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背景

在dna測序產(chǎn)業(yè)內(nèi)，合成(非天然)分子的使用是用于區(qū)分構(gòu)成dna的四個核苷酸堿基(a、c、t及g)的主要策略。此策略被成功地應用于sanger測序的古老方法，該方法是用于最初的人類基因組研究。

存在用于dna測序的技術(shù)，但對于可提高速度、減小錯誤率并降低復雜性、成本及試劑需要的新技術(shù)有商業(yè)需要。對可使用電子電路進行dna測序的技術(shù)有極大關(guān)注，因為固態(tài)電子學可在速度、成本及復雜性方面提供許多益處。

近年來，已產(chǎn)生電子構(gòu)造，其是通過使dna穿過納米孔并且監(jiān)測穿過同一孔隙的離子電流或者通過使dna穿過納米孔但使用相鄰的電隧道結(jié)轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)運來操作。兩個平臺都依賴dna穿過納米孔，因此它們共有在納米孔下操作的特征性困難，如不穩(wěn)定性、脆性及精確的流體處理需要。此外，dna穿過納米孔具有有限的信噪比，以使得實際上必須使用熒光法獨立地證實任何測序信息。另外，高錯誤率及“滑動”穿過納米孔限制了應用，如為具有短串聯(lián)重復的高度重復序列測序，這是人類鑒別應用需要的。

生物傳感器是摻入生物識別元件的分析裝置，該生物識別元件在空間上直接與轉(zhuǎn)導元件接觸。此整合確保生物事件向可檢測信號的快速及適當轉(zhuǎn)化。在不同的電生物感測構(gòu)造中，基于場效應晶體管(fet)的裝置已經(jīng)吸引了極大的關(guān)注，因為它們是一種類型的生物傳感器，這種生物傳感器可將靶分子(例如生物分子)與晶體管表面的相互作用直接轉(zhuǎn)化為可讀的電信號。在標準場效應晶體管中，電流沿著連接到兩個電極(源電極和漏電極)上的導電路徑(溝道)流動。源電極與漏電極之間的溝道電導是由第三(柵)電極接通并且斷開，該第三電極通過薄介電層進行電容性耦合。場效應晶體管檢測靶化學品并且測量化學濃度以用于廣泛的商業(yè)應用，包括例如工業(yè)過程控制、泄露檢查、排出流監(jiān)測以及醫(yī)學診斷。

例如，在美國專利申請?zhí)?3/626,760中公開了一種電子裝置，其對在單分子水平下的檢測足夠敏感。使用其上連接有單個敏化分子的導電溝道實現(xiàn)本發(fā)明的方面。因此，其中公開的裝置監(jiān)測單分子反應的動態(tài)，并且可用于重要的單分子生物化學測定，如在單分子測序反應中的檢測器。

因此，在本領(lǐng)域中存在對下一代dna測序技術(shù)的需要，該技術(shù)比現(xiàn)有技術(shù)更高效并且有更多信息。本文提供了對本領(lǐng)域中的這些及其他問題的解決方案。

概述

本文尤其提供了具有天然和非天然核苷酸堿基的混合物以測定dna樣品的基因序列的電路。描述了使用電路來測定dna鏈的遺傳密碼的專項技術(shù)和具體實施。

所述電路使得能夠為dna測序并且通過延伸，對rna及碳水化合物進行測序。本發(fā)明提供了一種低成本、高速、高保真度的dna測序方法，其可成功地與更傳統(tǒng)的測序方法競爭。

本文所提供的方法和組合物可依據(jù)酶促加工期間單分子的活性。合成的底物、核苷酸及熒光團可用于由dna鏈產(chǎn)生獨特的和可區(qū)分的信號。

附圖簡述

圖1a-1c.用化學修飾的dntp電監(jiān)測kf活性。圖1a：單kf納米電路及測試其通過kf摻入的化學修飾的dntp。(a)單壁碳納米管場效應晶體管(swcnt-fet)經(jīng)由被引入“指狀物”子域中的單半胱氨酸非共價地生物綴合至dna聚合酶i(kf)的單分子上的示意圖。芘-馬來酰亞胺接頭(黃色)經(jīng)由π-π堆疊粘附到swcnt-fet上并且共價地連接到單半胱氨酸上以固定kf。swcnt-fet在sio2上生長，連接到源極和漏極金屬電極上，并用聚合物(pmma，紅色)鈍化。圖ib：原子力顯微鏡顯示具有單kf連接(7nm，箭頭)的1-2nm直徑的swntfet。圖1c：本文所公開的類似dntp的化學結(jié)構(gòu)。突出顯示了來自天然dntp的化學修飾。

圖2a-2f.天然和類似dntp摻入期間的電流變化。圖2a：在此電流測量中，在聚(dc)42模板及其互補天然dgtp存在下，δi(t)偏移在每個堿基摻入期間發(fā)生。高和低電流狀態(tài)分別對應于酶的開放和閉合構(gòu)象。圖2b-2f：對應于圖2a(時間窗1.5至2.5s)的數(shù)據(jù)的時間放大倍數(shù)示出了對應于dgtp(圖2b)、α-硫代-dgtp(圖2c)、6-氯-2aptp(圖2d)及2-硫代-dctp(圖2e-2f)的堿基摻入的切換事件的減少。在圖2b-2f各自的右邊，放大視圖描繪了每個所示堿基的單個δi(t)偏移，突出顯示了單堿基分辨率，其中條棒表示1ms時間間隔。

圖3a-3b.在來自>50s數(shù)據(jù)組的所示dntp摻入期間的開放τ開放和閉合τ閉合狀態(tài)持續(xù)時間的概率分布的直接比較。y軸是以對數(shù)概率％繪制。對于τ閉合(圖3a)和τ開放(圖3b)兩者，均聚物聚(dc)42提供模板。在圖3a-3b中，每個核苷酸的單指數(shù)擬合顯示為實線。

圖4a-4b.在聚(da)42的加工中產(chǎn)生的電子信號。圖4a：當kf在天然的核苷酸三磷酸脫氧胸苷(dttp)存在下加工聚(da)42時，各堿基對摻入產(chǎn)生負電流尖峰δi<0。圖4b：當dttp被非天然核苷酸2-硫代-2’-脫氧胸苷-5’-三磷酸(2-硫代-dttp)取代時，堿基摻入產(chǎn)生正電流尖峰δi>0。

圖5a-5c.在異質(zhì)性底物的加工中產(chǎn)生的電子信號。圖5a：當kf在所有四種天然核苷酸(dntp)存在下加工異質(zhì)性底物時，每個堿基對摻入產(chǎn)生負電流尖峰δi<o。個別尖峰可如所示列舉，但一般說來，它們不能將一種類型的堿基與另一種相區(qū)分。圖5b：圖5b顯示用被2-硫代-dttp取代的dttp對相同數(shù)據(jù)集的模擬。在硫醇化脫氧胸苷下，正尖峰現(xiàn)表示(#2、6、7)摻入t核苷酸時的位置。圖5c顯示當kf在與某些類似物混合的天然核苷酸(dntp)存在下加工異質(zhì)性底物時，所得圖案含有可用于鑒別所選的堿基的正和負電流尖峰。此實施例示出了使用與6-cl-2aptp混合的三種天然核苷酸(datp、dttp、dctp)作為用于g摻入的類似物獲得的數(shù)據(jù)。將此信息用于寡核苷酸的納米管測序方法中。

圖6.附圖描繪了在過表達和純化之后kf的代表性15％sds-page凝膠。將kf純化至>95％同質(zhì)性并且在約68kda的預期質(zhì)量下遷移。

圖7.附圖描繪了基于熒光的活性測定，其展示了在穩(wěn)態(tài)條件下的kf(l790c)(黑色圓形)和野生型kf(灰色圓形)活性。引物延伸反應在datp、dttp、dctp及dgtp存在下發(fā)生。用背景減去原始數(shù)據(jù)，背景測量了在dntp不存在下的活性。

圖8a-8b.附圖描繪了顯示用本文所述的模板摻入dntp類似物的整體測定。將具有dntp類似物和a/t摻入模板(圖8a)或g/c摻入模板(圖8b)的聚合產(chǎn)物在5％高分辨率的瓊脂糖凝膠上電泳。僅與3種dntp的陰性對照反應省去dttp(1)、datp(2)、dctp(8)及dgtp(9)，不含dsdna。與所有四種dntp的陽性對照反應示出了用a/t摻入模板(3)和g/c摻入模板(10)向dsdna的轉(zhuǎn)化。與dntp類似物(4-7和11-14)的反應省去其天然dntp對應物并含有其余三種天然dntp。在a/t摻入模板的相對位置處，α-硫代-dttp(4)和2-硫代-dttp(5)在模板堿基a相對位置上摻入，并且α-硫代-datp(6)和6-cl-2aptp(7)在模板堿基t相對位置上摻入。在g/c摻入模板的相對位置處，α-硫代-dctp(11)和2-硫代-dctp(12)在模板堿基g相對位置上摻入，并且α-硫代-dgtp(13)和6-cl-2aptp(14)在模板堿基c相對位置上摻入。目測之后，反轉(zhuǎn)圖像顏色，然后轉(zhuǎn)換為黑色和白色。

發(fā)明詳述

本文尤其提供了一種檢測核酸聚合酶構(gòu)象中的變化的方法；一種對核酸聚合酶測序的方法，其中檢測了核酸聚合酶的構(gòu)象變化。在實施方案中，所述方法包括用核酸類似物檢測核酸聚合酶的構(gòu)象變化。

定義

為了理解本發(fā)明主題并且構(gòu)思所附專利權(quán)限納入以下定義。本文所用的縮寫具有在化學和生物領(lǐng)域內(nèi)的慣用含義。

除非另外定義，本文所用的技術(shù)和科學術(shù)語具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。參見，例如singleton等人,dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology第2版,j.wiley&sons(newyork,ny1994)；sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringsharborpress(coldspringsharbor,ny1989)。與本文所述相似或等效的任何方法、裝置和材料可在本公開的實踐中使用。提供以下定義以便于理解本文中常用的某些術(shù)語并且不意圖限制本公開的范圍。

術(shù)語“核酸”是指呈單鏈、雙鏈或多鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物、或其互補序列。術(shù)語“多核苷酸”是指核苷酸的線性序列。術(shù)語“核苷酸”通常是指多核苷酸的單個單元，即單體。核苷酸可為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或其修飾形式。本文所預期的多核苷酸的實例包括單鏈和雙鏈dna、單鏈和雙鏈rna(包括sirna)、以及具有單鏈和雙鏈dna和rna的混合物的雜交分子。核酸可為線性或支化的。舉例來說，核酸可為直鏈核苷酸或者核酸可為支化的，例如以便核酸包含一個或多個核苷酸臂或分支。任選地，支化核酸經(jīng)反復支化以形成更高階結(jié)構(gòu)，如樹枝狀分子等。

核酸(包括具有硫代磷酸酯主鏈的核酸)可包括一個或多個反應性部分。如本文所用，術(shù)語反應性部分包括能夠經(jīng)由共價、非共價或其他相互作用與另一分子(例如核酸或多肽)反應的任何基團。舉例來說，核酸可包括經(jīng)由共價、非共價或其他相互作用與蛋白質(zhì)或多肽上的氨基酸反應的氨基酸反應性部分。

該術(shù)語還包括含有已知的核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或鍵聯(lián)的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，具有與參照核酸類似的結(jié)合性質(zhì)，并且以類似于參照核苷酸的方式代謝。這種類似物的實例包括但不限于磷酸二酯衍生物，包括例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)(又稱為硫代磷酸酯(phosphothioate))、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦?；人狨ァ㈧ⅤＲ宜?、膦酰甲酸、膦酸甲酯、硼膦酸酯或o-甲基亞磷酰胺鍵聯(lián)(參見，eckstein,oligonucleotidesandanalogues:apracticalapproach,oxforduniversitypress)；以及肽核酸主鏈和鍵聯(lián)。其他類似物核酸包括具有陽性主鏈；非離子主鏈、修飾的糖及非核糖主鏈(例如，二氨基磷酸酯嗎啉代寡聚物或鎖核酸(lna))，包括美國專利號5,235,033和5,034,506及第6和7章,ascsymposiumseries580,carbohydratemodificationsinantisenseresearch,sanghui&cook,eds中所描述的那些。含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的一個定義內(nèi)?？捎捎诙喾N原因進行核糖磷酸主鏈的修飾，以便例如增加這種分子在生理環(huán)境中或作為生物芯片上的探針的穩(wěn)定性和半衰期?？芍频锰烊淮嬖诘暮怂岷皖愃莆锏幕旌衔?；或者，可制得不同核酸類似物的混合物以及天然存在的核酸和類似物的混合物。在實施方案中，dna中的核苷酸間鍵聯(lián)為磷酸二酯、磷酸二酯衍生物或兩者的組合。

詞語“互補的”或“互補性”是指多核苷酸中的核酸與第二多核苷酸中的另一核酸形成堿基對的能力。例如，序列a-g-t與序列t-c-a互補?；パa性可為部分的，其中僅一些核酸根據(jù)堿基配對匹配，或者可為完全的，其中所有核酸根據(jù)堿基配對匹配。

