一種桔青霉的固定化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種桔青霉的固定化方法，以經(jīng)過(guò)預(yù)處理的纖維材料作為固定化介質(zhì)，將核酸酶P1的生產(chǎn)菌株桔青霉活化后接入發(fā)酵容器中培養(yǎng)24～60h，使菌株在培養(yǎng)過(guò)程中吸附于纖維材料上。本發(fā)明中，固定化細(xì)胞所用的纖維材料經(jīng)過(guò)了相應(yīng)的預(yù)處理過(guò)程，其作為固定化材料成本低、無(wú)毒、易得、制備過(guò)程簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的纖維材料具有較高的孔隙率和比表面積，因此單位體積固定的細(xì)胞數(shù)目多，保證了高密度發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，而且具有良好的傳質(zhì)性能，并縮短了發(fā)酵周期。
【專利說(shuō)明】一種桔青霉的固定化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及桔青霉的固定化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸酶Pl是具有重要應(yīng)用價(jià)值的酶制劑，主要催化特性為裂解RNA和DNA中的3’，5’ -磷酸二酯鍵，生成5’ -核苷酸以及在低溫環(huán)境下分解單核苷酸和寡核苷酸中的3’-磷酸單酯鍵，是核苷酸工業(yè)生產(chǎn)中必不可少的原料。核酸酶Pl的生產(chǎn)通常采用固體或液體發(fā)酵。固體發(fā)酵簡(jiǎn)便、成本低，但占地面積大、生產(chǎn)效率低，而且產(chǎn)生的分生孢子易污染環(huán)境。深層發(fā)酵避免了上述缺點(diǎn)，但成本較高。
[0003]隨著固定化技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物發(fā)酵領(lǐng)域。將桔青霉菌絲體固定在谷?；蚱渌恍┒栊圆牧仙?，重復(fù)使用，既降低了發(fā)酵液粘度，利于氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，提高了細(xì)胞利用率和生物反應(yīng)速率，同時(shí)也便于產(chǎn)物的分離提取等后處理加工。近年來(lái)，核酸酶Pi的固定化發(fā)酵生產(chǎn)得到了越來(lái)越多的關(guān)注。
[0004]目前應(yīng)用于桔青霉的固定方法常見(jiàn)的有吸附法和包埋法。夏黎明等利用吸附固定在多孔聚酯載體上的桔青霉菌絲生產(chǎn)核酸酶，酶活可高達(dá)513U/mL，其產(chǎn)酶效率是游離菌絲的3.6倍，連續(xù)生產(chǎn)28批，產(chǎn)酶水平?jīng)]有下降，平均酶活達(dá)到507U/mL。王克明等先使用玉米芯顆粒吸附桔青霉孢子，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的海藻酸鈉包埋吸附固定化細(xì)胞玉米芯顆粒,于搖瓶中培養(yǎng)50h后，發(fā)酵液中核酸酶Pl的活力高達(dá)503U/mL，并經(jīng)過(guò)了 30批次連續(xù)重復(fù)發(fā)酵產(chǎn)酶穩(wěn)定在較高水平。宋威等采用聚乙烯醇與海藻酸鈉比例為2:I的復(fù)合載體固定桔青霉的孢子，連續(xù)發(fā)酵20個(gè)周期后，生產(chǎn)的核酸酶酶Pl活力損失不大，始終保持在468~501U/mL。但是，為了更 進(jìn)一步提高核酸酶Pl的生產(chǎn)效率，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，仍需要尋找更加天然、高效的固定化材料。
[0005]近年來(lái)，以纖維材料作為固定化介質(zhì)的纖維床生物反應(yīng)器作為一種新型固定化方法受到了廣泛關(guān)注。用纖維材料做固定材料，不僅工藝穩(wěn)定，無(wú)毒，廉價(jià)易得，吸附效果好，重復(fù)使用率高，而且對(duì)細(xì)胞活性具有較好的保護(hù)作用，但目前為止纖維材料作為固定材料而應(yīng)用于核酸酶Pl的發(fā)酵卻鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種穩(wěn)定高效的桔青霉的固定化方法。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0008]一種桔青霉的固定化方法，以經(jīng)過(guò)預(yù)處理的纖維材料作為固定化介質(zhì)，將核酸酶Pl的生產(chǎn)菌株桔青霉活化后接入發(fā)酵容器中培養(yǎng)24~60h，使菌株在培養(yǎng)過(guò)程中吸附于纖維材料上。
