生成的rt產出的示例性ce分析。

圖5顯示了根據(jù)本公開內容的實施方案，通過特異性引物生成的rt產出的示例性分析。

圖6顯示了根據(jù)本公開內容的實施方案，使用特異性rt引物通過不同mirna生成的rt產物的示例性ce分析。

圖7顯示了根據(jù)本公開內容的實施方案，具有單核苷酸差異的mirna之間的區(qū)分的實例。

圖8示出了可用于公開內容的方法、組合物、反應混合物、試劑盒和/或系統(tǒng)中的計算機系統(tǒng)的非限制性實例。

圖9描述了公開內容的互補序列擴增方案的示例性示意圖。

圖10顯示了根據(jù)本公開內容的實施方案，mirna家族成員的特異性擴增的實例引物和結果。

圖11提供了顯示根據(jù)本公開內容的實施方案，mirna家族成員（let-7a、b、c、d和e）的靶擴增敏感性的結果。結果指示至少約25-250個mirna拷貝/μl的靈敏度。測定效率為約80-90%。

圖12提供了根據(jù)本公開內容的實施方案，示出背景信號減少的引物和擴增結果的實例。

圖13描繪了根據(jù)本公開內容的實施方案，特異性引物的3'互補序列的長度的示例性分析結果。

圖14描繪了根據(jù)本公開內容的實施方案，5'和3'互補序列的長度的示例性分析結果。

圖15描繪了根據(jù)本公開內容的實施方案，5'和3'臂序列的長度的示例性分析結果。

圖16a和16b顯示了使用阻斷寡核苷酸的背景減少的示例性方案和示例性分析的結果。

圖17a和17b顯示了根據(jù)公開內容的實施方案，rt-pcr條件的示例優(yōu)化的結果。rt引物濃度為約50nm。溫度概況如下：25℃45分鐘；85℃5分鐘。

定義

術語“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它們指任何長度的核苷酸的聚合形式，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結構，并且可以執(zhí)行已知的或未知的任何功能。下述是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、基因間dna、由連鎖分析限定的基因座（loci）（基因座（locus））、外顯子、內含子、信使rna（mrna）、轉移rna、核糖體rna、短干擾rna（sirna）、短發(fā)夾rna（shrna）、微小rna（mirna）、小核仁rna、核酶、cdna、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的dna、任何序列的分離的rna、核酸探針、銜接子和引物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在的話，可以在聚合物裝配之前或之后賦予對核苷酸結構的修飾。核苷酸序列可以被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在聚合后進一步修飾，例如通過與標記組分、標簽、反應性部分或結合配偶體綴合。除非另有說明，否則當提供時，多核苷酸序列以5'至3'方向列出。

如本文使用的，術語“靶多核苷酸”和“靶序列”可互換使用，并且指具有靶序列的核酸分子群體中的核酸分子或多核苷酸，本發(fā)明的一種或多種寡核苷酸被設計為與所述靶序列雜交。在一些實施方案中，靶序列唯一地識別來源于樣品，例如特定基因組、線粒體、細菌、病毒或rna（例如mrna、mirna、初級mirna或前體mirna）序列的序列。在一些實施方案中，靶序列是由多個不同靶多核苷酸共享的共同序列，例如與不同靶多核苷酸連接的共同銜接子序列?！鞍卸嗪塑账帷笨梢杂糜谥赴谝粭l或兩條鏈上的靶序列的雙鏈核酸分子或者包含靶序列的單鏈核酸分子，并且可以來源于用于分離或生成核酸分子的任何來源或過程。靶多核苷酸可以包含一種或多種（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種）靶序列，其可以是相同或不同的。一般而言，不同的靶多核苷酸包含不同的序列，例如一個或多個不同的核苷酸或者一種或多種不同的靶序列。

“雜交”和“退火”指其中一個或多個多核苷酸反應以形成復合物的反應，所述復合物經由核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵合穩(wěn)定。氫鍵合可通過沃森克里克堿基配對、hoogstein結合或以任何其他序列特異性方式發(fā)生。復合物可以包含形成雙鏈體結構的兩條鏈、形成多鏈復合物的三條或更多條鏈、單條自雜交鏈或這些的任何組合。雜交反應可以構成在更廣泛的過程例如pcr的起始或通過核酶的多核苷酸的酶促切割中的步驟。可以經由與第二序列的核苷酸殘基的堿基氫鍵合穩(wěn)定的第一序列被說成可與第二序列“雜交”。在這種情況下，第二序列也可以說成可與第一序列雜交。

“互補體（complement）”、“互補體（complements）”、“互補的”和“互補性”指與給定序列完全互補并且可雜交的序列。一般而言，可與第二序列或第二序列組雜交的第一序列可與第二序列或第二序列組特異性或選擇性雜交，使得與第二序列或第二序列組的雜交在雜交反應期間優(yōu)選（例如在給定的條件例如本領域通常使用的嚴格條件下熱力學更穩(wěn)定）于與非靶序列的雜交。通常，可雜交序列在其各自長度的全部或一部分上共享一定程度的序列互補性，例如在25%-100%互補性之間，包括至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%序列互補性。

如應用于多核苷酸的術語“雜交”指經由核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵合穩(wěn)定的復合物中的多核苷酸。氫鍵合可通過沃森克里克堿基配對、hoogstein結合或以任何其他序列特異性方式發(fā)生。復合物可以包含形成雙鏈體結構的兩條鏈、形成多鏈復合物的三條或更多條鏈、單條自雜交鏈或這些的任何組合。雜交反應可以構成在更廣泛的過程例如pcr反應的起始、連接反應、測序反應或切割反應中的步驟。

本發(fā)明適用于擴增各種短rna分子和非編碼rna分子。如本文使用的，術語“非編碼rna分子”或“短rna分子”指不編碼蛋白質的任何rna分子。非編碼rna分子的非限制性實例包括：微小rna（mirna）、piwi相互作用rna（pirna）、短干擾rna（sirna）、短發(fā)夾rna（shrna）、小核rna（snrna）、小核仁（snorna）、轉移rna（trna）和核糖體rna（rrna）。如本文使用的，術語“微小rna”用于指成熟微小rna的生物發(fā)生中的任何形式的微小rna，包括初級微小rna（初級mirna）、前體微小rna（前體mirna）和成熟微小rna。rna靶可以以小于1,000,000、100,000、10,000、5,000、2,500、1,000、500或100個拷貝或拷貝/細胞存在。

如本文使用的，“成熟微小rna”指具有在19至30個核苷酸范圍內的長度的rna分子。術語“微小rna”和“mirna”可以互換使用。本領域已知的mirna的非限制性實例包括：mir-1、mir-7、mir-9*、mir-10a、mir-10b、mir-15a、mir-15b、mir-16、mir-17-3p、mir-17-5p、mir-18、mir-19a、mir-19b、mir-20、mir-21、mir-22、mir-23a、mir-23b、mir-24、mir-25、mir-26a、mir-26b、mir-27a、mir-28、mir-29a、mir-29b、mir-29c、mir-30a-5p、mir-30b、mir-30c、mir-30d、mir-30e-5p、mir-30e-3p、mir-31、mir-32、mir-33、mir-34a、mir-34b、mir-34c、mir-92、mir-93、mir-95、mir-96、mir-98、mir-99a、mir-99b、mir-100、mir-101、mir-103、mir-105、mir-106a、mir-107、mir-122、mir-122a、mir-124、mir-124、mir-124a、mir-125a、mir-125b、mir-126、mir-126*、mir-127、mir-128a、mir-128b、mir-129、mir-130a、mir-130b、mir-132、mir-133a、mir-133b、mir-134、mir-135a、mir-135b、mir-136、mir-137、mir-138、mir-139、mir-140、mir-141、mir-142-3p、mir-143、mir-144、mir-145、mir-146、mir-147、mir-148a、mir-148b、mir-149、mir-150、mir-151、mir-152、mir-153、mir-154*、mir-154、mir-155、mir-181a、mir-181b、mir-181c、mir-182*、mir-182、mir-183、mir-184、mir-185、mir-186、mir-187、mir-188、mir-189、mir-190、mir-191、mir-192、mir-193、mir-194、mir-195、mir-196a、mir-196b、mir-197、mir-198、mir-199a*、mir-199a、mir-199b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-202、mir-203、mir-204、mir-205、mir-206、mir-208、mir-210、mir-211、mir-212、mir-213、mir-213、mir-214、mir-215、mir-216、mir-217、mir-218、mir-220、mir-221、mir-222、mir-223、mir-224、mir-296、mir-299、mir-301、mir-302a*、mir-302a、mir-302b*、mir-302b、mir-302d、mir-302c*、mir-302c、mir-320、mir-323、mir-324-3p、mir-324-5p、mir-325、mir-326、mir-328、mir-330、mir-331、mir-337、mir-338、mir-339、mir-340、mir-342、mir-345、mir-346、mir-363、mir-367、mir-368、mir-370、mir-371、mir-372、mir-373*、mir-373、mir-374、mir-375、mir-376b、mir-378、mir-379、mir-380-5p、mir-380-3p、mir-381、mir-382、mir-383、mir-410、mir-412、mir-422a、mir-422b、mir-423、mir-424、mir-425、mir-429、mir-431、mir-448、mir-449、mir-450、mir-451、let7a、let7b、let7c、let7d、let7e、let7f、let7g、let7i、mir-376a和mir-377。本發(fā)明的方法適用于其的靶的進一步實例以及上述微小rna靶的序列可以在如griffith-jones等人（2004），nucleicacidsresearch32:d109-d111，和griffith-jones等人（2006），nucleicacidsresearch34:d140-d144中所述的“mirbase序列數(shù)據(jù)庫”中找到。

如本文使用的，術語“前體微小rna”和“前體mirna”可互換地用于指其加工釋放成熟mirna的任何分子。前體mirna分子包含二級結構區(qū)域，其包含通過促成雙鏈區(qū)的區(qū)域之間的序列形成的雙鏈rna的區(qū)域和環(huán)區(qū)域，導致發(fā)夾樣結構。術語“初級rna”和“初級mirna”可互換地用于指其加工導致前體mirna的任何分子。初級mirna可以來自各種基因組來源，包括但不限于不同轉錄物、基因間區(qū)、其他轉錄物的非翻譯區(qū)和內含子（包括所謂的“mirtron”）。

如本文使用的，術語“短干擾rna”和“sirna”可互換地用于指短于約50、40、35、30、25、20或更少的核苷酸的任何rna分子，其能夠基于互補性誘導基因靶的沉默。沉默通常由argonaute蛋白介導，并且通常由短rna分子觸發(fā)起始。沉默可以是轉錄后或轉錄的。sirna分子可以與其表達降低的一種或多種基因完全或部分互補，并且沉默可以伴隨或不伴隨mrna轉錄物的切割而實現(xiàn)。如本文使用的，術語“短發(fā)夾rna”和“shrna”可互換地用于指具有由不參與堿基配對的區(qū)域分開、能夠彼此堿基配對的兩個區(qū)域的任何單鏈rna分子，其加工釋放一種或多種sirna。shrna可以是細胞（內源）或人工（外源）起源的。內源sirna包括“pirna”，其是一類piwi相互作用rna中的任一種。

此外，如本領域技術人員將了解的，一些mirna可以進一步根據(jù)其在廣泛多樣的生物和廣泛多樣的組織中影響基因調節(jié)的能力進行表征。單個基因可以被多重mirna調節(jié)，并且mirna調節(jié)可以協(xié)同地起作用。單個mirna也可能能夠調節(jié)多重mrna，例如，一些估計已提示單個人mirna可以調節(jié)高達100-200種基因。近期還描述了高達30%的人基因是mirna調節(jié)的靶。mirna可以從各種生物中分離，所述生物的非限制性實例包括哺乳動物、兩棲動物、昆蟲、線蟲、植物和在從后生動物到病毒范圍內的許多其他生物。mirna可以在生物之間、在生物內的組織之間差異表達，并且在生物內時間調節(jié)。mirna調節(jié)可以影響多重過程。受mirna基因調節(jié)影響的過程的非限制性實例包括：分化、發(fā)育、老化、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生、代謝、細胞生長和細胞增殖（zhou等人（2007），bmcgenomics8:396；和lu等人（2008），plosone3（10）:e3420）。由于受影響的許多途徑，mirna及其靶的失調已牽涉許多疾病，其非限制性實例包括：心血管疾病、自身免疫性病癥、牛皮癬、病毒感染、精神分裂癥、脂質代謝紊亂、肥胖、哮喘、唐氏綜合征、腎功能障礙、體液穩(wěn)態(tài)、發(fā)育異常、真性紅細胞增多癥、特應性濕疹、強直性肌營養(yǎng)不良、帕金森氏病、糖尿病、神經變性、圖雷特氏綜合征、脆性x綜合征（lu等人（2008），plosone3（10）:e3420）。mirna及其靶的失調已進一步牽涉許多癌癥，其非限制性實例包括：多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、兒科伯基特淋巴瘤、成人伯基特淋巴瘤、b細胞淋巴瘤、實體癌、造血系統(tǒng)惡性腫瘤、結腸癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、套細胞淋巴瘤、垂體腺瘤、白血病、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌、甲狀腺乳頭狀癌、膀胱癌、生殖細胞腫瘤、腦瘤和睪丸生殖細胞腫瘤。同上。像這樣，mirna可用作診斷、預后和治療疾病中的標記物。

如本文使用的，術語“同源性”指與參考核苷酸序列同源的核苷酸序列。相比之下，術語“互補的”和“互補體”指例如在pcr反應的雜交階段期間，能夠與參考核苷酸序列堿基配對的核苷酸序列。此外，“非互補的”用于指例如在pcr反應的雜交階段期間，在給定的一組條件下缺乏足夠的互補序列以與參考序列穩(wěn)定堿基配對的序列。同源性和互補性的程度可以根據(jù)給定的應用而變，并且可以多于5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或多于95%。此外，如本文使用的，術語“基本上非互補的”指與參考序列小于約50%、40%、30%、20%、10%或小于約5%互補的核苷酸序列序列。應理解具有相似結構的嘌呤和嘧啶含氮堿基根據(jù)沃森克里克配對是功能上等價的；并且例如通過甲基化的類似含氮堿基的相互取代不構成材料取代。