術(shù)語“雜交”等在通常和慣用的含義中是指形成雙鏈(即雙鏈體)核酸，包括例如dna/dna雜交體、dna/rna雜交體及rna/rna雜交體。應當理解，雙鏈體核酸的形成可經(jīng)由沃森-克里克堿基配對完成。短語“選擇性地(或特異性地)與…雜交”是指核酸與特定的核苷酸序列在例如更嚴格的條件下以比其他核苷酸序列(例如，總細胞或文庫dna或rna)更高的親和力結(jié)合、雙鏈化或雜交。

如本文所用，使用單壁碳納米管場效應晶體管(swcnt-fet)檢測核酸聚合酶的構(gòu)象變化。舉例來說，klenow片段(kf)納米電路包括經(jīng)由被引入“指狀物”子域中的單個半胱氨酸非共價地生物綴合至dna聚合酶i(kf)的單分子上的swcnt-fet。通過由kf納米電路產(chǎn)生的δi(t)信號測量構(gòu)象變化。所述裝置產(chǎn)生負δi(t)偏移的不間斷序列，各自表明形成一個堿基對，并且反轉(zhuǎn)振幅反映了不同的kf構(gòu)象(圖2c，圖2f)。

如本文所用，在實施方案中，第一核苷酸或第一核苷酸類似物可分別與第二核苷酸或第二核苷酸類似物相同。在實施方案中，第一核苷酸或第一核苷酸類似物可分別與第二核苷酸或第二核苷酸類似物不同。

短語“嚴格雜交條件”是指通常在核酸的復雜混合物中探針將與其靶序列雜交而不會與其他序列雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的并且在不同的環(huán)境中將是不同的。較長序列尤其是在較高溫度下雜交。核酸雜交的廣泛指導見于tijssen,techniquesinbiochemistryandmolecularbiology—hybridizationwithnucleicprobes,“overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)中。一般來說，對于在限定的離子強度ph下的特定序列，嚴格雜交條件被選為比熱熔點(tm)低約5-10℃。tm是50％與靶標互補的探針在平衡下(因為靶序列在tm下過量存在，50％的探針在平衡下被占用)與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強度、ph、及核酸濃度下)。嚴格雜交條件還可通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交，正信號至少兩倍于背景，優(yōu)選地10倍于背景雜交。示例性嚴格雜交條件可如下：50％甲酰胺、5xssc及1％sds，在42℃下孵育；或者5xssc、1％sds，在65℃下孵育，并且在65℃下在0.2xssc和0.1％sds中洗滌。示例性“中等嚴格的雜交條件”包括在37℃下在40％甲酰胺、1mnacl、1％sds的緩沖液中雜交，并且在45℃下在1xssc中洗滌。陽性雜交至少兩倍于背景。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認識到可使用替代雜交和洗滌條件來提供相似嚴格性的條件。用于確定雜交參數(shù)的另外的準則提供于許多參考文獻中，例如currentprotocolsinmolecularbiology,ausubel等人編著,johnwiley&sons。

在實施方案中，單分子傳感裝置10可采用晶體管形式，即場效應晶體管(fet)，其上連接的生物分子充當電路的“柵極(gate)”。在此實施方案中，單個敏化分子用于裝置的單分子柵極。晶體管實施方案可包括兩個或三個端子晶體管。導電溝道還可由金屬、金屬氧化物、半導體或納米級導體如納米線、石墨烯或單壁碳納米管(swnt)形成。在一個實施方案中，導電溝道是單個swnt。

方法

本文提供了一種檢測核酸聚合酶構(gòu)象中的變化的方法。所述方法包括使非共價地連接到單壁碳納米管(swnt)上的核酸聚合酶與核苷酸或核苷酸類似物(例如，第一核苷酸或核苷酸類似物)及模板核酸序列(例如，有義鏈寡核苷酸或多核苷酸)接觸，由此形成結(jié)合至核苷酸或核苷酸類似物及模板核酸序列上的構(gòu)象上變化的核酸聚合酶。通過測量核酸聚合酶與構(gòu)象上變化的核酸聚合酶之間swnt的電導變化來檢測構(gòu)象上變化的核酸聚合酶。術(shù)語“接觸”等在通常和慣用的含義中是指使兩種或更多種物質(zhì)充分緊密的接觸，以便相互作用可發(fā)生在物質(zhì)之間，例如，結(jié)合、化學反應等。術(shù)語“電導變化”等在通常和慣用的含義中是指可通過本領(lǐng)域中已知且本文所公開的方法測量的電導變化。術(shù)語“構(gòu)象上變化的核酸聚合酶”等在通常和慣用的含義中是指如本領(lǐng)域中已知的二級、三級和/或四級結(jié)構(gòu)或核酸的變化。

如本文所公開，電導變化可為形成核酸聚合酶的一部分的敏化分子相對于核酸聚合酶及構(gòu)象上變化的核酸聚合酶的位置中的變化結(jié)果。電流波動可由方邊圖案的簡單增加和減少組成?；蛘?，波動可包含任何小波，包括為三角形、正弦曲線的形狀或具有任意數(shù)目的傅里葉分量。這些小波的振幅、持續(xù)時間及形狀都編碼靶標特異性組分的活性且因此可使用計算機進行分析以揭示結(jié)合的動力學及其他機械和電子自由度。這些參數(shù)的統(tǒng)計分析提供了對靶結(jié)合及未結(jié)合過程的動力學可變性、轉(zhuǎn)換及中間化學狀態(tài)的認識。電流信號中的自由度在全部結(jié)合至同一位點的多個相似靶分子之間區(qū)別，例如，結(jié)合位點的靶分子與抑制劑分子之間。這些自由度還可區(qū)分弱相互作用，如在真正的結(jié)合之前發(fā)生的分子識別。

檢測核酸聚合酶構(gòu)象中的變化的方法可用作核酸(例如dna或rna)測序方法的一部分。因此，在一些實施方案中，所述方法還包括：在檢測結(jié)合至第一核苷酸或核苷酸類似物的構(gòu)象上變化的核酸聚合酶之后，通過允許所述構(gòu)象上變化的核酸聚合酶釋放第一核苷酸或核苷酸類似物由此改造核酸聚合酶來檢測所述核酸聚合酶構(gòu)象中的第二變化。所述方法還包括使非共價地連接到單壁碳納米管(swnt)上的核酸聚合酶與第二核苷酸或核苷酸類似物接觸，由此形成結(jié)合至第二核苷酸或核苷酸類似物上的構(gòu)象上變化的核酸聚合酶。通過測量核酸聚合酶與構(gòu)象上變化的核酸聚合酶之間swnt的電導變化來檢測結(jié)合至第二核苷酸或核苷酸類似物的構(gòu)象上變化的核酸聚合酶。

在實施方案中，第一和/或第二核苷酸或核苷酸類似物產(chǎn)生被檢測的獨特的電導信號。將獨特的電導信號用于鑒別所述第一和/或第二核苷酸或核苷酸類似物，由此鑒別模板核酸的序列。術(shù)語“電導信號”、“第一電導信號”、“獨特的電導信號”等在通常和慣用的含義中是指如通過本領(lǐng)域中已知的方法(包括本文所公開的方法)測量的物質(zhì)的電導。

適用于本文所提供的方法中的是碳納米管電路，其與更傳統(tǒng)的測序技術(shù)相比可更快地、以低成本并且在潛在低得多的錯誤率下操作。本文所提供的組合物和方法提供對兩種基于納米孔的電子構(gòu)造的顯著改進。首先，碳納米管電路產(chǎn)生具有極佳噪聲特性的電子信號，該特性不需要單獨確認。第二，納米管電路耐受廣泛多種環(huán)境和粗暴處理，由此在流體處理和整個系統(tǒng)復雜性上的說明與納米孔構(gòu)造相比可明顯放寬。第三，納米管電路在概念上是簡明的并且容易適應在多種不同模式下操作。第四，該手段可采用高保真度酶以提供堿基對辨別；對于18x10^-6的酶，估計錯誤率可低至理論最大值。這類低錯誤率表示對目前可用的商用儀器的大約10,000倍改進。因此，本文提供了顯著降低成本、復雜性、錯誤率及徹底再測序的額外負擔的方法和組合物。納米管電路的一般說明提供于附錄a及美國專利申請?zhí)?3/626,760中。

本發(fā)明一般提供一種足夠敏感以在單分子水平下檢測的電子裝置。使用其上連接有單個敏化分子的導電溝道實現(xiàn)本發(fā)明的方面。因此，本發(fā)明的裝置監(jiān)測單分子反應的動態(tài)，并且可用于重要的單分子生物化學測定，如在單分子測序反應中的檢測器。

本發(fā)明可使用一般見于場效應晶體管中的任何類型的傳導溝道。示例性導電溝道是由金屬、金屬氧化物、半導體或納米級導體如納米線、石墨烯或單壁碳納米管(swnt)形成。在實施方案中，導電溝道為單swnt。

作為一類材料，swnt為具有可在1電子伏至有效的零之間變化的電子帶隙的半導體。此變化使得碳swnt被歸類為金屬或半金屬材料，且其他被歸類為半導電的。借助于連接電極、靜電柵極及其他控制電路，半導電swnt可被配置為傳感器fet、rf放大器或低溫單電子晶體管。所述裝置和方法不排除這類添加，因為在實施方案中，所述裝置僅由雙端swnt導體構(gòu)成。swnt為導電溝道，其中單分子傳感裝置可由任何類型的swnt線制造，有或沒有柵電極，并且在玻璃、塑料或硅襯底上。在此描述的單分子傳感裝置可為fet內(nèi)的一個組件或任意數(shù)目的更復雜的電子或光電裝置和電路。

本公開的一方面是僅一種活性敏化分子在各裝置中的可靠成果。一般說來，敏化分子將以由制備中使用的濃度和孵育期確定的平均間距包覆swnt。一旦已憑經(jīng)驗為一組具體條件確定了平均間距，swnt導體便可由光刻法限定以具有相等長度。實際上，當敏化分子直接連接到swnt導體上時，此長度通常為1至100nm，即難以使用光刻技術(shù)控制的范圍。

在實施方案中，接頭分子充當連接中間體，其改善對敏化分子的平均間距的控制。本領(lǐng)域中已知的任何方法都可用于將單個敏化分子連接到導體上。在實施方案中，接頭分子被用于連接單個敏化分子。在實施方案中，接頭分子包含至少第一和第二官能團。一般說來，第一官能團與導電溝道(例如，單壁碳納米管)相互作用，而第二官能團與敏化分子相互作用。示例性第一官能團包括芘、苯、環(huán)己烷及2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。示例性第二官能團為馬來酰亞胺。在其中導電溝道為swnt的某些實施方案中，接頭分子經(jīng)由π-π堆疊與swnt的側(cè)壁相互作用。

使用接頭，敏化分子之間的長度可顯著地增至1微米或更大。敏化分子間隔1微米時，使用標準光刻掩模技術(shù)來限定裝滿導體的晶片將變得可能，每個長度大約1微米?；蛘?，鑒于如由掩模設(shè)計所設(shè)定的所需裝置間距，敏化分子的濃度和孵育持續(xù)時間可以變化以實現(xiàn)每裝置一個分子的相同結(jié)果。單分子傳感裝置可在10次制造嘗試的至少8次中產(chǎn)生，全部都沒有破壞swnt導體的sp2特性。

本領(lǐng)域中已知的任何敏化分子都可與本發(fā)明裝置一起使用，并且所選敏化分子將取決于有待檢測的分子或有待監(jiān)測的反應。示例性敏化分子包括酶、蛋白質(zhì)、核酸、核酶、適體及多糖。在某些實施方案中，所述酶為溶菌酶、蛋白激酶a或dna聚合酶i。

在其他方面中，一種以上敏化分子在每個裝置中可為必需的以實現(xiàn)單分子動態(tài)感測。例如，在所需操作溫度或ph下，特定類型的敏化分子可僅具有25％為化學活性的概率。在這些條件下，適宜的是將額外的敏化分子(例如四個)連接到每個導體上以便產(chǎn)生其中一個敏化分子可能具有活性的裝置。使用如上所述的方案容易實現(xiàn)此較高密度的連接，通過將裝置長度增至適當倍數(shù)的分子間平均間隔距離，抑或通過經(jīng)由改變連接條件減小相同間距而實現(xiàn)。

在實施方案中，單分子傳感裝置包括多個平行導體(例如swnt導體)。將單個活性敏化分子連接到導體中的一個上，并且這促成了動態(tài)電子信號，該電子信號可從未修改的導體的平行但靜態(tài)電導中分離。此實施方案提供了在導體合成或放置設(shè)計中的額外靈活性，以及使用具有極低連接概率的敏化分子的單分子傳感裝置的成功制造。

在實施方案中，使用相同類型的敏化分子平行制造多個單分子傳感裝置，其中每個裝置連接一個敏化分子。在另一實施方案中，制備多個導體，然后將其暴露于不同的敏化分子，以便實現(xiàn)針對不同靶標敏化的多個單分子傳感裝置。在另一實施方案中，單分子傳感裝置通過具有一定特異性的敏化分子響應于多個靶標。

在實施方案中，單分子傳感裝置包括第一電極和第二電極。將單壁碳納米管分別連接到第一電極和第二電極。所述裝置包括至少一種具有第一和第二官能團的接頭分子，所述至少一種接頭分子具有用單壁碳納米管的側(cè)壁非共價地官能化的第一官能團。單個敏化分子具有至少一個官能團，單個敏化分子的所述至少一個官能團被至少一種接頭分子的第二官能團官能化。

