專利名稱:生產(chǎn)嘌呤核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生產(chǎn)作為調(diào)味劑被大量需求的嘌呤核苷酸的方法,以及對所述方法有用的微生物。
5’-鳥苷酸(下文簡稱為GMP)和5’-肌苷酸(下文簡稱為IMP)是表現(xiàn)出強(qiáng)的增味活性的嘌呤核苷酸,其被廣泛用作化學(xué)調(diào)味成分。
已知一些生產(chǎn)上述增味核苷酸的方法例如,包括用核糖核酸酶P1水解提取自酵母細(xì)胞的RNA,然后分離和純化所需的5’核苷酸的方法[食品技術(shù),18,287(1964)];通過使用具有生產(chǎn)IMP之能力的微生物進(jìn)行發(fā)酵以直接生產(chǎn)IMP的方法[農(nóng)業(yè)和生物化學(xué),46,2257(1982)];包括通過化學(xué)磷酸化將如肌苷和鳥苷的核苷轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账岬姆椒╗日本化學(xué)會(huì)公報(bào),42,3505(1969)];包括使用巨大芽孢桿菌的突變體進(jìn)行發(fā)酵以生產(chǎn)5-氨基-4-咪唑氨甲酰核苷(下文簡稱為AICAR),然后通過化學(xué)合成由AICAR生產(chǎn)核苷酸的方法[生物技術(shù)與生物工程,9,329(1967);有機(jī)化學(xué)雜志,32,1825(1967)];和包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)5’-黃苷酸(下文簡稱為XMP)的產(chǎn)氨棒狀桿菌突變體以形成和積累XMP,培養(yǎng)經(jīng)自身-克隆使其XMP氨基酶(GMP合成酶)活性增強(qiáng)的大腸桿菌,然后使用經(jīng)培養(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞作為酶源,通過酶反應(yīng)由XMP生產(chǎn)GMP的方法[Biosci.Biotech.Biochem,61,840(1997);日本公開未審專利申請233798/88]。
總的說來,迄今為止已開發(fā)的生產(chǎn)增味核苷酸的方法在原理上可分為三類[Shoichi Takao等(編),Oyo Biseibutsugaku(應(yīng)用微生物學(xué)),Buneido Shuppan(1996)](1)酵母RNA被得自微生物的酶降解或被化學(xué)降解的方法(RNA降解法),(2)通過在含有糖,氮源和磷酸源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的突變體以直接生產(chǎn)核苷酸的方法(直接發(fā)酵法),和(3)包括通過發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸合成所用的中間體,并通過化學(xué)或酶學(xué)方法將所述中間體轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账岬姆椒?該方法是發(fā)酵和化學(xué)合成或酶促轉(zhuǎn)變的聯(lián)合)。
在RNA降解法(上文方法(1))中,所產(chǎn)生的嘧啶核苷酸的量與增味的嘌呤核苷酸的量幾乎相同,因此,必需的純化步驟變得復(fù)雜。在直接發(fā)酵法(上文方法(2))中,由于核苷酸的膜透性低,難以培養(yǎng)能在細(xì)胞外形成和積累相當(dāng)量的核苷酸的微生物,因此難以獲得在經(jīng)濟(jì)上令人滿意的核苷酸生產(chǎn)能力。具體地說,迄今為止還沒有一種方法可以直接生產(chǎn)GMP。然而,已知XMP可例外地大量形成和積累[Shoichi Takao等(編),Oyo Biseibutsugaku(應(yīng)用微生物學(xué)),BuneidoShuppan(1996)]。目前,在經(jīng)濟(jì)上有利的生產(chǎn)增味核苷酸的方法是發(fā)酵和化學(xué)合成或酶促轉(zhuǎn)變的聯(lián)合(方法(3)),該方法可廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)核苷酸。
在此聯(lián)合方法中,改善整個(gè)生產(chǎn)能力的一個(gè)要點(diǎn)是增加發(fā)酵步驟(此方法的第一階段)中核苷酸合成所用中間體的產(chǎn)量。為此,培養(yǎng)了大量具有高的XMP,鳥苷或肌苷生產(chǎn)能力的微生物[農(nóng)業(yè)和生物化學(xué),42,399(1978);農(nóng)業(yè)和生物化學(xué),43,1739(1979);農(nóng)業(yè)和生物化學(xué),46,2347(1982)]。
已開發(fā)了多種將中間體化學(xué)或酶學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账岬姆椒?此方法的第二階段)。關(guān)于化學(xué)方法,在工業(yè)上使用的是位點(diǎn)特異性磷酸化反應(yīng)(核苷至5’-核苷酸)[日本化學(xué)會(huì)公報(bào),42,3505(1969)]。然而,化學(xué)磷酸化反應(yīng)需要中間步驟以將作為磷酸基團(tuán)受體的核苷純化至必需的程度,除了用于發(fā)酵步驟發(fā)酵罐外還需要使用化學(xué)反應(yīng)容器。因此,作為替代方法,人們注意到使用氨基酶或磷酸化酶的酶法,并對其進(jìn)行了研究。至于氨基化,使用XMP氨基酶的方法是已知的[ShoichiTakao等(編),Oyo Biseibutsugaku(應(yīng)用微生物學(xué)),BuneidoShuppan(1996)]。
至于磷酸化,使用磷酸轉(zhuǎn)移酶,激酶和磷酸酶的方法是已知的。特別是已證明使用激酶或磷酸酶的反應(yīng)是有效的方法。例如,已開發(fā)了一種通過使用大腸桿菌菌株生產(chǎn)5’-核苷酸的方法,該菌株攜有編碼大腸桿菌肌苷-鳥苷激酶的基因(WO91/08286);還開發(fā)了一種通過使用產(chǎn)氨棒狀桿菌菌株生產(chǎn)5’-核苷酸的方法,該菌株攜有編碼乙酰微小桿菌肌苷-鳥苷激酶的基因(WO96/30501);和另一種通過使用大腸桿菌菌株生產(chǎn)5’-核苷酸的方法,該菌株攜有通過將隨機(jī)突變引入摩氏摩根氏菌的磷酸酶基因而制備的基因[日本公開未審專利申請37785/97,日本公開未審專利申請201481/98]。
至于磷酸基團(tuán)供體,已研究了多種化合物。例如,使用下列物質(zhì)的方法是已知的P-硝基苯基磷酸(日本公開未審專利申請2985/64),無機(jī)磷酸(日本公開未審專利申請1186/67,日本公開未審專利申請44350/74),多聚磷酸(日本公開未審專利申請56390/78),乙酰磷酸(日本公開未審專利申請82098/81),ATP(日本公開未審專利申請230094/88),多聚磷酸,苯基磷酸和氨甲酰磷酸(日本公開未審專利申請37785/97)和焦磷酸(日本公開未審專利申請37785/97,日本公開未審專利申請201481/98)。
然而,由于所用的底物是昂貴的或不穩(wěn)定的,而且因產(chǎn)物反應(yīng)的形成使得純化步驟變得復(fù)雜等,這些方法在工業(yè)上無利可圖。有關(guān)符合經(jīng)濟(jì)需求的實(shí)用方法,已開發(fā)了使用ATP-再生系統(tǒng)的核苷酸生產(chǎn)系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中,微生物在糖類代謝的過程中利用無機(jī)磷酸由AMP或ADP再生ATP。例如,已建議使用一種方法,其中可生產(chǎn)XMP的微生物所具有的通過代謝葡萄糖以生物合成ATP的活性被用作ATP再生系統(tǒng)。多篇文獻(xiàn)教導(dǎo)了使用便宜的葡萄糖和無機(jī)磷酸作為ATP再生底物而不是使用ATP生產(chǎn)GMP的方法,該方法中將上述ATP-再生系統(tǒng)與能由XMP和ATP形成GMP的微生物的XMP氨基酶活性相結(jié)合[Biosci.Biotech.Biochem,61,840(1997)],類似的方法使用肌苷激酶作為酶以生產(chǎn)IMP(日本公開未審專利申請230094/88)。
用于生產(chǎn)GMP或IMP的方法中使用了兩種微生物,所述方法包括通過直接發(fā)酵生產(chǎn)XMP,鳥苷或肌苷的發(fā)酵步驟,和將發(fā)酵產(chǎn)物酶促轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP或IMP的反應(yīng)步驟。
即,在作為該方法第一階段的發(fā)酵步驟中,將突變體培養(yǎng)物用作生產(chǎn)XMP-,鳥苷-或肌苷-的微生物(生產(chǎn)微生物)。在作為該方法第二階段的氨基化或磷酸化的反應(yīng)步驟中,使用了攜有高表達(dá)基因的微生物(轉(zhuǎn)變微生物),所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有XMP氨基酶活性或肌苷-鳥苷激酶活性。
通過第二階段所用的轉(zhuǎn)變微生物和第一階段所用的生產(chǎn)微生物的ATP再生活性,可再生第二階段反應(yīng)所必需的ATP。