如本文使用的，術語“擴增（amplify）”、“擴增（amplifies）”、“擴增（amplified）”、“擴增（amplification）”和“擴增子”指使用引物依賴性聚合酶用于復制核酸的任何方法和/或那些過程的產物。在一個優(yōu)選實施方案中，使用包含如上所述的第一和第二引物的一對引物借助于pcr來實現(xiàn)擴增。擴增的產物可以經歷子序列分析，包括但不限于解鏈曲線分析、核苷酸測序、單鏈構象多態(tài)性測定、等位基因特異性寡核苷酸雜交、dna印跡分析和限制性核酸內切酶消化。

可以通過使用探針來檢測擴增產物。如本文使用的，術語“探針”指攜帶可檢測成員并且與靶核酸具有互補性的多核苷酸，因此能夠與所述靶雜交并且被所述可檢測成員檢測。在某些實施方案中，探針可以包括沃森克里克堿基或修飾的堿基。修飾的堿基包括但不限于aegis堿基（來自eragenbiosciences），其已在例如美國專利號5,432,272；5,965,364；和6,001,983中描述。在某些方面，堿基通過天然磷酸二酯鍵或不同的化學鍵連接。不同的化學鍵包括但不限于肽鍵或lna鍵，其在公開的pct申請wo00/56748和wo00/66604中描述。

除非另有說明，否則本發(fā)明的實踐采用在本領域的技術內的生物化學、化學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、基因組學和重組dna的常規(guī)技術。參見例如sambrook，fritsch和maniatis，molecularcloning:alaboratorymanual，第2版（1989）；currentprotocolsinmolecularb1ology（f.m.ausubel等人編輯，（1987））；系列methodsinenzymology（academicpress，inc.）:pcr2:apracticalapproach（m.j.macpherson，b.d.hames和g.r.taylor編輯（1995））以及animalcellculture（r.i.freshney，編輯（1987））。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法、組合物、反應混合物、試劑盒和/或系統(tǒng)。這些方法、組合物、反應混合物、試劑盒和/或系統(tǒng)可特別用于檢測短核酸。

方法：

在一個方面，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法，所述方法包括使樣品在反應混合物中在產生關于靶多核苷酸區(qū)域的完全序列的條件下經歷核酸擴增反應，其中所述反應混合物包含：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列d和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a與靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）環(huán)引物的序列b與靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；和（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸從5'至3'延伸環(huán)引物的序列b，所述靶多核苷酸充當用于模板引導的引物延伸的模板，以產生靶多核苷酸的互補序列。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法，所述方法包括使樣品在產生關于靶多核苷酸區(qū)域的完全序列的條件下，經歷具有環(huán)引物、正向引物、反向引物和聚合酶的核酸擴增反應，其中所述反應混合物包含：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列d和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a與靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）序列b與靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸從5'至3'延伸環(huán)引物的序列b，所述靶多核苷酸充當用于模板引導的引物延伸的模板，以產生靶多核苷酸的互補序列；（c）反向引物，其顯示出與相對于序列a'或b'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其與和環(huán)引物互補的序列特異性雜交。

在本文公開的任何方法中使用或在任何組合物中存在的環(huán)引物指在其兩端處與靶多核苷酸具有兩段互補性的多核苷酸。該方法中使用的序列a是在環(huán)引物的5'端處的互補段，并且該方法中使用的序列b是在環(huán)引物的3'端處的互補段。在該方法中使用的這兩個序列與靶多核苷酸的序列a'和b'堿基配對，其中a'定位比b'更5'。序列a'和b'彼此非常接近，并且僅通過在靶多核苷酸上的n'序列分開，如該方法中使用的。序列a和a'可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施方案中，序列a為長度5-15個核苷酸（例如長度10個核苷酸）。序列b和b'可以是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。在一些實施方案中，序列b為長度4-6個核苷酸。序列n'可以是1、2、3、4或5個核苷酸。在方法中使用的環(huán)引物上的序列a和b之間的間插接頭序列（序列d）可以具有足夠的長度，以允許環(huán)引物的結構空間同時使a和b分別對a'和b'退火。

在實踐任何公開內容的方法中，環(huán)引物一般被設計成以a-a'堿基配對和b-b'堿基配對與靶多核苷酸特異性雜交。聚合酶然后使用靶多核苷酸作為模板從序列b的3'端延伸，以生成關于靶多核苷酸的互補序列，其中互補體針對區(qū)域n'，a'，然后經由模板引導的引物延伸生成的靶多核苷酸的剩余部分以該順序產生。在模板引導的引物延伸期間，當聚合酶從序列b的3'端延伸時，a-a'雜交被敲除。第一互補序列因此將從5'到3'具有下述區(qū)域：a、d、b、n、a和靶多核苷酸的剩余部分。該互補序列由于通過序列d提供的長度而更長。該互補序列也可以是比靶多核苷酸更穩(wěn)定的形式；例如，如果靶多核苷酸是mirna并且聚合酶是逆轉錄酶，則該互補序列是更長的dna多核苷酸，其更穩(wěn)定。

設計用于任何主題方法或組合物的環(huán)引物的一個考慮是對于a-a'和b-b'選擇的互補性區(qū)域。因為模板引導的引物延伸在序列b的3'端處發(fā)生，使得僅在靶多核苷酸上的b'的5'區(qū)域被擴增，所以期望a'和b'區(qū)域選擇為相對接近于靶多核苷酸的3'端。這種選擇確保足夠數(shù)量的靶多核苷酸序列是a-a'和b-b'雜交的5'，以包括在第一互補序列中。

環(huán)引物、序列a和序列b的長度將取決于本領域已知的許多因素，例如引物的所需雜交溫度、靶核酸序列和待擴增的不同靶核酸序列的復雜性。將環(huán)引物的核酸序列并入每個合成的第一互補核酸分子的序列內。在一些實施方案中，位于環(huán)引物的3'端處的第一互補核酸多核苷酸與靶互補核酸多核苷酸的至少一部分互補，并且因此能夠與靶互補核酸多核苷酸的至少一部分雜交，并且可以是長度至少約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個核苷酸。在一些實施方案中，第一互補核酸分子包含與靶序列的一個或多個核苷酸錯配，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個錯配?；旧戏腔パa序列的選擇將取決于待擴增的靶。這種基本上非互補的序列可以是人工的或設計的，例如在另一生物中發(fā)現(xiàn)的序列、在另一物種中發(fā)現(xiàn)的序列、在另一亞種中發(fā)現(xiàn)的序列、來自相同物種的不同成員的基本上非互補序列、選自與靶基本上非互補的區(qū)域來自相同主體的序列、已知與靶基本上非互補的隨機生成的序列、或已知與靶基本上非互補的特別設計的序列。

在一些實施方案中，用于實踐主題方法的序列a為長度2nt至約10nt，并且序列b為長度2nt至約10nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度為約5nt至約20nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度足以與靶多核苷酸特異性雜交以實現(xiàn)環(huán)引物的延伸。在一些實施方案中，當最佳比對時，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少80%互補。在一些實施方案中，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少90%互補。在一些實施方案中，序列a'的3'端在序列b'的1nt至約5nt內。

如方法中使用的環(huán)引物設計的另一個考慮是a-a'和b-b'雜交序列中的核苷酸數(shù)目。核苷酸的總數(shù)可以增加環(huán)引物和靶多核苷酸復合物的特異性和穩(wěn)定性。該復合物的特異性和穩(wěn)定性有助于靶多核苷酸的隨后擴增和定量的準確性。需要時，序列b中的核苷酸數(shù)目可以大于序列a中的核苷酸數(shù)目，以增加效率，使得在從序列b的3'端的引物延伸的延長期間，aa'雜交被敲除。

在一些實施方案中，序列a和b在核苷酸堿基中具有相等的長度，包含至少3、4、5、6、7、8、9或10個但不超過約50個核苷酸。在另一個實施方案中，序列a是2個核苷酸，并且序列b是3個核苷酸。在另一個實施方案中，序列a是2個核苷酸，并且序列b是4個核苷酸。在另一個實施方案中，序列a是3個核苷酸，并且序列b是4個核苷酸。

設計環(huán)引物的相關考慮是a和b序列的組合長度，其一般足以允許與靶多核苷酸的特異性雜交。這種雜交應當足夠穩(wěn)定，以允許隨后延長序列b的3'端的時間。在一些實施方案中，a和b的組合長度為約5至50個核苷酸、約5至約10個核苷酸、或約5至約15個核苷酸。

環(huán)引物中a和b序列的互補性程度一般足以與靶多核苷酸特異性雜交。這種雜交應當足夠穩(wěn)定，以允許隨后延長序列b的3'端的時間。在一些實施方案中，當序列最佳比對時，a和b序列與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補。

環(huán)引物中的序列a和b之間的核苷酸數(shù)目一般對應于序列n'和n的長度，這可以影響在第一互補鏈合成期間在序列b的3'端處的聚合酶延伸的效率。距離越大，聚合酶越容易配合環(huán)引物以起始模板引導的引物延伸且敲除a-a'雜交。然而，對于更大的距離，環(huán)引物和靶多核苷酸之間的結合特異性可以降低，因為更大的n'個核苷酸與由環(huán)引物的序列a和b指定的序列不特異性相互作用。在一些實施方案中，序列a'的3'端在序列b'的5'端的1nt至約10nt內、1nt至約5nt內、或2nt至約5nt內。

可以設計環(huán)引物以檢測單核苷酸變異。例如，主題方法可利用在序列a和b中的一個堿基位置中不同的一對環(huán)引物，使得一個識別靶序列的一個等位基因，并且另一個識別靶序列的不同等位基因。環(huán)引物在環(huán)序列d中也不同，并且可以被選擇性擴增和/或檢測。

在一個實施方案中，一個環(huán)引物結合等位基因核苷酸以及相鄰序列，并且另一個環(huán)引物結合與等位基因核苷酸緊相鄰的序列；前者僅捕獲一個等位基因，而后者捕獲兩個等位基因。在隨后的檢測、定量和擴增步驟期間，可以選擇性區(qū)別可以具有不同接頭序列的兩個環(huán)引物，這依次又允許靶多核苷酸的不同等位基因與第一互補序列區(qū)別檢測、定量且擴增。

主題環(huán)引物中的接頭序列d一般被設計為具有用于aa'和b-b'兩者的雜交的足夠長度，其依次又增加環(huán)引物結合正確小rna靶的特異性。在一個實施方案中，接頭序列為約5至約100、10至約80或20至約50個核苷酸。在一些其他實施方案中，接頭序列為長度約10、20、30、40、50、60、70、80、90或約100個核苷酸。

需要時，主題方法中使用的或主題組合物中存在的接頭序列可以包含一種或多種序列元件，包括但不限于一種或多種條形碼序列、一種或多種限制性酶識別序列、一種或多種寡核苷酸探針結合序列或其互補體、一種或多種測序引物退火序列或其互補體、在多種不同環(huán)引物或不同環(huán)引物的子集之間共享的一種或多種共同序列、用于形成發(fā)夾的一對或多對互補序列或這些的組合。在一些實施方案中，接頭序列包含多種不同環(huán)引物共有的通用序列。兩個或更多個序列元件可以彼此不相鄰（例如由一個或多個核苷酸分開）、彼此相鄰、部分重疊或完全重疊。例如，擴增引物退火序列也可以充當測序引物退火序列。序列元件可以具有任何合適的長度，例如長度約、小于約或多于約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50個或更多個核苷酸。

在一些實施方案中，接頭序列包含用于形成發(fā)夾結構的一對或多對互補序列。一對序列中的每個序列可以稱為“莖序列”。一對莖序列中的莖序列可以在其整個長度上完全互補，或者可以包含一個或多個（例如1、2、3、4、5個或更多）錯配。在一些實施方案中，一對莖序列中的莖序列至少80%、85%、90%、95%或100%互補。莖序列可以是任何合適的長度，例如長度約或至少約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個或更多個核苷酸。在一些實施方案中，莖序列長度在5-10個核苷酸之間（例如長度7個核苷酸）。可以設計莖序列，使得通過其雜交形成的莖具有例如在35-90℃、40-75℃、45-65℃或50-55℃之間的特定解鏈溫度（tm）。在一些實施方案中，通過莖序列之間的雜交形成的莖具有在60-72℃之間的tm。每個莖序列在接頭序列內的位置可以改變。一般而言，莖序列之間的接頭內的序列在莖序列之間雜交后形成環(huán)結構。莖序列之間的距離可以影響形成環(huán)的序列的長度，例如長度至少約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個或更多個核苷酸的環(huán)序列。在一些實施方案中，環(huán)序列為長度5-10個核苷酸（例如長度5個核苷酸）。環(huán)序列可以被設計為缺乏靶結合序列（例如與mirna靶互補的序列）。莖可包括緊在環(huán)引物序列a和/或序列b中核苷酸之前的核苷酸?？商娲?，環(huán)引物可包含在莖序列的端與序列a或序列b中的一個或兩個的起點之間的一個或多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個或更多個）核苷酸，所述序列可稱為“臂序列”。包含形成發(fā)夾結構的接頭序列的環(huán)引物可以包含無、一個或兩個臂，其中每個臂的長度彼此獨立地選擇。在一些實施方案中，一個或兩個臂被設計為長度在5-15個核苷酸之間。

在一些實施方案中，接頭序列包含獨特的序列以有助于隨后檢測，定量目的靶多核苷酸的產生的互補序列。在產生第一互補體序列后，接頭序列的一部分與正向引物互補。因此，在接頭序列內具有特定條形碼可以允許不同的環(huán)引物通過不同的正向引物但相同的反向引物擴增、檢測或定量。在一些實施方案中，一個環(huán)引物的序列a和b可以結合與另一個環(huán)引物的序列a和b的相同靶多核苷酸略微不同的區(qū)域，這允許更大的特異性和/或用戶驗證。由于接頭序列中不同的條形碼，通過不同的正向引物不同地結合，可以促進這些不同環(huán)引物的后續(xù)擴增、檢測和定量。