在實施方案中，制造單分子傳感裝置的方法包括在連接到第一電極和第二電極的襯底上形成至少一個單壁碳納米管；用至少一種含有多個官能團的接頭分子的至少一個官能團非共價地官能化所述裝置的單壁碳納米管側(cè)壁；以及用單個敏化分子的一個或多個官能團官能化至少一種接頭分子中的至少一個官能團。

在實施方案中，公開了一種使用具有單壁碳納米管(swnt)的單分子傳感裝置的方法。swnt被設(shè)置在襯底上并連接到第一電極和第二電極，使用以swnt非共價官能化的接頭分子將具有單個敏化分子的傳感裝置固定到swnt上。施加電壓于swnt上。使敏化分子暴露于化學環(huán)境。監(jiān)測流過swnt的電流波動。

在實施方案中，公開了使用單分子傳感裝置進行核酸測序的方法。傳感裝置包括導電溝道。導電溝道可包括在襯底上的單壁碳納米管(swnt)，所述襯底連接到第一電極和第二電極。傳感裝置具有單個敏化酶，使用以溝道(例如swnt)非共價官能化的接頭分子將所述酶固定到溝道上。所述方法包括將裝置暴露于至少一種類型核苷酸；在溝道上施加電壓電位；監(jiān)測流過swnt的電流波動；以及至少部分基于監(jiān)測到的電流波動鑒別通過酶摻入核酸模板中的核苷酸。所述酶可為聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。所述核苷酸可為核苷酸類似物。在某些實施方案中，將裝置一次暴露于多于一種類型的核苷酸。

傳感裝置還可用于測定蛋白質(zhì)或酶的加工動力學。傳感裝置的另一應用是測定遺傳突變的影響。使用具有遺傳突變的敏化分子或靶標的裝置可與從不具有突變的敏化分子或靶標的類似裝置處獲得的性能比較。在另一應用中，傳感裝置可用于測量藥物或其他小分子對蛋白質(zhì)的影響，使得蛋白質(zhì)變得有活性或無活性。

制造本發(fā)明裝置的方法可涉及生物化學綴合方案，接著是受控制的沖洗。這樣的過程產(chǎn)生具有一個敏化分子并且沒有干擾分子的非特異性結(jié)合的本發(fā)明裝置。在某些實施方案中，敏化分子經(jīng)由非共價相互作用直接連接到導體。在其他實施方案中，敏化分子被連接到具有至少兩個官能團的中間接頭分子，一個為非共價連接而設(shè)計，而另一個為與敏化分子的通用生物綴合而設(shè)計。使用中間接頭的一個方案提供用于由一大類敏化分子構(gòu)建本發(fā)明裝置的化學上通用的平臺。

在實施方案中，用于制造單分子傳感裝置的方法包括在連接到第一電極和第二電極的襯底上形成至少一個單壁碳納米管；用至少一種含有多個官能團的接頭分子的至少一個官能團非共價地官能化所述裝置的單壁碳納米管側(cè)壁；以及用單個敏化分子的一個或多個官能團官能化至少一種接頭分子中的至少一個官能團。

在實施方案中，單分子傳感裝置可采用晶體管形式，即場效應晶體管(fet)，其上連接的生物分子充當電路的“柵極”。在此實施方案中，單個敏化分子用于裝置的單分子柵極。晶體管實施方案可包括兩個或三個端子晶體管。導電溝道還可由金屬、金屬氧化物、半導體或納米級導體如納米線、石墨烯或單壁碳納米管(swnt)形成。在一個實施方案中，導電溝道是單個swnt。

一般說來，swnt的長度可在約0.1至約10微米之間變化。選擇swnt的具體長度以使得統(tǒng)計上大部分所制造的裝置10僅具有與swnt相連的單個敏化分子。甚至更優(yōu)選地，選擇暴露于外部化學環(huán)境的swnt的長度以使得超過75％所制造的裝置僅包括與swnt相連的單個敏化分子。在一些情況下，此距離為第一電極與第二電極之間的距離。

第一電極和第二電極可任選地用覆蓋物覆蓋。所述覆蓋物可包括窗、凹槽、狹縫或其他開放區(qū)段，其提供從外部環(huán)境進入到swnt的入口。就此而言，swnt可暴露于化學環(huán)境。例如，可在制造過程期間在覆蓋物中界定暴露的窗。保護性覆蓋物確保包括第一和第二電極的大部分表面被保護免于受環(huán)境的影響。此外，在一個優(yōu)選實施方案中，窗的長度被調(diào)整以實現(xiàn)正確的裝置長度。窗的長度可變化以實現(xiàn)swnt上的所需活性區(qū)域。舉例來說，第一和第二電極可連接到swnt上并且由2μm的距離分隔。然而，所述窗可小于電極間距離。使保護性覆蓋物內(nèi)的暴露窗暴露于swnt并且使連接的敏化分子暴露于化學環(huán)境。保護性覆蓋物可為由一個或多個層構(gòu)成的任何電絕緣薄膜。薄膜材料包括聚合物、氧化鋁、二氧化鉿、二氧化硅或氮化硅。使用光刻技術(shù)在保護性覆蓋物內(nèi)界定所述窗。光刻技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的并且包括使用光暴露、電子束方法及正性或負性抗蝕劑的任何可接受的組合。

在實施方案中，裝置制造包括將裝置以正電子束抗蝕劑如聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)的保護性覆蓋物涂覆；用電子束書寫光刻圖案；然后顯影已寫入?yún)^(qū)域以暴露長度為0.5至1.0μm的活性swnt溝道。在另一實施方案中，裝置制造包括以氧化鋁保護性覆蓋物涂覆裝置；進一步以光致抗蝕劑薄膜涂覆裝置；將所需的窗暴露于光；顯影已寫入?yún)^(qū)域以使氧化鋁窄窗暴露；蝕刻氧化鋁以進一步暴露長度為0.5至1.0μm的下層swnt溝道。在保護涂層中兩層或更多層材料的組合提供具有不同化學特性的涂層。

所述裝置被耦合到電子電路。電子電路被用于在第一電極與第二電極之間施加偏壓(例如，50-100mv)并且還被配置來測量隨時間而變的流過swnt的電流。電子電路可耦合到其中具有一個或多個處理器的計算機24，處理器被用于控制通過裝置的電壓和電流的應用并且還獲取、儲存并分析由裝置生成的數(shù)據(jù)。在裝置操作期間，電壓(例如，恒定dc電壓或ac與dc電壓的組合)被施加到第一電極與第二電極之間。接著使用電子電路測量通過swnt的電流，所述電子電路可包括具有一個或多個放大器的電流計。

第一電極、第二電極及swnt可設(shè)置在襯底頂上。所述襯底可包括任意數(shù)目的襯底材料，如玻璃、塑料或硅。本發(fā)明的一個替代實施方案涉及在光學透明的襯底如玻璃或石英上制造裝置。不同于傳感器fet及大部分有關(guān)感測的現(xiàn)有技術(shù)，所述裝置不需要柵電極或?qū)щ娭我r底。因此，所述裝置可在廣泛多種表面(包括透明表面)上制造。石英是如上所述的cvd制造工藝所優(yōu)選的，因為它與高溫相容。如果合成swnt并且通過其他手段如從溶液中旋涂沉積到襯底上的話，或者如果在晶片上制造裝置，然后轉(zhuǎn)移到玻璃用于支撐的話，也可使用玻璃晶片。在任何情況下，石英、玻璃、藍寶石或其他透明襯底的使用都能實現(xiàn)裝置的光學監(jiān)測。監(jiān)測來自連接分子的熒光信號是本領(lǐng)域中公知的，并且最好通過透明襯底完成。在石英襯底上形成的裝置10允許使用本文所述的電學技術(shù)并且通過包括單分子熒光和smfret的光學技術(shù)獨立監(jiān)測分子動力學。

在實施方案中，在不同時期或同時獲得來自同一單分子的電和光信號。位于透明襯底(例如石英)上的單分子傳感裝置提供在現(xiàn)有技術(shù)中未發(fā)現(xiàn)的獨特機會以用獨立的單分子技術(shù)補充smfret。在此實施方案中，使用照射源通過透明襯底照射swnt。發(fā)出的熒光可使用物鏡來收集，該物鏡使用油或水以接觸透明襯底?？墒褂美绻馐蛛x器將熒光導向光子計數(shù)器。

這種雙重模式監(jiān)測可校準通過一種手段進行的測量，如在整體水平下進行的熒光周轉(zhuǎn)測量下的電子監(jiān)測。通過兩種獨立手段對一個分子的同時詢問提供研究同一分子的兩個不同部分的機會，例如，以便比較移動的部分、接受電荷轉(zhuǎn)移的部分、含有催化位點的部分或吸收或發(fā)射光子的部分。兩個這種部分的同步監(jiān)測可確定兩個事件的相對時間和因果關(guān)系，如活性位點的移動與調(diào)節(jié)位點的構(gòu)象變化有關(guān)。此外，透明襯底允許催化位點官能團的光誘發(fā)的活化或光驅(qū)動的電荷轉(zhuǎn)移以用于所生成的構(gòu)象變化的檢查。在一個實施方案中，swnt可整合到流動池等中以使得流體可流過swnt以便于測量?；蛘?，流體可選擇性地沉積在裝置的頂上。

所述裝置可包括一個接頭分子，其含有一個或多個非共價地連接到swnt的外側(cè)壁上的官能團。官能團可包括芘、苯、環(huán)己烷及2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。非共價地連接到swnt的外部側(cè)壁的官能團是本領(lǐng)域中公知的并且針對此官能團的特殊設(shè)計可包括適用于本發(fā)明的任何設(shè)計。此外，接頭分子含有一個或多個用另一官能團官能化的官能團，所述另一官能團以一定方式連接到或已連接到敏化分子上以便保持敏化分子的一些或全部功能性。官能團對可包括疊氮化物和炔烴、nhs酯和胺、硫醇和炔烴、以及硫醇和馬來酰亞胺。用其他官能團官能化的官能團是本領(lǐng)域中公知的并且針對此官能團的特殊設(shè)計可包括適用于本發(fā)明的任何設(shè)計。

所述裝置可包括含有一個或多個官能團的單個敏化分子，所述一個或多個官能團以一定方式被其中一個接頭分子的一個或多個官能團官能化以保留敏化分子的功能性。本發(fā)明的敏化分子包括任何分子。優(yōu)選的敏化分子包括在其與其他分子的相互作用中化學特異性的分子。更優(yōu)選地，敏化分子可包括聚合物、蛋白質(zhì)、dna、rna、核酶和/或適體、多糖或其他生物分子。敏化分子30是本領(lǐng)域中公知的并且可包括適用于本發(fā)明的任何敏化分子。

在實施方案中，接頭分子可包括非共價地粘附到swnt的壁上的第一官能團及被設(shè)計連接到敏化分子的第二官能團。接頭分子的使用避免了在敏化分子與swnt之間設(shè)計有效的直接連接的困難。在此實施方案中，接頭分子和敏化分子實際上是單個實體。在實踐中，實現(xiàn)和控制所需表面密度常常要求接頭分子和敏化分子以兩種單獨的溶液來制備，它們之間的最終鍵聯(lián)在swnt上的適當位置進行。敏化分子可包括第一官能團和第二官能團，所述官能團可包括靶標選擇性官能團。敏化分子的第一官能團結(jié)合至接頭分子的第二官能團。所述結(jié)合可為本領(lǐng)域中已知的任何化學相互作用，例如共價或非共價結(jié)合。在實施方案中，結(jié)合是經(jīng)由共價鍵。第二官能團被設(shè)計以通過任何結(jié)合相互作用結(jié)合至一個靶分子或多個靶分子。敏化分子還包括導電性調(diào)節(jié)組分，其理想地位于靠近swnt連接的位點處。導電性調(diào)節(jié)組分不必緊密接近于第二官能團，但這兩者將通過機械、變構(gòu)或電子手段通信，以使得敏化分子與化學靶標的相互作用誘發(fā)同一敏化分子的導電性調(diào)節(jié)組分的動態(tài)變化，從而影響swnt中的電子變化。

在實施方案中，芘官能團可經(jīng)由π-π堆疊非共價地連接到swnt表面。單個敏化分子可與swnt相連。完成的裝置的典型電特性可用與半導電swnt的側(cè)壁直接接觸的含水電解質(zhì)測量。

在實施方案中，所有三種組分都被合并到單個敏化分子中。舉例來說，蛋白質(zhì)的一個氨基酸可為用于結(jié)合至swnt的有效位點，另一氨基酸可具有能夠調(diào)節(jié)swnt導電性的凈表面電荷，且第三氨基酸可充當?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)合配偶體(即，有待檢測的靶分子)的識別或結(jié)合位點。或者，共價或非共價復合物可經(jīng)設(shè)計并且合成以使所有三種組分在一起作為單個敏化劑。

在實施方案中，敏化分子的不同功能組分被分到兩個或更多個分子中，所有都共價或非共價地裝配在swnt導體上。在此替代實施方案中，導電性調(diào)節(jié)組分可為連接至接頭分子的一個官能團上的分子，且靶標選擇性化學組分可為連接至同一接頭的不同官能團上的第二分子?；蛘撸袠诉x擇性化學組分可具有直接結(jié)合至含有導電性調(diào)節(jié)組分的分子的官能團。此結(jié)合可通過共價鍵或通過非共價識別或?qū)υS多生物分子通用的對接(docking)。在每個情況下，將在組分之間實現(xiàn)某種形式的機械、空間或電通信，使得靶標特異性化學組分的動態(tài)導致整個敏化復合物的導電性調(diào)節(jié)組分的變化。