[0009]其中，所述的纖維材料為棉纖維織物、活性炭纖維、納米纖維、竹纖維、聚乙烯醇纖維、聚氨酯泡沫、絲綢、細(xì)菌纖維素膜、絲瓜瓤和甘蔗渣中的任意一種或幾種。
[0010]其中，所述的預(yù)處理，具體步驟如下:[0011](I)將纖維材料在沸水中煮沸后烘干；
[0012](2)將經(jīng)過(guò)步驟(1)處理后的纖維材料置于濃度為I~100g/L的表面改性劑水溶液中浸泡I~20小時(shí)，并用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后烘干；
[0013] (3)將經(jīng)過(guò)步驟(2)處理后的纖維材料置于濃度為I~100g/L的交聯(lián)劑水溶液中浸泡I~20小時(shí)，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后烘干，保存?zhèn)溆谩?br> [0014]所述的表面改性劑為聚乙烯亞胺、聚醚酰亞胺、丁二酰亞胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一種或幾種；所述的交聯(lián)劑為戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1，3-丙二醛和(2S，3R) -2, 3- 二羥基丁二醛中的任意一種或幾種。
[0015]其中，當(dāng)發(fā)酵容器為搖瓶時(shí)，纖維材料以50g/L的添加量平鋪固定于搖瓶底部的不銹鋼絲圈上。
[0016]其中，當(dāng)發(fā)酵容器為氣升式發(fā)酵罐時(shí)，將纖維材料裁剪成長(zhǎng)條狀，沿垂直方向螺旋纏繞在多條不銹鋼絲條上，如圖1所示。
[0017]其中，當(dāng)發(fā)酵容器為自吸式發(fā)酵罐時(shí)，將纖維材料平鋪在與之大小形狀均相同的鋼絲網(wǎng)上，纖維材料與鋼絲網(wǎng)一起卷成筒狀，如圖2所示。
[0018]有益效果:相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明優(yōu)勢(shì)如下:
[0019]1、本發(fā)明所采用的纖維材料為化學(xué)惰性，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒害作用，機(jī)械強(qiáng)度高，也不會(huì)被細(xì)胞代謝分解，不影響微生物的生長(zhǎng)代謝，死細(xì)胞自行脫落，而活細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)自增殖過(guò)程，始終維持很高的催化效率。
[0020]2、選用的纖維材料具有較高的孔隙率和比表面積，因此單位體積固定的細(xì)胞數(shù)目多，不僅固定化的細(xì)胞密度大，保證了高密度發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，而且具有良好的傳質(zhì)性能，傳質(zhì)效率高，并縮短了發(fā)酵周期，搖瓶發(fā)酵的時(shí)間由游離發(fā)酵的48-65小時(shí)下降至36-50h，氣升式纖維床反應(yīng)器的發(fā)酵時(shí)間也由游離發(fā)酵的72-96小時(shí)下降至60-82小時(shí)，自吸式纖維床反應(yīng)器的發(fā)酵時(shí)間也由游離發(fā)酵的65-84小時(shí)下降至48-76小時(shí)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為氣升式發(fā)酵罐中纖維材料的固定方式示意圖；其中，I表示不銹鋼絲條；2表示纖維材料。
[0022]圖2為自吸式發(fā)酵罐中纖維材料的固定方式示意圖；其中，I表示不銹鋼絲網(wǎng)；2表示纖維材料。
[0023]圖3為采用本發(fā)明的核酸酶Pl固定化發(fā)酵方法的示意圖；其中，I表示補(bǔ)料瓶；2表示螺動(dòng)泵；3表示接種口 ；4表示排氣口 ；5表示空壓機(jī)；6表示轉(zhuǎn)子流量計(jì)；7表示空氣過(guò)濾器；8表示空氣分布器。
[0024]圖4為吸附于棉纖維材料上的桔青霉生物膜樣品的SEM照片。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0026]以下實(shí)施例所使用的生產(chǎn)核酸酶Pl的菌株為桔青霉YL104，該菌株已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC N0.2014，記載在中國(guó)專利CN101067116A 中。
[0027]實(shí)施例1:纖維材料固定化介質(zhì)的制備。
[0028]天然纖維材料由于和微生物細(xì)胞的表面特性相近，因此在一定程度上阻礙了菌體細(xì)胞吸附到纖維材料表面，所以要對(duì)纖維材料進(jìn)行相關(guān)預(yù)處理，以促進(jìn)細(xì)胞吸附到纖維載體表面。就上述纖維材料的預(yù)處理方法所確定的一個(gè)具體實(shí)施方案:
[0029](I)將纖維材料在沸水中煮沸0.1-5小時(shí)后20-100°C下烘干；
[0030](2)將纖維材料置于濃度為I~100g/L的表面改性劑水溶液中浸泡1-20小時(shí)，并用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的PH至7.0，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后60-80°C烘干；
[0031](3)將纖維材料置于濃度為I~100g/L的交聯(lián)劑水溶液中浸泡1-20小時(shí)，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后60-80°C烘干，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0032]所述的表面改性劑為聚乙烯亞胺、聚醚酰亞胺、丁二酰亞胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一種或幾種；所述的交聯(lián)劑為戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1，3-丙二醛和(2S，3R) -2, 3- 二羥基丁二醛中的任意一種或幾種。
[0033]例如可以采用如下具體的預(yù)處理過(guò)程；
[0034]方式一:
[0035](I)將活性炭纖維在沸水中煮沸I小時(shí)后60°C下烘干；
[0036](2)將活性炭纖維·置于濃度為10g/L的二甲胺基丙胺水溶液中浸泡4小時(shí)，并用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，再將活性炭纖維置于去離子水中充分漂洗后60°C烘干；
[0037](3)將活性炭纖維置于濃度為10g/L的乙二醛水溶液中浸泡4小時(shí)，再將活性炭纖維置于去離子水中充分漂洗后60°C烘干，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0038]方式二:
[0039](I)將棉纖維在沸水中煮沸2小時(shí)后80°C下烘干；
[0040](2)將棉纖維置于濃度20g/L的聚乙烯亞胺水溶液中浸泡2小時(shí)，并用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，再將棉纖維置于去離子水中充分漂洗后60°C烘干；
[0041](3)將棉纖維置于濃度為15g/L的戊二醛水溶液中浸泡2小時(shí)，再將棉纖維置于去離子水中充分漂洗后60°C烘干，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0042]方式三:
[0043](I)將竹纖維在沸水中煮沸I小時(shí)后60°C下烘干；
[0044](2)將竹纖維置于濃度為5g/L的丁二酰亞胺水溶液中浸泡3小時(shí)，并用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，再將竹纖維置于去離子水中充分漂洗后60°C烘干；
[0045](3)將竹纖維置于濃度為10g/L的2-甲基-1，3_丙二醛水溶液中浸泡3小時(shí)，再將竹纖維置于去離子水中充分漂洗后80°C烘干，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0046]預(yù)處理后的纖維材料的孔隙率> 90%，比表面積> 30m2/m3，不僅固定化的細(xì)胞密度大，而且具有良好的傳質(zhì)性能。
[0047]實(shí)施例2:采用活性炭纖維固定化介質(zhì)于搖瓶中生產(chǎn)核酸酶P1。
[0048]按照實(shí)施例1中方式一所述的方法將活性炭纖維進(jìn)行預(yù)處理，將處理過(guò)的活性炭纖維以50g/L的添加量平鋪在直徑略小于三角瓶直徑的鋼絲圈上進(jìn)行固定，作為搖瓶中固定化發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶Pl的固定化介質(zhì)。[0049]將桔青霉菌株于麥芽汁斜面上28~30°C培養(yǎng)5~7天進(jìn)行活化，用無(wú)菌水充分洗滌桔青霉斜面得到孢子懸液，轉(zhuǎn)接于裝IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(組分:葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀0.04g/L，磷酸氫二鉀0.04g/L，硫酸鎂0.05g/L，氯化鈣0.05g/L，硫酸鋅0.05g/L, pH5-7)的500mL的搖瓶中，于28~30°C,250rpm搖床中培養(yǎng)24_60h，待發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液全部移出，測(cè)定發(fā)酵液中核酸酶Pl的酶活，并補(bǔ)入相同體積的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行下一批發(fā)酵。搖瓶中活性炭纖維固定化發(fā)酵的時(shí)間由游離發(fā)酵的48-65小時(shí)下降至36-50h，連續(xù)生產(chǎn)22批，產(chǎn)酶水平基本沒(méi)有下降，酶活始終保持在450-500U/mL。
[0050]實(shí)施例3:以棉纖維為固定化介質(zhì)的氣升式纖維床反應(yīng)器生產(chǎn)核酸酶P1。
[0051]按實(shí)施例1中方式二所述的方法將棉纖維進(jìn)行預(yù)處理，如圖1所示，將棉纖維材料裁剪成長(zhǎng)條狀，呈螺旋狀纏繞在不銹鋼絲柱的側(cè)柱上，作為氣升式發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶Pl的固定化介質(zhì)。[0052]將桔青霉菌進(jìn)行斜面培養(yǎng)，斜面孢子用無(wú)菌水洗下接入三角瓶，在無(wú)菌狀態(tài)下接入15升內(nèi)循環(huán)氣升式發(fā)酵罐中進(jìn)行游離培養(yǎng)，培養(yǎng)基為葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀0.04g/L,磷酸氫二鉀0.04g/L,硫酸鎂0.05g/L,氯化鈣0.05g/L,硫酸鋅0.05g/L,PH5-7，培養(yǎng)溫度28~30°C，罐壓0.8~1.5MPa，通氣量1.2~1.8m3/h,待發(fā)酵液中核酸酶Pl的酶活達(dá)到100U/mL以上，用無(wú)菌壓縮空氣將發(fā)酵液全部移至一氣升式纖維床反應(yīng)器中，培養(yǎng)基成分和發(fā)酵參數(shù)同上，使菌株邊發(fā)酵邊固定于纖維床上，測(cè)定發(fā)酵液中的酶活，當(dāng)發(fā)酵液中的酶活達(dá)到400U/mL時(shí)，將發(fā)酵液全部移出，并補(bǔ)入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行下一批發(fā)酵。氣升式纖維床反應(yīng)器的發(fā)酵時(shí)間由游離發(fā)酵的72-96小時(shí)下降至62-80小時(shí)，連續(xù)生產(chǎn)了 15批，發(fā)酵周期穩(wěn)定在同一水平。
[0053]實(shí)施例4:以竹纖維為固定化介質(zhì)的自吸式纖維床反應(yīng)器生產(chǎn)核酸酶P1。
[0054]以實(shí)施例1中方式三所述的方法對(duì)竹纖維進(jìn)行預(yù)處理，如圖2，將處理過(guò)的竹纖維材料2以15g/L的添加量平鋪在與之大小形狀均相同的鋼絲網(wǎng)I上，與其卷成筒狀，纖維材料層與層之間保持疏松均勻，填充在自吸式發(fā)酵罐中作為生產(chǎn)核酸酶Pl的固定化介質(zhì)。
[0055]將桔青霉菌株在斜面上活化后，接入氣升罐中進(jìn)行游離培養(yǎng)，待發(fā)酵液中開(kāi)始有酶活后，用無(wú)菌壓縮空氣將發(fā)酵液全部移至自吸式纖維床反應(yīng)器中進(jìn)行固定化發(fā)酵，培養(yǎng)基成分為葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀0.04g/L,磷酸氫二鉀0.04g/L,硫酸鎂0.05g/L，氯化鈣 0.05g/L,硫酸鋅 0.05g/L, pH5_7，培養(yǎng)溫度 28 ~30°C，罐壓 0.5 ~1.2MPa，通氣量0.4~1.0m3/h，待發(fā)酵液中核酸酶Pl的酶活達(dá)到400U/mL時(shí)，換入新鮮的發(fā)酵液進(jìn)行下一批發(fā)酵。從第二批發(fā)酵開(kāi)始，培養(yǎng)基成分調(diào)整為葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀0.032g/L,磷酸氫二鉀0.032g/L,硫酸鎂0.05g/L,氯化鈣0.05g/L,硫酸鋅0.05g/L，pH5-7，以節(jié)約發(fā)酵成本，并按第一批的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。自吸式纖維床反應(yīng)器的發(fā)酵時(shí)間由游離發(fā)酵的65-84小時(shí)下降至48-76小時(shí)，連續(xù)進(jìn)行了 12批的反復(fù)批次發(fā)酵，產(chǎn)酶水平?jīng)]有下降，發(fā)酵工藝穩(wěn)定。
【權(quán)利要求】
1.一種桔青霉的固定化方法，其特征在于，以經(jīng)過(guò)預(yù)處理的纖維材料作為固定化介質(zhì)，將核酸酶Pl的生產(chǎn)菌株桔青霉活化后接入發(fā)酵容器中培養(yǎng)24~60h，使菌株在培養(yǎng)過(guò)程中吸附于纖維材料上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，所述的纖維材料為棉纖維織物、活性炭纖維、納米纖維、竹纖維、聚乙烯醇纖維、聚氨酯泡沫、絲綢、細(xì)菌纖維素膜、絲瓜瓤和甘蔗渣中的任意一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，所述的預(yù)處理，具體步驟如下: (1)將纖維材料在沸水中煮沸后烘干； (2)將經(jīng)過(guò)步驟(1)處理后的纖維材料置于濃度為I~100g/L的表面改性劑水溶液中浸泡I~20小時(shí)，并用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后烘干； (3)將經(jīng)過(guò)步驟(2)處理后的纖維材料置于濃度為I~100g/L的交聯(lián)劑水溶液中浸泡I~20小時(shí)，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后烘干，保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，所述的表面改性劑為聚乙烯亞胺、聚醚酰亞胺、丁二酰亞胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一種或幾種；所述的交聯(lián)劑為戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1，3-丙二醛和(2S，3R)-2, 3-二羥基丁二醛中的任意一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 桔青霉的固定化方法，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵容器為搖瓶時(shí)，纖維材料以50g/L的添加量平鋪固定于搖瓶底部的不銹鋼絲圈上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵容器為氣升式發(fā)酵罐時(shí)，將纖維材料裁剪成長(zhǎng)條狀，沿垂直方向螺旋纏繞在多條不銹鋼絲條上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桔青霉的固定化方法，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵容器為自吸式發(fā)酵罐時(shí)，將纖維材料平鋪在與之大小形狀均相同的鋼絲網(wǎng)上，纖維材料與鋼絲網(wǎng)一起卷成筒狀。
【文檔編號(hào)】C12N11/12GK103571818SQ201310595509
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】應(yīng)漢杰, 陳勇, 趙南, 吳菁嵐, 李淑亞, 李振建, 程浩, 劉慶國(guó) 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)