因此,第二階段的反應(yīng)步驟是將XMP氨基酶活性或肌苷-鳥苷激酶活性與兩種微生物的ATP再生活性相結(jié)合的系統(tǒng)。
整個(gè)方法的概況將在下文描述。
首先,在大發(fā)酵罐中,在主要含有糖和氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)微生物以形成和積累XMP,鳥苷或肌苷。另外,在小發(fā)酵罐中培養(yǎng)轉(zhuǎn)變微生物。當(dāng)?shù)谝浑A段的發(fā)酵完成之后,將分開培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變微生物加入大發(fā)酵罐中以在便宜的能量供體和磷酸基團(tuán)供體的存在下進(jìn)行磷酸化反應(yīng)或氨基化反應(yīng)。
相對于上述化學(xué)磷酸化方法而言,利用酶反應(yīng)的上述方法是有利的。然而,該方法的效率仍不能令人十分滿意,因?yàn)榕囵B(yǎng)轉(zhuǎn)變微生物必需小發(fā)酵罐,考慮到需加入轉(zhuǎn)變微生物,第一階段的發(fā)酵步驟所用的培養(yǎng)基必需減少,這會(huì)減少每批所得的所需核苷酸的量。
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種能在一個(gè)發(fā)酵罐中有效生產(chǎn)嘌呤核苷酸的方法。
本發(fā)明人尋求開發(fā)更好的生產(chǎn)嘌呤核苷酸之方法的可能性,該方法通過將能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的基因?qū)肽苌a(chǎn)嘌呤核苷酸前體的發(fā)酵微生物中,并調(diào)節(jié)該基因在發(fā)酵步驟和反應(yīng)步驟中的表達(dá),可僅在一個(gè)發(fā)酵罐中使用一種微生物依次進(jìn)行生產(chǎn)核苷酸前體的發(fā)酵過程和將所述前體轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账岬姆磻?yīng)。在尋求可能性的過程中進(jìn)行了創(chuàng)造性的研究,結(jié)果完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及下列(1)-(19)。(1)生產(chǎn)嘌呤核苷酸的方法,所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,該微生物能生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體,并攜有導(dǎo)入的DNA,所述DNA可誘導(dǎo)和表達(dá)能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶;使所述的嘌呤核苷酸前體在培養(yǎng)基中積累;誘導(dǎo)和表達(dá)能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶;由所述前體形成嘌呤核苷酸并在培養(yǎng)基中積累;從培養(yǎng)基中回收所述的嘌呤核苷酸。(2)根據(jù)上文(1)的方法,其中嘌呤核苷酸的前體是5’-黃苷酸,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黃苷酸氨基酶,嘌呤核苷酸是5’-鳥苷酸。(3)根據(jù)上文(1)的方法,其中嘌呤核苷酸的前體是鳥苷,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶,嘌呤核苷酸是5’-鳥苷酸。(4)根據(jù)上文(1)的方法,其中嘌呤核苷酸的前體是肌苷,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶,嘌呤核苷酸是5’-肌苷酸。(5)根據(jù)上文(1)的方法,其中微生物屬于選自棒狀桿菌,大腸桿菌和芽孢桿菌的屬。(6)根據(jù)上文(1)的方法,其中微生物是產(chǎn)氨棒狀桿菌。(7)根據(jù)上文(1)的方法,其特征在于通過改變條件或通過將碳源由糖改變?yōu)榉翘莵碚T導(dǎo)和表達(dá)能合成嘌呤核苷酸的酶,所述條件的改變選自溫度的升高,pH的升高和滲透壓的升高。(8)根據(jù)上文(7)的方法,其中非糖碳源是醋酸或醋酸鹽。(9)可誘導(dǎo)和表達(dá)能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的DNA。(10)根據(jù)上文(9)的DNA,該DNA通過改變條件或通過將碳源由糖改變?yōu)榉翘莵碚T導(dǎo)和表達(dá)能合成嘌呤核苷酸的酶,所述條件的改變選自溫度的升高,pH的升高和滲透壓的升高。(11)根據(jù)上文(10)的DNA,其中非糖碳源是醋酸或醋酸鹽。(12)根據(jù)上文(9)或(10)的DNA,該DNA是pLAC857或pIGK2。(13)微生物,該微生物能生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體,并攜有導(dǎo)入的DNA,所述DNA可誘導(dǎo)和表達(dá)能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶。(14)根據(jù)上文(13)的微生物,其中嘌呤核苷酸的前體是5’-黃苷酸,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黃苷酸氨基酶,嘌呤核苷酸是5’-鳥苷酸。(15)根據(jù)上文(13)的微生物,其中嘌呤核苷酸的前體是鳥苷,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶,嘌呤核苷酸是5’-鳥苷酸。(16)根據(jù)上文(13)的微生物,其中嘌呤核苷酸的前體是肌苷,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶,嘌呤核苷酸是5’-肌苷酸。(17)根據(jù)上文(13)的微生物,其中微生物屬于選自棒狀桿菌,大腸桿菌和芽孢桿菌的屬。(18)根據(jù)上文(13)的微生物,其中微生物是產(chǎn)氨棒狀桿菌。(19)根據(jù)上文(18)的微生物,其中微生物是產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC6872/pLAC857(FERM BP-6639)或產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872/pIGK2(FERMBP-6638)。
附圖簡述
圖1顯示了質(zhì)粒pLAC857的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了質(zhì)粒pGUA2的結(jié)構(gòu)。
圖3顯示了質(zhì)粒pIGK2的結(jié)構(gòu)。
圖中所用的符號(hào)表示PLPL啟動(dòng)子guaA大腸桿菌的XMP氨基酶基因C.glt ORI谷氨酸棒狀桿菌的復(fù)制起點(diǎn)Spcr壯觀霉素抗性基因cI857溫度敏感型阻抑蛋白基因TICL谷氨酸棒狀桿菌的異檸檬酸裂合酶基因的終止子igk大腸桿菌的肌苷-鳥苷激酶基因Kmr卡那霉素抗性基因Apr氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌ORI大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)本發(fā)明提供了這樣一種方法,其中在一個(gè)發(fā)酵罐中使用一種微生物依次進(jìn)行通過直接發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體的發(fā)酵過程和將所述發(fā)酵步驟中生產(chǎn)的前體酶促轉(zhuǎn)變?yōu)猷堰屎塑账岬姆磻?yīng)步驟。
已發(fā)現(xiàn)下列三個(gè)需求對所述方法的建立是至關(guān)重要的。
第一個(gè)需求是在通過直接發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體的發(fā)酵過程中,編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的基因的表達(dá)需要被抑制到某一水平以使發(fā)酵基本上不被干擾。
如果所述酶的表達(dá)不被抑制,發(fā)酵過程中會(huì)通過所述酶的活性在細(xì)胞內(nèi)形成和積累嘌呤核苷酸,而且,因下列原因使得發(fā)酵產(chǎn)量降低當(dāng)GMP作為嘌呤核苷酸被積累時(shí),誘導(dǎo)了嘌呤生物合成途徑中的關(guān)鍵酶的反饋抑制,從而停止生產(chǎn)XMP。當(dāng)IMP被積累時(shí),肌苷的生成形成無效循環(huán),導(dǎo)致ATP的浪費(fèi)。因此,細(xì)胞內(nèi)形成和積累嘌呤核苷酸降低了發(fā)酵產(chǎn)量,這可導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。
第二個(gè)需求是在由其前體合成嘌呤核苷酸的反應(yīng)步驟中,能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的活性需要被充分誘導(dǎo)。