一個實施方案，所述單分子傳感裝置可包括具有一個或多個swnt的導體；一種或多種含有兩個或更多個官能團的接頭分子，其中一個或多個官能團非共價地結(jié)合至swnt的表面；以及含有至少一個官能團的單個敏化分子，所述官能團被官能化到接頭分子的至少一個官能團。

在實施方案中，單分子傳感裝置包括含有羧酸酯基團的接頭分子和含有胺的敏化分子。接頭分子的羧酸酯官能團可被活化為反應性酯并且使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)來酰胺化。然后，反應性酯可被共價偶聯(lián)到敏化分子的胺基上以形成本領(lǐng)域中公知的穩(wěn)定酰胺鍵。

在實施方案中，單分子傳感裝置包括為芘馬來酰亞胺的接頭分子及含有反應性硫醇基的敏化分子。接頭分子的馬來酰亞胺官能團可與敏化分子的硫醇基共價偶聯(lián)以形成本領(lǐng)域中公知的穩(wěn)定硫酯鍵。

在實施方案中，非共價單分子傳感裝置包括為芘馬來酰亞胺的接頭分子及為蛋白質(zhì)的敏化分子。其他實施方案包括其中蛋白質(zhì)為酶的那些實施方案。在實施方案中，酶為dna聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。利用這些酶中的每一種的單分子傳感裝置的相似產(chǎn)率已通過調(diào)整酶連接期間使用的溶液ph、浸泡持續(xù)時間及沖洗條件實現(xiàn)。

在實施方案中，敏化分子為核酸(例如dna、rna)、核酶、適體、多糖或其他生物分子。一旦與底物或配體結(jié)合或作用于底物或配體便經(jīng)歷構(gòu)象動態(tài)變化的任何敏化分子均適用于本發(fā)明中。在實施方案中，接頭分子包括含有以下的接頭分子：在本領(lǐng)域中已知非共價地官能化到swnt的表面的至少一個官能團；和為在本領(lǐng)域中已知與另一官能團形成鍵的官能團的至少一個官能團。

一個實施方案為使用dna或rna聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶作為非共價地連接到swnt上的單個敏化分子以允許dna、cdna或rna分子的非光學測序。已知催化dntp的模板依賴性摻入的酶經(jīng)歷了充分表征的構(gòu)象變化，其可用于根據(jù)本文所述的方法和裝置監(jiān)測天然或類似dntp或ntp的核苷酸特異性摻入且由此提供模板分子序列。此無標記測序方法就以下特點來說比目前實施的非光學測序方法具有優(yōu)點，因為所述方法允許將核苷酸特異性摻入事件與四種天然或類似dntp或ntp的均勻混合物區(qū)別開，盡管本發(fā)明適合出于序列測定目的使個別dntp或類似dntp或ntp以連續(xù)和循環(huán)方式流動的操作。逆轉(zhuǎn)錄酶作為非共價結(jié)合的敏化分子30的使用使得能夠在無需中間cdna轉(zhuǎn)化步驟的情況下實現(xiàn)rna分子的直接測序。

由于正確核苷酸摻入的精確度在dna、rna或cdna測序中具有相當?shù)闹匾?，所以提高對正確dntp或ntp的特定摻入的檢測的替代方法將使用類似dntp或ntp，其增強了正確核苷酸摻入的構(gòu)象動力學，由此確保精確的測序?？捎糜谔岣哒_核苷酸摻入的動力學或動態(tài)鑒別的非標記類似dntp或ntp是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括但不限于嘌呤和嘧啶堿基的修飾(即，在c-4和c-7位置處)、核苷酸的脫氧核糖或核糖部分、以及dntp或ntp的α、β及γ磷酸酯，包括使用四磷酸酯或五磷酸酯，有或沒有額外的磷酸酯修飾。

可使用序列精確度提高的其他方法，該方法與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的本發(fā)明相容，包括但不限于讀取同一模板分子多次。其他可能性涉及使用讀取兩次格式，其中焦磷酸解被用于再次讀取同一模板分子。

在實施方案中，提供了一種用于檢測單分子傳感裝置的動態(tài)和動力學的方法。用于測量swnt的電導變化的任何方法都可用于監(jiān)測單分子傳感裝置。在實施方案中，在swnt上施加100mv的偏壓差，并且使用電路測量隨時間變化的流過導體的電流。在敏化分子的靶標特異性組分處的化學結(jié)合或識別造成敏化分子的導電性調(diào)節(jié)組分的變化，從而導致測量電流的增大和減小。平均后包含靶標特異性組分的化學動力學的多個結(jié)合和未結(jié)合事件產(chǎn)生多個電流波動，所述電流波動可使用本領(lǐng)域中已知的信號處理技術(shù)對多電流波動進行定時、計數(shù)、鑒別、分析或存儲。電流波動可由方邊圖案的簡單增加和減少組成?；蛘?，波動可包含任何小波，包括三角形、正弦曲線的形狀或具有任意數(shù)目的傅里葉分量。這些小波的振幅、持續(xù)時間及形狀都編碼靶標特異性組分的活性且因此可使用計算機24進行分析以揭示結(jié)合的動力學及其他機械和電子自由度。這些參數(shù)的統(tǒng)計分析提供了對靶結(jié)合及未結(jié)合過程的動力學可變性、轉(zhuǎn)換及中間化學狀態(tài)的認識。電流信號中的自由度在全部結(jié)合至同一位點的多個相似靶分子之間區(qū)別，例如，結(jié)合位點的靶分子與抑制劑分子之間。這些自由度還可區(qū)分弱相互作用，如在真正的結(jié)合之前發(fā)生的分子識別。

在實施方案中，提供了區(qū)分并監(jiān)測抑制劑分子的共價或非共價結(jié)合的能力。蛋白質(zhì)功能的抑制劑作為藥劑在商業(yè)上很重要，包括抗病毒劑、抗癌劑及抗細菌治療劑。有效抑制劑的測試是一個耗時和昂貴的過程。所述裝置提供以單分子分辨率直接監(jiān)測蛋白質(zhì)功能，而同時用任意數(shù)目的不同候選抑制劑探測蛋白質(zhì)。使用本領(lǐng)域中公知的自動流體遞送系統(tǒng)如流動池，候選抑制劑溶液可一個接一個地遞送到裝置中以鑒別具有所需動力學性質(zhì)的抑制劑。或者，候選抑制劑可在混合物中，如所合成抑或通過化學結(jié)構(gòu)或功能或任何其他特征有目的分類的，以便快速地分析整批候選分子。

因此，可見本公開方法能夠檢測單個敏化分子的動態(tài)和動力學。當敏化分子為酶時，動力學和動態(tài)包括酶促周轉(zhuǎn)率或構(gòu)象運動率。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢是在于可檢測單個敏化分子的動態(tài)和動力學，克服了當多個敏化分子存在于swnt上時出現(xiàn)的整體測量問題。此外，本發(fā)明所公開的方法克服了與制造單分子裝置的先前方法有關(guān)的問題，該先前方法在swnt上形成了缺陷位點，swnt則官能化單個敏化分子。

實施方案包括一種制造單分子傳感裝置的方法。所述方法包括在具有其第一和第二末端的襯底26上形成至少一個單壁碳納米管，該第一和第二末端分別連接到第一電極和第二電極上。隨后用至少一種含有多個官能團的接頭分子的至少一個官能團非共價官能化裝置的單壁碳納米管側(cè)壁。用至少一種接頭分子的至少一個官能團(例如，未用swnt非共價官能化的官能團)官能化單個敏化分子。

在實施方案中，制造swcnt-fet并且用缺乏核酸外切酶的kf(d355a/e357a/l790c/c907s)的單半胱氨酸變體來官能化。kf純化至>95％是由其同質(zhì)性確保(圖6)?；跓晒獾臏y定證實連接之前本體酶的活性(圖7)。kf與swcnt-fet的連接是通過以下步驟實現(xiàn)：將裝置浸泡在n-(1-芘基)馬來酰亞胺(1mm在乙醇中，30min)的溶液中，接著與kf(300nmkf，在20mmtris、50mmnacl、10mmmgcl2、100μmtcepph8.0的標準kf活性緩沖液中)一起孵育。數(shù)據(jù)收集之后的原子力顯微術(shù)證實單個kf分子與每個裝置的連接(圖1b)。這類裝置簡稱為kf納米電路。

在實施方案中，將與互補dntp類似物混合的均聚物模板聚(da)42、聚(dt)42、聚(dg)42或聚(dc)42用于檢測聚合酶(例如dna聚合酶)的構(gòu)象變化。在實施方案中，將每個模板融合至m13引發(fā)位點并且以1:1化學計量比與m13正向引物混合；對于雜交，將混合物在熱循環(huán)儀中加熱至95℃持續(xù)5至10min，接著冷卻至65℃，然后以每五分鐘5℃的梯度進一步冷卻直到達到室溫。在實施方案中，將kf納米電路以100nm濃度浸沒在具有退火模板-引物的活性緩沖液中。將天然或類似dntp過量添加到緩沖液中，從而確保用于kf催化的vmax條件。為了彌補dntp類似物的可能降低的親和力，實驗采用比天然dntp(例如，10μm)更高濃度的類似物(圖1c，例如100μm)。

在實施方案中，測量是由通過swcnt-fet監(jiān)測源-漏電流i(t)組成，而連接的kf分子與其周圍環(huán)境相互作用。在實施方案中，漏電極被偏壓在100mv，并且充當柵電極的電解質(zhì)保持在0v上或附近。裝置與任何模板-引物及其互補dntp的孵育轉(zhuǎn)導波動δi(t)，而這些波動在非互補dntp下或在遺失模板-引物或kf連接的控制測量中可能是不存在的。在實施方案中，i(t)波動被放大，在100khz下數(shù)字化，并且存儲為不間斷的，600s。測量之間，可用活性緩沖液沖洗kf納米電路兩次，在緩沖液中孵育5min，隨后在引入另一核苷酸和模板-引物之前用緩沖液沖洗兩次。每個kf分子可用多個類似物、其相應的天然dntp及無核苷酸的緩沖液監(jiān)測以便收集直接可比較的數(shù)據(jù)集，從而證實典型的kf活性并且產(chǎn)生δi(t)偏移。

圖2a和2b示出了由在dgtp存在下加工聚(dc)42模板的kf納米電路產(chǎn)生的代表性δi(t)信號。在實施方案中，所述裝置產(chǎn)生負δi(t)偏移的不間斷序列，在三個不同放大倍數(shù)下示出。每個δi(t)偏移表示形成一個堿基對，并且來源于δi(t)數(shù)據(jù)集的動力學參數(shù)與kf運動的已知單分子分析及整體kf摻入率一致。在實施方案中，g·c或c·g堿基對形成可彼此相同；a·t/t·a堿基對形成也可提供彼此極類似的聚合動力學、動態(tài)及δi(t)值。用天然dntp的測量可提供用于與dntp類似物比較的基線值。

在實施方案中，在整體和單分子測定兩者中將可商購獲得的dntp類似物經(jīng)由kf聚合摻入dna中(圖8a-8b)。在實施方案中，用α-硫代-dntp或dntpαs類似物的測量產(chǎn)生δi(t)數(shù)據(jù)集，其可類似于天然dntp出現(xiàn)，但具有不同的摻入率(圖2c)。在實施方案中，當用kf納米電路測量時，6-氯-2-氨基嘌呤-drtp或6-cl-2-aptp的摻入與聚(dc)42和聚(dt)42模板兩者相反，造成具有反轉(zhuǎn)振幅的δi(t)信號，反映了不同的kf構(gòu)象(圖2d)。此類似物更緩慢地摻入；例如，與聚(dc)42相反，6-cl-2aptp在80％的dgtp比率下產(chǎn)生δi(t)偏移。在2-硫代-dntp類似物下的δi(t)記錄產(chǎn)生混合行為，其中kf活性在一分鐘期間產(chǎn)生負δi(t)偏移，在另一分鐘期間產(chǎn)生正δi(t)偏移，且更少見地，兩種行為沿著單模板鏈的混合物(圖2e-2f)。

對于天然dntp，實驗基線電流τ開放的時間常數(shù)也可稱為τ高。表示天然dntp摻入事件的時間常數(shù)可在較低電流下出現(xiàn)，并且被稱為τ低。本文公開了正、負或正和負δi(t)偏移的混合物，并且任一方向的偏移的時間常數(shù)被稱為τ閉合。τ開放和τ閉合的分布來源于聚合數(shù)據(jù)的每個記錄。

圖3a-3b示出了dgtp底物摻入到聚(dc)42模板中的示例性分布。來自天然和類似dgtpτ閉合事件的分布幾乎不能區(qū)分，例外的是在尾部中的稀有事件，對此有最少的統(tǒng)計資料(圖3a)。為了繪出天然與類似dntp之間的比較，專注于這些分布的主要poissonian分量的平均時間常數(shù)<τ>。<τ閉合>的所有平均值非常一致地為約0.3±0.1ms。通過比較，<τ開放>的分布與平均值明顯不同。舉例來說，kf當加工α-硫代-dgtp時在其開放構(gòu)象上耗費了63.6±2.8ms，這比對于天然dgtp觀察到的40.8±0.6ms要長56％(圖3b)。