在一些實施方案中，接頭包含一種或多種限制性酶識別序列。擴增后，用限制性消化可以顯著改善檢測的準確度，使得僅含有接頭序列限制位點的從第一互補體序列擴增的真正產物被切割并且列表用于檢測和定量。

在其他實施方案中，接頭序列包含一種或多種寡核苷酸探針結合序列、寡核苷酸探針結合序列的互補體、引物退火序列或引物退火序列的互補體。在擴增期間，以序列特異性方式雜交的另外探針（如taqman）或增加擴增特異性的另外引物可以利用這些序列，以允許關于靶多核苷酸的第一互補序列的準確擴增的更大保證。

在其他實施方案中，接頭序列包含與反應混合物中利用的所有環(huán)引物共同的區(qū)域。所有環(huán)引物共有的這種接頭序列可以降低檢測和定量的成本，因為隨后的探針（例如taqman探針）、酶促消化及其序列、正向引物和作用于環(huán)引物的任何其他試劑可以跨越用于檢測許多不同的靶多核苷酸的許多不同環(huán)引物在用途中是通用的。

在一些實施方案中，多個環(huán)引物中的每一個被設計為使得每個環(huán)引物或每個第一互補核酸分子的解鏈溫度在35℃和90℃之間，例如在40℃和75℃之間、在45℃和65℃之間、或在50℃和55℃之間。在一些實施方案中，多個環(huán)引物中的每一個被設計為使得每個環(huán)引物或每個互補核酸分子的解鏈溫度為約、小于約或多于約40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、72℃、75℃、80℃或更高。在一些實施方案中，第一引物可以以約、至少約或至多約10、50、100、150、200、250、300、350至300、350、400、450、500、550、600、800、10000nm或μm，或其間可衍生的任何范圍或值的濃度存在。

在使用環(huán)引物和來自序列b的3'端的模板引導的引物延伸產生第一互補序列之后，使用靶多核苷酸作為模板，該第一互補序列變成用于擴增后續(xù)反應的模板，包括用于定量以及檢測的目的。為了生成另外的拷貝，第一互補序列，尤其是對于在其內與靶多核苷酸互補的區(qū)域，正向引物與接頭序列d內的序列特異性雜交，并且反向引物與比靶多核苷酸上的序列a'更5'的序列特異性雜交，其將比第一互補序列上的序列a更3'。然后可以在隨后的反應中指數(shù)地擴增側接所選引物的這個特定區(qū)域，非常類似于常規(guī)pcr。

在一些實施方案中，用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的方法進一步包括在反向引物和任選正向引物的存在下，擴增關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的步驟，其中反向引物和正向引物分別顯示出與擴增產物和環(huán)引物的序列互補性。在一些實施方案中，正向引物與接頭序列中的序列特異性雜交。在一些實施方案中，反向引物與序列特異性雜交，所述序列與相對于序列a'或b'為5'的靶多核苷酸的一部分互補。

正向和反向引物一般足夠長，以在擴增反應的條件下引發(fā)靶核酸序列的模板引導的擴增。第二引物組引物的長度將取決于本領域已知的許多因素，例如引物的所需雜交溫度、靶核酸序列和待擴增的不同靶核酸序列的復雜性。在一些實施方案中，正向和反向序列包含與靶序列的一個或多個核苷酸錯配，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個錯配?；旧戏腔パa序列的選擇將取決于待擴增的靶。這種基本上非互補的序列可以是人工的或設計的，例如在另一生物中發(fā)現(xiàn)的序列、在另一物種中發(fā)現(xiàn)的序列、在另一亞種中發(fā)現(xiàn)的序列、來自相同物種的不同成員的基本上非互補序列、選自與靶基本上非互補的區(qū)域來自相同主體的序列、已知與靶基本上非互補的隨機生成的序列、或已知與靶基本上非互補的特別設計的序列。

需要時，環(huán)、正向和反向引物各自可以包含核苷酸類似物，例如修飾的核酸或其他非規(guī)范核苷酸。核苷酸類似物的其他非限制性實例包括但不限于2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-溴du、脫氧尿苷、反轉dt、雙脫氧核苷酸、5-甲基dc、脫氧肌苷、鎖核酸（lna）、5-硝基吲哚和2'-o-甲基rna堿基。

在一些實施方案中，正向和反向引物被設計為使得各自的解鏈溫度在35℃和90℃之間，例如在40℃和75℃之間、在45℃和65℃之間、或在50℃至55℃之間。在一些實施方案中，多個正向和反向引物中的每一個被設計為使得各自的熔解溫度為約、小于約或多于約40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、72℃、75℃、80℃或更高。在進一步的實施方案中，環(huán)、正向和反向引物可以以約、至少約或至多約10、50、100、150、200、250、300、350至300、350、400、450、500、550、600、800、10000nm或μm，或其間可衍生的任何范圍或值的濃度存在于擴增反應中。

如上文注意到的，在一些實施方案中，通過使用本文公開的與包括正向和反向引物的第二組引物組合的環(huán)引物，達到主題方法中的第一互補核酸分子的擴增。第二引物組可以與環(huán)引物同時加入反應中?？商娲兀诃h(huán)引物延伸之后添加第二引物組。在另外其他實施方案中，可以在延伸反應后添加另外量的環(huán)引物。在延伸反應后添加一定量環(huán)引物可以伴隨第二引物組的添加。在一些實施方案中，正向引物（例如與環(huán)引物內的序列的互補體雜交的引物）為長度約或至少約10、15、20個或更多個核苷酸。正向引物可以被設計為具有所需解鏈溫度，例如55-75℃之間（例如62℃）的tm。反向引物（例如與靶多核苷酸（例如mirna）的互補體雜交的引物）可以被設計為具有一種或多種性質，例如55-75℃之間（例如62℃）的tm。

在一些實施方案中，反應在單個反應混合物中在獲得關于靶多核苷酸區(qū)域的完全序列的條件下發(fā)生，其中所述反應混合物包含：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列d和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）環(huán)引物的序列a與靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）序列b與靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；和（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸從5'至3'延伸環(huán)引物的序列b，所述靶多核苷酸充當用于模板引導的引物延伸的模板，以產生靶多核苷酸的互補序列；（c）反向引物，其展示與關于序列a'或b'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其與和環(huán)引物互補的序列特異性雜交。

在一些實施方案中，主題方法利用與靶多核苷酸的量相比較過量存在的環(huán)、正向和/或反向引物。例如，所利用的環(huán)、正向和/或反向引物是與擴增反應中存在的靶多核苷酸的至少約1倍、10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍、3000倍、5000倍、7500倍、10000倍、20000倍、50000倍、100000倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍或更多倍。在一些實施方案中，環(huán)引物、正向引物和反向引物的使用允許一種或多種靶核酸分子擴增至可檢測水平，其中在擴增之前在樣品中存在一種或多種靶核酸分子的少于約5000、2500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5個或更少拷貝。

第一互補序列的產生可以是一步rt-pcr或兩步rt-pcr的一部分，其中反應混合物可以含有分別用于第一鏈合成和擴增的試劑，或者用于第一鏈合成和擴增兩者一起的試劑。此外，用于隨后擴增的反應混合物可以含有與第一互補序列產物雜交的不同引物，以獲得不同長度或覆蓋第一互補序列內的不同范圍的產物。此外，定量或檢測第一互補序列內的區(qū)域的特異性探針可增加特異性；例如，識別接頭序列d中的特異性區(qū)域、靶多核苷酸序列或甚至第一互補序列中的這兩個區(qū)域之間的重疊的taqman探針可以在產生靶核酸的第一互補序列之前、產生靶核酸的第一互補序列同時或產生靶核酸的第一互補序列之后加入反應混合物中。

第一互補序列的產生可以通過聚合酶實現(xiàn)。本領域中可獲得廣泛多樣的聚合酶。非限制性實例包括rna依賴性dna聚合酶，例如來源于莫洛尼鼠白血病病毒（mmlv-rt）、禽成髓細胞瘤病毒（amv-rt）、牛白血病病毒（blv-rt）、勞斯肉瘤病毒（rsv-rt）、人免疫缺陷病毒（hiv-rt）、勞斯相關病毒（rav-rt）、成髓細胞瘤相關病毒（mav-rt）或其他禽肉瘤白血病病毒（aslv-rt）的逆轉錄酶（rt）、棲熱菌屬（thermus）z05聚合物、δz05聚合酶及其任何修飾形式或衍生物。在一些實施方案中，rna依賴性dna缺乏rnaseh活性（例如，由invitrogen，1600faradayavenue，pobox6482，carlsbad，calif.92008銷售的superscriptiii?）。在一些實施方案中，具有rna依賴性dna聚合酶活性的酶也具有dna依賴性dna聚合酶活性，并且用于逆轉錄和擴增步驟兩者。

在任何一種主題方法中，環(huán)引物的引物延伸的條件可以取決于靶、第一引物的雜交要求、聚合酶、對其他試劑的要求和所需結果而變。改變引物延伸條件的方法是本領域已知的。許多試劑是商購可得的，并且可以優(yōu)化濃度以達到期望的結果。典型的逆轉錄程序的非限制性實例包括在約42℃下進行約120分鐘的引物延伸和通過在約80℃或高于約80℃的溫度下溫育約5分鐘使酶失活的步驟。用于延伸的溫育溫度可以取決于所提及的因素而變，并且可以包括約、多于約或小于約25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃的溫度或其間的任何溫度。在一些實施方案中，延伸反應的溫育溫度為48℃至52℃。用于延伸的溫育時間也可以改變，以包括約、多于約或小于約1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、180或更多分鐘。失活時間和溫度可以是達到酶失活的任何溫度，并且可以包括但不限于約、多于約或小于約70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃的溫度，以及約或多于約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多分鐘的時間。引物延伸之前可以是或不是熱變性步驟，以破壞rna分子之間的分子間和分子內相互作用。在一些實施方案中，引物延伸之前不進行熱變性步驟。在一些實施方案中，逆轉錄程序不包括熱失活步驟。在一些實施方案中，逆轉錄和pcr步驟是整合的，在單個管中執(zhí)行。然后可以在環(huán)境溫度下執(zhí)行逆轉錄，其中優(yōu)選熱啟動的聚合酶具有低活性。逆轉錄酶優(yōu)選是莫洛尼鼠白血病病毒（m-mlv）或禽成髓細胞瘤病毒（amv）的天然或改造的變體。也可以使用具有兩種活性的單一酶，例如pyrophage（lucigeninc.）執(zhí)行rt-pcr。

需要時，使用聚合酶鏈反應（pcr）酶促擴增第一互補核酸分子。該技術通常使用dna依賴性dna聚合酶，其是能夠催化dna聚合的酶。該方法的一個應用是檢測或分離以低拷貝數(shù)存在的核酸。在某些方面，聚合酶在約或高于約20℃、23℃、25℃、37℃、42℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或更高下是活性的。在一些實施方案中，主題方法利用熱穩(wěn)定聚合酶。示例性的熱穩(wěn)定聚合酶包括但不限于嗜熱棲熱菌（thermusthermophilus）hb8（參見例如美國專利號5,789,224和美國公開20030194726）；突變型thermusoshimai；水管致黑棲熱菌（thermusscotoductus）、嗜熱棲熱菌（thermusthermophilus）1b21；嗜熱棲熱菌gk24；水生棲熱菌（thermusaquaticus）聚合酶（amplitaq?fs或taq（g46d；f667y）（參見例如美國專利號5,614,365）、taq（g46d；f667y；e6811）和taq（g46d；f667y；t664n；r660g）；激烈熱球菌（pyrococcusfuriosus）聚合酶；thermococcusgorgonanus聚合酶；熱球菌屬（pyrococcus）物種gb-d聚合酶；熱球菌屬（thermococcus）物種（菌株9°n-7）聚合酶；嗜熱脂肪芽孢桿菌（bacillusstearothermophilus）聚合酶；tsp聚合酶；thermalace?聚合酶（invitrogen）；黃棲熱菌（thermusflavus）聚合酶；thermuslitoralis聚合物；棲熱菌屬z05聚合物；δz05聚合物（例如δz05golddna聚合物）；及其突變體、變體或衍生物。示例性的非熱穩(wěn)定聚合酶包括但不限于dna聚合酶i；突變型dna聚合酶i，包括但不限于klenow片段和klenow片段（減去3'至5'個核酸外切酶）；t4dna聚合酶；突變型t4dna聚合酶；t7dna聚合酶；突變型t7dna聚合酶；phi29dna聚合酶；和突變型phi29dna聚合酶。在一些實施方案中，在引物延伸步驟中使用的具有dna依賴性dna聚合酶活性的酶是在第一引物延伸步驟中用于第一引物的引物延伸的相同酶，使得所述酶還具有rna依賴性dna聚合酶活性。

在一些實施方案中，主題方法利用熱啟動聚合酶。熱啟動聚合酶是需要熱活化的修飾形式的dna聚合酶（參見例如美國專利號6,403,341和7,122,355，通過引用在此整體并入）。這種聚合酶可以用于例如進一步增加靈敏度、特異性和產率；和/或進一步改善低拷貝靶擴增。通常，熱啟動酶以非活性狀態(tài)提供。在熱活化后，釋放修飾或修飾劑，生成活性酶。許多熱啟動聚合酶可從不同商業(yè)來源獲得，例如appliedbiosystems；bio-rad；eenzymellc；eppendorfnorthamerica；finnzymesoy；genechoice，inc.；invitrogen；jenabiosciencegmbh；midsci；minervabiolabsgmbh；newenglandbiolabs；novagen；promega；qiagen；rocheappliedscience；sigma-aldrich；stratagene；takaramirusbio；usbcorp.；yorkshirebioscienceltd；等等。

主題方法可用于同時產生具有不同序列的不同靶多核苷酸的互補序列?？梢酝ㄟ^在延伸反應中使用多于一種不同的環(huán)引物來達到多于一種不同的第一互補核酸分子的生成，每種不同的環(huán)引物在其3'端處具有不同的第一序列，與多個不同的多核苷酸分子靶之一的至少一部分具有互補性。在一些實施方案中，可以選擇這些不同的環(huán)引物序列，以具有與目的特定多核苷酸分子靶的至少一部分具有互補性的限定序列。在其他實施方案中，環(huán)引物序列是隨機和未限定的或接近隨機的，其中沿環(huán)引物序列的某些位置偏向一個或多個核苷酸，例如，包含從兩種或更多種不同核苷酸隨機選擇的一個或多個核苷酸?？梢越M合多種不同的環(huán)引物，不同環(huán)引物各自的濃度相同或不同，以產生環(huán)引物的“庫”。這種環(huán)引物庫的使用允許同時產生多種不同的第一互補核酸分子，各自與多種不同的多核苷酸分子靶之一具有互補性。

在方法的一個進一步的實施方案中，多于一種不同的第一互補多核苷酸分子用作擴增的模板以產生多個拷貝。這可以通過在擴增反應中使用多于一組正向和反向引物來達到，每種不同的引物在其3'端處具有不同的第二序列，與多個不同的第一互補多核苷酸靶之一的至少一部分具有互補性。在一些實施方案中，可以選擇這些不同的正向和反向引物，以具有與目的特定第一dna分子靶的至少一部分具有互補性的限定序列。在其他方面，不同的正向和反向引物是隨機和未限定的或接近隨機的，其中沿序列的某些位置偏向一個或多個核苷酸，例如從兩種或更多種不同核苷酸隨機選擇的一個或多個核苷酸?？梢越M合多種不同的正向和反向引物，不同引物各自的濃度相同或不同，以產生二級引物的“庫”。與環(huán)引物庫組合的這種二級引物庫的使用允許同時產生多種不同的第一互補序列分子，各自與多種不同靶多核苷酸分子靶之一的至少一部分具有互補性。

用于生產或擴增第一dna分子的庫中的引物組合可以是多種選項中的任何一種。使用第一引物庫生產第一dna分子隨后可以為使用具有第二序列的一種或多種選擇第二引物的擴增，所述第二序列與一個或多個選擇的第一dna分子具有互補性?？商娲?，使用第一引物庫生產第一dna分子隨后可以為使用第二引物庫的擴增，其中庫含有用于引物延伸反應的預期第一dna分子產物各自的第二引物。在仍另外一個實施方案中，可以加入一對或多對第一和第二引物，以使用第一引物庫擴增通過引物延伸產生的一個或多個第一dna分子。引物庫無需含有完全重疊的rna子集和互補的第一dna分子靶。

產生關于靶多核苷酸的互補序列和/或擴增雙鏈靶多核苷酸的主題方法可以在相同的反應位點（例如包含在容器中）執(zhí)行。用于產生互補序列的試劑和用于隨后擴增的試劑可以同時或序貫加入。在一些實施方案中，用于進行環(huán)引物延伸反應和擴增反應兩者的所有試劑一起加入，使得兩個反應可以在無需樣品的進一步操作下進行。在一些實施方案中，在環(huán)引物延伸反應后添加用于進行擴增反應的一種或多種試劑。在一些實施方案中，第一互補分子的擴增在與用于通過環(huán)引物的引物延伸產生第一dna分子的分開容器中進行。當轉移環(huán)引物延伸產物時，可以使用完全反應體積或其一部分。來自單環(huán)引物延伸反應的多重部分可以轉移到多個分開的容器中，以便進行多重擴增反應。單獨的反應容器可以具有與引物延伸反應中使用的相同或不同的類型。反應容器的非限制性實例包括微量離心管、錐形管、薄壁管、條管、多孔板、微流體裝置和微陣列。

需要時，反應的不同步驟可以用偶聯(lián)至支持物的一種或多種引物（例如環(huán)引物、正向或反向引物）發(fā)生。在一些實施方案中，一個或多個環(huán)引物偶聯(lián)至固體支持物。在一些實施方案中，環(huán)連同正向和反向引物中的一種或多種偶聯(lián)至支持物。偶聯(lián)可以以多種方式實現(xiàn)，其非限制性實例包括兩種或更多種分子之間的共價連接、靜電相互作用和分子間相互作用。不同種類的固體支持物是本領域已知的，其非限制性實例包括晶片、芯片、珠、孔、板、微流體裝置、微陣列和不同尺寸的管。固體支持物可以由能夠支持這種偶聯(lián)的各種材料構成，所述材料的非限制性實例包括硅、塑料、玻璃、聚合物、金屬和半導體材料。

在實踐一種或多種主題方法時，可以利用設計為同時擴增多種不同靶多核苷酸分子的反應容器，每種不同靶分子在不同位置中擴增。這可以以各種方式達到。在一個實施方案中，多個不同位置各自包含例如在陣列中具有第二序列的一個或多個引物，所述第二序列與特異性第一互補序列分子的至少一部分互補。不同的位置各自可以進一步包括用于生成和擴增特定靶多核苷酸的相應環(huán)引物。引物可以或可以不物理偶聯(lián)至其各自不同的位置?？商娲?，偶聯(lián)至具有第二序列（其與特定第一互補序列分子的至少一部分具有互補性）的一種或多種引物的珠在與偶聯(lián)至具有不同第二序列的一種或多種第二引物的其他珠的不同位置中分離，其中例如通過水包脂質乳劑或在表面上排列來達到分離。在一些實施方案中，通過第一互補序列分子的引物延伸的產生在不同位置中的擴增之前在溶液中游離完成。在其他實施方案中，例如當環(huán)引物以及正向和反向引物的第二引物組位于不同位置中時，通過第一互補序列分子的引物延伸的產生在不同位置中進行。

靶核苷酸序列或其區(qū)域的擴增可以在聚合酶鏈反應期間以多個循環(huán)執(zhí)行。期望數(shù)目的擴增循環(huán)可以在1至45個擴增循環(huán)之間，例如1至25個擴增循環(huán)，或例如5至35個擴增循環(huán)，或例如10至45個擴增循環(huán)。循環(huán)參數(shù)將變化，并且可以基于許多因素進行優(yōu)化，所述因素包括但不限于引物序列、引物解鏈溫度、靶分子的長度、靶序列、靶的復雜性、靶群體的復雜性、聚合酶的最佳活性、以及其他試劑的要求。典型pcr方案的非限制性實例如下：（1）95℃10分鐘，（2）95℃20秒，（3）50℃20秒，（4）72℃1分鐘，（5）重復步驟2至4四十次，（6）72℃10分鐘，其中步驟（1）至（6）分別對應于初始解鏈、循環(huán)解鏈、雜交、延伸、循環(huán)計數(shù)和最終延伸。對于每個反應可以優(yōu)化每個步驟的溫度和持續(xù)時間，如從一個步驟到下一個步驟的溫度變化速率一樣。在一些實施方案中，可能能夠組合步驟（3）（退火）和步驟（4）（延伸），并且可以完全排除步驟（6）。這種pcr方案的非限制性實例如下：（1）95℃10分鐘，（2）95℃15秒，（3）60℃1分鐘，（4）重復步驟2通過339次。在一些實施方案中，雜交溫度為約、至少約或至多約20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或更高。在一些實施方案中，雜交步驟的持續(xù)時間為約、至少約或至多約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、45、60、90、120或更多秒。在一些實施方案中，可能期望包括解鏈曲線分析。解鏈曲線分析參數(shù)的非限制性實例如下：（1）95℃15秒，（2）60℃15秒，（3）95℃15秒。

擴增反應的成功可以通過在擴增過程期間（例如實時）或擴增過程之后經由使用可檢測標記物（例如探針或標記）檢測擴增產物來確定。例如，擴增的dna分子可以通過染料（例如，sybr綠）的存在來檢測且定量，所述染料在本發(fā)明方法的pcr擴增步驟期間優(yōu)先或排他地結合雙鏈dna。例如，molecularprobes，inc.（29851willowcreekroad，eugene，oreg.97402）銷售包括sybr綠染料的定量pcr反應混合物。作為進一步的實例，可以用于標記在實時pcr期間產生的雙鏈dna的另一種染料（稱為“bebo”）由bengtsson，m.等人，nucleicacidsresearch31（8）:e45（2003年4月15日）描述，所述出版物通過引用并入本文。例如，包括熒光團和猝滅劑的第一和/或第二引物可以用于引發(fā)本發(fā)明方法的pcr擴增步驟。在pcr期間在標記引物的延伸之后發(fā)生的熒光團和猝滅劑的物理分離允許熒光團發(fā)熒光，并且熒光可以用于測量pcr擴增產物的量。包括熒光團和猝滅劑的商購可得引物的實例包括scorpion引物和uniprimers，它們都由molecularprobes，inc銷售。

在一些實施方案中，多重擴增中存在的寡核苷酸探針適合于監(jiān)測作為時間函數(shù)產生的擴增產物的量。這樣的寡核苷酸探針包括但不限于5'-核酸外切酶測定（例如taqman?）探針（參見上文以及美國專利號5,538,848）、莖-環(huán)分子信標（參見例如美國專利號6,103,476和5,925,517以及tyagi＆kramer，1996）、無莖或線性信標（參見例如wo99/21881）、pna分子信標（參見例如美國專利號6,355,421和6,593,091）、線性pna信標（參見例如kubista等人、2001）、非fret探針（參見例如美國專利號6,150,097）、sunrise??/amplifluor??探針（參見例如美國專利號6,548,250）、莖-環(huán)和雙鏈體scorpion?探針（參見例如solinas等人，2001和美國專利號6,589,743）、凸環(huán)探針（參見例如美國專利號6,590,091）、假結探針（參見例如美國專利號6,548,250）、環(huán)狀體（cyclicon）（參見例如美國專利號6,383,752）、mgbeclipse?探針（epochbiosciences）、發(fā)夾探針（參見例如美國專利號6,596,490）、肽核酸（pna）點亮探針、自裝配納米顆粒探針和二茂鐵修飾的探針例如在美國專利號6,485,901；mhlanga等人，2001；whitcombe等人，1999；isacsson等人，2000；svanvik等人，2000；wolffs等人，2001；tsourkas等人，2002；riccelli等人，2002；zhang等人，2002；maxwell等人，2002；broude等人，2002；huang等人，2002；和yu等人，2001中描述。

在某些實施方案中，標記附著至一個或多個探針并且具有下述性質中的一種或多種：（i）提供可檢測信號；（ii）與第二標記相互作用，以修飾由第二標記提供的可檢測信號，例如fret（熒光共振能量轉移）；（iii）穩(wěn)定雜交，例如雙鏈體形成；和（iv）提供結合復合物或親和組的成員，例如親和性、抗體/抗原、離子復合物、半抗原/配體（例如生物素/抗生物素蛋白）。在仍另外其他方面，可以使用大量已知技術中的任何一種，采用已知的標記、連接、連接基團、試劑、反應條件、以及分析和純化方法來完成標記的使用。

標記的其他非限制性實例包括生成或淬滅可檢測的熒光、化學發(fā)光或生物發(fā)光信號的發(fā)光、光散射和光吸收化合物（參見例如kricka，1992）和garman，1997）。可用作標記的熒光報告染料包括但不限于熒光素（參見例如美國專利號5,188,934；6,008,379；和6,020,481）、羅丹明（參見例如美國專利號5,366,860；5,847,162；5,936,087；6,051,719；和6,191,278）；苯并吩噁嗪（參見例如美國專利號6,140,??500）、包含供體和受體對的能量轉移熒光染料（參見例如美國專利號5,863,727；5,800,996；和5,945,526）和花青素（參見例如kubista，wo97/45539）、以及能夠生成可檢測信號的任何其他熒光部分。熒光素染料的實例包括但不限于6-羧基熒光素；2',4',1,4,-四氯熒光素；和2',4',5',7',1,4-六氯熒光素。在某些方面，熒光標記選自sybr?綠、6-羧基熒光素（“fam”）、tet、rox、vic?和joe。在某些實施方案中，標記是放射性標記。

在再一個進一步的實施方案中，標記是雜交穩(wěn)定部分，其作用于增強、穩(wěn)定或影響雙鏈體的雜交，例如嵌合劑和嵌入染料（包括但不限于溴化乙錠、evagreen?和sybr?綠）、小溝粘合劑和交聯(lián)官能團（參見例如blackburn，g.和gait，m.編輯"dnaandrnastructure"于nucleicacidsinchemistryandbiology（1996）。標簽包括通過特異性或非特異性捕獲實現(xiàn)分子分離或固定的那些標記，例如生物素、地高辛和其他半抗原（參見例如，andrus，1995）。

在一些實施方案中，不同的探針包括可彼此區(qū)別的可檢測和不同的標記。例如，在某些實施方案中，標記是能夠在不同的光譜可分辨的波長下發(fā)光的不同熒光團（例如，4種不同顏色的熒光團）；某些此類標記的探針是本領域已知的并且在上文以及美國專利號6,140,054和saiki等人，1986中描述。

在一些實施方案中，可檢測標記物用于在擴增反應完成后確定靶核酸分子的存在、不存在、相對豐度和/或數(shù)量。在一些實施方案中，可檢測標記物是探針。在一些實施方案中，多種不同的探針用于同時檢測多種不同的靶核酸分子擴增產物。探針可以結合到固體表面，例如在珠或陣列上?？梢圆贾藐嚵猩系奶结?，使得每個探針的位置是已知的，并且擴增產物與探針的雜交的檢測鑒定擴增產物?？捎糜跈z測和/或定量非編碼rna分子的探針和陣列的實例在通過引用并入本文的us20080045418和us20080312099中提供。

本文公開的方法適用于產生任何類型的靶核酸分子的互補序列，包括但不限于dna。在一些實施方案中，靶多核苷酸是rna分子。在一些實施方案中，靶多核苷酸是非編碼rna分子。在一些實施方案中，非編碼rna分子選自：成熟微小rna分子、前體微小rna分子、初級微小rna分子、sirna分子、pirna分子、piwirna、lncrna、rrna和shrna分子。在一些實施方案中，靶多核苷酸長度小于100nt。在一些實施方案中，靶多核苷酸長度小于50nt。

在任何公開的方法中可用作擴增靶的非編碼rna分子可以從任何生物，例如真核生物或其部分，包括器官、組織和/或各個細胞包括培養(yǎng)細胞中分離?？梢允褂冒ò衦na的任何合適的制劑，例如總rna、純化的小rna或者含有rna和dna兩者的樣品?？梢酝ㄟ^涉及細胞裂解的程序從細胞中分離rna，并且可以進一步涉及其中包含的蛋白質的變性。由其提取rna的細胞可以是野生型細胞、操作的野生型細胞、修飾的細胞和操作的修飾的細胞，其中操作包括但不限于藥物治療。

可用作本發(fā)明方法中的擴增靶的短dna分子可以從任何生物，例如真核生物或其部分，包括器官、組織和/或各個細胞包括培養(yǎng)細胞中分離，使用本領域已知的另外的標準步驟以去除一些或全部dna。細胞裂解和核酸提取的程序是本領域眾所周知的。這種程序的非限制性實例包括下述。可以用例如非離子去污劑完成細胞裂解，隨后為微量離心以去除細胞核，且由此去除細胞dna的大部分?？梢允褂昧蚯杷犭伊呀鈴牟煌愋偷哪康募毎刑崛na，隨后為cscl離心以使rna與dna分離（參見chirgwin等人，1979，biochemistry18:5294-5299）。rna的提取和任選地與dna的分離也可以通過有機提取，例如用苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇或類似制劑（包括trizol（invitrogen）和trireagent（appliedbiosystems））來完成。提取技術的其他非限制性實例包括：（1）有機提取，隨后為乙醇沉淀，例如在某些實施方案中使用苯酚/氯仿有機試劑（ausubel等人，1993），使用自動化核酸提取器，例如可得自appliedbiosystems（carlsbad，calif.）的model341dnaextractor；（2）固相吸附法（美國專利號5,234,809；walsh等人，1991）；和（3）鹽誘導的核酸沉淀方法（miller等人，（1988），這種沉淀方法通常稱為“鹽析”方法。在某些實施方案中，上述分離方法之前可以為酶消化步驟，以幫助從樣品中消除不想要的蛋白質，例如，用蛋白酶k或其他類似蛋白酶消化。參見例如美國專利號7,001,724，如果需要，則可以將rnase抑制劑加入裂解緩沖液中。對于某些細胞類型，可能期望向方案中加入蛋白質變性/消化步驟。含有rna的樣品可以包含多種不同的rna分子，每種不同的rna分子具有不同的核苷酸序列。

主題方法可特別用于擴增短靶序列包括短rna分子。具有接頭序列d的添加長度的環(huán)引物對第一互補序列添加長度用于隨后的擴增。在一些實施方案中，靶多核苷酸為長度小于100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt或15nt。

組合物：

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的組合物，所述組合物包含環(huán)引物、正向引物和反向引物，其中：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）序列a和靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）序列b和靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）反向引物，其顯示出與相對于序列a'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（c）正向引物，其與接頭序列中的序列特異性雜交。

在主題組合物中體現(xiàn)的環(huán)引物可以是具有上文部分公開的一種或多種特征的任何環(huán)引物。例如，環(huán)引物包含在其兩端處與靶多核苷酸的兩段互補性。該組合物中使用的序列a是在環(huán)引物的5'端處的互補段，并且該組合物中使用的序列b是在環(huán)引物的3'端處的互補段。在該組合物中使用的這兩個序列與靶多核苷酸的序列a'和b'堿基配對，其中a'定位比b'更5'。在另一個例子中，序列a'和b'彼此非常接近，并且它們僅通過在靶多核苷酸上的n'序列分開。在其他實施方案中，序列a和a'可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在其他例子中，序列b和b'可以是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。序列n'可以是1、2、3、4或5個核苷酸。

需要時，環(huán)引物可以包含上文部分中公開的任何其他特征。例如，可能期望設計定位接近于靶多核苷酸的3'端的a'和b'區(qū)。這種選擇確保足夠數(shù)目的靶多核苷酸序列是a-a'和b-b'雜交的5'，以包括在第一互補序列中。例如，序列a為長度約2nt至約10nt或2nt至約5nt，并且序列b為長度約2nt至約10nt或長度2nt至約5nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度為約5nt至約20nt、或5nt至約15nt、或5nt至約10nt。在一些實施方案中，序列a和b的組合長度足以與靶多核苷酸特異性雜交，以實現(xiàn)環(huán)引物的延伸。在一些實施方案中，當最佳比對時，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少80%、85%、90%、95%、99%或100%互補。在一些實施方案中，序列b和a的線性串聯(lián)與序列a'和b'的線性串聯(lián)至少90%、95%、99%或100%互補。在一些實施方案中，序列a'的3'端在序列b'的1nt至約5nt內。

在一些實施方案中，序列b中的核苷酸數(shù)目可以大于序列a中的核苷酸數(shù)目，以增加效率，使得在從序列b的3'端的引物延伸的延長期間，aa'雜交被敲除，在一些實施方案中，序列a和b在核苷酸堿基中具有相等的長度，包含至少3、4、5、6、7、8、9或10個但不超過約50個核苷酸。在另一個實施方案中，序列a是2個核苷酸，并且序列b是3個核苷酸。在另一個實施方案中，序列a是2個核苷酸，并且序列b是4個核苷酸。在另一個實施方案中，序列a是3個核苷酸，并且序列b是4個核苷酸。

環(huán)引物中的序列a和b之間的核苷酸數(shù)目一般對應于序列n'和n的長度，這可能影響在第一互補鏈合成期間在序列b的3'端處的聚合酶延伸效率。在一些實施方案中，序列a'的3'端在序列b'的5'端的1nt至約10nt內、1nt至約5nt內、或2nt至約5nt內。

在一些實施方案中，環(huán)引物被設計為檢測單核變化。例如，一對環(huán)引物在序列a和b中的一個堿基位置中不同，使得一個識別靶序列的一個等位基因，并且另一個識別靶序列的不同等位基因。環(huán)引物在環(huán)序列d中也不同，并且可以被選擇性擴增和/或檢測。

主題環(huán)引物中的接頭序列d一般被設計為具有足夠的長度用于aa'和b-b'兩者的雜交，其依次又增加環(huán)引物結合正確小rna靶的特異性。在一個實施方案中，接頭序列為約5至約100、10至約80、或20至約50個核苷酸。在一些其他實施方案中，接頭序列為長度約10、20、30、40、50、60、70、80、90或約100個核苷酸。

需要時，主題方法中的使用或主題組合物中存在的接頭序列包含選自下述的一種或多種序列元件：一種或多種條形碼序列、一種或多種限制性酶識別序列、一種或多種寡核苷酸探針結合序列或其互補體、一種或多種測序引物退火序列或其互補體、以及這些序列的組合。在一些實施方案中，接頭序列包含多種不同環(huán)引物共有的通用序列。

在一些實施方案中，接頭序列包含獨特的序列以有助于隨后檢測，定量目的靶多核苷酸的產生的互補序列。在產生第一互補體序列后，接頭序列的一部分與正向引物互補。因此，在接頭序列內具有特定條形碼可以允許不同的環(huán)引物通過不同的正向引物但相同的反向引物擴增、檢測或定量。在一些實施方案中，一個環(huán)引物的序列a和b可以結合與另一個環(huán)引物的序列a和b的相同靶多核苷酸略微不同的區(qū)域，這允許更大的特異性和/或用戶驗證。由于接頭序列中不同的條形碼，通過不同的正向引物不同地結合，可以促進這些不同環(huán)引物的后續(xù)擴增、檢測和定量。

在一些實施方案中，接頭包含一種或多種限制性酶識別序列。擴增后，用限制性消化可以顯著改善檢測的準確度，使得僅含有接頭序列限制位點的從第一互補體序列擴增的真正產物被切割并且列表用于檢測和定量。

在其他實施方案中，接頭序列包含一種或多種寡核苷酸探針結合序列、寡核苷酸探針結合序列的互補體、引物退火序列或引物退火序列的互補體。在擴增期間，以序列特異性方式雜交的另外探針（如taqman）或增加擴增特異性的另外引物可以利用這些序列，以允許關于靶多核苷酸的第一互補序列的準確擴增的更大保證。

在其他實施方案中，接頭序列包含與反應混合物中利用的所有環(huán)引物共同的區(qū)域。所有環(huán)引物共有的這種接頭序列可以降低檢測和定量的成本，因為隨后的探針（例如taqman）、酶促消化及其序列、正向引物和作用于環(huán)引物的任何其他試劑可以跨越用于檢測許多不同的靶多核苷酸的許多不同環(huán)引物在用途中是通用的。

在一些實施方案中，主題組合物以脫水形式制備。在一些實施方案中，將主題組合物包裝在容器中。例如，容器可以是孔、板、管、室、燒瓶、瓶、注射器、流動池、芯片等等。

在一些實施方案中，將主題組合物包裝為含有上述方法、組合物、反應混合物、測試和/或系統(tǒng)中公開的任何一種或多種元素的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包含在一個或多個容器中的本發(fā)明的組合物。例如，試劑盒可以包括下述的一種或多種：包含與之附著的寡核苷酸的一種或多種固體支持物、用于附著至固體支持物的一種或多種寡核苷酸、一種或多種環(huán)引物、一種或多種擴增引物、利用這些中的任何的試劑、以及使用這些中的任何的說明書。在一些實施方案中，試劑盒進一步包含下述的一種或多種：（a）dna連接酶，（b）dna依賴性dna聚合酶，（c）rna依賴性dna聚合酶，（d）隨機引物，（e）具有3'至5'核酸外切酶活性的依賴性dna聚合酶，（f）多個引物，每個引物具有多個所選序列之一，（g）dna激酶，（h）dna核酸外切酶，（i）磁珠和（j）適合于試劑盒中包含的一種或多種元素的一種或多種緩沖液。引物、其他寡核苷酸和試劑可以是但不限于本文所述的任何一種。試劑盒的元素可以進一步無限制地以任何量和/或組合提供（例如在相同的試劑盒或相同的容器中）。試劑盒可以進一步包含根據(jù)本發(fā)明的方法使用的另外試劑。試劑盒元素可以在任何合適的容器中提供，包括但不限于試管、小瓶、燒瓶、瓶、安瓿、注射器等等。試劑可以以可直接用于本發(fā)明方法的形式提供，或以需要在使用前制備的形式提供，例如在凍干試劑的重構中。試劑可以以等分試樣提供以用于一次性使用或作為儲備物，由其可以獲得例如在多個反應中的多次使用。

在一個實施方案中，試劑盒可以包括包含下述組分中的一種或多種的反應混合物：靶多核苷酸、本文公開的環(huán)引物、正向引物、反向引物和聚合酶，以產生可檢測量的擴增子，其中所述靶多核苷酸為長度小于約100nt。

需要時，主題試劑盒的組分可以在容器中在水性介質中或以凍干形式包裝。當試劑盒中存在多于一種組分時，試劑盒一般還含有其中另外的組分可以分開置于其內的第二、第三或其他另外的容器。然而，組分的不同組合可以包含在一個或多個小瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常還包括用于商業(yè)銷售的用于容納引物、探針、緩沖液、稀釋劑的容器和/或在封閉式(closeconfinement)的任何其他試劑容器。這種容器可以包括所需小瓶保留在其中的注射或吹塑成型的塑料容器。當包含用于產生關于靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的組合物的試劑盒的組分在一種或多種液體溶液中提供時，液體溶液通常是水溶液，其中無菌水溶液是特別優(yōu)選的。然而，試劑盒的組分可以作為干燥粉末提供。當試劑和/或組分作為干粉形式提供時，可以通過加入合適的溶劑來重構粉末。設想溶劑也可以在另一個容器裝置中提供。

在一些實施方案中，主題試劑盒包括給用戶的關于如何使用試劑盒組分產生關于靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的說明書。

需要時，主題試劑盒可以進一步包含一種或多種可檢測標記物，以能夠例如實時監(jiān)測擴增產物的累積。可檢測標記物的非限制性實例在上文描述，并且包括在pcr擴增步驟期間優(yōu)先或排他地結合雙鏈dna的染料，例如sybr綠染料或bebo染料。在其他實施方案中，試劑盒可以包括第一和/或第二引物，其包括熒光團和猝滅劑以測量pcr擴增產物的量。在一些實施方案中，試劑盒進一步包含上述任何種類的探針，以檢測擴增反應的進展或產物。

主題試劑盒可以進一步包含產生關于靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列所必需的一種或多種試劑。例如，試劑盒可以包含可以用于合成第一dna分子的任何rna依賴性dna聚合酶。rna依賴性dna聚合酶的非限制性實例包括來源于莫洛尼鼠白血病病毒（mmlv-rt）、禽成髓細胞瘤病毒（amv-rt）、牛白血病病毒（blv-rt）、勞斯肉瘤病毒（rsv-rt）、人免疫缺陷病毒（hiv-rt）、勞斯相關病毒（rav-rt）、成髓細胞瘤相關病毒（mav-rt）或其他禽肉瘤白血病病毒（aslv-rt）的逆轉錄酶（rt）、棲熱菌屬z05聚合酶、δz05聚合酶及其任何修飾形式或衍生物。在一些實施方案中，rna依賴性dna缺乏rnaseh活性（例如，由invitrogen，1600faradayavenue，pobox6482，carlsbad，calif.92008銷售的superscriptiii?）。在一些實施方案中，具有rna依賴性dna聚合酶活性的酶也具有dna依賴性dna聚合酶活性，并且用于反應混合物中的逆轉錄和擴增步驟兩者。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的反應混合物，所述反應混合物包含環(huán)引物、正向引物和反向引物，其中：（a）環(huán)引物，其包含在單鏈上從5'至3'定向的序列a、接頭序列和序列b；其中所述環(huán)引物經由下述與靶多核苷酸特異性雜交：（i）序列a和靶多核苷酸上的序列a'之間的序列互補性，和（ii）序列b和靶多核苷酸上的序列b'之間的序列互補性，其中序列a'和序列b'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）反向引物，其顯示出與相對于序列a'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（c）正向引物，其與接頭序列中的序列特異性雜交。

在反應混合物中使用的靶多核苷酸可以是短的非編碼rna或任何其他短rna，包括微小rna或上文方法部分中描述的任何其他靶多核苷酸。類似地，本文公開的任何環(huán)引物均可用于反應混合物中。環(huán)引物的特定序列的選擇將取決于待生成的靶多核苷酸序列。

反應混合物可以包含產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列所必需的試劑，包括酶、緩沖液等等。例如，反應混合物可以包含可以用于合成第一dna分子的任何rna依賴性dna聚合酶。rna依賴性dna聚合酶的非限制性實例包括來源于莫洛尼鼠白血病病毒（mmlv-rt）、禽成髓細胞瘤病毒（amv-rt）、牛白血病病毒（blv-rt）、勞斯肉瘤病毒（rsv-rt）、人免疫缺陷病毒（hiv-rt）、勞斯相關病毒（rav-rt）、成髓細胞瘤相關病毒（mav-rt）或其他禽肉瘤白血病病毒（aslv-rt）的逆轉錄酶（rt）、棲熱菌屬z05聚合酶、δz05聚合酶及其任何修飾形式或衍生物。在一些實施方案中，rna依賴性dna缺乏rnaseh活性（例如，由invitrogen，1600faradayavenue，pobox6482，carlsbad，calif.92008銷售的superscriptiii?）。在一些實施方案中，具有rna依賴性dna聚合酶活性的酶也具有dna依賴性dna聚合酶活性，并且用于反應混合物中的逆轉錄和擴增步驟兩者。

在一些實施方案中，本發(fā)明的反應混合物進一步包含具有鉀鹽（例如氯化鉀）、鎂鹽（例如氯化鎂）、還原劑（例如二硫蘇糖醇）、脫氧核苷三磷酸（例如dntp）、去污劑、核苷酸或核苷酸類似物的緩沖液，以及用于實時監(jiān)測擴增產物累積的一種或多種可檢測標記物。

在一些實施方案中，用于產生關于樣品中的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列的反應混合物在本文公開的容器中。在一些實施方案中，容器是孔、板、管、室、流動池或芯片。

主題方法和組合物可特別用于從小核酸靶分子例如mirna分子產生和擴增cdna分子?？梢詼y量dna分子的量，其可以提供原材料中的靶小核酸分子的量的測量。例如，本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)可以用于測量活細胞中的特異性非編碼rna分子（例如特異性mirna分子）的量。例如，本發(fā)明可以用于測量活體中的不同細胞類型中的特異性非編碼rna分子（例如特異性mirna分子）的量，從而產生在體內的特異性非編碼rna分子分布的“圖譜”。另外，本發(fā)明可以用于測量響應刺激（例如響應用藥物治療活細胞群體）在特異性非編碼rna分子（例如特異性mirna分子）的量中的變化。

本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)的實施方案可以用于診斷和/或評價患者中的狀況或潛在狀況，其包括測量一種或多種小核酸，例如來自患者的樣品中的mirna的表達。來自患者的樣品中的表達和參考（例如正?；蚍遣±順悠分械谋磉_）中的差異可以指示病理性、疾病或癌性狀況或其風險。樣品可以取自患有或疑似患有疾病或病理狀況的患者。在某些方面，樣品可以是但不限于組織（例如活檢樣品，特別是針吸活檢樣品）、血液、血清、血漿、胰液或其他體液。樣品可以是新鮮的、冷凍的、固定的（例如福爾馬林固定的）、包埋的（例如石蠟包埋的）或這些的組合（例如福爾馬林固定和石蠟包埋的）。

本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)在用于許多疾病或狀況的小核酸樣品的診斷篩選中特別有利。在某些實施方案中，診斷方法涉及鑒定在指示疾病或狀況的樣品（非正常樣品）中差異表達的一種或多種rna，例如mirna。在某些實施方案中，診斷疾病或狀況涉及檢測和/或定量所表達的非編碼rna（和任選的一種或多種編碼rna）。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法用于比較與狀況相關的一個或多個樣品以及與狀況無關的一個或多個樣品之間的非編碼rna的存在、不存在、相對豐度和/或數(shù)目，并且從而建立一種或多種非編碼rna的存在、不存在、相對豐度和/或數(shù)目與狀況之間的關聯(lián)性。與疾病表型相關的rna稱為“生物標記物”。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了比傳統(tǒng)定量逆轉錄酶pcr（qrt-pcr）方法（其依賴更長的擴增子（例如60-200nt））更短（例如<30nt）的擴增子的檢測。臨床樣品經常遭受廣泛的rna降解，如果靶的擴增子大小與降解的rna大約相同大小或更大，則這可能限制檢測的靈敏度。使用較短的擴增子來檢測靶改善了即使高度降解，靶也將被指數(shù)擴增的可能性。此外，使用較短的靶特異性擴增子來檢測rna可以提供在福爾馬林固定石蠟包埋（ffpe）樣品中的rna的靈敏定量，其中rna可以通過經由固定過程的共價修飾而受損，以及被包埋過程中使用的高溫降解。

本發(fā)明還可以用于檢測傳染病中的核酸，例如rna病毒如hiv、hcv和其他微生物。本發(fā)明還可以具有用于檢測疾病例如白血病中的疾病特異性非編碼rna的效用，其中精確生物標記物的了解可以具有預后價值，以及指導治療決策和疾病管理的其他方面，例如預測對所選擇治療的響應性。

特別地，本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)可以用于評估關于疾病或狀況的樣品，所述疾病或狀況包括但不限于：阿爾茨海默氏病，黃斑變性，慢性胰腺炎；胰腺癌；aids，自身免疫性疾病（類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病-胰島素依賴性和非依賴性、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和格雷夫斯?。话┌Y（例如惡性、良性、轉移性、癌前期）；心血管疾病（心臟病或冠狀動脈疾病、中風缺血性和出血性以及風濕性心臟?。?；神經系統(tǒng)疾病；以及通過致病性微生物的感染（足癬、水痘、普通感冒、腹瀉病、流行性感冒、生殖器皰疹、瘧疾、腦膜炎、肺炎、竇炎、皮膚疾病、鏈球菌性咽炎、結核、尿道感染、陰道感染、病毒性肝炎）；炎癥（過敏、哮喘）；朊病毒疾?。ɡ鏲jd、庫魯病、gss、ffi）。

可以通過本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)評估的癌癥包括包含細胞的癌細胞，以及來自膀胱、血液、骨、骨髓、腦、乳腺、結腸、食道、胃腸道、牙齦、頭、腎、肝、肺、鼻咽、頸、卵巢、胰腺、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌或子宮的癌細胞。另外，癌癥可以具體地具有下述組織學類型，盡管它但不限于這些：腫瘤，惡性；癌；癌，未分化；巨細胞癌和梭形細胞癌；小細胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛母質癌；移行細胞癌；乳頭狀移行細胞癌；腺癌；胃泌素瘤，惡性；膽管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌和膽管癌；小梁狀腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉內腺癌；腺癌，家族性結腸息肉；實體瘤；類癌瘤；惡性；細支氣管肺泡狀腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細胞癌；嗜酸性細胞癌；嗜酸性腺癌；嗜堿性粒細胞癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾泡性腺癌；乳頭狀和濾泡腺癌；非包圍性硬化性癌；腎上腺皮質癌；子宮內膜樣癌；皮膚附屬器癌；大汗腺腺癌；皮脂性腺癌；耵聹腺癌；粘液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒細胞癌；浸潤性導管癌；髓樣癌；小葉癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡細胞癌；腺鱗狀癌；腺癌w/鱗狀化生；胸腺瘤，惡性；卵巢間質腫瘤，惡性；卵泡膜細胞瘤，惡性；粒層細胞瘤，惡性；睪丸母細胞瘤，惡性；支持細胞癌；萊迪希細胞瘤，惡性；脂質細胞瘤，惡性；副神經節(jié)瘤，惡性；乳腺外副神經節(jié)瘤，惡性；嗜鉻細胞瘤；血管球肉瘤；惡性黑素瘤；無黑色素性黑素瘤；淺表擴散性黑素瘤；巨大色素痣內惡性黑素瘤；上皮樣細胞黑素瘤；藍痣，惡性；肉瘤；纖維肉瘤；纖維組織細胞瘤，惡性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎橫紋肌肉瘤；肺泡橫紋肌肉瘤；間質肉瘤；混合瘤，惡性；苗勒混合瘤；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤；間葉瘤，惡性；布倫內羅氏瘤（brennertumor），惡性；葉狀瘤，惡性；滑膜肉瘤；間皮瘤，惡性；無性細胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，惡性；卵巢甲狀腺腫，惡性；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內皮瘤，惡性；卡波西氏肉瘤；血管外皮細胞瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮質骨肉瘤；軟骨肉瘤；軟骨母細胞瘤，惡性；間質性軟骨肉瘤；骨巨細胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性腫瘤，惡性；成釉細胞性牙肉瘤；成釉細胞瘤，惡性；成釉細胞性纖維肉瘤；松果體瘤，惡性；脊索瘤；神經膠質瘤，惡性；室管膜瘤；星形細胞瘤；原漿性星形細胞瘤；纖維性星形細胞瘤；星形母細胞瘤；膠質母細胞瘤；少突神經膠質瘤；成少突神經膠質瘤；原始神經外胚層；小腦肉瘤；節(jié)細胞神經母細胞瘤；神經母細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅神經源性腫瘤；腦膜瘤，惡性；神經纖維肉瘤；神經鞘瘤，惡性；顆粒細胞瘤，惡性；惡性淋巴瘤；霍奇金?。换羝娼鹆馨土?；副肉芽腫；惡性淋巴瘤，小淋巴細胞性；惡性淋巴瘤，大細胞，彌漫性；惡性淋巴瘤，濾泡；蕈樣真菌??；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；惡性組織細胞增多癥；多發(fā)性骨髓瘤；肥大細胞肉瘤；免疫增生性小腸疾病；白血??；淋巴樣白血病；漿細胞白血病；紅白血病；淋巴肉瘤細胞性白血病；髓樣白血??；嗜堿粒細胞白血病；嗜酸性粒細胞白血??；單核細胞性白血病；肥大細胞白血病；巨核細胞白血??；髓樣肉瘤；和毛細胞白血病。此外，可以在癌前，例如化生、發(fā)育不良和增生中評估rna。

特別預期本發(fā)明可以用于評估疾病階段例如增生、瘤形成、癌前和癌癥之間的差異，或原發(fā)性腫瘤和轉移性腫瘤之間的差異。此外，考慮也可以比較具有某些途徑的活性中的差異的樣品。這些途徑包括下述和涉及下述因素的那些途徑：抗體應答、細胞凋亡、鈣/nfat信號傳導、細胞周期、細胞遷移、細胞粘附、細胞分裂、細胞因子和細胞因子受體、藥物代謝、生長因子和生長因子受體、炎癥應答、胰島素信號傳導、nfκ-b信號傳導、血管生成、脂肪生成、細胞粘附、病毒感染、細菌感染、衰老、運動、葡萄糖轉運、應激反應、氧化、老化、端粒延伸、端?？s短、神經傳遞、凝血、干細胞分化、g蛋白偶聯(lián)受體（gpcr）信號傳導和p53活化。