第三個(gè)需求是經(jīng)發(fā)酵和誘導(dǎo)處理的生產(chǎn)微生物需要保留足夠的ATP再生活性和轉(zhuǎn)變反應(yīng)所需的磷酸化或氨基化活性,這些活性需要在反應(yīng)步驟中充分發(fā)揮作用以由其前體合成嘌呤核苷酸。
用于本發(fā)明的微生物可以是野生型菌株,突變體,融合的細(xì)胞系,轉(zhuǎn)導(dǎo)子或利用重組DNA技術(shù)得到的重組菌株,條件是該微生物能生產(chǎn)嘌呤核苷酸的前體并具有ATP再生活性。優(yōu)選的微生物包括屬于棒狀桿菌,大腸桿菌和芽孢桿菌屬的微生物,它們可用于核酸發(fā)酵和氨基酸發(fā)酵。特別優(yōu)選的是具有強(qiáng)的ATP再生活性的產(chǎn)氨棒狀桿菌。
嘌呤核苷酸的前體包括XMP,鳥苷,肌苷,腺苷等。
ATP再生活性指的是在微生物代謝糖以作為能量供體底物的方法中,使用無機(jī)磷酸由AMP或ADP再生ATP的活性。這一ATP再生系統(tǒng)是糖類代謝系統(tǒng)和能量代謝系統(tǒng),如糖酵解途徑,TCA循環(huán)和電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一部分,幾乎所有微生物都具有此活性。
用于本發(fā)明的具體微生物的例子包括下列菌株及其衍生的突變體。
產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 21295產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 21477谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032谷氨酸棒狀桿菌ATCC 14067谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13869大腸桿菌ATCC 14948大腸桿菌ATCC 11303大腸桿菌ATCC 9637枯草芽孢桿菌ATCC 14618至于本發(fā)明中使用的能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶,可使用任何能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶,適當(dāng)?shù)睦影╔MP氨基酶,肌苷-鳥苷激酶,磷酸酶和腺苷酸激酶。
編碼上述酶的DNA的例子見下文。
編碼XMP氨基酶的基因包括那些得自大腸桿菌[核酸研究,13,1303(1985)],枯草芽孢桿菌[核酸研究,18,6710(1990)],產(chǎn)氨棒狀桿菌(基因庫編號(hào)g2765074)等基因。
編碼肌苷-鳥苷激酶的基因包括那些得自大腸桿菌(WO91/08286),乙酰微小桿菌(WO96/30501)等的基因。
編碼磷酸酶的基因包括那些得自摩氏摩根氏菌(日本公開未審專利申請37785/97,日本公開未審專利申請201481/98)等的基因。
編碼腺苷酸激酶的基因包括那些得自釀酒酵母[生物化學(xué)雜志,263,19468(1988)]的基因。
可通過已知方法得到編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的基因。
例如,對編碼XMP氨基酶的基因而言,可根據(jù)XMP氨基酶結(jié)構(gòu)基因序列兩端的序列合成引物,使用制備的引物和大腸桿菌染色體DNA,枯草芽孢桿菌染色體DNA或產(chǎn)氨棒狀桿菌染色體DNA,通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法可得到XMP氨基酶結(jié)構(gòu)基因。
對編碼肌苷-鳥苷激酶的基因而言,可根據(jù)肌苷-鳥苷激酶結(jié)構(gòu)基因序列兩端的序列合成引物,使用制備的引物和大腸桿菌染色體DNA或乙酰微小桿菌染色體DNA,通過PCR法可得到肌苷-鳥苷激酶結(jié)構(gòu)基因。類似地,通過使用PCR法,可由摩氏摩根氏菌染色體DNA得到磷酸酶結(jié)構(gòu)基因,可由釀酒酵母染色體DNA得到腺苷酸激酶的結(jié)構(gòu)基因。
將由此獲得的編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的基因插入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)型表達(dá)載體中,以使基因處于能調(diào)控其誘導(dǎo)和表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)的控制之下,籍此得到可調(diào)控所述基因之表達(dá)的重組質(zhì)粒。
對誘導(dǎo)型表達(dá)載體沒有特別的限制,只要它能在所用的微生物中復(fù)制并滿足下列三個(gè)條件即可。
首先,需將編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的基因的表達(dá)抑制到某一水平,以使通過直接發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體的發(fā)酵步驟中的發(fā)酵基本上不被干擾。
第二,在由其前體合成嘌呤核苷酸的反應(yīng)步驟之前進(jìn)行誘導(dǎo)處理以充分誘導(dǎo)能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的活性。
第三,所述誘導(dǎo)方法是在誘導(dǎo)處理之后能使生產(chǎn)微生物保留足夠的ATP再生活性和轉(zhuǎn)變活性的方法。
滿足上述三個(gè)條件的載體的例子包括pPAC31,其含有PL啟動(dòng)子/cI857阻抑蛋白基因,在高溫下可被誘導(dǎo)(WO98/12343);pBB1,其含有l(wèi)ac啟動(dòng)子/lacIts阻抑蛋白基因,在高溫下可被誘導(dǎo)(基因,70,415(1988));pRK248cIts,其含有PL啟動(dòng)子/cI857阻抑蛋白基因,在高pH下可被誘導(dǎo)[基因,97,125(1991)];pOSEX2,其含有proU表達(dá)-調(diào)控區(qū),在高滲透壓下可被誘導(dǎo)[基因,151,137(1994)];pTrc99A,其含有trc啟動(dòng)子/lacIq阻抑蛋白基因,可被異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)[基因,69,301(1988)];pAL9181,其含有araBAD啟動(dòng)子/araC阻抑蛋白基因,可被L-阿拉伯糖誘導(dǎo)[應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù),37,205(1992)],以及通過將碳源由糖變?yōu)榉翘嵌T導(dǎo)的載體。這些載體是為大腸桿菌構(gòu)建的誘導(dǎo)型表達(dá)載體。
另外,也可以使用通過用突變技術(shù)或重組DNA技術(shù)修飾與上述誘導(dǎo)型表達(dá)載體中的表達(dá)調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄-翻譯信號(hào)區(qū)域得到的載體。
當(dāng)這些已知的誘導(dǎo)型表達(dá)載體或經(jīng)進(jìn)一步改良的載體被用于非大腸桿菌的宿主細(xì)胞時(shí),應(yīng)在其中插入在宿主中起作用的復(fù)制起點(diǎn)。例如,當(dāng)產(chǎn)氨棒狀桿菌被用作宿主時(shí),可在所述載體中插入得自谷氨酸棒狀桿菌之質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn),該復(fù)制起點(diǎn)可在產(chǎn)氨棒狀桿菌或類似菌株中起作用。
得自谷氨酸棒狀桿菌的質(zhì)粒包括pCG1(日本公開未審專利申請134500/82),pCG2(日本公開未審專利申請35197/83),pCG4(日本公開未審專利申請183799/82),pAM330(日本公開未審專利申請67699/83)和pAG1,pAG3,pAG14和pAG50(日本公開未審專利申請166890/87)。
在棒狀桿菌中起作用的優(yōu)選載體包括可通過升溫被誘導(dǎo)的質(zhì)粒載體,該載體是通過將高溫下可被誘導(dǎo)的大腸桿菌載體pPAC31攜有的PL啟動(dòng)子/cI857基因與可在棒狀桿菌中自主復(fù)制的載體連接而制備的;和能被非糖碳源,如醋酸誘導(dǎo)的載體pCEX2(日本公開未審專利申請224259/91)。
另一方面,當(dāng)與誘導(dǎo)型表達(dá)載體中的基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄-翻譯信號(hào)不在所用的微生物中起作用時(shí),或當(dāng)其起作用,但上述三個(gè)需求不能充分滿足時(shí),必需通過突變技術(shù)或重組DNA技術(shù)改良所述轉(zhuǎn)錄-翻譯信號(hào)區(qū)域以使上述三個(gè)需求能被滿足,或必需研制適用于所述微生物的新的誘導(dǎo)和表達(dá)系統(tǒng)。在前一種情況下,可通過例如涉及所用微生物的已知轉(zhuǎn)錄-翻譯信號(hào)序列的定點(diǎn)誘變進(jìn)行改良。在后一種情況下,可根據(jù)為大腸桿菌等構(gòu)建的上述一般性誘導(dǎo)-表達(dá)系統(tǒng)的研制方法開發(fā)和構(gòu)建新系統(tǒng)。