動力學參數(shù)<τ閉合>、<τ開放>及平均摻入率k是針對具有天然和類似dntp的四個均聚模板來分析(表1)。正如如上所述的情況一樣，每個組合產(chǎn)生相同的τ閉合分布，其中<τ閉合>值在0.3±0.1ms范圍內(nèi)。雖然先前對于四種天然dntp觀察到類似效應，³³但此結(jié)果向具有不同核堿基大小、電子性質(zhì)、氫鍵合或在α-磷酸二酯處的取代的dntp類似物的擴展是出乎意料的。

另一方面，τ開放對dntp特性更敏感。<τ開放>的平均持續(xù)時間在23ms(對于天然dctp)至145ms(對于α-硫代-datp)范圍內(nèi)。在四種天然dntp中，<τ開放>對于dttp或datp摻入比對于dgtp或dctp摻入要更長。此分級在針對所有四種α-硫代-dntp所測量的更長的<τ開放>持續(xù)時間內(nèi)保留。α-硫代取代在dgtp和dctp的情況下使<τ開放>增加了50％，而對于dttp和datp增加超過100％。

dntp摻入的平均kf加工速率經(jīng)計算為k＝(<τ開放>+<τ閉合>)^-1。τ開放在很大程度上決定了k，因為它比τ閉合長至少60倍。在其最快時，kf以超過30s^-1摻入2-硫代-dctp。上文針對α-硫代-dntp所述的的τ開放增加使k對于α-硫代-dctp和α-硫代-dgtp降至15s^-1并且對于α-硫代-datp和α-硫代-dttp降至7s^-1。6-cl-2aptp摻入的速率最有利地與針對天然dgtp摻入觀察到的緩慢速率相比。相反，2-硫代-dttp和2-硫代-dctp摻入比其天然對應物的摻入稍微更快地出現(xiàn)。

使用一打不同的kf分子再現(xiàn)相似結(jié)果。每個kf連接至不同的swcnt-fet并且獨立地測量。對于比較，用dntp類似物測量的非均聚模板產(chǎn)生相似的動力學(數(shù)據(jù)未示出)。如先前提及，實驗應用100μm的dntp類似物以確保穩(wěn)態(tài)條件；對于比較，用聚(dt)42模板的10μmα-硫代-datp不影響dna聚合。由于靜態(tài)失調(diào)，一些kf分子比整體平均更快地或更慢地加工，但對于類似物與天然dntp的相對比較沒有任何顯著變化。

在此項研究中進行的單分子實驗對dna聚合酶像kf的充分理解的可塑性作了說明和新的闡述。此類酶可適應、甚至顯著修飾引入的dntp。然而，直接觀察到由酶所需的構(gòu)象運動當面對某些改變的dntp時保持保真度。反映了對這種適應的限制，已知dna聚合酶展現(xiàn)對dntp大小與形狀中的微小變化的強敏感性。分析受益于在許多持續(xù)摻入事件期間單分子數(shù)據(jù)與天然和dntp的比較。此分析從催化期間兩個觀察到的酶構(gòu)象的動力學開始，其是由τ開放和t閉合捕獲。

在τ開放期間發(fā)生的事件包括dntp識別的限速步驟，其對核堿基和主鏈修飾都敏感。合適的核苷酸的成功識別和結(jié)合觸發(fā)kf活化和閉合。相關(guān)t7dna聚合酶的先前基于fret的實驗已鑒別了由錯配識別引起的“充分開放”構(gòu)象狀態(tài)。然而，使用l790c連接位點，swcnt-fet沒有記錄kf運動并且在錯配的dntp存在下沒有信號。中間狀態(tài)的不存在或錯配相關(guān)運動表明連接位點對此初始保真度檢查點不敏感。因此，δi(t)偏移是由催化定向的構(gòu)象引起，并且并不僅局限于酶開放和閉合的全局運動。

dntp類似物因其通過dna聚合酶摻入dna模板中的能力以及在大小、結(jié)構(gòu)及反應性上的變化而被選擇。檢查在α-磷酸酯或核堿基處的取代。第一類型的類似物(例如α-硫代-dntp)用硫取代非橋接的α-磷?；踉右砸胄碌牧Ⅲw中心并且改變此關(guān)鍵位點處的反應性。第二類別的dntp類似物在核堿基上的取代(例如鹵素或硫取代)改變堿基對的大小和電子結(jié)構(gòu)；一些類似物還改變可用于堿基配對的氫鍵。例如，6-cl-2-aptp(圖1c)具有兩個氫鍵分布，允許其在t和c堿基的相對位置處摻入。與datp相比，6-cl-2-aptp用氯置換6-氨基，但引入2-氨基官能團；此構(gòu)型最終提供與datp相同數(shù)目的與t互補的沃森-克里克氫鍵。當用作dgtp類似物時，6-cl-2-aptp具有不同的互變異構(gòu)化，這n-1從氫鍵供體改變?yōu)槭荏w。在此情況下，用氯置換氧顯著降低氫鍵的強度。⁴¹像6-cl-2aptp一樣，硫取代的類似物2-硫代-dttp和2-硫代-dctp由于硫代羰基的鍵長增加還形成更大的堿基對。

在實施方案中，dntp或ntp類似物在三磷酸酯部分包括化學修飾。在實施方案中，在三磷酸酯部分的化學修飾在α-位處具有s對o的取代。在實施方案中，任何dntp或ntp類似物的三磷酸酯部分具有式(i)的結(jié)構(gòu)，其中x^-1為s或o。在實施方案中，dntp類似物為α-硫代-datp、α-硫代-dgtp、α-硫代-dctp或α-硫代-dttp。在實施方案中，ntp類似物為α-硫代-atp、α-硫代-gtp、α-硫代-ctp或α-硫代-ttp。在實施方案中，dntp或ntp類似物包括在如式(i)中列出的三磷酸酯部分的α位處的取代、以及一個或多個如本文所公開并在本領(lǐng)域中已知的核堿基處的取代。

在實施方案中，dntp或ntp類似物在核堿基處被取代。在實施方案中，嘌呤如式(iia)中所示被取代：其中x¹為氫、鹵素或-nh2，且x²為氫或-nh2。在實施方案中，x¹為-nh2，且x²為氫，提供datp或atp。在實施方案中，x¹不為-nh2，且x²為-nh2，提供6-取代的2-aptp或其取代的類似物。在實施方案中，該類似物為6-cl-2-aptp，也稱為6-cl-dgtp。

在實施方案中，dntp或ntp類似物包括核堿基，其是8-氧代鳥嘌呤、2,6-二氨基-4-氧代-5-甲酰胺基嘧啶、n⁶-甲基-腺苷、o⁶-甲基鳥苷、n²-甲基-鳥苷、2,6-二氨基嘌呤、吲哚基、5-甲基吲哚基、5-烷基-吲哚基(例如5-乙基-吲哚基)、5-亞乙基-吲哚基、5-硝基-吲哚基、4-硝基-吲哚基、5-苯基-吲哚基、5-鹵基-吲哚基(例如5-f-吲哚基)、5-氨基-吲哚基或6-硝基-吲哚基。

在實施方案中，dntp或ntp包括具有式(iib)結(jié)構(gòu)的核堿基：其中x³為o或s。在實施方案中，x³為o，提供胞嘧啶核堿基。在實施方案中，x³為s，提供2-硫代核堿基。在實施方案中，核堿基為2-硫代-dctp或2-硫代-ctp。

在實施方案中，dntp或ntp包括具有式(iic)結(jié)構(gòu)的核堿基：其中x⁴為o或s。在實施方案中，x⁴為o，提供胸腺嘧啶核堿基。在實施方案中，x⁴為s，提供2-硫代核堿基。在實施方案中，核堿基為2-硫代-dttp或2-硫代-ttp。

在實施方案中，dntp或ntp包括具有式(iid)結(jié)構(gòu)的核堿基：其中x⁵為o或s。在實施方案中，x⁵為o，提供6-氮雜-胸腺嘧啶核堿基。在實施方案中，x⁵為s，提供6-氮雜-2-硫代核堿基。在實施方案中，核堿基為6-氮雜-2-硫代-dttp或6-氮雜-2-硫代-ttp。

在實施方案中，類似物為α-硫代datp、dttp、dctp及dgtp、2-硫代datp、dttp、dctp及dgtp、2-氨基-6-cl-嘌呤-2'-脫氧核糖核苷-三磷酸(稱為6-cldgtp或6-cl-2aptp)、4-硫代dttp、2-氮雜dttp、5-氟代dttp或γ-ansdttp。

在實施方案中，τ開放中觀察到的差異很大程度上反映了識別和結(jié)合非天然dntp的機制。與天然dgtp相比α-硫代-dgtp和6-cl-2aptp的分布中的長尾可已經(jīng)造成<τ開放>增加(圖3b)。所述尾可以200ms的時間常數(shù)擬合第二指數(shù)，比天然dgtp的<τ開放>長約五倍?？稍诒疚乃_的所有dntp類似物下觀察到類似的長尾，說明了當摻入非天然底物時酶所面臨的挑戰(zhàn)。除識別外的步驟在本文所報道的τ開放期間潛在地進行；共價鍵形成是一個可能的實例，其發(fā)生過于快速以致于因為速率限制而不可檢測，甚至在α-硫代-dntp的緩慢反應性下也如此。在2-硫代類似物下觀察到的較快摻入速率可由更穩(wěn)定的堿基對形成引起，從而有效地縮短了<τ開放>值。在與模板g堿基的氫鍵合界面處的2-硫代-dctp硫原子的較大尺寸似乎不會影響2-硫代-dctp有效地堿基配對的能力。在實施方案中，檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法檢測到與dttp摻入相比2-硫代-dttp和4-硫代-dttp的聚合效率的提高。

6-cl-2aptp類似物與dgtp相比具有弱得多的氫鍵合及后續(xù)不夠理想的堿基配對，其例示了kf催化的dna聚合期間堿基配對識別的挑戰(zhàn)。6-cl-2aptp對比dgtp相對于聚(dc)42模板的摻入的較長<τ開放>值說明了dna聚合酶部分地通過延長分配給識別的時間而接受非天然dntp的可能性。在相對于聚(dc)的6-cl-2aptp聚合期間觀察到的<τ開放>值及由此的摻入速率降至介于天然dgtp與datp相對于互補均聚模板的摻入所測量的值之間。因此，盡管當與dgtp相比時其更改的互變異構(gòu)化及后續(xù)至少一個堿基配對氫鍵的損失，6-cl-2aptp仍可比天然datp更快地摻入。在實施方案中，檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法檢測到當6-cl-2aptp被視為dgtp類似物時在小溝中的堿基配對氫鍵保持不變并且可控制針對dgtp、dctp及6-cl-2aptp相對于聚(dc)模板所觀察到的相對較快速率。

在實施方案中，參見，例如圖5a，kf在所有四種天然核苷酸(dntp)存在下加工異質(zhì)性底物，每個堿基對摻入產(chǎn)生負電流尖峰δi<o。個別尖峰可如圖5a所示列舉，但它們一般不能將一種類型的堿基與另一種相區(qū)分。

在實施方案中，參見，例如圖5b，使用2-硫代-dttp類似物。在硫醇化脫氧胸苷下，正尖峰表示(#2、6、7)摻入t核苷酸時的位置。此觀察結(jié)果可通過用rna聚合酶取代kf而擴展至rna測序。圖5b中描繪的過程鑒別了在特定的dna底物中的所有t核苷酸摻入。所述過程可通過用四種不同的硫醇化核苷酸的每一種測量底物而擴展至所有四種堿基。

在實施方案中，參見，例如圖5c，當kf在與某些類似物混合的天然核苷酸(dntp)存在下加工異質(zhì)性底物時，所得圖案含有可用于鑒別所選堿基的正和負電流尖峰。在實施方案中，使用與6-cl-2aptp混合的三種天然核苷酸(datp、dttp、dctp)作為用于g摻入的類似物。將在此實施方案中的電流尖峰編號以列舉15個堿基摻入事件。大多數(shù)事件(#1、4、7、9、10、13、14、15)可由單個負電流尖峰組成，該尖峰鑒別了天然核苷酸的摻入。在實施方案中，其中五個事件(例如，#2、3、6、8、11；在圖5c中用箭頭突出顯示)是正電流尖峰，其鑒別了6-cl-2aptp核苷酸摻入。在實施方案中，當6-cl-2aptp被用作天然dgtp核苷酸的類似物時，事件(例如，#2、3、6、8、11；在圖5c中用箭頭突出顯示)鑒別了在dna序列中的g核苷酸。

在實施方案中，圖5c中示出的兩個事件(#5、12)含有一對緊密間隔的電流尖峰。這些尖峰對可表示一個天然和一個6-cl-2aptp核苷酸快速連續(xù)的摻入。或者，一對尖峰可為由充當datp的假類似物的6-cl-daptp引起的獨特信號。

在實施方案中，檢測聚合酶中的構(gòu)象變化的方法被用于為寡核苷酸測序。獲得的信息(例如，圖5a-5c)傳達寡核苷酸的序列，因為尖峰指出哪種核苷酸或類似物在聚合酶沿著其底物移動時被摻入。