可以使用本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)評估的細胞途徑還包括但不限于下述：粘附或運動途徑，包括但不限于涉及下述的那些：環(huán)狀amp、蛋白激酶a、g蛋白偶聯(lián)受體、腺苷酸環(huán)化酶、l-選擇素、e-選擇素、pecam、vcam-1、α-輔肌動蛋白、樁蛋白、鈣粘蛋白、akt、整聯(lián)蛋白-α、整聯(lián)蛋白-β、raf-1、erk、pi-3激酶、紐蛋白、基質金屬蛋白酶、rhogtp酶、p85、三葉因子、肌動蛋白抑制蛋白、fak、map激酶、ras、小窩蛋白、鈣蛋白酶-1、鈣蛋白酶-2、表皮生長因子受體、icam-1、icam-2、絲切蛋白、肌動蛋白、凝溶膠蛋白、rhoa、rac1、肌球蛋白輕鏈激酶、血小板源生長因子受體或埃茲蛋白；任何細胞凋亡途徑，包括但不限于涉及下述的那些：akt、fas配體、nfκb、半胱天冬酶-9、pi3激酶、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、icad、cad、endog、粒酶b、bad、bax、bid、bak、apaf-1、細胞色素c、p53、atm、bcl-2、parp、chk1、chk2、p21、c-jun、p73、rad51、mdm2、rad50、c-abl、brca-1、穿孔素、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-10、rho、jun激酶、jun激酶激酶、r1p2、核纖層蛋白-a、核纖層蛋白-b1、核纖層蛋白-b2、fas受體、h2o2、粒酶a、nadph氧化酶、hmg2、cd4、cd28、cd3、tradd、ikk、fadd、gadd45、dr3死亡受體、dr4/5死亡受體、flip、apo-3、grb2、shc、erk、mek、raf-1、環(huán)狀amp、蛋白激酶a、e2f、視網膜母細胞瘤蛋白、smac/diablo、ach受體、14-3-3、fak、sodd、tnf受體、rip、細胞周期蛋白d1、pcna、bcl-xl、pip2、pip3、pten、atm、cdc2、蛋白激酶c、鈣調磷酸酶、ikkα、ikkβ、ikkγ、sos-1、c-fos、traf-1、traf-2、iκbβ或蛋白酶體；任何細胞活化途徑，包括但不限于涉及下述的那些：蛋白激酶a、一氧化氮、小窩蛋白-1、肌動蛋白、鈣、蛋白激酶c、cdc2、細胞周期蛋白b、cdc25、grb2、src蛋白激酶、adp-核糖基化因子（arf）、磷脂酶d、akap95、p68、aurorab、cdk1、eg7、組蛋白h3、pkac、cd80、pi3激酶、wasp、arp2、arp3、p16、p34、p20、pp2a、血管緊張素、血管緊張素轉化酶、蛋白酶激活受體-1、蛋白酶激活受體-4、ras、raf-1、plcβ、plcγ、cox-1、g蛋白偶聯(lián)受體、磷脂酶a2、ip3、sumo1、sumo2/3、泛素、ran、ran-gap、ran-gef、p53、糖皮質激素、糖皮質激素受體、swi/snf復合物的組分、ranbp1、ranbp2、輸入蛋白、輸出蛋白、rcc1、cd40、cd40配體、p38、ikkα、ikkβ、nfκb、traf2、traf3、trap5、traf6、il-4、il-4受體、cdk5、ap-1轉錄因子、cd45、cd4、t細胞受體、map激酶、神經生長因子、神經生長因子受體、c-jun、c-fos、jun激酶、grb2、sos-1、erk-1、erk、jak2、stat4、il-12、il-12受體、一氧化氮合酶、tyk2、ifnγ、彈性蛋白酶、il-8、上皮蛋白、il-2、il-2受體、cd28、smad3、smad4、tgfβ或tgfβ受體；任何細胞周期調節(jié)、信號傳導或分化途徑，包括但不限于涉及下述的那些：tnf、src蛋白激酶、cdc2、細胞周期蛋白b、grb2、sos-1、shc、p68、aurora激酶、蛋白激酶a、蛋白激酶c、eg7、p53、細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶、神經生長因子、表皮生長因子、視網膜母細胞瘤蛋白、atf-2、atm、atr、akt、chk1、chk2、14-3-3、wee/1、cdc25cdc6、起點識別復合蛋白、p15、p16、p27、p21、abl、cabl、smad、泛素、sumo、熱休克蛋白、wnt、gsk-3、血管緊張素、p73任何ppar、tgfα、tgfβ、p300、mdm2、gadd45、notch、cdc34、brca-1、brca-2、skp1、蛋白酶體、cul1、e2f、p107、類固醇激素、類固醇激素受體、iκbα、iκbβ、sin3a、熱休克蛋白、ras、rho、erk、ikk、pi3激酶、bcl-2、bax、pcna、map激酶、動力蛋白、rhoa、pkac、細胞周期蛋白amp、fak、pip2、pip3、整聯(lián)蛋白、血小板生成素、fas、fas配體、plk3、mek、jak、stat、乙酰膽堿、樁蛋白、鈣調磷酸酶、p38、輸入蛋白、輸出蛋白、ran、rad50、rad51、dna聚合酶、rna聚合酶、ran-gap、ran-gef、numa、tpx2、rcc1、sonichedgehog、crml、patched（ptc-1）、mpf、cam激酶、微管蛋白、肌動蛋白、動粒相關蛋白、著絲粒結合蛋白、端粒酶、tert、pp2a、c-myc、胰島素、t細胞受體、b細胞受體、cbp、ikβ、nfκb、rac1、raf1、epo、二?；视?、c-jun、c-fos、jun激酶、缺氧誘導因子、gata4、β-連環(huán)素、α-連環(huán)素、鈣、抑制蛋白、存活素、半胱天冬酶、半胱天冬酶原、creb、crem、鈣粘蛋白、pecam、皮質類固醇、集落刺激因子、鈣蛋白酶、腺苷酸環(huán)化酶、生長因子、一氧化氮、跨膜受體、類視黃醇、g蛋白、離子通道、轉錄激活因子、轉錄共激活因子、轉錄阻遏物、白細胞介素、維生素、干擾素、轉錄輔阻遏物、核孔、氮、毒素、蛋白水解或磷酸化；任何代謝途徑，包括但不限于涉及下述的那些：氨基酸生物合成、脂肪酸氧化、神經遞質和其他細胞信號傳導分子的生物合成、聚胺的生物合成、脂質和鞘脂的生物合成、氨基酸和營養(yǎng)物的分解代謝、核苷酸合成、類花生酸、電子傳遞反應、er相關降解、糖酵解、纖維蛋白溶解、酮體形成、吞噬體形成、膽固醇代謝、食物攝入的調節(jié)、能量穩(wěn)態(tài)、凝血酶原激活、乳糖和其他糖的合成、多藥抗性、磷脂酰膽堿的生物合成、蛋白酶體、淀粉樣蛋白前體蛋白、rabgtp酶、淀粉合成、糖基化、磷酸甘油酯的合成、維生素、檸檬酸循環(huán)、igf-1受體、尿素循環(huán)、囊泡轉運或補救途徑。進一步考慮本發(fā)明的核酸分子可用于關于任何上述途徑或因子的診斷和治療方法。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，非編碼rna可以相對于上述途徑或因子中的一種或多種差異表達。

表型性狀還包括特征例如壽命、發(fā)病率、外觀（例如禿頭、肥胖）、力量、速度、耐力、生育力、對特定藥物或治療處理的敏感性或接受性（藥物功效）、和藥物毒性的風險。在這些表型性狀方面不同的樣品也可以使用所述方法進行評估。

在本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)的某些實施方案中，可以生成核酸譜以評估這些譜并且使這些譜與藥代動力學相關聯(lián)。例如，可以在患者被治療之前或在治療期間創(chuàng)建rna譜且評估患者腫瘤和血樣，以確定是否存在其表達與患者后果相關的rna。差異rna的鑒別可以導致涉及其的診斷測定，所述診斷測定可以用于評估腫瘤和/或血樣，以確定應該給患者提供何種藥物方案。另外，該方法可以用于鑒定或選擇適合于特定臨床試驗的患者。如果確定rna譜與藥物功效或藥物毒性相關聯(lián)，則它可能與該患者是否是接受藥物或特定劑量的藥物的適當患者相關。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的靶多核苷酸的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：（a）配置為接收客戶請求以對樣品執(zhí)行檢測反應的計算機；（b）在權利要求37的反應混合物中執(zhí)行核酸擴增反應以產生擴增產物的擴增系統(tǒng)；和（c）報告生成器，其向接收者發(fā)送報告，其中所述報告含有檢測對應于所述擴增產物的量的檢測信號的結果。在一個實施方案中，接收方是客戶。在一些實施方案中，計算機可讀介質包括代碼，所述代碼在由一個或多個處理器執(zhí)行后，實施檢測樣品中的靶多核苷酸的方法，所述方法包括：（a）接收客戶請求，對樣品執(zhí)行檢測反應；（b）在權利要求40的反應混合物中執(zhí)行核酸擴增反應，以產生擴增產物；和（c）生成含有檢測對應于擴增產物的量的檢測信號的結果的報告。

在一些實施方案中，該系統(tǒng)進一步包括配置為接受購買核酸檢測、定量或擴增服務的報價的網頁。在一些實施方案中，顯示是電子的例如網頁。在一些實施方案中，該系統(tǒng)還包括顯示器，其基于售出信息展示對顧問和/或其他醫(yī)療專業(yè)人員（例如，醫(yī)學遺傳學家或產科醫(yī)生/婦科醫(yī)生）的轉診。

互聯(lián)網和萬維網提供對信息的訪問和分發(fā)。在一些實施方案中，網站可以特別適于有效提供允許客戶購買核酸檢測、定量或擴增服務的不同功能。該系統(tǒng)通常將包括網站駐留于其上的服務器。用戶使用連接到服務器的接口，例如計算機監(jiān)視器或電話屏幕，通過在彈出信息或將用戶引導到另一網頁的鏈接上點擊或滾動來與網站交互。網站通常是交互式的，允許用戶輸入信息或查詢并在接口上獲得響應。

在系統(tǒng)和商業(yè)方法的一些實施方案中，網站可以允許客戶購買、管理且查看核酸檢測、定量或擴增的結果，以及更一般地了解這些結果的后果。例如，客戶可以是尋求學習他或她的小rna譜是否指示疾病譜的患者?？梢韵蚩蛻舫尸F(xiàn)購買核酸檢測、定量或擴增服務的報價，以確定下述中的一個或多個：（i）客戶的遺傳狀態(tài)；（ii）客戶將發(fā)生一種或多種疾病或性狀的可能性；和（iii）基于在客戶的核酸樣品中鑒定的致病性遺傳變異，客戶將發(fā)生一種或多種疾病或性狀的可能性。

如果客戶選擇購買使用本發(fā)明的方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)的核酸檢測、定量或擴增服務，則客戶可以例如通過在線信用卡交易、交換服務、直接電話咨詢公司的工作人員和/或轉診給相關的醫(yī)療專業(yè)人員而支付費用。測試和轉診可以在購買時支付費用，或可以包括在初始用戶注冊費中。在一些實施方案中，服務是免費的，并且由公司通過與特定產品結合做其他產品廣告來生成收入。例如，在客戶在線下訂單后，將訂單發(fā)送到服務器進行處理。一旦支付已被驗證，訂單處理服務器就可以向運輸供應商發(fā)送電子通知，以將核酸收集試劑盒郵寄給客戶。在一個實施方案中，收集試劑盒與檢測、定量和/或擴增服務分開，或者用戶或客戶已具有核酸收集試劑盒或從另一來源獲得核酸收集試劑盒。通知也可以定期以電子方式發(fā)送給客戶，包括訂單確認以及訂單和運送狀態(tài)的更新。在本發(fā)明的商業(yè)方法的一些實施方案中，客戶可以將樣品存放在收集試劑盒內。本領域技術人員顯而易見的任何樣品可以存放到收集試劑盒中或收集試劑盒上。樣品可以是含有對于本領域技術人員顯而易見的待分析核酸的任何材料，例如體液如唾液或血液。然后可以將收集試劑盒送回公司用于送至實驗室，或者可直接返回實驗室進行處理。公司內部、與公司合作簽約或公司外部的實驗室，可以從提供的樣品中分離客戶的核酸。在已從樣品中分離核酸后，裝置（例如本文所述的儀器）可以用于檢測、擴增和/或定量其存在。在一些實施方案中，核酸不必從樣品中分離，以檢測、定量和/或擴增核酸。

關于使用該方法、組合物、反應混合物、測試、試劑盒和/或系統(tǒng)檢測、定量和/或擴增的核酸的信息可以電子發(fā)送到服務器用于存儲和處理。服務器上的計算機代碼可以對核酸信息執(zhí)行，以推斷客戶的醫(yī)療保健信息學和/或確認致病性遺傳變異體和/或非主體序列（如果有的話）的存在。然后可以將處理的核酸信息電子發(fā)送到服務器，其中服務器上的計算機代碼可以對處理的核酸信息執(zhí)行，以預測客戶將具有由發(fā)現(xiàn)存在于客戶的處理核酸信息中的致病性遺傳變異引起的多個性狀中的每一個的概率。然后，可以將結果電子傳送到服務器用于存儲。

在一個例子中，可以向客戶發(fā)送通知以向客戶警告結果的可用性。該通知可以是電子的，其非限制性實例包括文本消息、電子郵件或其他數(shù)據(jù)包；或該通知可以是非電子的，其非限制性實例包括來自顧問的電話或印刷通訊例如通過郵件發(fā)送的報告。提供給客戶的結果可以向客戶告知客戶的一種或多種疾病或性狀的攜帶者狀態(tài)和/或客戶將發(fā)生一種或多種疾病或性狀的機會。在客戶收到結果和轉診后，客戶的訂單可以被視為履行，并且結果和轉診可以通過在線網站帳戶保持客戶可訪問。然后，如果客戶希望但是在網站的范圍之外，則客戶可以選擇進一步尋找離線的轉診。

實施例

給出下述實施例是用于舉例說明本發(fā)明的不同實施方案的目的，并不意味著以任何方式限制本發(fā)明。本實施例連同本文所述的方法目前代表優(yōu)選實施方案，是示例性的，并且不預期作為對本發(fā)明范圍的限制。本領域技術人員將想到涵蓋在如由權利要求的范圍限定的本發(fā)明的精神內的本文的變化和其他用途。

實施例1：用于mirna定量的新型策略的示意性描述

本發(fā)明的互補序列擴增方案的示例性示意圖表現(xiàn)在圖1中。rt環(huán)引物含有三個部分：通用序列（由連接序列a和序列b的線表示）、在rt環(huán)引物的5'端處的mirna互補序列（序列a）、以及在rt環(huán)引物的3'端處的mirna互補序列（序列b）。rt反應從rt環(huán)引物的3'端（序列b）起始，并且生成含有mirna和通用序列兩者的雜交cdna鏈。使用特定環(huán)引物的該rt在rna靶或引物延伸的情況下使用逆轉錄酶或在dna靶的情況下使用聚合酶。在其產生關于序列b雜交區(qū)域5'的靶多核苷酸中的區(qū)域的互補序列中，聚合酶敲除序列a與靶多核苷酸的雜交。在rt后，使用與通用序列互補的正向引物和與mirna特異性序列互補的反向引物，通過qpcr來定量雜交cdna。

實施例2：靶mirna和引物

登錄號mimat0000062，22nt）和登錄號mimat0000064，22nt）的序列得自mirbase網站：http://www.mirbase.org/index.shtml。通過將hsa-let-7a-5p的鳥嘌呤替換為胞嘧啶生成hsalet-7x-test的序列。在本報告中，三個合成mirna被簡化為let-7a、let-7c和let-7x。合成的mirna寡核苷酸和引物購自integrateddnatechnologies（idt）。引物如下命名且具有如下5'至3'列出的序列：“3+3”：

。

實施例3：逆轉錄和qpcr

rt反應溶液含有0.25μg合成mirna寡核苷酸和0.7μmrt引物。rt緩沖液、dntp、mgcl2、rnaseout和superscript?iiirt由試劑盒superscript?iiifirst-strandsynthesissystem（invitrogenbylifetechnology，18080-051）提供。根據(jù)制造商的說明書執(zhí)行rt。簡言之，將10μl反應溶液在bio-radcfx儀器中在37℃、42℃或50℃下溫育50分鐘，隨后在75℃下溫育15分鐘，然后將rt產出保持在4℃下。

根據(jù)制造商的說明書，通過毛細管電泳（ce）儀器、fragmentanalyzer（advancedanalyticaltechnologies）以及sensitivityrnaanalysiskit（dnf-489-0500）分析rt產出。該反應含有rt引物，但沒有mirna模板設置為rt對照。

根據(jù)制造商的說明書，使用tataasybr?grandmaster?mix執(zhí)行qpcr。由rt生成的cdna用te-lpa緩沖液（將8μllpa懸浮于10ml1xtris-edta中）稀釋至大約10⁶拷貝/μl。然后將1μl稀釋的cdna和200nmpcr引物5+5fp（通用，22nt）和5+5rp（mirna特異性，22nt）加入pcr反應溶液中。通過下式計算反應溶液中的靶cdna的拷貝數(shù)：cdna拷貝數(shù)=mirna模板濃度（nm）x6.022x10²³/（mirna的長度x650x10⁹）。使10μl反應溶液在95℃下溫育1分鐘，隨后為95℃5秒、52℃30秒和72℃10秒的45個循環(huán)。所有反應均重復進行。

實施例4：rt過程的驗證

為了達到mirna定量的最佳特異性，我們提出了如圖1例示的新策略。首先，通過使用含有40nt通用序列和5-10ntmirna特異性序列的引物的逆轉錄獲得雜交cdna模板。然后使用通用正向引物和mirna特異性反向引物執(zhí)行qpcr。

在該測定中，rt引物的5'和3'端都與靶mirna重疊。因此，提出了一個問題：需要多少rt引物核苷酸與靶mirna雜交，而不干擾逆轉錄酶連同mirna模板的性能。為了解決這個問題，在實施例2中測試了具有與靶mirna的5'和3'端互補的不同數(shù)目的核苷酸的不同rt引物。

存在通過rt引物“5+5”有效的rt。rt反應首先在50℃下進行。使用合成的mirnalet-7a作為模板，并且通過ce分析rt產出。在用引物“5+5”的rt后，與圖2（b部分）中不含mirna模板的rt對照相比較，在圖2（a部分）中檢測到比rt引物多18nt的另外峰。在圖2（a部分），具有大約74nt的雜交cdna的峰由箭頭指示。圖2（b部分）顯示了含有引物5+5但不含mirna的rt對照的結果。圖2中的lm指示20-nt梯標記物。該結果指示雜交cdna由rt引物“5+5”生成。

雜交cdna的存在通過用pcr引物5+5fp和5+5rp的qpcr進一步證實，如圖3（a部分）中所示。rt引物的濃度對于mirna定量的準確性也是重要的。我們發(fā)現(xiàn)，當rt引物5+5的濃度從1.4降低到0.7μm時，它顯示對下游qpcr很少的干擾，不影響圖3（a和b部分）中的rt過程。在圖3（部分a）中，通過0.7μmrt引物5+5生成rt產物。在圖3（部分b）中，通過1.4mrt引物5+5生成rt產物。對于圖3部分a和b兩者，擴增曲線i是雜交cdna的擴增子，擴增曲線ii是rt對照的擴增子。

在用實施例2中列出的其他引物執(zhí)行rt后，其中無一在50℃下生成雜交cdna。考慮到溫度可能影響rt的結果，rt在37℃和42℃（實驗室中使用的另外兩個常見rt溫度）下進行。如圖4中所示，在兩個溫度下通過引物5+5生成cdna。相比之下，在這兩個測試溫度的任一下，通過其他引物對仍未生成雜交cdna。在圖4（a部分）中，rt在42℃下執(zhí)行。在圖4（b部分）中，rt在37℃下執(zhí)行。在圖4（c部分），rt對照含有引物5+5，但不含mirna。在圖4中，新近生成的cdna由箭頭指示；lm指示梯標記物；rna用20nt指示。

高濃度的rt引物可以通過將cdna產出的信號壓縮至低rfu導致ce的假陰性讀數(shù)。因此，rt引物的濃度從0.7m降低到0.28m。然后在圖5（a和b部分）中用rt引物3+3的rt后觀察到可能代表雜交cdna產出的另外峰。為了確保雜交cdna的存在，通過qpcr使用引物5+5fp和5+5rp驗證rt產物，并且cq值僅比rt對照的那種多2.3個循環(huán)，如圖5（c部分）中可見的。在圖5（a部分）中，當rt引物3+3的濃度為1.4μm時，觀察到代表雜交cdna產出的ce分析中的另外峰。在圖5（b部分）中，當rt引物3+3的濃度為2.8μm時，觀察到表示雜交cdna產出的ce分析中的另外峰。在圖5（c部分）中，qpcr分析顯示擴增曲線i代表由0.28m引物3+3生成的rt產物的擴增子，并且擴增曲線ii代表rt對照（不含mirna模板的rt）的擴增子，所述rt對照含有0.28mrt引物3+3?？傊?，含有靶mirna序列的雜交cdna可以通過引物對5+5逆轉錄。這些結果指示在測試的條件下，對于該靶，在rt引物的3'端處重疊mirna序列的5nt是用于起始rt過程最佳的。

實施例5：特異性的驗證

通過使用let-7c和let-7x的合成mirna（其與let-7a僅相差少至一個核苷酸）來評估該測定法的特異性。首先，評估rt的特異性。使用與let-7a完全匹配的rt引物5+5執(zhí)行rt。通過ce檢查rt的產出。結果指示從不同的mirna模板生成相似量的rt產物，如圖6（a-c部分）中所示。在圖6（a部分）中，let-7a用作rt模板。在圖6（b部分）中，let-7c用作rt模板。在圖6（c部分）中，let-7x用作rt模板。在圖6中，lm指示20ntrna梯標記物。

其次，評估qpcr的特異性。rt產物通過pcr引物5+5fp和5+5rp擴增。通過式2^{-（cq非特異性-cq特異性）}計算完全匹配和錯配靶之間的cq差異的相對檢測效率，假設完全匹配的100%效率。如圖7中所示，當比較let-7a與let-7x的擴增結果時，觀察到低至1.48%的非特異性信號水平。然而，區(qū)分let-7c與let-7a的特異性很低，顯示let-7c對let-7a21.8%的相對檢測效率。通過使用另一批rt產物重復實驗，并且獲得相似的結果。在圖7中，假設let-7a的擴增效率為100%，let-7c和let-7x的擴增cq值針對let-7a，并且計算相對檢測效率。

盡管let-7c和let-7x兩者均具有與let-7a的一個核苷酸錯配，但let-7c和let-7x針對let-7a的相對檢測效率是相當不同的。這種差異可能由錯配核苷酸的位置決定。對于let-7x，錯配的核苷酸位于mirna的3'端處，并且可以在qpcr過程期間被mirna特異性pcr引物5+5rp覆蓋。因此，在rt和qpcr兩個過程期間達到let-7a與let-7x的區(qū)分。與let-7x不同，let-7c的錯配核苷酸懸掛在let-7c的5'端處，并且在qpcr過程期間不存在與let-7x一樣的擴增選擇。此外，相對高的非特異性信號可能是由于在rt過程期間g-t的交叉反應。從這個角度來看，在優(yōu)化rt和qpcr引物后，這種mirna定量策略的特異性可能顯著增強。

實施例6：用于mirna定量的替代策略的示意性描述

圖9中顯示了環(huán)引物的替代結構的示例性示意圖，其中環(huán)的部分折疊成發(fā)夾結構。引物含有5'識別元件（序列a）、5'臂序列（序列d）、具有莖（序列e＆g）和環(huán)（序列f）的發(fā)夾、3'臂序列（序列h）和3'識別元件（序列b）。發(fā)夾穩(wěn)定環(huán)結構，并且隔絕大部分堿基與樣品中的其他核酸相互作用，因此降低背景。莖設計可以進行調整以修改系統(tǒng)的特征。通過將發(fā)夾結構引入環(huán)引物內的背景降低的實例顯示于圖12中。

實施例7：使用包含發(fā)夾的環(huán)引物驗證特異性

圖10顯示了基于通過rt和qpcr測量的靶向let7家族的前五個成員（let7a-e）的指示環(huán)引物，七個測定法的交叉反應性的分析結果。從mirbase（www.mirbase.org/）獲得hsa-let-7a-5p至hsa-let-7e-5p的序列。使用的rt和qpcr引物顯示于圖10（a部分）中。針對let7b和let7c各自設計了兩種環(huán)引物。

根據(jù)制造商的說明書，使用tataagrandscript?flexcdnasynthesiskit，在包含12pg合成mirna寡核苷酸和50nmrt引物的10μl反應體積中執(zhí)行rt反應。對于每個mirna靶，添加無核酸酶的水代替逆轉錄酶執(zhí)行rt對照。使反應溶液在bio-radcfx96儀器中在31℃下溫育45分鐘，隨后在85℃下溫育5分鐘，然后保持在4℃下。

根據(jù)制造商的說明書，使用tataasybr?grandmaster?mix，在含有400nm引物的10μl反應體積中執(zhí)行qpcr。將來自rt的cdna在無核酸酶的水中稀釋5倍，并且將2μl加入到每個qpcr中，除了其中加入無核酸酶的水代替cdna的ntc之外。使反應溶液在bio-radcfx384儀器中在95℃下溫育30秒，隨后為95℃5秒、60℃15秒和72℃10秒的45個循環(huán)，然后是以0.5℃/秒的步驟從65℃到95℃的熔融曲線。所有反應重復進行。

從qpcr獲得的cq值顯示在圖10（b部分）中，并且通過式2^{-（cq非特異性-cq特異性）}計算的相對檢測效率顯示于圖10（c部分）中。完全匹配的靶的cq值顯著變化，這可能是由于模板濃度中的變化和/或環(huán)引物在引發(fā)rna逆轉錄成cdna的效率中的變化。除了幾個例外，交叉重復活性低于2%，即使幾個靶序列僅在單個堿基位置中不同。設計為靶向let7c的環(huán)引物之一顯示與let7b的20.1%交叉反應性，但與其他let7c環(huán)引物的交叉反應性降低至1.3%。對于與let7c具有12.4%交叉反應的設計為靶向let7b的環(huán)引物之一也觀察到較低的特異性。然而，對于let7b的另一環(huán)引物顯示僅1.6%的交叉反應性。

實施例8：使用本發(fā)明的發(fā)夾環(huán)引物驗證測定效率

使用發(fā)夾環(huán)引物的測定的廣泛范圍顯示于圖11中。mirnahsp-let-7a-5p的輸入量從2.5*10¹⁰-250個拷貝/rt反應不等。測定在所研究的范圍內顯示極佳的線性，并且qpcr系統(tǒng)的效率為約86%。

根據(jù)制造商的說明書，使用tataagrandscript?flexcdnasynthesiskit，在包含50nmrt引物的10μl反應體積中執(zhí)行rt反應。包括使用無核酸酶的水代替逆轉錄酶的rt陰性對照來測量背景信號。使反應溶液在bio-radcfx96儀器中在25℃下溫育45分鐘，隨后在85℃下溫育5分鐘，然后保持在4℃下。

根據(jù)制造商的說明書，使用tataasybr?grandmaster?mix，在包含400nm正向引物和反向引物的10μl反應體積中執(zhí)行qpcr。將來自rt的cdna在無核酸酶的水中稀釋4倍，并且將2μl加入到每個qpcr中，除了其中加入無核酸酶的水代替cdna的非模板對照之外。使反應溶液在bio-radcfx384儀器中在95℃下溫育30秒，隨后為95℃5秒、60℃15秒和72℃10秒的45個循環(huán)，然后是以0.5℃/秒的步驟從65℃到95℃的熔融曲線。所有反應重復進行。

實施例9：使用包含發(fā)夾的環(huán)引物驗證背景降低

改變環(huán)引物中的發(fā)夾設計以測試對背景信號的作用。設計具有相同的3'和5'識別元件，但在發(fā)夾、臂和環(huán)序列中具有小變異的四種環(huán)引物（圖12）。陽性反應的cq值非常相似，范圍為16.07（rt18）至16.44（rt19），證明修飾對效率的作用可忽略不計。另一方面，陰性對照顯示顯著更高的變化，范圍從rt10引物的cq34.86到rt18的cq>45（當運行45個循環(huán)時未觀察到雜交）。這指示可以通過精細調諧設計來消除測定的背景信號，而不損害陽性信號。

根據(jù)制造商的說明書，使用tataagrandscript?flexcdnasynthesiskit，在包含12pg合成mirna寡核苷酸和50nmrt引物的10μl反應體積中執(zhí)行rt反應。對于每個靶，添加無核酸酶的水代替逆轉錄酶執(zhí)行rt對照。使反應溶液在bio-radcfx96儀器中在31℃下溫育45分鐘，隨后在85℃下溫育5分鐘，然后保持在4℃下。

根據(jù)制造商的說明書，使用tataasybr?grandmaster?mix，在包含400nm正向引物和反向引物的10μl反應體積中執(zhí)行qpcr。將來自rt的cdna在無核酸酶的水中稀釋4倍，并且將2μl加入到每個qpcr中，除了其中加入無核酸酶的水代替cdna的非模板對照之外。使反應溶液在bio-radcfx384儀器中在95℃下溫育30秒，隨后為95℃5秒、60℃15秒和72℃10秒的45個循環(huán)，然后是以0.5℃/秒的步驟從65℃到95℃的熔融曲線。所有反應重復進行。

雖然本文已顯示且描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但對于本領域技術人員顯而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。本領域技術人員目前將想到眾多變化、改變和取代，而不背離本發(fā)明。應當理解在實踐本發(fā)明時可以采用本文所述的本發(fā)明實施方案的不同替代方案。旨在下述權利要求限定本發(fā)明的范圍，并且由此涵蓋這些權利要求及其等價物的范圍內的方法和結構。