攜有可誘導(dǎo)的-表達(dá)系統(tǒng)的微生物的優(yōu)選例子為產(chǎn)氨棒狀桿菌菌株,分別將溫度誘導(dǎo)型質(zhì)粒載體和能通過加入便宜的醋酸調(diào)控表達(dá)的pCEX2用作基因誘導(dǎo)和表達(dá)系統(tǒng)可產(chǎn)生這些菌株,所述溫度誘導(dǎo)型質(zhì)粒載體是通過將高溫下可被誘導(dǎo)的大腸桿菌載體pPAC31攜有的PL啟動(dòng)子/cI857基因與可在棒狀桿菌中自主復(fù)制的載體連接而制備的。
在本發(fā)明中,編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的基因可存在于載體質(zhì)粒中,或可摻入宿主微生物的染色體中,只要滿足上述三個(gè)需求即可。即,可使用攜有含基因之質(zhì)粒的菌株或基因已摻入染色體中的菌株,只要所述基因的表達(dá)能被適當(dāng)調(diào)控即可。
通過使用原生質(zhì)體法,電脈沖法,氯化鈣法,和分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊,第2版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)(下文簡稱為分子克隆,第2版)所述的常規(guī)方法等,可將含有編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的基因的誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體的微生物中。
例如,當(dāng)棒狀桿菌屬的細(xì)菌被用作宿主微生物時(shí),特別有效的方法是原生質(zhì)體法(日本公開未審專利申請183799/82)和電脈沖法(日本公開未審專利申請207791/90)。當(dāng)大腸桿菌被用作宿主微生物時(shí),也可使用氯化鈣法[分子生物學(xué)雜志,53,159(1970)]等。
通過在含有碳源,氮源和無機(jī)物,以及必需的痕量有機(jī)營養(yǎng)物的普通培養(yǎng)基中,培養(yǎng)本發(fā)明所得的攜有編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)化子以形成和積累嘌呤核苷酸前體,然后對所得培養(yǎng)物進(jìn)行誘導(dǎo)處理,如加熱或加入醋酸即可誘導(dǎo)和表達(dá)能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶。
至于上述發(fā)酵步驟所用培養(yǎng)基中的碳源,可使用任何能被所述微生物同化的碳源。適當(dāng)碳源的例子是糖類,如葡萄糖,果糖,蔗糖,糖蜜,赤糖糊和淀粉水解物;醇類,如乙醇,甘油和山梨糖醇;有機(jī)酸,如丙酮酸和乳酸,和如甘氨酸,丙氨酸,谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸。其優(yōu)選濃度范圍為5-30%。
氮源的例子包括氨,多種無機(jī)和有機(jī)銨鹽,如氯化銨,硫酸銨,硝酸銨,碳酸銨,醋酸銨和磷酸銨,尿素,多種氨基酸,蛋白胨,NZ胺,肉汁浸膏,酵母膏,玉米浸出汁,酪蛋白水解物,魚粉及其消化物。
無機(jī)物的例子包括磷酸二氫鉀,磷酸氫二鉀,硫酸鎂,磷酸鎂,氯化鈉,硫酸鐵,硫酸錳,硫酸鋅和碳酸鈣。
當(dāng)所用微生物需要特別的營養(yǎng)成分,如氨基酸,核酸和維生素用于生長時(shí),可在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)量的這些物質(zhì)。
在需氧條件下進(jìn)行培養(yǎng),例如,在通氣條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)或旋動(dòng)培養(yǎng)。最適溫度通常是26-37℃,培養(yǎng)期通常為1至5天。
在適用于所用載體的條件下進(jìn)行誘變處理以表達(dá)編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的基因;例如,優(yōu)選在下列條件下處理下述載體。
pPAC31或pBB137-42℃通氣旋動(dòng)培養(yǎng)1-24小時(shí)pRK248cItspH9下培養(yǎng)1-24小時(shí)pOSEX250-300 mmol/l NaCl存在下培養(yǎng)1-24小時(shí)pTrc99A0.1-0.5 mmol/l IPTG存在下培養(yǎng)1-24小時(shí)pAL9181加入0.2%L-阿拉伯糖培養(yǎng)1-24小時(shí)pCEX2加入0.1-2%醋酸銨或醋酸鈉培養(yǎng)1-24小時(shí)優(yōu)選在反應(yīng)步驟中加入表面活性劑以由其前體合成嘌呤核苷酸。
至于表面活性劑,優(yōu)選可促進(jìn)嘌呤核苷酸滲透穿過細(xì)胞膜的表面活性劑。適當(dāng)?shù)睦邮顷栯x子表面活性劑,如聚氧化乙烯硬脂胺(如Nymeen S-215,NOF公司),鯨蠟基三乙基溴化銨,Cation FB和CationF2-40E;陰離子表面活性劑,如硫酸油?;c(sodium oleylamidesulfate),Newrex TAB和Rapizole 80;和兼性表面活性劑,如聚氧乙烯山梨糖醇酐一硬脂酸(如Nonion ST221)。表面活性劑的常用濃度為0.1-50mg/ml,優(yōu)選為1-20mg/ml。
于20-40℃,pH 6-8時(shí),將由其前體合成嘌呤核苷酸之步驟中的反應(yīng)進(jìn)行1-48小時(shí)。
完成反應(yīng)之后,可通過已知方法回收反應(yīng)混合物中形成和積累的嘌呤核苷酸,所述方法如除去微生物細(xì)胞并通過濃縮結(jié)晶核苷酸,活性炭處理和離子交換樹脂法[Isao Endo等,Kagakukogakkai(TheSociety of Chemical Engineers,Japan)(編)Bioseparation ProcessBinran(生物分離方法手冊),Kyoritsu Shuppan(1996)]。
下列實(shí)施例闡明了本發(fā)明的某些實(shí)施方案,這些實(shí)施例并不能限制本發(fā)明的范圍。除非特別說明,根據(jù)分子克隆,第2版所述的方法進(jìn)行基因工程方法。實(shí)施例1構(gòu)建生產(chǎn)XMP的產(chǎn)氨棒狀桿菌菌株并由該菌株生產(chǎn)GMP,所述菌株攜有處于PL啟動(dòng)子控制之下的大腸桿菌XMP氨基酶基因(1)構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pLAC857,該質(zhì)粒能通過溫度的改變調(diào)節(jié)XMP氨基酶基因的表達(dá)通過下列兩個(gè)步驟由已知質(zhì)粒pPLA66構(gòu)建熱誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pLAC857。pPLA66是高水平表達(dá)XMP氨基酶的質(zhì)粒,通過將XMP氨基酶基因連接至PL啟動(dòng)子與trpL SD序列的下游即可構(gòu)建該質(zhì)粒[Biosci.Biotech.Biochem.,61,840(1997)]。
按下列方法將溫度敏感型阻抑蛋白基因cI857插入質(zhì)粒pPLA66。
用EcoRI(5單位)和BglII(5單位)裂解質(zhì)粒pPLA66(1μg),通過瓊脂糖凝膠電泳分離裂解的片斷,使用QIAEXII(QIAGEN有限公司)從凝膠中回收DNA片斷,該片斷含有PL啟動(dòng)子和得自大腸桿菌的XMP氨基酶基因(guaA基因)區(qū)域。
用EcoRI(5單位)和BamHI(5單位)裂解攜有cI857基因的質(zhì)粒pPAC31(WO98/12343)(1μg),通過瓊脂糖凝膠電泳分離裂解的片斷,從凝膠中回收DNA片斷,該片斷含有cI857基因,氨芐青霉素抗性基因和得自大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)。
使用連接試劑盒(Takara Shuzo有限公司)將含有所述基因的DNA片斷和先前制備的含有g(shù)uaA基因的DNA片斷相連接。
使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo有限公司),然后鋪于含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上,得到氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA。
用多種限制性酶裂解質(zhì)粒并分析之,從而證實(shí)得到質(zhì)粒pLA857,其含有XMP氨基酶基因,cI857基因,氨芐青霉素抗性基因和在大腸桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn),它們處于PL啟動(dòng)子控制之下。
按下列方法將在棒狀桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)插入質(zhì)粒pLA857。
用PstI(5單位)裂解質(zhì)粒pLA857(1μg)上存在的唯一的PstI-裂解位點(diǎn),通過瓊脂糖凝膠電泳分離裂解的片斷,從凝膠中回收這些片斷,籍此得到pLA857的PstI-裂解片斷。
用PstI(5單位)裂解可在產(chǎn)氨棒狀桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體pCG116(日本公開未審專利申請265892/89)(1μg),通過堿性磷酸酶處理進(jìn)行DNA去磷酸化以防止再結(jié)合之后,用苯酚提取并用乙醇沉淀,從而得到pCG116的PstI-裂解片斷。
使用上述連接試劑盒將所得的pLA857的PstI-裂解片斷與pCG116的PstI-裂解片斷相連接。
利用電脈沖法[應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù),30,283(1989)]將1μg通過連接處理得到的DNA轉(zhuǎn)化至產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872中,然后鋪于含有100μg/ml壯觀霉素的A瓊脂培養(yǎng)基上
。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA。
用多種限制性酶裂解質(zhì)粒并分析之,從而證實(shí)所得轉(zhuǎn)化子攜有質(zhì)粒pLAC857,其具有
圖1所示的所需結(jié)構(gòu)。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約,于1999年2月5日將攜有pLAC857的產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872/pLAC857保藏于日本工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究院,國立生物科學(xué)和人類-技術(shù)研究所(National Institute of Bioscienceand Human-Technology,Agency of Industrial Science andTechnology),1-3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-0046,其保藏號(hào)為FERM BP-6639。(2)測定通過將pLAC857導(dǎo)入菌株FERM BP-1261所制備菌株的XMP氨基酶活性通過堿性細(xì)菌裂解法從產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872/pLAC857(FERMBP-6639)中提取質(zhì)粒pLAC857。
通過上述電脈沖法,使用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XMP生產(chǎn)菌株產(chǎn)氨棒狀桿菌FERM BP-1261(日本專利2618383腺嘌呤-滲漏需求型和鳥嘌呤需求型)。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA。
用多種限制性酶裂解質(zhì)粒并分析之,從而證實(shí)所得轉(zhuǎn)化子攜有質(zhì)粒pLAC857。
分別于30℃和37℃,在含有100μg/ml壯觀霉素的A培養(yǎng)基(從A瓊脂培養(yǎng)基中除去瓊脂的培養(yǎng)基)上將攜有pLAC857的XMP生產(chǎn)菌株FERM BP-1261振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
培養(yǎng)完成之后,通過離心從各個(gè)培養(yǎng)物中得到細(xì)胞。
用100mmol/l Tris-HCl(pH7.0)將所得細(xì)胞洗滌兩次并懸浮于10ml相同緩沖液中。
在所得懸浮液中加入10g玻璃珠(Shinmaru Enterprises有限公司,0.1-0.2φ),接著在冰浴中使用勻漿器(Nippon Seiki有限公司)破碎10分鐘。
4℃下,將所得懸浮液離心(14000×g)10分鐘,回收上清液作為細(xì)胞提取物。
42℃下,在1.15ml含有先前已加熱至42℃的細(xì)胞提取物的反應(yīng)混合物[160mmol/l Tris-HCl(pH8.6),12mmol/l ATP Na2.3H2O,16mmol/l MgSO4.7H2O和40mmol/l(NH4)2SO4]中加入0.1ml 0.3M XMP起始反應(yīng)。15分鐘之后,在反應(yīng)混合物中加入3.9ml 3.5%高氯酸以終止反應(yīng)。
以3000rpm離心反應(yīng)混合物10分鐘,測定上清液于290nm下的光吸收。將1分鐘內(nèi)形成1μmol GMP的活性定為1個(gè)單位(U),計(jì)算每毫克蛋白質(zhì)的比活。使用蛋白質(zhì)檢測試劑盒(BioRad Laboratories)測定蛋白質(zhì)的量。
結(jié)果示于表1。在30℃培養(yǎng)的細(xì)胞中未檢測到活性,而在37℃培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測到活性。這些結(jié)果表明XMP氨基酶基因的表達(dá)處于攜有pLAC857之FERM BP-1261菌株的PL啟動(dòng)子控制之下,通過改變溫度可以調(diào)節(jié)所述酶的活性。表1
(3)通過攜有pLAC857的XMP生產(chǎn)菌株FERM BP-1261生產(chǎn)GMP30℃下,在含有20μg/ml壯觀霉素的A瓊脂培養(yǎng)基上將攜有pLAC857的FERM BP-1261菌株培養(yǎng)2天。將所得細(xì)胞接種于含有60mlC種子培養(yǎng)基的250ml錐瓶中,所述種子培養(yǎng)基中含有20μg/ml壯觀霉素,其配方是5%葡萄糖,1%酵母膏,1%蛋白胨,0.25%氯化鈉,0.3%尿素,150mg/l腺嘌呤和150mg/l鳥嘌呤(pH7.2),接著于30℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
將所得的全部培養(yǎng)物接種于2升發(fā)酵罐中,其中含有0.94升D種子培養(yǎng)基[8.8%葡萄糖,1.7%肉膏,1.7%蛋白胨,0.167%KH2PO4,0.167%K2HPO4,0.167%MgSO4.7H2O,333mg/l腺嘌呤,350mg/l鳥嘌呤,33mg/l FeSO4.7H2O,17mg/l ZnSO4.7H2O,6.7mg/l MnSO4.4-6H2O,25mg/l β-丙氨酸,33mg/l L-半胱氨酸,167μg/l生物素,1.3mg/lCuSO4.5H2O和8.3mg/l硫胺素(pH7.2)],接著,于30℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養(yǎng)24小時(shí),培養(yǎng)過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
將所得培養(yǎng)物(120ml)接種于含0.88升F發(fā)酵培養(yǎng)基的2升發(fā)酵罐中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方是8%葡萄糖,1.67%正磷酸,1.29%KOH,1.2% MgSO4.7H2O,123mg/l CaCl2.2H2O,24.6mg/l FeSO4.7H2O,12.3mg/l MnSO4.4-6H2O,12.3mg/l ZnSO4.7H2O,18.5mg/l β-丙氨酸,24.6mg/l L-半胱氨酸,6.2mg/l煙酰胺,24.6mg/l組氨酸,185μg/l生物素,2.5mg/l CuSO4.5H2O,203mg/l腺嘌呤和10mg/l鳥嘌呤(pH7.2),接著,于28℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養(yǎng)44小時(shí),培養(yǎng)過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
完成培養(yǎng)之后,按下列方法通過HPLC測定培養(yǎng)物上清液中積累的XMP和GMP的量。
HPLC分析的條件柱Asahipak GS-320H(Asahi Chemical Industry有限公司)洗脫液0.2M NaH2PO4(pH3.0)流速1mL/min檢測UV 254nm通過測定UV 254nm下的光吸收值并與標(biāo)準(zhǔn)值相比較以測定積累的XMP和GMP的量。
HPLC分析的結(jié)果是XMP形成和積累的量是27.2g/l,但未檢測到GMP。
為了誘導(dǎo)和表達(dá)XMP氨基酶基因,將培養(yǎng)肉湯加熱至40℃,在相同溫度下攪拌(600rpm)并通氣(1L/min)6小時(shí),其間用5.5M氨水將pH維持在7.2。
在經(jīng)上述熱誘導(dǎo)處理的XMP發(fā)酵肉湯中加入2.5%葡萄糖,10g/l植酸,4.4g/l MgSO4.7H2O,9.36g/l NaH2PO4,96.9mg/l腺嘌呤和10g/lNymeen S-215,于40℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min),使所得混合物反應(yīng)24小時(shí),反應(yīng)過程中用5.5M氨水將pH維持在7.4。
完成反應(yīng)之后,在上述HPLC分析條件下測定反應(yīng)混合物上清液中積累的GMP的量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GMP形成和積累的量是20.8g/l。實(shí)施例2構(gòu)建生產(chǎn)XMP的產(chǎn)氨棒狀桿菌菌株并由該菌株生產(chǎn)GMP,所述菌株攜有處于異檸檬酸裂合酶基因啟動(dòng)子控制之下的產(chǎn)氨棒狀桿菌XMP氨基酶基因(1)通過PCR擴(kuò)增和克隆XMP氨基酶基因按下列方法,根據(jù)核苷酸序列經(jīng)PCR分離產(chǎn)氨棒狀桿菌的XMP氨基酶基因。
首先,合成SEQ ID NO1和2所示的寡核苷酸序列,所述序列位于XMP氨基酶基因的兩端,各具有限制性酶AflII和BamHI的裂解位點(diǎn)。根據(jù)制備原生質(zhì)體的方法,通過用溶菌酶和無色肽酶(achromopeptidase)處理在甘氨酸存在下培養(yǎng)的細(xì)胞,制備產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872的染色體DNA以用作模板(日本公開未審專利申請225776/94)。
在0.1ml含有各為200μM的dATP,dCTP,dGTP和dTTP,50mmol/l氯化鉀,1.5mmol/l氯化鎂和0.0001%明膠的10mmol/l Tris-HCl緩沖液(pH8.3)中加入所得的染色體DNA(0.1μg),作為引物的上述寡核苷酸(各為0.25μM)和Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司,2.5個(gè)單位),對所得混合物進(jìn)行PCR。
通過將94℃ 90秒,50℃ 120秒和72℃ 120秒的反應(yīng)循環(huán)重復(fù)10次;94℃ 90秒,40℃ 120秒和72℃ 120秒的反應(yīng)循環(huán)重復(fù)10次;94℃ 90秒,40℃ 120秒和72℃ 180秒的反應(yīng)循環(huán)重復(fù)20次;然后72℃反應(yīng)360秒來進(jìn)行PCR。
對所得的反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,籍此回收約1.6kb的所需DNA片斷。
用限制性酶Af1II(5單位)和BamHI(5單位)裂解所述DNA片斷,通過瓊脂糖凝膠電泳分離并回收其末端分別經(jīng)AflII和BamHI處理的約1.6kb的裂解片斷。(2)構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pGUA2,該質(zhì)粒能用碳源調(diào)節(jié)XMP氨基酶基因的表達(dá)按下列方法,使用誘導(dǎo)型表達(dá)載體pCEX2(日本公開未審專利申請224259/91)構(gòu)建能用碳源調(diào)節(jié)XMP氨基酶基因表達(dá)的質(zhì)粒。
pCEX2是含有谷氨酸棒狀桿菌異檸檬酸裂合酶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列的載體,糖的存在會(huì)抑制插入該質(zhì)粒之多克隆位點(diǎn)的外源基因的表達(dá),而非-糖類,如醋酸的存在會(huì)誘導(dǎo)這種表達(dá)。
用AflII(0.5單位)部分裂解pCEX2載體DNA(1μg),然后用BamHI(5單位)裂解之。通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收7.6kb的DNA片斷,該片斷含有異檸檬酸裂合酶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)域,壯觀霉素抗性基因和在谷氨酸棒狀桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)。
將所述DNA片斷與上文實(shí)施例2(1)中所得XMP氨基酶基因的經(jīng)PCR擴(kuò)增的片斷相連接,得到經(jīng)連接的DNA。
通過電脈沖法用所述經(jīng)連接的DNA(1μg)轉(zhuǎn)化產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC6872,然后鋪于含有100μg/ml壯觀霉素的A瓊脂培養(yǎng)基上。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA。
用多種限制性酶裂解質(zhì)粒DNA并分析之,從而證實(shí)所得轉(zhuǎn)化子攜有質(zhì)粒pGUA2,其具有圖2所示的所需結(jié)構(gòu)。(3)測定通過將pGUA2導(dǎo)入菌株FERM BP-1261所制備菌株的XMP氨基酶活性通過堿性細(xì)菌裂解法從攜有pGUA2的產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872中提取質(zhì)粒pGUA2。
通過電脈沖法,使用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XMP生產(chǎn)菌株產(chǎn)氨棒狀桿菌FERMBP-1261(腺嘌呤-滲漏需求型和鳥嘌呤需求型)。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA。
用多種限制性酶裂解質(zhì)粒并分析之,從而證實(shí)所得轉(zhuǎn)化子攜有pGUA2。
于30℃,分別在兩種培養(yǎng)基中將攜有pGUA2的XMP生產(chǎn)菌株FERMBP-1261振蕩培養(yǎng)24小時(shí),所述培養(yǎng)基是含有100μg/ml壯觀霉素的培養(yǎng)基和通過用醋酸銨替代所述培養(yǎng)基中的葡萄糖而制備的培養(yǎng)基。
按與實(shí)施例1(2)相同的方法,從所得培養(yǎng)物中得到細(xì)胞以制備細(xì)胞提取物。
根據(jù)實(shí)施例1(2)所述的方法測定各個(gè)提取物中的XMP氨基酶活性。
結(jié)果示于表2。
在使用葡萄糖作為碳源培養(yǎng)的細(xì)胞中僅檢測到極低水平的活性,而在使用2%醋酸銨作為碳源培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測到高水平的活性。
這些結(jié)果表明XMP氨基酶基因的表達(dá)處于攜有pGUA2的FERMBP-1261中的異檸檬酸裂合酶基因啟動(dòng)子的控制之下,改變碳源可調(diào)節(jié)所述酶的活性。表2
(4)通過將pGUA2導(dǎo)入XMP生產(chǎn)菌株FERM BP-1261所制備的菌株生產(chǎn)GMP在與實(shí)施例1(3)相同的培養(yǎng)條件下,使用攜有pGUA2的FERMBP-1261菌株進(jìn)行XMP發(fā)酵。完成培養(yǎng)之后,按與實(shí)施例1(3)相同的方法測定培養(yǎng)物上清液中形成和積累的XMP和GMP的量。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)XMP積累的量為18.4g/l,但未檢測到GMP。
發(fā)酵完成之后,為了誘導(dǎo)和表達(dá)XMP氨基酶基因,在發(fā)酵肉湯中加入醋酸銨至終濃度為2%,攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養(yǎng)10小時(shí),培養(yǎng)過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
在醋酸銨存在下經(jīng)上述誘導(dǎo)處理的培養(yǎng)物中加入2.5%葡萄糖,10g/l植酸,4.4g/l MgSO4.7H2O,9.36g/l NaH2PO4,96.9mg/l腺嘌呤和10g/l Nymeen S-215,于40℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min),使所得混合物反應(yīng)24小時(shí),培養(yǎng)過程中用5.5M氨水將pH維持在7.4。
完成反應(yīng)之后,按與實(shí)施例1(3)所述相同的方法測定反應(yīng)混合物上清液中積累的GMP的量。
發(fā)現(xiàn)反應(yīng)混合物中形成和積累的GMP的量為14.4g/l。實(shí)施例3構(gòu)建生產(chǎn)肌苷的產(chǎn)氨棒狀桿菌菌株并由該菌株生產(chǎn)IMP,所述菌株攜有處于異檸檬酸裂合酶基因啟動(dòng)子控制之下的大腸桿菌肌苷-鳥苷激酶基因(1)通過PCR擴(kuò)增和克隆肌苷-鳥苷激酶基因按下列方法,根據(jù)已知的核苷酸序列(WO91/08286)經(jīng)PCR分離大腸桿菌的肌苷-鳥苷激酶基因。
合成SEQ ID NO3和4所示的寡核苷酸,所述序列位于肌苷-鳥苷激酶基因的兩端,各具有限制性酶AflII和BamHI的裂解位點(diǎn)。
大腸桿菌HM70/pBM2(WO91/08286)攜有的質(zhì)粒pBM2被用作肌苷-鳥苷激酶基因的模板。
在0.1ml含有各為200μM的dATP,dCTP,dGTP和dTTP,50mmol/l氯化鉀,1.5mmol/l氯化鎂和0.0001%明膠的10mmol/l Tris-HCl緩沖液(pH8.3)中加入上述質(zhì)粒DNA(0.1μg),作為引物的上述寡核苷酸(各為0.25μM)和Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司,2.5個(gè)單位),對所得混合物進(jìn)行PCR。
通過將94℃ 90秒,50℃ 120秒和72℃ 120秒的反應(yīng)循環(huán)重復(fù)10次;94℃ 90秒,40℃ 120秒和72℃ 120秒的反應(yīng)循環(huán)重復(fù)10次;94℃ 90秒,40℃ 120秒和72℃ 180秒的反應(yīng)循環(huán)重復(fù)20次;然后72℃反應(yīng)360秒來進(jìn)行PCR。
將所得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與克隆PCR產(chǎn)物的載體pT-Adv(Clontech有限公司)相連接。
使用1μg通過所述的連接處理得到的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后鋪于含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒pT-AI。
使用多種限制性酶分析質(zhì)粒pT-AI的結(jié)構(gòu),從而證實(shí)此質(zhì)粒含有肌苷-鳥苷激酶基因(1.3kb),氨芐青霉素抗性基因,卡那霉素抗性基因和在大腸桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)。(2)構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pIGK2,該質(zhì)粒能用碳源調(diào)節(jié)肌苷-鳥苷激酶基因的表達(dá)按下列方法,使用誘導(dǎo)型表達(dá)載體pCEX2(日本公開未審專利申請224259/91)構(gòu)建能用碳源調(diào)節(jié)肌苷-鳥苷激酶基因表達(dá)的質(zhì)粒。
用KpnI(5單位)裂解pCEX2載體DNA(1μg),然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收7.6kb的DNA片斷,該片斷含有異檸檬酸裂合酶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)域,壯觀霉素抗性基因和在谷氨酸棒狀桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)。
用KpnI(5單位)裂解實(shí)施例3(1)所得的含有肌苷-鳥苷激酶基因的質(zhì)粒pT-AI(1μg),然后進(jìn)行去磷酸化。
將經(jīng)KpnI裂解的DNA片斷與上文中經(jīng)KpnI裂解的pCEX2片斷相連接。
使用所得的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后鋪于含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上,得到氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒。
用多種限制性酶裂解質(zhì)粒并分析之,從而證實(shí)得到質(zhì)粒pIGK2,其具有圖3所示的所需結(jié)構(gòu)。
通過電脈沖法,使用此質(zhì)粒(1μg)轉(zhuǎn)化產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872,然后鋪于含有100μg/ml壯觀霉素的A瓊脂培養(yǎng)基上。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)證實(shí)轉(zhuǎn)化子攜有pIGK2。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約,于1999年2月5日將攜有pIGK2的產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872/pIGK2保藏于日本工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究院,國立生物科學(xué)和人類-技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology,Agency of Industrial Science andTechnology),1-3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-0046,其保藏號(hào)為FERM BP-6638。(3)測定通過將pIGK2導(dǎo)入菌株FERM BP-2217所制備菌株的肌苷-鳥苷激酶活性通過堿性細(xì)菌裂解法從產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872/pIGK2(FERMBP-6638)中提取質(zhì)粒pIGK2。
通過電脈沖法,使用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化肌苷生產(chǎn)菌株產(chǎn)氨棒狀桿菌FERM BP-2217(日本專利2578496腺嘌呤-滲漏需求型和鳥嘌呤需求型)。
通過堿性細(xì)菌裂解法從所得的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA。
用多種限制性酶裂解質(zhì)粒并分析之,從而證實(shí)所得轉(zhuǎn)化子攜有pIGK2。
于30℃,分別在兩種培養(yǎng)基中將攜有pIGK2的肌苷生產(chǎn)菌株FERMBP-2217培養(yǎng)24小時(shí),所述培養(yǎng)基是含有100μg/ml壯觀霉素的培養(yǎng)基和通過用醋酸銨替代所述培養(yǎng)基中的葡萄糖而制備的培養(yǎng)基。
根據(jù)實(shí)施例1(2)所述的方法,從所得培養(yǎng)物中得到細(xì)胞以制備細(xì)胞提取物。
按下列方法測定各個(gè)提取物中的肌苷-鳥苷激酶活性。
在0.1ml預(yù)先加熱至30℃的反應(yīng)混合物[100mmol/l HEPES緩沖液(pH7.2),10mmol/l MgSO4,50mmol/l Kcl,1mmol/l ATP和1mmol/l肌苷]中加入0.01ml細(xì)胞提取物,接著于30℃反應(yīng)約30分鐘。
在反應(yīng)過程中,間隔取樣反應(yīng)混合物,用0.2M NaH2PO4(用H3PO4調(diào)節(jié)至pH2.6)將取出的樣品稀釋20倍以終止反應(yīng)。
通過HPLC分析測定稀釋樣品中的肌苷和IMP的量。
HPLC分析的條件柱Asahipak GS-320H(Asahi Chemical Industry有限公司)
洗脫液0.2M NaH2PO4(pH2.6)流速1mL/min檢測UV 254nm通過測定UV 254nm下的光吸收值并與標(biāo)準(zhǔn)值相比較以測定積累的肌苷和IMP的量。將1分鐘內(nèi)形成1μmol IMP的活性定為1個(gè)單位(U),計(jì)算每毫克蛋白質(zhì)的比活。使用蛋白質(zhì)檢測試劑盒(BioRadLaboratories)測定蛋白質(zhì)的量。
結(jié)果示于表3。在使用葡萄糖作為碳源培養(yǎng)的細(xì)胞中僅檢測到極低水平的活性,而在使用2%醋酸銨作為碳源培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測到高水平的活性。這些結(jié)果表明肌苷-鳥苷激酶基因的表達(dá)處于攜有pIGK2的FERM BP-2217中的異檸檬酸裂合酶基因啟動(dòng)子的控制之下,改變碳源可調(diào)節(jié)所述酶的活性。表3
>(4)通過攜有pIGK2的肌苷生產(chǎn)菌株FERM BP-2217生產(chǎn)IMP于30℃,在含有20μg/ml壯觀霉素的A瓊脂培養(yǎng)基中將攜有pIGK2的FERM BP-2217菌株培養(yǎng)2天。
完成培養(yǎng)之后,將所得細(xì)胞接種于含有60ml CI種子培養(yǎng)基的250ml錐瓶中,所述種子培養(yǎng)基中含有20μg/ml壯觀霉素,其配方是5%葡萄糖,1%酵母膏,1%蛋白胨,0.25%氯化鈉,0.25%尿素,300mg/l腺嘌呤和100mg/l鳥嘌呤(pH7.2),接著于30℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
將所得的全部培養(yǎng)物接種于2升發(fā)酵罐中,其中含有0.94升DI種子培養(yǎng)基[7%葡萄糖,1%肉膏,1%蛋白胨,0.1%KH2PO4,0.1%K2HPO4,0.1%MgSO4.7H2O,300mg/l腺嘌呤,300mg/l鳥嘌呤,10mg/lFeSO4.7H2O,10mg/l ZnSO4.7H2O,10mg/l MnSO4.4-6H2O,16mg/l β-丙氨酸,20mg/l L-半胱氨酸,30μg/l生物素,2mg/l CuSO4.5H2O和6mg/l硫胺素(pH7.2)],接著,于30℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養(yǎng)24小時(shí),培養(yǎng)過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
將所得培養(yǎng)物(120ml)接種于含0.88升FI發(fā)酵培養(yǎng)基的2升發(fā)酵罐中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方是8%葡萄糖,2.07%CSL,0.21%KH2PO4,0.21%K2HPO4,0.43%MgSO4.7H2O,105mg/l CaCl2.2H2O,10.4mg/lFeSO4.7H2O,20.7mg/l MnSO4.4-6H2O,5.2mg/l ZnSO4.7H2O,10.4mg/l泛酸鈣,20.7mg/l L-半胱氨酸,5.2mg/l煙酸,93.8μg/l生物素,0.51mg/l CuSO4.5H2O和313mg/l腺嘌呤(pH7.2),接著,于28℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養(yǎng)44小時(shí),培養(yǎng)過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
培養(yǎng)完成之后,根據(jù)實(shí)施例3(3)中所述的方法測定培養(yǎng)物上清液中形成和積累的肌苷和IMP的量。
培養(yǎng)物上清液中形成和積累的肌苷的量為23.1g/l,未檢測到IMP。
培養(yǎng)完成之后,為了誘導(dǎo)和表達(dá)肌苷-鳥苷激酶基因,在所得培養(yǎng)物中加入醋酸銨至終濃度為2%,接著,攪拌(600rpm)并通氣(1L/min)培養(yǎng)10小時(shí),其間用5.5M氨水將pH維持在7.2。
在所得培養(yǎng)物中加入2.5%葡萄糖,10g/l植酸,4.4g/l MgSO4.7H2O,9.36g/l NaH2PO4,96.9mg/l腺嘌呤和10g/l Nymeen S-215,于40℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min),使所得混合物反應(yīng)24小時(shí),其間用5.5M氨水將pH維持在7.4。
完成反應(yīng)之后,根據(jù)實(shí)施例3(3)中所述的方法測定反應(yīng)混合物上清液中形成和積累的IMP的量。
反應(yīng)混合物中形成和積累的IMP的量為37.7g/l。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)嘌呤核苷酸的方法,所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,該微生物能生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體,并攜有導(dǎo)入的DNA,所述DNA可誘導(dǎo)和表達(dá)能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶;使所述嘌呤核苷酸前體在培養(yǎng)基中積累;誘導(dǎo)和表達(dá)能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶;由所述前體形成嘌呤核苷酸并在所述培養(yǎng)基中積累;從培養(yǎng)基中回收所述嘌呤核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中嘌呤核苷酸的前體是5’-黃苷酸,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黃苷酸氨基酶,嘌呤核苷酸是5’-鳥苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中嘌呤核苷酸的前體是鳥苷,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶,嘌呤核苷酸是5’-鳥苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中嘌呤核苷酸的前體是肌苷,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶,嘌呤核苷酸是5’-肌苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中微生物屬于選自棒狀桿菌,大腸桿菌和芽孢桿菌的屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中微生物是產(chǎn)氨棒狀桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于通過改變條件或通過將碳源由糖改變?yōu)榉翘莵碚T導(dǎo)和表達(dá)能合成嘌呤核苷酸的酶,所述條件的改變選自溫度的升高,pH的升高和滲透壓的升高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中非糖碳源是醋酸或醋酸鹽。
9.可誘導(dǎo)和表達(dá)能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的DNA,該DNA通過改變條件或通過將碳源由糖改變?yōu)榉翘莵碚T導(dǎo)和表達(dá)能合成嘌呤核苷酸的酶,所述條件的改變選自溫度的升高,pH的升高和滲透壓的升高。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的DNA,其中非糖碳源是醋酸或醋酸鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10的DNA,該DNA是pLAC857或pIGK2。
13.微生物,該微生物能生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體,并攜有導(dǎo)入的DNA,所述DNA可誘導(dǎo)和表達(dá)能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的微生物,其中嘌呤核苷酸的前體是5’-黃苷酸,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黃苷酸氨基酶,嘌呤核苷酸是5’-鳥苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的微生物,其中嘌呤核苷酸的前體是鳥苷,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶,嘌呤核苷酸是5’-鳥苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的微生物,其中嘌呤核苷酸的前體是肌苷,能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶,嘌呤核苷酸是5’-肌苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的微生物,其中微生物屬于選自棒狀桿菌,大腸桿菌和芽孢桿菌的屬。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的微生物,其中微生物是產(chǎn)氨棒狀桿菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的微生物,其中微生物是產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC6872/pLAC857(FERM BP-6639)或產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC 6872/pIGK2(FERM BP-6638)。
全文摘要
本發(fā)明提供了生產(chǎn)嘌呤核苷酸的方法,所述方法包括:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,該微生物能生產(chǎn)嘌呤核苷酸前體,并攜有導(dǎo)入的DNA,所述DNA可誘導(dǎo)和表達(dá)能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶;使所述嘌呤核苷酸前體在培養(yǎng)基中積累;誘導(dǎo)和表達(dá)能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶;由所述前體形成嘌呤核苷酸并在所述培養(yǎng)基中積累;從培養(yǎng)基中回收所述嘌呤核苷酸。本發(fā)明還提供了可用于所述方法的微生物。
文檔編號(hào)C12N9/16GK1267735SQ0010195
公開日2000年9月27日 申請日期2000年2月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月8日
發(fā)明者高野裕, 池田正人, 藤尾達(dá)郎 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社