除了識別和結(jié)合之外，α-硫代-dntp摻入的延長的<τ開放>值也可由新合成的dna的降低的穩(wěn)定性引起。均聚模板的kf催化加工可產(chǎn)生扭曲的dsdna。此外，α-硫代-dntp尤其傾向于在不利的dna主鏈相互作用下形成穩(wěn)定性較小的二元復合物，其逐漸減慢kf的催化速率。在α-硫代-datp/α-硫代-dttp對比α-硫代-dgtp/α-硫代-dctp摻入期間觀察到與用相應的天然dntp的實驗相比對此步驟更明顯的作用。在實施方案中，檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法表現(xiàn)出序列依賴性dna不穩(wěn)定性，當使用均聚模板時其突顯了警告?；蛘撸瞬町惪商崾睛?硫代取代進一步干擾致使對于天然a·t/t·a堿基對的<τ開放>更長的機制。與α-硫代-dntp摻入有關(guān)的τ開放中的一些變化可由弱抑制性rp立體異構(gòu)體(ki≈30μm)引起，在此類似物的商業(yè)合成中以與sp立體異構(gòu)體大約1:1的比率存在。此抑制比天然dntp的km弱約一個數(shù)量級，¹⁰且因此預期可僅適度地影響<τ開放>值。

在τ閉合期間，kf經(jīng)歷對應于引入的核苷酸與新生dsdna之間的一個磷酸二酯鍵形成的不同構(gòu)象變化。在底物受限的實驗中，δi(t)偏移的數(shù)量匹配懸垂模板堿基的數(shù)量；因此，τ閉合期間的構(gòu)象變化必須在每次成功的持續(xù)核苷酸摻入時發(fā)生。早先，天然dntp的<τ閉合>的短且相等持續(xù)時間支持其中τ閉合由共價鍵形成步驟自身引起的模型。³³在實施方案中，檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法使用在dntp類似物下的三個觀察結(jié)果。首先，δi(t)偏移的方向?qū)τ谝恍ヾntp類似物是逆向的。其次，2-硫代-dntp類似物的摻入產(chǎn)生正和負δi(t)偏移的混合物。再者，如表1所示，<τ閉合>的不變性擴展至所有測試的類似物，盡管在親電子α-磷酸處有取代或適應核堿基上的取代所需的可能替代構(gòu)象。

在此項電子技術(shù)中，下層swcnt-fet通過連接位點1nm內(nèi)的蛋白質(zhì)帶電表面殘基而對靜電門控非常敏感。同一酶的不同變體根據(jù)swcnt相鄰殘基的電荷及其運動方向可展現(xiàn)正或負δi(t)偏移。在實施方案中，在檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法期間，kf及其靜電門控swcnt-fet的帶電殘基可保持不變?？勺兊摩膇(t)偏移可指示鄰近于kf連接位點的殘基響應于有催化能力的循環(huán)期間的某些dntp類似物采用不同的運動。這類運動可經(jīng)由變構(gòu)性從kf活性位點傳出，但其不是共價鍵形成的運動。在實施方案中，共價步驟不能用相同機制和以相同<τ閉合>持續(xù)時間進行，但是以兩個相對運動。相反，造成τ閉合的相關(guān)殘基運動可不依賴于初始分子識別及kf催化的化學步驟。

在實施方案中，在檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法中，kf經(jīng)由“指狀物”子域中的蛋白質(zhì)l790c側(cè)鏈連接至swcnt-fet，從而將相關(guān)帶電殘基的靜電門控運動與τ閉合期間的催化定向運動聯(lián)系起來。每個τ閉合事件可由活性位點o-螺旋本身或在成功的核苷酸摻入的觀察階段期間在兩個可能方向上扭轉(zhuǎn)的特定o-螺旋殘基引起。此提出的扭轉(zhuǎn)是由于考慮到核苷酸摻入的已知階段期間的活性位點殘基運動及其對帶電殘基相對于swcnt-fet的理論鄰近性的作用而推斷。舉例來說，用kf的smfret實驗揭示了活性位點o-螺旋介于開放與閉合狀態(tài)之間的中間構(gòu)象；在kf同系物bstpoli的晶體結(jié)構(gòu)中觀察到潛在相似的“半開”構(gòu)象。bstpolio-螺旋的c末端在通向閉合的途徑上扭結(jié)以使得kfy766等效物的大移位伴隨有kff762等效物的細微旋轉(zhuǎn)。kff762等效物的旋轉(zhuǎn)繼續(xù)直到酶閉合。

通過比較kf與bstpoli的晶體結(jié)構(gòu)，鑒別出鄰近于swcnt-fet的帶電殘基，其可響應于kf活性位點中的y766和f762的旋轉(zhuǎn)而移動。在實施方案中，在檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法中，δi(t)偏移的來源是酶閉合及堿基摻入之后y766和/或f762的額外運動，該運動繼續(xù)傳播到接近swcnt-fet的帶電殘基。通過smfret在成功的核苷酸摻入之后已經(jīng)觀察到當新生堿基對移到kf插入后位點時的額外kf構(gòu)象變化，并且可能是通過τ閉合測量的運動。由芳族活性位點殘基賦予的顯著相互作用可包括新形成的堿基對的π-π堆疊。這類運動可評估堿基對的電子構(gòu)型并且詢問鍵形成步驟的保真度而無需親水性相互作用，這是通過dntp類似物的取代而改變。

dna聚合酶(包括所公開的)非常易于誘變以調(diào)整其性質(zhì)，包括用于dna測序應用。在實施方案中，本公開的方法涉及引入dna聚合酶中的突變以用于酶與碳納米管的生物綴合。在實施方案中，這類突變改變dna聚合酶的性質(zhì)以便于非天然堿基的更高效摻入并且改變酶的持續(xù)合成能力(processivity)。在實施方案中，這類誘變用于改善電讀出和酶的性質(zhì)。例如，在實施方案中，突變被引入酶活性位點中以適應具有與對酶活性位點作出的突變互補的形狀或官能團的特定dntp類似物。在實施方案中，dna聚合酶經(jīng)突變以增強由dna聚合期間摻入的每個堿基引起的電響應；舉例來說，接近碳納米管的酶的帶電殘基的取代提供酶運動期間的可合理化反應。

kf納米電路展現(xiàn)了對于堿基對的a·t/t·a組比g·c/c·g組更大的δi(t)偏移。結(jié)構(gòu)結(jié)果已表明a和t模板堿基大多數(shù)深埋于dna聚合酶活性位點中且因此，o-螺旋的旋轉(zhuǎn)可最大化。kfe710和y766及其他同源活性位點谷氨酸和酪氨酸殘基已與用于a·t/t·a堿基對超過g·c/c·g堿基對的穩(wěn)定化的機制有關(guān)。在實施方案中，核苷酸摻入之前在kfe710與kfy766之間的氫鍵合相互作用可影響活性位點的大小和形狀并且可在dntp類似物識別的τ閉合步驟中起重要作用。

在實施方案中，在2-硫代-dttp和2-硫代-dctp摻入期間的相似結(jié)果說明觀察到堿基對電子結(jié)構(gòu)的kf優(yōu)先識別。雖然硫取代僅影響2-硫代-dctp類似物中的沃森-克里克氫鍵受體，但兩種2-硫代-dntp類似物都產(chǎn)生正和負δi(t)偏移的混合物且因此都造成摻入期間的類似kf運動。2-硫代-dntp類似物的硫取代與引入6-cl-2aptp中的更顯著電子變化相比較小，但酶以類似但非排他性方式作出響應。所觀察到的負和正δi(t)偏移的混合物提示kf在2-硫代取代的dntp的摻入期間分別進入天然和替代運動。明顯的記憶效應將酶鎖定在一個運動或另一運動持續(xù)幾十秒，暗示額外的構(gòu)象變化，該變化在2-硫代-dntp的特殊情況下在能量上是雙穩(wěn)態(tài)的。

在實施方案中，檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法包括使新生dna穿梭到無活性的核酸外切酶(外)結(jié)構(gòu)域作為正δi(t)偏移的可能來源。不穩(wěn)定的引物末端一旦由于不夠理想的堿基配對而解鏈，dna便穿梭往返于無活性的外結(jié)構(gòu)域并且kf經(jīng)歷不同的構(gòu)象變化。然而，這類轉(zhuǎn)變遠離連接位點出現(xiàn)并且此時觀察到的正δi(t)偏移不改變<τ閉合>的持續(xù)時間。因此，向外結(jié)構(gòu)域的穿梭似乎與正δi(t)偏移的觀察結(jié)果不一致。類似于已知在錯配的dntp識別期間出現(xiàn)的構(gòu)象步驟，向外結(jié)構(gòu)域的穿梭必須在τ開放期間進行。本公開的δi(t)偏移可在定向催化循環(huán)期間出現(xiàn)，并且可表示與旋轉(zhuǎn)o-螺旋一致的可適應的kf運動，由此測試新形成的dna堿基對的電子完整性。

在實施方案中，檢測核酸聚合酶構(gòu)象的方法，dntp類似物挑戰(zhàn)通過dna聚合酶進行核苷酸摻入的限制，包括在親電子磷酸處的立體化學、引入的堿基的氫鍵合能力以及保真度檢查的機制。因為大多數(shù)dntp類似物增加平均<τ開放>及其動力學分布的寬度，所以速率決定的dntp識別步驟似乎對底物結(jié)構(gòu)中的甚至較小變化也高度敏感。然而，在鍵形成的反應性位點處的顯著取代未能影響<τ閉合>的持續(xù)時間。另一方面，δi(t)偏移的方向在堿基修飾的dntp類似物下切換為正信號或負信號與正信號的混合物。因為這些dntp類似物在與天然底物相同的鍵形成中心處具有官能團，所以δi(t)方向的顯著改變可由在開放以加工下一底物之前通過kf的保真度檢查引起。這類事件可容易區(qū)分于天然dntp摻入事件并且通過逆轉(zhuǎn)其動態(tài)錯誤檢查的方向提供對適應非天然dntp的酶的直接觀察。

實施例

實施例1.通過單分子dna聚合酶i(klenow片段)納米電路摻入脫氧核苷三磷酸類似物

引言.為了確保所有已知生命形式的存活，dna聚合酶必須準確地識別引入的脫氧核苷三磷酸(dntp)底物并且成功地催化它們向新dna鏈中的摻入。所有dna聚合酶的所需保真度部分地依賴于與單鏈dna模板雜交的引入的dntp的沃森-克里克堿基對互補性。[1,2]然而，不能與天然互補堿基進行氫鍵合的非天然dntp也通過dna聚合酶成功地摻入。這種類似物可形成具有類似于規(guī)范的a·t和g·c堿基對的形狀的穩(wěn)定堿基對。[3-5]dntp類似物的研究揭示了對核苷酸摻入期間的立體化學、幾何結(jié)構(gòu)、電子效應及疏水性相互作用的需要。[6-9]

來自dntp類似物摻入實驗的結(jié)果闡明了通過dna聚合酶的核苷酸選擇標準，包括對進一步鏈延伸和高效催化的需要。例如，來自與硫代磷酸酯類似物的聚合的催化速率決定了對通過將3’-oh引發(fā)到dntp的親電子α-磷酸酯上的親核攻擊的立體化學優(yōu)選。[6]核堿基的小修飾，包括在氫鍵合位置中的硫代和鹵取代，造成摻入率改變并且顯示對在dna聚合酶活性位點中的緊密空間配合的需要。[8,10]]摻入非天然堿基所需的沃森-克里克樣幾何結(jié)構(gòu)是通過聚合酶活性位點與出現(xiàn)的堿基對之間的若干相互作用誘導。[5]

除了單個堿基對之外的非天然dntp聚合的詳細評估可提供關(guān)于此非天然聚合酶活性的準確的動力學信息。此外，堿基識別期間相關(guān)的小構(gòu)象變化向可靠的測量的轉(zhuǎn)換可展現(xiàn)空間排列和電子學在dna聚合中的作用的新方面。如在此所報道，這種信息可通過單分子技術(shù)被闡明。

酶的本體或整體群體的常規(guī)研究不能觀察反應機制中的中間步驟和過渡狀態(tài)。然而，個別分子的實驗允許觀察這種狀態(tài)，否則其將在整體群體中被平均。[11-13]采用單分子共振能量傳遞(smfret)的dna聚合實驗已揭示了構(gòu)象靈活性以及對dna聚合酶iklenow片段(在下文中稱為kf)的保真度機制的認識。[14-16]盡管smfret有捕捉有關(guān)酶動態(tài)的新信息的能力，但它需要熒光標記的蛋白質(zhì)和/或底物。光漂白及熒光團之間的光子通量分別限制了smfret實驗的持續(xù)時間和時間分辨率。

近來，描述了一種單分子酶學的新方法并且將其應用于三種酶。在此項技術(shù)中，個別蛋白質(zhì)被生物綴合至單壁碳納米管場效應晶體管(swcnt-fet；圖1a)。該方法揭示了對t4溶菌酶(一種已研究了100余年的酶)的步驟數(shù)量、動力學參數(shù)及持續(xù)加工能力的新認識。[17,18]多核苷酸激酶a(pka)的極大動態(tài)速率揭示了酶作為高度可調(diào)節(jié)的分子開關(guān)的作用。[19]在檢查綴合至swcnt-fet的kf時，a·t/t·a與g·c/c·g堿基配對之間的顯著差異提示酶的閉合構(gòu)象取決于引入的dntp的特性。[20]對此差異的敏感性是驚人的，因為沃森-克里克堿基對具有相似的大小，并且這指出swcnt-fet技術(shù)還可能響應于獨特的動力學及與dntp類似物有關(guān)的構(gòu)象。

在此，swcnt-fet技術(shù)被用于區(qū)分在通過kf摻入期間的天然dntp與dntp類似物之間的差異。使用硫代和鹵取代的dntp類似物，監(jiān)測dna聚合，然后進行統(tǒng)計分析以揭示一些而非所有dntp類似物的摻入動力學中的差異。此外，每種類似物花費在酶開放和閉合構(gòu)象上的時間揭示了限速步驟所需的時間變化。結(jié)果提供了在催化期間酶錨定的形象及分子識別中的挑戰(zhàn)。

實驗.制造swcntfet[17]并且用核酸外切酶缺乏的kf的單半胱氨酸變體來官能化。kf純化至>95％確保了其同質(zhì)性。基于熒光的測定證實了連接之前本體酶的活性。[20,21]從每個裝置收集數(shù)據(jù)之后，原子力顯微術(shù)證實了個別kf分子的連接(圖1b)。

對于每次測量，選擇dntp以與均聚模板聚(da)42、聚(dt)42、聚(dg)42及聚(dc)42互補。將每個模板融合至m13引發(fā)位點并且與m13正向引物以1:1化學計量比混合；對于雜交，將混合物加熱至95℃持續(xù)5至10分鐘，接著冷卻至室溫。將swcntfet與模板-引物雜交物一起以100nm濃度浸沒在標準dnapoli活性緩沖液(20mmtris、50mmnacl、10mmmgcl2、100μmtcepph8.0)中。將天然或類似dntp過量添加到緩沖液中，從而確保對kf的vmax條件。為了彌補dntp類似物的較慢摻入，實驗采用比天然dntp(10μm，fisher)更高濃度的類似物(圖1c，100μm，trilinkbiotechnologies)。

測量由在連接的kf分子與其周圍環(huán)境相互作用時監(jiān)測swcntfet的源-漏電流i(t)組成。fet被偏壓在100mv，并且充當柵電極的電解質(zhì)保持在0v。裝置與任何核苷酸及其互補模板-引物的孵育轉(zhuǎn)導用電流前置放大器(keithley428)測量的波動δi(t)，在100khz下數(shù)字化，并且存儲用于后續(xù)分析。測量之間，用分析緩沖液沖洗kf納米電路兩次，在緩沖液中孵育5分鐘，隨后在引入另一核苷酸之前用緩沖液再次沖洗兩次。在多個類似物、相應的天然dntp及無核苷酸的緩沖液下監(jiān)測每個kf分子以便收集直接可比的數(shù)據(jù)集，從而證實典型的kf活性并且再現(xiàn)先前報道的δi(t)類型。[20]

結(jié)果.納米電路與天然dntp及其互補模板-引物的孵育導致電流的負變化δi(t)(圖2a)。如先前所報道，快速電流波動僅在kf、dntp及模板-引物存在下出現(xiàn)。每個δi(t)偏移與kf酶的閉合有關(guān)。因此，來源于在天然dntp下的這種電流偏移測量的動力學參數(shù)與先前的酶運動分析一致(例如，圖2a)。[20]這些測量提供基線值以供與dntp類似物比較(表1)。

表1：通過kf的天然和類似dntp摻入的動力學^a

^a平均值±標準偏差

^b對于向上或向下切換事件觀察到相似的值。

dntp類似物檢查在α-磷酸處的取代或核堿基的改變。在第一類別中，硫?qū)α柞；踉拥娜〈鷮⑿碌牧Ⅲw中心引入dntp中以形成α-硫代-dntp，也稱為dntpαs。商業(yè)上合成而不對立體化學進行控制，在此α-磷處的非對映異構(gòu)體比率可能為1:1。在第二類別的dntp類似物中，在核堿基上的鹵素或硫取代可引入具有改變的互變異構(gòu)化的較大堿基且因此不同的氫鍵合。例如，類似物6-氯-dgtp(也稱為6-cl-2-aptp)具有與dgtp不同的互變異構(gòu)化，這將n-1從氫鍵供體改變?yōu)槭荏w。而且，用氯化物置換氧降低氫鍵的強度。修飾的核堿基的其他實例2-硫代-dttp和2-硫代-dctp用硫取代氧以增加這些堿基的大小。由這些類似物摻入引起的動力學改變預期產(chǎn)生區(qū)別性的電子信號，或許減慢引入的dntp的酶識別。

將硫代磷酸酯類似物(α-硫代-dntp)、6-cl-dgtp、2-硫代-dttp及2-硫代-dctp與互補模板-引物一起孵育。如在天然dntp下觀察到的，負電流波動在α-硫代-dntp摻入期間發(fā)生(圖2b)。相反，6-cl-dgtp摻入造成正電流波動(圖2c)。含有2-硫代取代的類似物造成負和正電流波動的混合物。α-硫代-dgtp和6-cl-dgtp類似物兩者都產(chǎn)生δi(t)偏移兩次至三次，與dgtp相比不那么頻繁。

τ開放和τ閉合的分布來源于dgtp及其兩種類似物的大于50s的聚合數(shù)據(jù)(圖3a-3b)。數(shù)據(jù)擬合具有單<τ>時間常數(shù)的簡單泊松分布。天然和類似dgtpτ閉合事件的分布的擬合僅稍微彼此偏離，特別是在尾部處。大多數(shù)事件與高概率重疊(-50％)。在dgtp、α-硫代-dgtp或6-cl-dgtp存在下閉合復合物的平均持續(xù)時間相差很小(0.2-0.4ms)。對于天然dgtp，對數(shù)據(jù)的單指數(shù)擬合涵蓋>90％的τ開放事件。然而，對于α-硫代-dgtp或6-cldgtp數(shù)據(jù)的相似擬合僅可涵蓋≈75％的τ開放事件。在kf開放構(gòu)象中，僅20-30％的類似物事件與天然dgtp所需的精確時間常數(shù)重疊。dgtp類似物摻入的動力學明顯與天然偏離，并且它們的平均時間常數(shù)可容易區(qū)分。

動力學參數(shù)τ閉合、τ開放及摻入速率(k)的分析擴展到其他天然和類似底物(表1)。如對于α-硫代-dgtp和6-cl-dgtp所述，kf閉合期間磷酸二酯鍵的形成(通過τ閉合量化)對于所檢查的所有dntp(包括天然和類似物)來說持續(xù)0.2與0.4ms。對于所有α-硫代dntp來說，kf開放構(gòu)象τ開放的平均持續(xù)時間比其天然dntp長2至3倍。舉例來說，與天然dgtp(24±1ms)相比，當加工α-硫代-dgtp(63±3ms)時kf在開放構(gòu)象τ開放上花費大約2.5倍更久。如對于天然dntp所報告，[20]α-硫代-dctp和α-硫代-dgtp與α-硫代-datp和α-硫代-dttp相比更快地摻入到新生鏈中。τ開放占優(yōu)勢的a·t/t·a堿基對形成比g·c/c·g堿基對的τ開放長2至3倍。

τ開放和τ閉合值揭示dntp摻入的完整循環(huán)所需的時間。平均kf加工速率計算為k＝1/(<τ開放>+<τ閉合>)?？紤]到在開放構(gòu)象中花費的多得多的時間(>98％)，τ開放的持續(xù)時間很大程度上決定了酶促催化的速率。平均kf加工速率對于α-硫代-dntp和6-cl-dgtp類似物來說低2至3倍，因為τ開放要長2至3倍。舉例來說，當加工6-cl-dgtp(<τ開放>＝50±1ms)時花費在kf開放構(gòu)象上的時間是dgtp加工時的約兩倍(<τ開放>＝24±1ms)，分別產(chǎn)生20s-1對比41s-1的速率。2-硫代-dttp(<k>＝16s-1)和2-硫代-dctp(<k>＝36s-1)的速率與其天然對應物大致相同。

討論.磷酸二酯鍵形成似乎與類似物取代無關(guān)，甚至在α-磷酸酯被修飾時。α-硫代-dntp的硫取代關(guān)鍵的親電子官能團中的非橋連氧原子。盡管磷酸酯的親電性較弱且硫代磷酸二酯與磷酸二酯相比后續(xù)反應性降低，但鍵交換步驟仍是快速而非限速的。[22,23]

大約25％的α-硫代-dgtp和6-cl-dgtpτ開放事件偏離數(shù)據(jù)的單指數(shù)擬合，這與當酶努力在非天然dntp周圍閉合時發(fā)生的更大外離事件一致。τ開放的較慢時間常數(shù)證實修飾堿基所固有的限速的引入dntp識別步驟所需的時間更久。然而，天然與類似dgtp的分布之間的相當大的重疊防止每個事件的kf構(gòu)象的瞬時分配(instantaneousassignment)。

先前的研究確定了α-硫代dntp的sp非對映異構(gòu)體作為dnapoli摻入的唯一優(yōu)選底物。6觀察到的α-硫代-dntp加工速率可歸因于通過rp非對映異構(gòu)體的dna聚合酶的假底物抑制。α-硫代-dttp的rp非對映異構(gòu)體較弱地結(jié)合至kf活性位點，并且以ki≈30μm抑制其催化。此抑制常數(shù)比天然dntp的km弱大約一個數(shù)量級。6雖然非立體化學控制的α-硫代取代有效地除去一半可利用的底物，但大量過量的α-硫代-dgtp確保這種作用不可能是花費在酶開放構(gòu)象上的時間明顯延長的原因。另外，α-硫代-dntp的非對映異構(gòu)體混合物還可影響所合成鏈的dna主鏈的穩(wěn)定性。[24,25]然而，在酶閉合構(gòu)象期間發(fā)生的由τ閉合量化的磷酸二酯主鏈的形成保持不變。因此，在減緩α-硫代-dntp的動力學中最可能的原因是引入的堿基識別步驟期間通過rp立體異構(gòu)體的抑制。因此，kf發(fā)現(xiàn)具有正確立體化學構(gòu)型的dntp，排除了競爭結(jié)合并抑制酶的不正確底物。

先前的研究顯示通過dna聚合酶α高效催化的6-cl-dgtp以堿基配對摻入聚(dc)模板中。[26]]盡管6-cl-dgtp可通過t4dna聚合酶在堿基t的相對位置摻入，[27,28]但迄今為止此能力未在kf官能化的納米電路中被探究。本文所述的6-cl-dgtp的實驗說明dna聚合酶能夠以不正確的沃森-克里克堿基配對接受非天然dntp。為了成功地摻入這些非天然堿基，dna聚合酶必須采用核苷酸選擇的常規(guī)氫鍵合識別標準的替代。動力學結(jié)果與同dntp識別期間的氫鍵合有關(guān)的速率限制步驟的調(diào)整一致。

推測在鑒別較大尺寸的堿基6-cl-dgtp、2-硫代-dttp及2-硫代-dctp之后的構(gòu)象變化可誘導在對敏感swcnt-fet的電荷門控中的差異。令人高興的是，當kf納米電路與6-cl-dgtp及聚(dc)42一起孵育時觀察到獨特信號。正δi(t)偏移或“向上切換”可能表示酶閉合的不同模式(圖2d)。這些信號與天然dgtp摻入的結(jié)果相反。20如在t4溶菌酶的電荷突變體的實驗中所示，29在6-cl-dgtp摻入期間帶負電的氨基酸官能團必須移動更靠近納米管抑或帶正電的官能團必須移動遠離。對于2-硫代取代的dntp，觀察到向上和向下切換事件的復雜混合物。與kf閉合有關(guān)的向上和向下切換的隨機分布表明酶采用一種以上構(gòu)象來保持高效催化。

盡管在天然與類似dgtp摻入的動力學中有大的重疊，但kf在2-硫代dctp、2-硫代dttp及6-cl-dgtp的催化期間明顯獲取不同的構(gòu)象。這些獨特的向上切換信號可由在往返于核酸外切酶結(jié)構(gòu)域分配期間通過kfj-螺旋調(diào)節(jié)的構(gòu)象變化所引起，因為kf識別不那么完美的互補堿基的摻入。[14,30-32]然而，這種穿梭需要以極快速率進行，因為與天然dntp相比，對于6-cl-dgtp、2-硫代-dttp及2-硫代-dctp沒有觀察到酶閉合時間τ閉合之間的差異。為了在dna測序中的可能應用，允許引入的dntp鑒別的這些不同信號的潛能值得進一步研究。

結(jié)論.總之，dntp類似物挑戰(zhàn)通過dna聚合酶摻入核苷酸的限制，包括親電子磷酸處的立體化學、引入的堿基的氫鍵合能力以及酶閉合的程度。因為大多數(shù)所檢查的類似物減小τ開放及相應的酶速率，所以速率決定的dntp識別步驟似乎對底物結(jié)構(gòu)中的較小變化也高度敏感。相反，在鍵形成的反應性位點處的甚至顯著取代也未能影響kf閉合時間。在此所述的結(jié)果表明在使用kf納米電路進行dntp類似物摻入的每個步驟期間兩種可能的策略是針對kf構(gòu)象分配。首先，修飾可靶向dntp識別和活化期間開放kf的構(gòu)象。然而，迄今為止，包括6-cl-dgtp和α-硫代-dntp的修飾的dntp只能減緩酶的平均速率。值得額外研究的另一策略影響kf的閉合構(gòu)象。修飾的堿基如6-cl-dgtp、2-硫代dctp及2-硫代-dttp可改變摻入期間酶的構(gòu)象，從而顯著影響增加通過swcnt的電流時觀察到的電子信號。這種向上切換可容易區(qū)分于天然dntp的摻入并且提供對容易適應非天然dntp的酶的直接觀察?？傊?，即使是充分研究的酶的構(gòu)象敏感的電子測量也可揭示酶運動和動態(tài)的新的且出乎意料的方面。

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實施例2.通過單分子dna聚合酶i(klenow片段)納米電路-2摻入的脫氧核苷三磷酸類似物。

說明.將dna聚合酶i的klenow片段(kf)的單個拷貝連接到單壁碳納米管裝置并且在不同的化學輔因子存在下進行電學測量。制造的所有方面都按照由olsen等人所述的方案進行。

結(jié)果.圖4a-4b顯示當kf在天然的核苷酸三磷酸脫氧胸苷(dttp存在下加工聚(da)42時，各堿基對摻入產(chǎn)生負電流尖峰δi<0。當dttp被非天然核苷酸2-硫代-2’-脫氧胸苷-5’-三磷酸(2-硫代-dttp)取代時，堿基摻入產(chǎn)生正電流尖峰δi>0。

圖5a顯示當kf在所有四種天然核苷酸(dntp)存在下加工異質(zhì)性底物時，每個堿基對摻入產(chǎn)生負電流尖峰δi<o。個別尖峰可如所示列舉，但一般說來，它們不能將一種類型的堿基與另一種相區(qū)分。

如圖5b中所示，用被2-硫代-dttp取代的dttp模擬相同的數(shù)據(jù)集。在硫醇化脫氧胸苷下，正尖峰現(xiàn)表示(#2、6、7)摻入t核苷酸時的位置。此觀察結(jié)果可通過用rna聚合酶取代kf而擴展至rna測序。圖5b中描繪的過程鑒別了在特定的dna底物中的所有t核苷酸摻入。所述過程可通過用四種不同的硫醇化核苷酸的每一種測量底物而擴展至所有四種堿基。

圖5c顯示當kf在與某些類似物混合的天然核苷酸(dntp)存在下加工異質(zhì)性底物時，所得圖案含有可用于鑒別所選的堿基的正和負電流尖峰。此實施例示出了使用與6-cl-2aptp混合的三種天然核苷酸(datp、dttp、dctp)作為用于g摻入的類似物獲得的數(shù)據(jù)。將在此數(shù)據(jù)的電流尖峰編號以列舉15個堿基摻入事件。大多數(shù)事件(#1、4、7、9、10、13、14、15)由單個負電流尖峰組成，該尖峰鑒別了天然核苷酸的摻入。五個事件(#2、3、6、8、11)用箭頭突出顯示，因為它們是鑒別6-cl-2aptp核苷酸摻入的正電流尖峰。因為6-cl-2aptp在此被用作天然dgtp核苷酸的類似物，所以這五個事件鑒別了dna序列中的g核苷酸。

圖5c中示出的兩個事件(#5、12)含有一對緊密間隔的電流尖峰。這些尖峰對可表示一個天然和一個6-cl-2aptp核苷酸快速連續(xù)的摻入?；蛘撸粚夥蹇蔀橛沙洚攄atp的假類似物的6-cl-daptp引起的獨特信號。

參考(實施例2和背景).[1]t.j.olsen,y.choi,p.c.sims,0.t.gul,b.l.corso,c.dong,...g.a.weiss,electronicmeasurementsofsingle-moleculeprocessingbydnapolymerasei(klenowfragment),iam.chem.soc.135,7855(2013)；[2]y.choi,1.s.moody,p.c.sims,s.r.hunt,b.l.corso,g.a.weiss,andp.g.collins,single-moleculelysozymedynamicsmonitoredbyanelectroniccircuit,science335,319(2012)；[3],y.choi,1.5.moody,p.c.sims,s.r.hunt,b.l.corso,d.e.seitz,...g.a.weiss,singlemoleculedynamicsoflysozymeprocessingdistinguisheslinearandcross-linkedpeptidoglycansubstrates,.1.am.chem.soc.134,2032(2012)；[4],y.choi,t.j.olsen,p.c.sims,1.s.moody,b.l.corso,m.n.dang,.p.g.collins,dissectingsingle-moleculesignaltransductionincarbonnanotubecircuitswithproteinengineering,nanolett.13,625(2013)；[5],p.c.sims,i.s.moody,y.choi,c.dong,m.iftikhar,b.l.corso,...g.a.weiss,electronicmeasurementsofsingle-moleculeprocessingbyproteinkinasea,iani.chem.soc.135,7861(2013；[6],l.t.c.franca,e.carrilho,andt.b.l.kist,areviewofdnasequencingtechniques,quarterlyreviewsofbiophysics35,169(2002)；[7],5.e.jacutin,unnaturalnucleotidesfordnasequencing.(texasa&muniversity,collegestation,tx,1997).[8],t.d.harris,p.r.buzby,h.babcock,e.beer,j.bowers,i.braslavsky,.z.xie,single-moleculednasequencingofaviralgenomescience320106(2008)；[9],d.stoddart,a.j.heron,e.mikhailova,g.maglia,andh.bayley,single-nucleotidediscriminationinimmobilizeddnaoligonucleotideswithabiologicalnanopore,proc.nati.acad.sci.u.s.a.106,7702(2009)；[10],s.sorgenfrei,c.-y.chiu,r.l.gonzalez,y.-j.yu,p.kim,c.nuckolls,andk.l.shepard,label-freesingle-moleculedetectionofdna-hybridizationkineticswithacarbonnanotubefield-effecttransistor,nat.nanotechnol.6,126(2011)；[11],t.c.glenn,fieldguidetonext-generationdnasequencers,molecularecologyresources11,759(2011).

實施例3：kf的表達和純化

商購獲得的試劑包括抗生素(fisherscientific)、ni-imac樹脂(bio-radlaboratories)、細胞系(stratagene)、脫氧核苷三磷酸(fisherscientific)、脫氧核苷三磷酸類似物(trilinkbiotechnologies)、酶(newenglandbiolabs或fermentas)、寡核苷酸(fisher)、高分辨率瓊脂糖(thenestgroup)以及96孔熒光板(nunc)。所有其他化學品都是由acrosorganics,emd,fisherscientific或sigmaaldrich商購獲得。所有試劑都直接使用。

含有編碼kf(d355a/e357a/c907s/l790c)^1,2的基因(在下文稱為kf)的pet28c質(zhì)粒被用于通過熱休克轉(zhuǎn)化cacl2感受態(tài)bl21(de3)大腸桿菌細胞。在固體培養(yǎng)基上生長過夜之后，單個集落被用于接種25ml補充有40μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基用于在37℃下伴隨振蕩在液體培養(yǎng)基中生長過夜。用10ml過夜培養(yǎng)物接種補充有40μg/ml卡那霉素的lb(1l)并且在37℃下伴隨振蕩孵育幾小時。一旦細胞達到對數(shù)晚期(od600＝0.9)，便通過添加1mmiptg誘導kf表達。在37℃下伴隨振蕩表達蛋白質(zhì)3-4h之后，通過離心(6000rpm，20min，4℃)采集細胞并且再懸浮于溶解緩沖液(20mmtris、50mmnacl、10mmbme，ph8.0)中。通過超聲處理溶解細胞并且通過離心(15,000rpm，45min，4℃)收集細胞碎片。經(jīng)由0.45μm孔隙過濾器過濾之后，允許溶解產(chǎn)物上清液在4℃下結(jié)合至ni-imac樹脂過夜。將kf在具有250mm咪唑的溶解緩沖液中洗脫，濃縮，然后用tev蛋白酶在4℃下處理兩天。將混合物離心，然后經(jīng)由0.45μm過濾器過濾，之后在bio-radbiologicduoflowfplc上在tbs(20mmtris、50mmnacl、100μmtcepph7.9)中進行尺寸排阻色譜法。通過sds-page評價kf純度(圖6)。

kf及dntp類似物摻入的整體活性

用于測試活性的寡核苷酸

表2列出了用于測試kf活性、dntp類似物摻入及用于納米電路測量的寡核苷酸。一旦接收到，便將hplc純化的寡核苷酸在水中溶解至100μm。粗體區(qū)表示m13引發(fā)位點。斜體區(qū)表示限制位點。[2ampur]表示2-氨基嘌呤。

表2.用于活性及電子測量的寡核苷酸

kf活性的整體測定

為了證實變體kf(l790c)對比野生型kf的活性，先前所述的測定如下進行改編。^1,3將含有2-氨基嘌呤(表s1中的actassay模板)和m13引發(fā)位點(加下劃線)的隨機化dna模板通過加熱混合物至65℃并緩慢冷卻至室溫持續(xù)1h來與m13f引物退火。在與引物-模板混合物(25μm)和dntp(250μm)孵育后，對于kf(l790c)和野生型kf(都是1μm)觀察到熒光的可比較的減少。通過減去背景校正原始熒光數(shù)據(jù)，其是在dntp不存在下測量。在此實驗中使用的激發(fā)和發(fā)射波長分別為305和365nm。

dntp類似物摻入的整體測定

為了證實dntp類似物的摻入，在與m13f引物雜交之后通過kf聚合隨機化dna模板(表s1)。陽性對照反應含有kf(1μm)、dntp或dntp類似物(100μm)以及在10mmtris、50mmnacl、10mmmgcl2、1mmdttph7.9中的a/t或g/c摻入模板-引物(5μm)。測試dntp類似物摻入的反應含有100μm類似物代替其天然dntp，且陰性對照反應省去類似物或其天然dntp。將反應保持在25℃下在熱循環(huán)儀中2h，之后在5％高分辨率瓊脂糖凝膠上電泳(圖8b)。

本公開的實施方案：

一種檢測核酸聚合酶構(gòu)象中的變化的方法，所述方法包括：

(i)將非共價地連接至單壁碳納米管(swnt)的核酸聚合酶與第一核苷酸或第一核苷酸類似物及模板核酸序列接觸，由此形成結(jié)合至所述第一核苷酸或第一核苷酸類似物及所述模板核酸序列的構(gòu)象上變化的核酸聚合酶；

(ii)通過測量核酸聚合酶與構(gòu)象上變化的核酸聚合酶之間在swnt中的第一電導變化來檢測構(gòu)象上變化的核酸聚合酶。

所述方法，其中所述核酸聚合酶與第一核苷酸類似物接觸。

所述方法，其還包括(iii)基于由所述第一電導變化產(chǎn)生的第一信號鑒別所述第一核苷酸或第一核苷酸類似物。

所述方法，其還包括：(iv)允許所述構(gòu)象上變化的核酸聚合酶釋放所述第一核苷酸或第一核苷酸類似物，由此改造所述核酸聚合酶。

所述方法還包括

(v)將非共價地連接至單壁碳納米管(swnt)的核酸聚合酶與第二核苷酸或第二核苷酸類似物及所述模板核酸序列接觸，由此形成結(jié)合至所述第二核苷酸或第二核苷酸類似物及所述模板核酸序列的構(gòu)象上變化的核酸聚合酶；以及

(vi)通過測量所述核酸聚合酶與結(jié)合至第二核苷酸或第二核苷酸類似物及模板核酸序列的構(gòu)象上變化的核酸聚合酶之間在swnt中的電導變化來檢測所述構(gòu)象上變化的核酸聚合酶。

如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述核酸聚合酶與第二核苷酸類似物接觸。

所述方法，其還包括(vii)基于由所述第二電導變化產(chǎn)生的第二信號鑒別所述第二核苷酸或第二核苷酸類似物；以及鑒別模板核酸內(nèi)的序列。

所述方法，其中所述第一核苷酸類似物或所述第二核苷酸類似物以非沃森-克里克堿基配對與所述模板核酸序列雜交。

所述方法，其中所述第一核苷酸類似物或所述第二核苷酸類似物為2-硫代dctp、2-硫代dttp或6-cl-dgtp、6-氮雜-dttp、α-硫代-datp或α-硫代-dttp。

所述方法，其中所述第一核苷酸類似物或所述第二核苷酸類似物在三磷酸酯部分被修飾。

所述方法，其中所述三磷酸酯部分包含α-硫代取代。

所述方法，其中所述第一核苷酸類似物或所述第二核苷酸類似物為α-硫代-datp、α-硫代-dgtp、α-硫代-dctp或α-硫代-dttp。

所述方法，其中所述第一核苷酸類似物或所述第二核苷酸類似物還在核堿基處包含取代。

所述方法，其中所述第一核苷酸類似物或所述第二核苷酸類似物為α-硫代-2-硫代-dttp、α-硫代-2-硫代-dctp、α-硫代-6-cl-20aptp或6-cl-2aptp。

序列表

<110>theregentsoftheuniversityofcalifornia

collins,philipg.

weiss,gregorya.

choi,yongki

olsen,tivoli

<120>使用納米管的核酸聚合酶構(gòu)象變化的檢測

<130>48538-526001wo

<150>us62/093,671

<151>2014-12-18

<160>12

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>1

tgtaaaacgacggccagt18

<210>2

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(19)..(19)

<223>2-氨基嘌呤

<400>2

tcgagctatctctaaagcagctaactatcgagctatcgcgaaactggccgtcgttttaca60

<210>3

<211>59

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>3

cctaacgcagatagacgttgtttagagcccgggtcggccatactggccgtcgttttaca59

<210>4

<211>59

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>4

cctaacgcagatagacgttgtttagagatttaaattcggccactggccgtcgttttaca59

<210>5

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>5

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactggccgtcgttttaca60

<210>6

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>6

ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttactggccgtcgttttaca60

<210>7

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>7

ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggactggccgtcgttttaca60

<210>8

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>8

ccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccactggccgtcgttttaca60

<210>9

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>9

tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt42

<210>10

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>10

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<210>11

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>11

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<210>12

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成多核苷酸

<400>12

cccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccc42