專利名稱：合成核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由特異核苷酸序列構(gòu)成的核酸的合成方法，一種有用的擴(kuò)增核酸的方法。
背景技術(shù)：
基于核苷酸序列互補(bǔ)性的分析方法可直接分析遺傳特征。因此，該分析是一種鑒定遺傳疾病，癌變，微生物等非常強(qiáng)有力的方法。而且，檢測(cè)的對(duì)象是基因自身，所以某些情況下耗時(shí)而又繁瑣的操作過程如培養(yǎng)中的就可省略。
然而，當(dāng)樣品中靶基因量非常少時(shí)一般不易檢測(cè)，因此必須對(duì)靶基因自身或其檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增。作為擴(kuò)增靶基因的方法，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法已為大家所知(Science，230，1350-1354，1985)。目前，PCR方法是體外擴(kuò)增核酸序列最普遍的技術(shù)方法。指數(shù)式擴(kuò)增結(jié)果使其具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，所以該方法牢牢地確立了一種非常好的檢測(cè)途徑。此外，由于回收到的擴(kuò)增產(chǎn)物可以是DNA，因此作為一種支持遺傳工程技術(shù)例如基因克隆和結(jié)構(gòu)決定的重要工具，該方法得到了廣泛應(yīng)用。然而PCR方法明顯有下述的問題實(shí)際操作中必須要用專門的溫度控制器；擴(kuò)增反應(yīng)的指數(shù)式上升導(dǎo)致在定量中產(chǎn)生問題；樣品和反應(yīng)溶液易受到外部污染，使混入的核酸作為模板錯(cuò)誤地運(yùn)行。
基因組信息的日益增多，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分析逐步受到了注意。通過設(shè)計(jì)引物使其核苷酸序列包含SNPs，依靠PCR檢測(cè)SNPs是可行的。也就是，是否存在與引物互補(bǔ)的核苷酸序列可通過是否存在反應(yīng)產(chǎn)物的決定得出推斷。然而，一旦PCR中偶然誤合成互補(bǔ)鏈，在接下去的反應(yīng)中該產(chǎn)物以模板運(yùn)行，就會(huì)造成錯(cuò)誤的結(jié)果。實(shí)際應(yīng)用中，據(jù)說引物末端僅一個(gè)堿基不同就很難嚴(yán)格控制PCR。因此，必須改進(jìn)特異性使PCR應(yīng)用于SNPs的檢測(cè)上。
一方面，實(shí)際中還在應(yīng)用連接酶合成核酸的方法。LCR方法(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligase chain reaction)，Laffler TG；Garrino JJ；Marshall RL；Ann.Biol.Clin.(Paris)，519，821-6，1993)是基于這樣的反應(yīng)，該反應(yīng)中兩個(gè)相鄰的探針與靶序列雜交并且通過連接酶互相連接。在缺少靶核苷酸序列的情況下所述兩探針不能被連接，因此連接產(chǎn)物的存在是靶核苷酸序列存在的象征。LCR方法也需要控制溫度用于從模板分離互補(bǔ)鏈，遇到PCR方法中相同的問題。對(duì)于LCR，有通過增加在相鄰探針間提供缺口并利用DNA聚合酶填補(bǔ)缺口的步驟以改進(jìn)特異性方法的報(bào)道。該改進(jìn)方法所期望的是特異性的改進(jìn)，然而，由于需要控制溫度所以仍然存在問題。此外，使用額外酶導(dǎo)致費(fèi)用增加。
稱為SDA的方法(鏈置換擴(kuò)增，strand displacement amplification)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，392-396，1992][Nucleic.Acid Res.，20，1691-1696，1992]也是人們所知的擴(kuò)增具有序列與靶序列互補(bǔ)的模板DNA的方法。SDA方法中，在替換雙鏈5’-側(cè)的序列時(shí)，用特定的DNA聚合酶從與某核苷酸序列3’-側(cè)互補(bǔ)的引物開始合成互補(bǔ)鏈。本發(fā)明中簡單表達(dá)5’-側(cè)和3’-側(cè)指的是模板鏈的，由于新合成的互補(bǔ)鏈替換了5’-側(cè)的雙鏈，稱該項(xiàng)技術(shù)為SDA方法。SDA方法中限制酶識(shí)別序列作為引物預(yù)先插入到退火序列中就可去除PCR方法中必須的溫度變化步驟。即通過限制酶生成的切口供給3’-OH基作為互補(bǔ)鏈的合成起點(diǎn)，并且先合成的互補(bǔ)鏈通過鏈置換合成得以釋放單鏈，接著再次作為模板用于下面的互補(bǔ)鏈合成。這樣，在SDA方法中就不需要PCR方法中所必須的復(fù)雜溫度控制。
然而在SDA方法中，除了鏈置換型DNA聚合酶，還要用到生成切口的限制酶。需要應(yīng)用額外酶是導(dǎo)致較高費(fèi)用的主要原因。此外，由于限制酶不是用來斷開兩條鏈，而是為產(chǎn)生切口(也就是僅斷開其中一條鏈)，dNTP衍生物例如α-硫代dNTP被用作合成的底物使其它鏈能抗該酶的消化。因此，SDA擴(kuò)增產(chǎn)物與天然核酸結(jié)構(gòu)不同，并且對(duì)用限制酶來斷裂或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用到基因克隆上存在限制。這方面也是導(dǎo)致費(fèi)用較高的主要原因。另外，SDA方法應(yīng)用在未知序列時(shí)，與用于引入缺口的限制酶識(shí)別序列相同的核苷酸序列可能存在于要被合成的區(qū)中。這種情況下，有可能阻止完全互補(bǔ)鏈的合成。
NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification)，也稱TMA/轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增方法)也是我們所知的擴(kuò)增核酸方法，其中不需要復(fù)雜的溫度控制。NASBA是反應(yīng)系統(tǒng)，其中DNA通過DNA聚合酶在以靶RNA為模板，加入有T7啟動(dòng)子的探針而得以合成，第二探針進(jìn)入雙鏈?zhǔn)巩a(chǎn)物得以生成，接著以生成的雙鏈DNA為模板通過T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄而擴(kuò)增大量的RNA(Nature，350，91-92，1991)。NASBA需某些熱變性步驟直到雙鏈DNA形成，但是接下去的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在等溫條件下通過T7 RNA聚合酶得以進(jìn)行。然而必須要用多種酶組合例如反轉(zhuǎn)錄酶，RNase H，DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶，然后多種酶的組合與SDA相似這對(duì)于費(fèi)用是不利的。而且由于設(shè)定多種酶的反應(yīng)條件復(fù)雜，該方法很難作為一般的分析方法得以推廣。已知的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，還存在如上所述復(fù)雜的溫度控制及需用到多種酶的問題。
對(duì)這些已知的合成核酸的反應(yīng)，很少有關(guān)于進(jìn)一步改進(jìn)核酸合成的效率而又不損失特異性或費(fèi)用的嘗試的報(bào)道。例如在稱為RCA(滾環(huán)擴(kuò)增，rolling-circle amplification)的方法中，顯示具有一系列核苷酸序列與掛鎖探針(padlock probe)互補(bǔ)的單鏈DNA在靶核苷酸存在下可被連續(xù)的合成(Paul M.Lizardi et al.，Nature Genetics，19，225-232，July，1998)。在RCA中，用到具有特殊結(jié)構(gòu)掛鎖探針，其中在LCR中一條鏈的寡核苷酸每個(gè)5’-和3’-末端構(gòu)成相鄰的探針。然后以掛鎖探針為模板通過結(jié)合聚合酶催化合成鏈置換型互補(bǔ)鏈的反應(yīng)，合成互補(bǔ)鏈的連續(xù)反應(yīng)得以啟動(dòng)，該模板在靶核苷酸序列存在下被連接并環(huán)化。由此生成的單鏈核酸具有一種重復(fù)的連續(xù)的結(jié)構(gòu)，每個(gè)區(qū)由相同的核苷酸組成。引物進(jìn)一步被退火使該單鏈核酸合成其互補(bǔ)鏈，從而實(shí)現(xiàn)高度擴(kuò)增。但仍存在需多種酶的問題。而且，互補(bǔ)鏈合成的啟動(dòng)取決于連接兩鄰近區(qū)的反應(yīng)，并且其特異性基本上與LCR中的相同。
為了提供3’-OH，在已知方法中在3’-末端提供給核苷酸序列與其互補(bǔ)的序列，并且在末端形成發(fā)夾環(huán)(Gene 71，29-40，1988)。以靶序列自身為模板互補(bǔ)鏈的合成在發(fā)夾環(huán)處開始形成由互補(bǔ)核苷酸序列構(gòu)成的單鏈核酸。例如，在PCT/FR95/00891中同一鏈末端發(fā)生退火的結(jié)構(gòu)與互補(bǔ)的核苷酸序列的連接已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。然而，末端消除與該互補(bǔ)鏈配對(duì)的堿基并且在同一鏈上重新再構(gòu)成堿基配對(duì)，該方法中這步是必須的。據(jù)估計(jì)該步的運(yùn)行取決于涉及堿基對(duì)配對(duì)的互相互補(bǔ)的核苷酸序列末端的一種微平衡狀態(tài)。也就是，在與互補(bǔ)鏈配對(duì)的堿基和同一鏈上配對(duì)的堿基間維持一種平衡狀態(tài)。利用這種平衡狀態(tài)并且僅與同一鏈中核苷酸退火的鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)鏈合成的起點(diǎn)。于是，認(rèn)為應(yīng)設(shè)定嚴(yán)格的反應(yīng)條件以獲得高的反應(yīng)效率。進(jìn)一步地，在先端技術(shù)中，引物自身形成一種環(huán)的結(jié)構(gòu)。因此，一旦形成引物二聚物，不管是否存在靶核苷酸序列，擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)自動(dòng)開始，于是就會(huì)合成非特異性產(chǎn)物。這可是嚴(yán)重的問題。此外，引物二聚物的形成和接下來的非特異性合成反應(yīng)中引物的消耗導(dǎo)致所需反應(yīng)的擴(kuò)增效率降低。
此外，有利用不充當(dāng)DNA聚合酶模板的區(qū)來實(shí)現(xiàn)能與同一鏈退火的3’-末端結(jié)構(gòu)的報(bào)道(EP713922)。由于生成二聚物引物，在末端動(dòng)力平衡的利用及非特異性合成反應(yīng)的可能性方面，該報(bào)道存在與上面所述的PCT/FR95/00891相同的問題。另外，不能為DNA聚合酶提供模板的區(qū)應(yīng)被制成引物。
此外，將上述NASBA原理應(yīng)用于各種信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)中，經(jīng)常利用末端具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸來提供雙鏈的啟動(dòng)子區(qū)(JP-A 5-211873)。然而，這些并不是那些為互補(bǔ)鏈合成連續(xù)提供3’-OH的技術(shù)。而且，在JP-A 10-510161(WO96/17079)中用發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)以達(dá)到獲得RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA模板的目的，該發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)在同一鏈3’-末端退火。模板通過轉(zhuǎn)錄成RNA和RNA到DNA反轉(zhuǎn)錄得以擴(kuò)增。然而，該方法中，反應(yīng)系統(tǒng)不結(jié)合大量的酶就不能被構(gòu)成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種合成核酸的方法，該方法基于一種新的原理。更具體地的目的是提供一種能實(shí)現(xiàn)依靠序列高效合成核酸的低成本方法。也就是，本發(fā)明的目的是提供通過在一種單酶甚至等溫條件下完成核酸合成和擴(kuò)增的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種核酸合成的方法，該方法可實(shí)現(xiàn)用已知的核酸合成反應(yīng)原理很難達(dá)到的高特異性，還提供一種用該合成方法擴(kuò)增核酸方法。
本發(fā)明人把注意力集中在該事實(shí)上，利用聚合酶催化鏈置換型的互補(bǔ)鏈合成而不需復(fù)雜的溫度控制，有益于核酸的合成。該DNA聚合酶是SDA和RCA中用到的酶。然而，即使用這樣的酶，在以引物為基礎(chǔ)的已知方法中總是需要另一種酶反應(yīng)提供3’-OH作為合成的起點(diǎn)，例如SDA。
這些情況下，本發(fā)明人用與已知方法完全不同的方法討論了3’-OH的供給，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過利用具有特定結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，不需任何額外酶反應(yīng)3’-OH就可被提供，由此得出本發(fā)明。即本發(fā)明涉及合成核酸的方法，通過用所述核酸合成方法擴(kuò)增核酸的方法和應(yīng)用所述方法的新寡核苷酸，如下所述
(1)合成在其一條鏈上具有交替連接之互補(bǔ)核苷酸序列的核酸的方法，所述方法包括a)提供一種核酸，其3′末端具有可與同一條鏈上的部分F1c退火的F1區(qū)，并且通過所述F1區(qū)與F1c的退火可形成包含了可進(jìn)行堿基配對(duì)的F2c區(qū)在內(nèi)的環(huán)；b)以與F1c退火的F1 3′末端為起點(diǎn)合成互補(bǔ)鏈；c)使在其3′末端包含與F2c區(qū)互補(bǔ)的F2序列的寡核苷酸退火并以該寡核苷酸為合成起點(diǎn)，通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)而進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成，以置換步驟b)中所合成的互補(bǔ)鏈；d)使一種多核苷酸退火并以其3′末端為合成起點(diǎn)，通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)而進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成，以置換步驟c)中所合成的互補(bǔ)鏈，其中所述多核苷酸在其3′末端包含一種與步驟c)中合成的互補(bǔ)鏈的任意區(qū)域互補(bǔ)的序列；(2)如(1)所述的方法，其中步驟d)中所述合成起點(diǎn)為同一鏈上3′末端的可與R1c區(qū)退火的R1區(qū)，通過R1與R1c的退火可形成包含了可進(jìn)行堿基配對(duì)的R2c區(qū)在內(nèi)的環(huán)。
(3)一種寡核苷酸，其至少由以下兩個(gè)區(qū)域X2及X1c構(gòu)成，且X1c連接至X2的5′側(cè)，X2區(qū)具有與含特定核苷酸序列的核酸中任意X2c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列；X1c區(qū)具有與含特定核苷酸序列的核酸中X2c區(qū)5′側(cè)的X1c區(qū)基本相同的核苷酸序列。
(4)如(1)所述的方法，其中步驟a)所述的核酸是通過以下步驟產(chǎn)生的第二核酸i)使如(3)所述寡核苷酸的F2區(qū)與作為模板的核酸中的F2c區(qū)退火，其中所述寡核苷酸中，X2區(qū)為F2區(qū)，X1c區(qū)為F1c區(qū)；ii)以所述寡核苷酸中的F2為起點(diǎn)合成具有與所述模板互補(bǔ)之核苷酸序列的第一核酸；iii)使步驟ii)中合成的第一核酸的任意區(qū)處于可進(jìn)行堿基配對(duì)的狀態(tài)；
iv)使一種寡核苷酸退火并以該寡核苷酸為合成起點(diǎn)，合成第二核酸，并使該核酸3′末端的F1處于可進(jìn)行堿基配對(duì)的狀態(tài)，其中所述寡核苷酸具有與步驟iii)中的第一核酸中可進(jìn)行堿基配對(duì)的區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列。
(5)如(4)所述的方法，其中步驟iii)中可進(jìn)行堿基配對(duì)的區(qū)域?yàn)镽2c，且步驟iv)中的寡核苷酸為如(3)所述的寡核苷酸，其中X2c區(qū)為R2c區(qū)，X1c區(qū)為R1c區(qū)。
(6)如(4或5)所述的方法，其中步驟iii)及iv)中可進(jìn)行堿基配對(duì)的狀態(tài)通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)而產(chǎn)生，該反應(yīng)的合成起點(diǎn)啟用兩種外引物一種是與模板中F2c的3′側(cè)退火的外引物，另一種是與作為步驟iv)中第一核酸合成起點(diǎn)的區(qū)域的3′側(cè)退火的外引物。
(7)如(6)所述的方法，所述反應(yīng)中所用的每種寡核苷酸與其在模板中的互補(bǔ)區(qū)之間的解鏈溫度在相同嚴(yán)謹(jǐn)條件下存在以下的關(guān)系(外引物/模板3′側(cè)區(qū))≤(F2c/F2及R2c/R2)≤(F1c/F1及R1c/R1)。
(8)如(4)-(7)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述作為模板的核酸為RNA，且步驟ii)中的互補(bǔ)鏈通過具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的酶來合成。
(9)擴(kuò)增在其一條鏈上具有交替連接之互補(bǔ)核苷酸序列的核酸的方法，所述方法通過重復(fù)以下步驟完成A)提供一種模板，使其3′末端和5′末端具有由互補(bǔ)于相同鏈上每一末端區(qū)的核苷酸序列組成的區(qū)，當(dāng)這些互補(bǔ)核苷酸序列退火時(shí)，形成可在兩者之間進(jìn)行堿基配對(duì)的環(huán)；B)以與同一鏈退火的上述模板的3′末端為合成起點(diǎn)合成互補(bǔ)鏈；C)使3′末端互補(bǔ)于3′末端側(cè)的環(huán)內(nèi)核苷酸序列的寡核苷酸與環(huán)部退火，并以該寡核苷酸為合成起點(diǎn)，通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)而合成互補(bǔ)鏈，以置換步驟B)中合成的互補(bǔ)鏈，使其3′末端處于可進(jìn)行堿基配對(duì)的狀態(tài)；D)使步驟C)中具有能進(jìn)行堿基配對(duì)的3′末端的鏈作為(A)中的新模板。
(10)如(9)所述的擴(kuò)增方法，其中步驟C)中寡核苷酸的5′末端具有一段與作為步驟B)之合成起始點(diǎn)的3末端互補(bǔ)的核苷酸序列。
(11)如(10)所述的擴(kuò)增方法，進(jìn)一步包含這樣的步驟以步驟C)中的寡核苷酸作為合成起始點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈用做步驟A)中的模板。
(12)如(9)所述的擴(kuò)增方法，其中步驟A)的模板是通過如(5)所述方法合成的。
(13)如(1)或(9)所述的方法，其中鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)是在解鏈溫度調(diào)節(jié)劑的存在下實(shí)施的。
(14)如(13)所述的方法，其中解鏈溫度調(diào)節(jié)劑為甜菜堿。
(15)如(14)所述的方法，其中允許反應(yīng)溶液中甜菜堿的濃度為0.2-3.0M。
(16)一種檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法，包括實(shí)施如(9)-(15)中任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法并觀察是否生成擴(kuò)增產(chǎn)物。
(17)如(16)所述的方法，其中在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入包含與所述環(huán)互補(bǔ)的核苷酸序列的探針，進(jìn)而觀察兩者之間的雜交。
(18)如(17)所述的方法，其中所述探針被標(biāo)記在顆粒上，并觀察通過雜交而發(fā)生的聚集反應(yīng)。
(19)如(16)所述的方法，其中如(9)-(15)中任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法在核酸檢測(cè)試劑的存在下實(shí)施，并根據(jù)該檢測(cè)試劑的信號(hào)變化來觀察是否生成擴(kuò)增產(chǎn)物。
(20)用如(16)所述方法檢測(cè)靶核苷酸序列中的突變的方法，其中核苷酸序列中作為擴(kuò)增對(duì)象的突變阻礙了組成該擴(kuò)增方法的任一互補(bǔ)鏈的合成。
(21)合成在其一條鏈上具有交替連接之互補(bǔ)核苷酸序列的核酸的試劑盒，其包括以下組分i)如(3)所述的寡核苷酸，其中作為模板的核酸中F2c區(qū)域是X2c，位于F2c 5′端的F1c是X1c；ii)一種寡核苷酸，其包含互補(bǔ)于以i)的寡核苷酸為引物而合成的互補(bǔ)鏈中任意區(qū)域的核苷酸序列；iii)一種寡核苷酸，其具有與作為模板的核酸中F2c區(qū)3′側(cè)的F3c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列；iv)一種用于催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的DNA聚合酶，和，v)一種核苷酸，其作為組分iv)的底物。
(22)如(21)所述的試劑盒，其中ii)的寡核苷酸為如(3)所述的寡核苷酸，以i)的寡核苷酸為合成起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈中任意R2c區(qū)為X2c，位于R2c 5′側(cè)的R1c為X1c。
(23)如(22)所述的試劑盒，進(jìn)一步包含以下組分vi)一種寡核苷酸，其具有與用i)的寡核苷酸作為起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈中任意R2c區(qū)3′側(cè)的R3c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列。
(24)一種用于檢測(cè)靶核苷酸序列的試劑盒，其中在如(21)-(23)中任一項(xiàng)所述試劑盒的基礎(chǔ)上，還進(jìn)一步包含用于檢測(cè)核酸合成反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)試劑。
具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸是本發(fā)明合成的目的，該核酸指的是具有互相互補(bǔ)核苷酸序列并排連接在單鏈里的核酸。此外，本發(fā)明中它應(yīng)包含用于在互補(bǔ)鏈間成環(huán)的核苷酸序列。本發(fā)明中該序列稱為成環(huán)序列。本發(fā)明合成的核酸基本上由通過成環(huán)序列連接的互相互補(bǔ)的鏈組成。一般而言，不管是否部分涉及堿基配對(duì)，一個(gè)在配對(duì)堿基分離時(shí)不能被分離成兩個(gè)或更多分子的鏈稱為單鏈。同一鏈中互補(bǔ)核苷酸序列可形成堿基配對(duì)。本發(fā)明通過容許具有核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸在同一鏈內(nèi)堿基配對(duì)，可獲得分子內(nèi)堿基配對(duì)的產(chǎn)物，該產(chǎn)物供給組成明顯雙鏈的區(qū)和不涉及堿基配對(duì)的環(huán)。
也就是，本發(fā)明具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸可被定義為單鏈核酸，其中包含能在同一鏈中退火的互補(bǔ)核苷酸序列，并且其退火產(chǎn)物，在彎曲鉸鏈部分組成不涉及堿基配對(duì)的環(huán)。具有互補(bǔ)核苷酸序列的核苷酸可退火成不涉及堿基配對(duì)的環(huán)。成環(huán)序列可以是任意的核苷酸序列。成環(huán)序列能堿基配對(duì)以啟動(dòng)用于置換的互補(bǔ)鏈的合成。并優(yōu)先地被提供與位于其它區(qū)的核苷酸序列不同的序列，以獲得特異性退火。例如，在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，成環(huán)序列基本上包含與F2c(或R2c)區(qū)相同的核苷酸序列，F(xiàn)2c(或R2c)區(qū)位于源于模板核酸的區(qū)(例如F1c或R1c)的3’-側(cè)，并在同一鏈內(nèi)退火。
本發(fā)明中基本相同的核苷酸序列定義如下。也就是，當(dāng)以某序列作為模板合成的互補(bǔ)鏈與靶核苷酸序列退火以供給合成互補(bǔ)鏈的起點(diǎn)時(shí)，該某序列基本上與靶核苷酸序列相同。例如，基本上與F2相同的序列不但完全包括與F2相同的序列，還包括能作為模板的核苷酸序列，所述模板能給出與F2退火的核苷酸序列并能作為合成互補(bǔ)鏈的起點(diǎn)。本發(fā)明術(shù)語“退火”指的是通過根據(jù)沃森-克里克定律的堿基配對(duì)，形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸。因此，即使組成堿基配對(duì)的核酸鏈為單鏈，如果分子內(nèi)互補(bǔ)核苷酸序列堿基配對(duì)，退火也會(huì)發(fā)生。既然通過堿基配對(duì)核酸組成雙鏈結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明退火和雜交有相同的意思。
本發(fā)明組成核酸的核苷酸序列對(duì)數(shù)至少為1。本發(fā)明所期望的模型，核苷酸序列對(duì)數(shù)可為1的整倍數(shù)。該情況中，本發(fā)明組成核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列對(duì)數(shù)理論上沒有上限，在由多組互補(bǔ)核苷酸序列構(gòu)成的本發(fā)明合成產(chǎn)物核酸時(shí)，該核酸由重復(fù)相同的核苷酸序列組成。
本發(fā)明合成的具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸與天然存在的核酸不可能有相同的結(jié)構(gòu)。已知當(dāng)通過核酸聚合酶作用合成核酸時(shí)如果用核苷酸衍生物作為底物，就可合成核酸衍生物。所用核苷酸衍生物包括放射性同位素標(biāo)記的核苷酸或結(jié)合配體標(biāo)記的核苷酸衍生物例如生物素或地高辛。這些核苷酸衍生物可用于標(biāo)記產(chǎn)物核酸。或者，如果底物是熒光核苷酸，則產(chǎn)物核酸可能為熒光衍生物。而且產(chǎn)物可為DNA亦可為RNA。生成的產(chǎn)物通過結(jié)合實(shí)現(xiàn)核酸聚合反應(yīng)的引物結(jié)構(gòu)，聚合反應(yīng)底物類型，聚合反應(yīng)的試劑而定。
利用DNA聚合酶能啟動(dòng)有上述結(jié)構(gòu)的核酸的合成，該DNA聚合酶具有鏈置換活性以及F1區(qū)具備在3’-末端與同一鏈上的部分F1c區(qū)退火形成包含可堿基配對(duì)的F2c區(qū)在內(nèi)的環(huán)。有許多關(guān)于互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的報(bào)道，其中形成發(fā)夾環(huán)，以發(fā)夾環(huán)序列自身為模板，而本發(fā)明中提供給發(fā)夾環(huán)部分能堿基配對(duì)的區(qū)，并且具有在合成互補(bǔ)鏈時(shí)利用該區(qū)的新特點(diǎn)。通過將該區(qū)用作合成的起點(diǎn)，先前以發(fā)夾環(huán)序列自身為模板合成的互補(bǔ)鏈被替換。接著位于替換鏈3’-末端R1c區(qū)(任意區(qū))處于一種可堿基配對(duì)的狀態(tài)。具有與該R1c互補(bǔ)序列的區(qū)通過退火進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成，導(dǎo)致生成核酸(2分子)，該核酸具有從F1延伸到R1c的核苷酸序列和其互補(bǔ)鏈通過成環(huán)序列通過彼此結(jié)合而形成。本發(fā)明中可任意地選擇任意區(qū)例如上面R1c，如果它可與該區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列的多核苷酸退火。并且以多核苷酸為合成起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈，該合成的互補(bǔ)鏈對(duì)本發(fā)明具有必不可少的作用。
本發(fā)明用到術(shù)語“核酸”，本發(fā)明核酸通常既包括DNA又包括RNA。
然而，功能為合成互補(bǔ)鏈的模板的，來自天然DNA或RNA的其核苷酸被人工衍生物所替換的核酸或修飾核苷酸也包括在本發(fā)明的核酸范圍中。通常本發(fā)明的核酸被包含于生物樣品中，生物樣品包括動(dòng)物，植物或微生物的組織，細(xì)胞，培養(yǎng)物和分泌物，或它們的提取物。本發(fā)明的生物樣品包括細(xì)胞內(nèi)寄生物基因組DNA或RNA例如病毒或支原體。本發(fā)明的核酸一般由包含在所述生物樣品的核酸衍生而來。例如由mRNA合成cDNA，基于生物樣品衍生來的核酸而擴(kuò)增的核酸，是本發(fā)明的核酸的典型實(shí)例。
本發(fā)明核酸的特征是在3’-末端被提供F1區(qū)，可與同一鏈上的部分F1c退火，通過該F1區(qū)與同一鏈上的F1c退火，可形成包含可堿基配對(duì)的F2c區(qū)在內(nèi)的環(huán)，可在各種方法中得到該核酸。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用有下述結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，通過合成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)可提供該結(jié)構(gòu)。
也就是，本發(fā)明有效的寡核苷酸至少由下面兩個(gè)區(qū)X2和X1c構(gòu)成，其中X1c與X2的5’-側(cè)相連。
X2區(qū)具有與核酸中X2c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列，所述核酸具有特異核苷酸序列。
X1c區(qū)有與X1c區(qū)基本上相同核苷酸序列，所述X1c區(qū)位于具有特異核苷酸序列的核酸里X2c區(qū)5’-側(cè)。
此處通過本發(fā)明寡核苷酸結(jié)構(gòu)所決定的具有特異核苷酸序列的核酸指的是以本發(fā)明寡核苷酸為引物時(shí)充當(dāng)模板的核酸。在基于本發(fā)明的合成方法檢測(cè)核酸情況中，所述具有特異核苷酸序列的核酸是檢測(cè)的靶子或是檢測(cè)靶子衍生的核酸。具有特異核苷酸序列的核酸指的是其中至少一部分核苷酸序列是公開的或可預(yù)言的。公開的部分核苷酸序列是X2c區(qū)和位于其5’-側(cè)X1c區(qū)。可推測(cè)這2個(gè)區(qū)是鄰近的或隔開存在的。通過兩區(qū)的相對(duì)位置，可由產(chǎn)物核酸自我退火時(shí)，形成的環(huán)部狀態(tài)來決定。優(yōu)選兩區(qū)的距離是互相分離不太遠(yuǎn)以便使核酸產(chǎn)物自我退火優(yōu)先于分子間的退火。因此，兩區(qū)位置關(guān)系優(yōu)選的是鄰近的，距離通常為0到500堿基。然而，在下述自我退火成環(huán)中，有這樣的情況，預(yù)計(jì)的所述兩區(qū)相互太近的狀態(tài)下將不利于環(huán)的形成。在環(huán)中，需要一種新寡核苷酸退火和以所述寡核苷酸為合成的起點(diǎn)順利啟動(dòng)鏈置換的互補(bǔ)鏈反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選的是，X2c區(qū)和位于其5’-側(cè)X1c區(qū)的距離設(shè)計(jì)成0到100個(gè)堿基，更期望是10到70個(gè)堿基。數(shù)值為不包括X1c和X2的長度。構(gòu)成環(huán)部分的堿基數(shù)該長度加上相當(dāng)于X2的區(qū)。
組成基于本發(fā)明所述寡核苷酸的核苷酸序列特征所用術(shù)語“相同的”和”互補(bǔ)的”并不意味著絕對(duì)相同和絕對(duì)互補(bǔ)。也就是，與某序列相同的序列包括與某序列退火的核苷酸序列互補(bǔ)的序列。另一方面，互補(bǔ)序列是嚴(yán)格條件下能退火的序列，提供作為互補(bǔ)鏈合成的起點(diǎn)3’-末端。
通常，對(duì)于具有特異核苷酸序列的核酸，組成本發(fā)明寡核苷酸的X2區(qū)和X1c區(qū)位置鄰近而沒有重疊。如果核苷酸序列中有共同部分，兩區(qū)就會(huì)有部分覆蓋，由于X2起到引物的功能，它總是3’-末端。另一方面，如下所述X1c將引物的作用供給互補(bǔ)鏈3’-末端，該互補(bǔ)鏈由核酸為模板合成，因此應(yīng)被設(shè)計(jì)在5’-末端。以該寡核苷酸為合成的起點(diǎn)得到互補(bǔ)鏈，在下一步中以該互補(bǔ)鏈為模板合成反向互補(bǔ)鏈。并且最終本發(fā)明寡核苷酸部分為模板被拷貝進(jìn)互補(bǔ)鏈。拷貝生成的3’-末端有核苷酸序列X1，該序列在同一鏈中與X1c退火成環(huán)。
本發(fā)明中，寡核苷酸是滿足兩個(gè)要求的核苷酸，即必須能形成互補(bǔ)堿基配對(duì)，并且在3’-末端供給-OH基為互補(bǔ)鏈合成的起點(diǎn)。因此，其主鏈并不必限于磷酸二酯鍵一種連接。例如，它可由硫代磷酸衍生物組成主鏈或者是基于肽連接的肽核酸，所述硫代磷酸衍生物為S取代P。堿基是指那些可互補(bǔ)配對(duì)的堿基。天然存在五種堿基，即A，C，T，G和U，堿基也可為類似物例如溴脫氧尿苷。優(yōu)選的是，本發(fā)明寡核苷酸不僅可用做合成的起點(diǎn)還可為互補(bǔ)鏈合成的模板。本發(fā)明術(shù)語多核苷酸包括寡核苷酸。本發(fā)明所用術(shù)語“多核苷酸”的鏈長沒有被限制，而所用術(shù)語“寡核苷酸”指的是有相對(duì)短的鏈長的核苷酸聚合物。
下述各種核酸合成反應(yīng)中在給定的條件下，本發(fā)明寡核苷酸鏈有能與互補(bǔ)鏈堿基配對(duì)并保持一定的特異性這樣一種長度。具體地，它由5-200個(gè)堿基組成，更優(yōu)選10-50個(gè)堿基對(duì)。識(shí)別已知聚合酶的鏈長至少為5個(gè)堿基。該聚合酶催化依靠序列的核酸合成反應(yīng)。所以退火部分的鏈長應(yīng)長于該長度。另外，統(tǒng)計(jì)學(xué)上所期望10個(gè)堿基的長度或更長以獲得所期望核苷酸特異性。另一方面，由于化學(xué)合成制備太長核苷酸序列比較困難。因此上述鏈長是所期望范圍的實(shí)例。例證的鏈長指的是部分與互補(bǔ)鏈退火的鏈長。正如下面所描述的，本發(fā)明寡核苷酸可最終至少分別與兩區(qū)退火。因此，這里例證的鏈長應(yīng)理解為組成寡核苷酸的每個(gè)區(qū)的鏈長。
此外，本發(fā)明的寡核苷酸可用已知的標(biāo)記物標(biāo)記。標(biāo)記物包括結(jié)合配體例如地高辛和生物素，酶，熒光物，發(fā)光物，放射性同位素。眾所周知通過熒光類似物替換組成寡核苷酸的堿基的技術(shù)(WO95/05391，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，6644-6648，1994)。
本發(fā)明其它寡核苷酸還可被結(jié)合到固相?；蛘?，寡核苷酸的任意部分可用結(jié)合配體標(biāo)記，例如生物素，間接地由結(jié)合配體例如固定抗生物素蛋白所固定。固定寡核苷酸為合成的起點(diǎn)時(shí)，合成反應(yīng)產(chǎn)物核酸為固相所捕獲，有利于其分離。通過核酸特異性指示物或與標(biāo)記探針的雜交可對(duì)分離部分進(jìn)行檢測(cè)。靶核酸片段由任意限制酶消化產(chǎn)物還可得以回收。
本發(fā)明所用術(shù)語“模板”是指用于合成互補(bǔ)鏈時(shí)作為模板的核酸。具有核苷酸序列與模板互補(bǔ)的互補(bǔ)鏈意思是指對(duì)應(yīng)于模板的鏈。但是二者的關(guān)系只是相對(duì)的。即合成的互補(bǔ)鏈可以再次起到模板的功能。也就是，互補(bǔ)鏈可作為模板。
本發(fā)明有用的寡核苷酸并不限于上述2區(qū)，可包含額外區(qū)。將X2和X1c分別設(shè)計(jì)到3’-和5’-末端，任意序列可在其間插入。例如它可是限制酶的識(shí)別序列，RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子，或編碼核酶的DNA。通過利用其作為限制酶的識(shí)別序列，本發(fā)明合成的具有互補(bǔ)的序列交替地連接到單鏈里的核酸可被斷裂成同樣長度的雙鏈核苷酸。將啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)成RNA聚合酶能識(shí)別的，本發(fā)明的合成產(chǎn)物作為模板以允許進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄成RNA。還可通過設(shè)計(jì)編碼核酶的DNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物自斷裂的系統(tǒng)就可實(shí)現(xiàn)。這些額外核苷酸序列是那些在形成雙鏈后發(fā)揮作用的序列。因此，在本發(fā)明單鏈核苷酸成環(huán)時(shí)，這些序列不起作用，直至核酸被延伸并在缺環(huán)情況下退火成具有互補(bǔ)核苷酸序列的鏈時(shí)才發(fā)揮作用。
當(dāng)啟動(dòng)子與基于本發(fā)明的寡核苷酸以允許合成區(qū)轉(zhuǎn)錄的方向進(jìn)行結(jié)合時(shí)，本發(fā)明在相同核苷酸序列被重復(fù)的部位的反應(yīng)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。通過將該系統(tǒng)與合適的表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合，就可翻譯蛋白。即利用該系統(tǒng)在細(xì)菌或動(dòng)物細(xì)胞或在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白。
可化學(xué)合成本發(fā)明具有上述結(jié)構(gòu)的寡核苷酸?；蛘?，天然核酸由例如限制酶斷裂可以改變上述的堿基序列的組成或它們的連接方式。
本發(fā)明實(shí)施合成反應(yīng)的基本原理參考圖5-圖6，該反應(yīng)通過利用上述有用的寡核苷酸與DNA聚合酶結(jié)合得以實(shí)施，在核酸合成反應(yīng)中該DNA聚合酶有鏈置換反應(yīng)的活性。首先X2(相應(yīng)于F2)作為模板，上述寡核苷酸(圖5中的FA)與模板核酸退火，以提供互補(bǔ)鏈合成的起點(diǎn)。圖5中由FA合成起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈被由外引物(F3)合成的互補(bǔ)鏈(下述)所替換而形成單鏈(圖5-A)。在進(jìn)一步合成互補(bǔ)鏈時(shí)，該互補(bǔ)鏈與正生成的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)，圖5-A合成的互補(bǔ)鏈核酸3’-末端有與本發(fā)明寡核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。即由于本發(fā)明寡核苷酸5’-末端有與X1c區(qū)(相應(yīng)于F1c)相同的序列。如此合成的核酸3’-末端有互補(bǔ)序列X1(F1)。圖5顯示從R1為合成起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈被由外引物R3為合成起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈所替換。一旦3’-末端部分通過該替換使其可堿基配對(duì)，在同一鏈上的3’-末端X1(F1)與X1c(F1c)退火，進(jìn)行以自身為模板的延伸反應(yīng)(圖5-B)。然后，位于其3’-末端的X2c(F2c)形成環(huán)，該環(huán)不涉及堿基配對(duì)。本發(fā)明寡核苷酸中X2(F2)退火成該環(huán)，以所述寡核苷酸為合成起點(diǎn)合成互補(bǔ)鏈(圖5-B)。以先合成的產(chǎn)物為模板的合成反應(yīng)的產(chǎn)物，通過鏈置換反應(yīng)被替換使其堿基配對(duì)。
本發(fā)明通過用一種基本組成為可進(jìn)行核酸合成的任意反向引物，其中所述核酸是以該寡核苷酸為引物合成的互補(bǔ)鏈用作模板。大多數(shù)核酸合成產(chǎn)物如圖6中所示的可被得到。從圖6中可看出，(D)是本發(fā)明所期望的核酸產(chǎn)物，具有互補(bǔ)的核苷酸序列交替地連接在單鏈里。通過處理例如熱變性一旦轉(zhuǎn)變成單鏈，其它產(chǎn)物(E)再次作為形成(D)的模板。如果雙鏈產(chǎn)物(D)核酸通過熱變性被轉(zhuǎn)換成單鏈，同一鏈內(nèi)發(fā)生退火高幾率而不能形成最初的雙鏈。這是因?yàn)榫哂邢嗤怄湝囟?Tm)的互補(bǔ)鏈的分子內(nèi)反應(yīng)優(yōu)先于分子間反應(yīng)進(jìn)行。從同一鏈中退火產(chǎn)物(D)衍生的每一條單鏈在同一鏈中被退火，并且返回到(B)狀態(tài)。每條鏈進(jìn)一步分別供給一個(gè)(D)分子和(E)分子。通過重復(fù)這些步驟，有可能連續(xù)合成具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸。在1循環(huán)中形成的模板和產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，因此使反應(yīng)非常有效。
為實(shí)現(xiàn)圖5(A)狀態(tài)，最初合成的互補(bǔ)鏈，至少在反向引物退火的部分，可堿基配對(duì)。該步可通過任意方法得以完成。針對(duì)最初的模板，尤其準(zhǔn)備了一個(gè)外引物，該外引物比由本發(fā)明寡核苷酸退火的F2c區(qū)在模板上更與3’-側(cè)的F3c區(qū)退火。如果通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成，將該外引物用作合成的起點(diǎn)以合成互補(bǔ)鏈，本發(fā)明從F2c為合成起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈被替換，結(jié)果通過R1與R1c區(qū)退火使其堿基配對(duì)(圖5)。通過利用鏈置換反應(yīng)，直到現(xiàn)在在等溫條件下該反應(yīng)可得以進(jìn)行。
在使用外引物時(shí)，在從F2c合成之后開始進(jìn)行從外引物(F3)的合成。在最簡單的方法中，使內(nèi)引物濃度高于外引物的濃度。特定地，所用引物通常在2倍到50倍，優(yōu)選4倍到10倍的濃度，因此反應(yīng)可按所期望的進(jìn)行。此外，設(shè)置外引物解鏈溫度(Tm)低于內(nèi)引物中X1的Tm(相當(dāng)于F1和R1)，因此可以控制合成的時(shí)間。也就是，(外引物F3F3c)≤F2c/F2)≤(F1c/F1)或(外引物/在模板3’-側(cè)的區(qū))≤(X2cX2)≤(X1cX1)。這里，(F2c/F2)≤(F1c/F1)是因?yàn)镕1c/F1間退火優(yōu)先與F2退火成環(huán)，F(xiàn)1c/F1間退火是分子內(nèi)的反應(yīng)，并可因此高幾率優(yōu)先進(jìn)行。然而，為了給出更多的反應(yīng)條件而考慮到Tm是有意義的。甚至在設(shè)計(jì)反向引物中，相似的反應(yīng)條件理所當(dāng)然的應(yīng)考慮到。通過利用這種關(guān)系，可獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上理想反應(yīng)的條件。如果其它條件不變，通過結(jié)合退火的互補(bǔ)鏈的長度和組成堿基配對(duì)的堿基，理論上解鏈溫度(Tm)可以被計(jì)算出來。因此，那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)公開的本說明書能導(dǎo)出更好的條件。
此外，稱為鄰近堆積的現(xiàn)象控制外引物退火時(shí)間的選擇。鄰近堆積使不能獨(dú)立退火的寡核苷酸在鄰近雙鏈部分上能退火的現(xiàn)象(ChiaraBorghesi-Nicoletti et al.，Bio Techniques，12，474-477(1992))。即外引物設(shè)計(jì)成鄰近F2c(X2c)并且不能獨(dú)立地退火。通過這樣做，直到F2c(X2c)退火時(shí)，最初的外引物才能退火，因此F2c(X2c)的退火優(yōu)先進(jìn)行，根據(jù)這一原則，實(shí)例顯示作為一系列反應(yīng)引物的必需寡核苷酸的核苷酸序列所設(shè)置。該步驟在通過加熱變性或用DNA解旋酶也可得以實(shí)現(xiàn)。
如果具有F2c(X2c)的模板核酸為RNA，圖5-(A)狀態(tài)也可通過不同的方法實(shí)現(xiàn)。例如，如果該RNA鏈被分解，使R1可堿基配對(duì)。也就是使F2與RNA中F2c退火并且通過反轉(zhuǎn)錄酶合成的互補(bǔ)鏈為DNA。通過堿變性或用核糖核酸酶處理作用于DNA/RNA雙鏈中的RNA，作為模板的RNA被分解，其中從F2合成的DNA形成單鏈。由于酶選擇性分解雙鏈DNA/RNA中的RNA，RNase H的某些反轉(zhuǎn)錄酶或核糖核酸酶活性得以應(yīng)用。這種方式中，使反向引物與能堿基配對(duì)的R1c退火。因此，不必需要導(dǎo)致R1c處于堿基配對(duì)的外引物。
或者，反轉(zhuǎn)錄酶鏈置換活性可被用在通過如上述外引物的鏈置換，這種情況中，反應(yīng)系統(tǒng)可僅通過反轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)成，即用RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶在模板中F2與F2c的退火有可能合成互補(bǔ)鏈和從退火為F3c外引物F3為合成起點(diǎn)合成互補(bǔ)鏈以及同時(shí)替換先前合成的互補(bǔ)鏈，外引物F3位于F2c的3’-側(cè)。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶以DNA為模板進(jìn)行合成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)時(shí)，所有通過反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行合成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)包括以與R1c退火的R1作為合成起點(diǎn)的互補(bǔ)鏈的合成，該互補(bǔ)鏈在鏈置換反應(yīng)中作為模板；以與R3c退火的R3作為合成起點(diǎn)的互補(bǔ)鏈的合成及同時(shí)的鏈置換發(fā)應(yīng)，R3位于R3c的3’-側(cè)。在所給反應(yīng)條件下不能預(yù)計(jì)反轉(zhuǎn)錄酶顯示DNA/RNA鏈置換活性時(shí)，可以結(jié)合具有如上述鏈置換活性的DNA聚合酶。如上述以RNA為模板獲得第一條單鏈核酸的模式為本發(fā)明的優(yōu)選模式。另一方面，如果使用既具有鏈置換活性又有反轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶諸如Bca DNA聚合酶，通過相同的酶不但從RNA的第一條單鏈核酸的合成，而且接下去以DNA為模板的反應(yīng)可得以類似地進(jìn)行。
通過利用有特定結(jié)構(gòu)的反向引物，本發(fā)明上述反應(yīng)方式導(dǎo)致各種內(nèi)在的變化。最有效的變化在下面描述。也就是，組成[5]中所描述的寡核苷酸在本發(fā)明最有利的模型中用作反向引物。[5]中的寡核苷酸是其中以F2為引物合成的互補(bǔ)鏈中的任意區(qū)R2c和R1c分別為X2c和X1c的一種寡核苷酸。通過使用這樣反向引物，有意義鏈和反義鏈中發(fā)生一系列反應(yīng)(向前的和反向的)，所述一系列反應(yīng)是指成環(huán)反應(yīng)和從該環(huán)合成和替換互補(bǔ)鏈的反應(yīng)。結(jié)果本發(fā)明中有效合成核酸的反應(yīng)得到大大改善，該核酸具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈上，而等溫條件下一系列這樣的反應(yīng)是可以進(jìn)行的。在下文中，作為參考更具體地描述了

圖1到3所概述的該模型。
下面模型中，基于本發(fā)明的2種寡核苷酸得以制備。為了說明，將其命名為FA和RA.組成FA和RA的區(qū)如下所述X2 X1cFA F2 F1cRA R2 R1c這里，F(xiàn)2是模板核酸中F2c區(qū)的互補(bǔ)核苷酸序列。R2與任意區(qū)R2c互補(bǔ)的核苷酸序列，R2c包含在以F2為引物合成的互補(bǔ)鏈中。F1c和R1c分別是位于F2c和R2c下游的任意核苷酸序列。F2和R2間的距離可是任意的。即使其長度約1kbp，合適的條件下，充分合成是可行的，盡管取決于用于實(shí)施合成互補(bǔ)鏈的DNA聚合酶的合成能力，特定地，當(dāng)用到Bst DNA聚合酶時(shí)，如果F2和R2c的距離為800bp，優(yōu)選500bp或更小，就一定能合成所需的產(chǎn)物。涉及溫度循環(huán)的PCR中，通過重點(diǎn)改變溫度使酶活性得到降低被認(rèn)為是降低了長核苷酸序列合成效率。在本發(fā)明優(yōu)選的模式中，擴(kuò)增核酸步驟中不需要溫度循環(huán)，因此甚至長核苷酸序列的合成和擴(kuò)增可確信能實(shí)現(xiàn)。
首先，針對(duì)模板核酸使FA中F2退火，并用作互補(bǔ)鏈合成的起點(diǎn)。接下去直到圖1(4)的反應(yīng)步驟與本發(fā)明先前所述的基本模型(圖5)相同。圖1(2)中退火序列為F3，就是上述的外部引物。用以該引物為合成起點(diǎn)進(jìn)行鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的DNA聚合酶從FA合成的互補(bǔ)鏈被置換并且處于堿基配對(duì)。
當(dāng)(4)中R2c處于堿基配對(duì)時(shí)，在R2c/R2的結(jié)合里反向引物RA于此退火。以該位置為合成起點(diǎn)進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成直到該鏈延伸到在FA 5’-末端的F1c。在該合成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)之后，用于替換的外引物R3在此退火合成互補(bǔ)鏈，在此期間鏈置換也在進(jìn)行，使從RA為合成起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈作被替換。由此替換的互補(bǔ)鏈中，RA位于其5’-端，與FA互補(bǔ)的序列位于其3’-端。
因此在被替換的單鏈核酸3’-側(cè)，同一鏈上存在有與F1c互補(bǔ)的F1序列。F1迅速與同一分子內(nèi)排列的F1c退火以啟動(dòng)互補(bǔ)鏈的合成。當(dāng)在同一鏈中3’-末端(F1)與F1c退火時(shí)，形成含F(xiàn)2c的環(huán)。正如圖2-(7)明確顯示的，該環(huán)部分可堿基配對(duì)。本發(fā)明的寡核苷酸FA與該環(huán)部分退火，并作為互補(bǔ)鏈(7)的合成起點(diǎn)，所述寡核苷酸具有與F2c互補(bǔ)的序列。當(dāng)在先前從F1啟動(dòng)的互補(bǔ)鏈合成中的反應(yīng)產(chǎn)物被替換時(shí)，從環(huán)進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。結(jié)果自身為模板合成的互補(bǔ)鏈在3’-末端再次可堿基配對(duì)。該3’-末端被提供同一鏈中能退火到R1c的R1區(qū)，并且由于分子內(nèi)的反應(yīng)迅速，所述兩鏈被優(yōu)先退火。與上述反應(yīng)相同的從以FA為模板合成的3’-末端開始的反應(yīng)也在該區(qū)得以進(jìn)行。結(jié)果，通過連續(xù)的合成互補(bǔ)鏈及接下去的置換，本發(fā)明具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接到相同單鏈的核酸，從3’-末端R1為起始點(diǎn)得以繼續(xù)延伸。由于R2c總是被包含在通過3’-末端R1的分子內(nèi)退火形成的環(huán)中，在接下去的反應(yīng)中提供R2的寡核苷酸(RA)在3’-末端退火成環(huán)。
當(dāng)注意力集中在從寡核苷酸開始被合成為互補(bǔ)鏈核酸時(shí)，該核酸以自身為模板得以延伸，所述寡核苷酸在單鏈核酸中退火成環(huán)，本發(fā)明具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸的合成也在進(jìn)行。即當(dāng)自環(huán)的互補(bǔ)鏈的合成到圖2-(7)中RA時(shí)，合成得以完成。然后，當(dāng)通過該核酸替換的核酸的合成啟動(dòng)互補(bǔ)鏈(圖3-(8))合成時(shí)，反應(yīng)到達(dá)曾作為合成起點(diǎn)的環(huán)，并且替換重新開始。這種方式中，從環(huán)開始被合成的核酸也被替換。結(jié)果得到同一鏈中能退火的3’-末端R1(圖3-(10))。該3’-末端R1在同一鏈中與R1c退火以啟動(dòng)互補(bǔ)鏈的合成。除了用F替代R外該反應(yīng)與圖2-(7)中的相同。因此，圖3-(10)所示結(jié)構(gòu)有起到新核酸的作用得以繼續(xù)自我延伸并形成新的核酸。
與上述反應(yīng)相反，從圖3-(10)所示的核酸啟動(dòng)合成核酸的反應(yīng)，導(dǎo)致從合成起點(diǎn)3’-末端F1開始延伸，也就是說，本發(fā)明中一個(gè)核酸被延伸，繼續(xù)提供能啟動(dòng)延伸的新核酸的反應(yīng)分別進(jìn)行，而且，隨著鏈的延伸，不僅在末端而且在同一鏈上產(chǎn)生許多成環(huán)序列，當(dāng)這些成環(huán)序列經(jīng)鏈置換反應(yīng)可堿基配對(duì)時(shí)，寡核苷酸退火充當(dāng)形成新核酸的反應(yīng)的起點(diǎn)。通過不但在末端而且在鏈內(nèi)開始的合成反應(yīng)，獲得進(jìn)一步有效的擴(kuò)增。基于本發(fā)明的寡核苷酸RA被結(jié)合為如上所述的反向引物，其中延伸和隨后新核酸的形成得以進(jìn)行。而且，本發(fā)明中該新形成的核酸本身得到了延伸，也導(dǎo)致了后面新核酸的形成，一系列這樣的反應(yīng)，理論上可永久地獲得非常有效的核酸擴(kuò)增。另外，本發(fā)明的反應(yīng)可在等溫條件下進(jìn)行。
因此，積累的反應(yīng)產(chǎn)物具有一種結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在F1和R1間具有核苷酸序列，并且其互補(bǔ)鏈交替地連接，然而，重復(fù)單元兩末端均有由連續(xù)核苷酸序列F2-F1(F2c-F1c)或R2-R1(R2c-R1c)組成的區(qū)，例如，圖3-(9)中，序列(R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c)自5’-側(cè)按照這樣的順序連接。這是因?yàn)榛诒景l(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)以這樣一種原理進(jìn)行，即反應(yīng)以寡核苷酸作為合成起點(diǎn)從F2(或R2)開始，接著，互補(bǔ)鏈通過以自身3’-末端作為合成起點(diǎn)從F1(或R1)合成的反應(yīng)得以延伸。
這里，在最優(yōu)選的模型中，本發(fā)明寡核苷酸FA和RA為退火成環(huán)部分的寡核苷酸。然而即使不使用這些具有限制結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)可通過利用能啟動(dòng)自環(huán)開始的互補(bǔ)鏈合成的寡核苷酸而得以實(shí)現(xiàn)，也就是，正在延伸的3’-末端，一旦被自從環(huán)開始合成的互補(bǔ)鏈所替換，就又一次供給環(huán)部分。因?yàn)閺沫h(huán)開始的互補(bǔ)鏈合成中總是以具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接到單鏈里核酸作為模板。很明顯，可以合成本發(fā)明所需核酸。然而，如此合成的核酸通過置換后形成環(huán)進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。但是沒有可用于接下去形成環(huán)的3’-末端，因此不能作為新模板使用。所以不象通過FA或RA啟動(dòng)合成的核酸，這種情況中的產(chǎn)物，不能得到所希望的指數(shù)式擴(kuò)增。由于這種原因，具有FA或RA結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可用于高效地合成本發(fā)明的核酸。
一系列這樣的反應(yīng)通過下面的描述得以進(jìn)行，向模板單鏈核酸添加下面的成分，并接著在組成FA和RA的核苷酸序列與其互補(bǔ)核苷酸序列能形成穩(wěn)定堿基配對(duì)而酶的活性能得以保持的這樣一種溫度下培養(yǎng)混合物。
·4種寡核苷酸FA，RA，外引物F3，和外引物R3，·用于進(jìn)行置換型互補(bǔ)鏈合成的DNA聚合酶，·用作DNA聚合酶底物的寡核苷酸。
因此，無需設(shè)定PCR之類的溫度周期。穩(wěn)定的堿基配對(duì)這里指的是反應(yīng)系統(tǒng)中至少一部分寡核苷酸可提供互補(bǔ)鏈合成起點(diǎn)的狀態(tài)。例如，能導(dǎo)致穩(wěn)定堿基配對(duì)所需條件將溫度設(shè)置為低于解鏈溫度(Tm)。一般而言，解鏈溫度(Tm)是具有互補(bǔ)核苷酸序列的核酸有50％堿基配對(duì)。本發(fā)明中將溫度設(shè)定為解鏈溫度(Tm)或低于解鏈溫度不是最重要的條件，但被認(rèn)為是達(dá)到高效合成的一個(gè)反應(yīng)條件。如果所用模板核酸是雙鏈，所述核酸至少在寡核苷酸退火區(qū)的應(yīng)可堿基配對(duì)。由于這個(gè)原因，一般進(jìn)行熱變性，并且在反應(yīng)開始前作為預(yù)處理僅進(jìn)行一次。
該反應(yīng)在下面成分存在下進(jìn)行，能使酶反應(yīng)處于合適pH值的緩沖液，退火或維持酶催化活性的必需鹽，保護(hù)酶的介質(zhì)以及調(diào)控解鏈溫度(Tm)所必須的調(diào)控物。對(duì)于緩沖液，例如所用的在中性或弱堿性范圍有緩沖作用的Tris-HCl。根據(jù)所用的DNA聚合酶調(diào)節(jié)pH值，對(duì)于鹽，KCl，NaCl，(NH4)2SO4等適量加入以保持酶的活性并調(diào)控核酸的解鏈溫度(Tm)，保護(hù)酶的介質(zhì)使用牛血清白蛋白或糖類。此外，一般用二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺作為解鏈溫度(Tm)的調(diào)控物。通過利用解鏈溫度(Tm)的調(diào)控物在限定的溫度條件下寡核苷酸的退火得到了調(diào)控。而且，甜菜堿(N，N，N-三甲基甘氨酸)或四烷基銨鹽(tetraalkyl)通過其等穩(wěn)定作用(isostabilization)對(duì)于改善鏈置換的效率也是有效的。通過向反應(yīng)溶液中加入0.2-3.0M甜菜堿，優(yōu)選0.5-1.5M，可得到所希望的本發(fā)明對(duì)核酸擴(kuò)增的促進(jìn)作用。因?yàn)檫@些解鏈溫度的調(diào)控物有降低解鏈溫度的作用，那些合適的嚴(yán)謹(jǐn)性和反應(yīng)性條件要結(jié)合鹽的濃度，反應(yīng)溫度等憑經(jīng)驗(yàn)而定。
本發(fā)明重要的特征是除非許多區(qū)的位置關(guān)系得以保持，否則一系列反應(yīng)不能進(jìn)行。由于這個(gè)特征，伴隨互補(bǔ)鏈非特異合成的非特異合成反應(yīng)得到了有效阻止。也就是即使發(fā)生某非特異反應(yīng)，在合成接下去的擴(kuò)增步驟中產(chǎn)物作為起始物質(zhì)的可能性也得到了降低，而且，通過許多區(qū)調(diào)控反應(yīng)的進(jìn)展，有可能導(dǎo)致在類似的核苷酸序列中能精確的鑒定出所需產(chǎn)物的檢測(cè)系統(tǒng)可被隨意地組成。
利用所述特征檢測(cè)基因突變。本發(fā)明使用外引物模式中，所用4個(gè)引物，即2個(gè)外引物和本發(fā)明寡核苷酸組成的2引物。若所述6區(qū)包含在4個(gè)寡核苷酸中不起作用的話，則本發(fā)明的合成反應(yīng)不能進(jìn)行。具體地，作為互補(bǔ)鏈合成起點(diǎn)的每個(gè)寡核苷酸3’-末端的序列和以所述互補(bǔ)鏈為合成起點(diǎn)的序列X1c區(qū)5’-末端的序列是重要的序列。因此設(shè)計(jì)這些重要的序列使相對(duì)應(yīng)的突變能被檢測(cè)，本發(fā)明合成反應(yīng)的產(chǎn)物能得以觀察，存在或不存在諸如堿基缺失或插入的突變、或諸如SNPs的遺傳多態(tài)性可得到廣泛的分析。更具體地，設(shè)計(jì)估計(jì)有突變或多態(tài)性的堿基使其與作為互補(bǔ)鏈合成起點(diǎn)的寡核苷酸3’-末端附近的或在互補(bǔ)鏈作為合成起點(diǎn)的5’-末端的堿基相當(dāng)，如果在互補(bǔ)鏈合成起點(diǎn)的3’-末端或其附近存在誤配，互補(bǔ)鏈合成核酸的反應(yīng)受到明顯地抑制。本發(fā)明中除非初始反應(yīng)中產(chǎn)物末端的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致重復(fù)反應(yīng)，否則不會(huì)得到高度擴(kuò)增的反應(yīng)。因此，甚至在發(fā)生錯(cuò)誤合成時(shí)，構(gòu)成擴(kuò)增反應(yīng)的互補(bǔ)鏈的合成在某步驟中總是被中斷，因此，在誤配的情況下不會(huì)存在高度擴(kuò)增的反應(yīng)。結(jié)果是誤配有效地抑制了擴(kuò)增反應(yīng)，最終導(dǎo)致產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果。也就是可以說基于本發(fā)明的核酸的擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)核苷酸序列的檢查有一高度完整的機(jī)制。這些特征是在諸如擴(kuò)增反應(yīng)僅在2個(gè)區(qū)進(jìn)行的PCR方法中很難預(yù)料到的優(yōu)點(diǎn)。
合成互補(bǔ)序列后，顯示本發(fā)明所用寡核苷酸特征的X1c區(qū)可作為合成的起點(diǎn)，并且該互補(bǔ)序列與新合成的同一鏈中X1序列退火，其中的合成反應(yīng)以自身為模板進(jìn)行的。因此，即使形成在前沿領(lǐng)域研究中常常成為問題的所謂的引物二聚物，該寡核苷酸不能成環(huán)。因此，歸因于引物二聚物形成的非特異性擴(kuò)增，在理論上是不能發(fā)生的。由此，所述寡核苷酸有助于改善該反應(yīng)的特異性。
此外，本發(fā)明所示外引物F3(圖1-(2))或R3(圖2-(5))被結(jié)合并由此使上述一系列反應(yīng)在等溫條件下得以進(jìn)行。也就是，本發(fā)明提供一種擴(kuò)增具有互補(bǔ)序列交替地連接在單鏈里的核酸的方法。其中包含在上述9中所示的步驟。該方法中，在F2c/F2間，R2c/R2間，F(xiàn)1c/F1間及R1c/R1間選擇能發(fā)生穩(wěn)定退火的溫度條件，通過在F2c/F2和R2c/R2的退火而分別地促進(jìn)鄰近堆積(contiguous stacking)現(xiàn)象優(yōu)選的是確定在F3c/F3和R3c/R3間退火。
本發(fā)明用到術(shù)語核酸“合成”和“擴(kuò)增”。本發(fā)明核酸的合成指的是從作為合成起點(diǎn)的寡核苷酸開始的核酸延伸。如果不但所述合成而且其它核酸的形成以及所形成核酸的反應(yīng)的延伸能夠連續(xù)進(jìn)行，一系列這樣的反應(yīng)廣義上稱為擴(kuò)增。
所產(chǎn)生的單鏈核酸在3’-末端有能與同一鏈中F1c部分退火的F1區(qū)，進(jìn)行同一鏈中F1區(qū)與F1c的退火，能形成含有可堿基配對(duì)的F2c區(qū)的環(huán)，是本發(fā)明重要的成分。這樣的單鏈核酸還可以下述原理的方式供給。也就是，互補(bǔ)鏈的合成根據(jù)具有下述結(jié)構(gòu)的引物才容許進(jìn)行。5’-[與引物中X1c區(qū)退火的X1區(qū)]-[能形成堿基配對(duì)序列環(huán)]-[X1c區(qū)]-[具有與模板互補(bǔ)的序列區(qū)]-3’。
制備具有與模板互補(bǔ)的序列區(qū)，兩個(gè)核苷酸序列，即一個(gè)核苷酸序列(引物FA)與F1互補(bǔ)并且一個(gè)核苷酸序列(引物RA)與R1c互補(bǔ)。組成要合成核酸的核苷酸序列組成包含從F1區(qū)延伸到R1c區(qū)的核苷酸序列和從具有與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的R1區(qū)延伸到F1c區(qū)的核苷酸序列。能在引物內(nèi)退火的X1c和X1可為任意的序列。然而，在引物FA和RA間的區(qū)內(nèi)，優(yōu)選的是使該X1c/X1區(qū)的序列不同。
首先，通過引物FA從模板核酸F1區(qū)進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成，接著在已合成的互補(bǔ)鏈中R1c區(qū)可堿基配對(duì)，使其它引物退火形成互補(bǔ)鏈的合成起點(diǎn)，該步驟中合成的互補(bǔ)鏈3’-末端有與組成起始合成鏈5’-末端的引物FA互補(bǔ)的序列。因此在其3’-末端被提供X1區(qū)，其中X1區(qū)在同一鏈中與X1c區(qū)退火成環(huán)。由此提供本發(fā)明特征性3’-末端的結(jié)構(gòu)，接下去的反應(yīng)組成先前顯示為最優(yōu)選模式的系統(tǒng)。退火成環(huán)部分的寡核苷酸在3’-末端被提供X2區(qū)，在5’-末端被提供X1區(qū)，X2區(qū)與環(huán)中X2c區(qū)互補(bǔ)。在先前的反應(yīng)系統(tǒng)中，用引物FA和RA合成與模板核酸互補(bǔ)的鏈，將環(huán)結(jié)構(gòu)供給核酸的3’-末端。該方法中，通過很短的引物就可有效地提供本發(fā)明特征性末端結(jié)構(gòu)。另一方面，所述模型中，組成環(huán)的全部核苷酸序列可作為引物被提供，并且必須合成長引物。
如果包含限制酶識(shí)別區(qū)的核苷酸序列可用作反向引物，則可構(gòu)建本發(fā)明不同的模型。利用包含限制酶識(shí)別序列的反向引物的反應(yīng)參考圖6具體描述。當(dāng)圖6-(D)得以完成時(shí)，通過限制酶產(chǎn)生切口相當(dāng)于反向引物中限制酶識(shí)別位點(diǎn)。以該切口為合成起點(diǎn)開始合成鏈置換型互補(bǔ)鏈的反應(yīng)。因?yàn)榉聪蛞镂挥诮M成(D)的雙鏈核酸的兩末端，合成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)也可從兩末端開始，盡管基本上基于先端技術(shù)中所述的SDA方法，本發(fā)明作為模板的核苷酸序列具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接的結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)成本發(fā)明獨(dú)一無二的核酸系統(tǒng)。作為要產(chǎn)生切口的反向引物互補(bǔ)鏈的一部分應(yīng)被設(shè)計(jì)為結(jié)合dNTP衍生物，通過限制酶阻止雙鏈斷裂產(chǎn)生對(duì)核酸酶一種對(duì)抗性。
也可能將RNA聚合酶啟動(dòng)子插入反向引物。圖6-(D)中從兩末端的轉(zhuǎn)錄通過RNA聚合酶識(shí)別該啟動(dòng)子得以進(jìn)行，在該情況中與先前應(yīng)用SDA的模型非常相似。
本發(fā)明合成的核酸是單鏈，就單鏈而言，由互補(bǔ)核苷酸序列構(gòu)成，其大部分均為堿基配對(duì)的。通過利用這個(gè)特征，對(duì)合成的產(chǎn)物可進(jìn)行檢測(cè)。通過實(shí)施本發(fā)明合成核酸的方法，在有熒光色素作為雙鏈特異性嵌入劑(double-specific intercalater)例如溴化乙錠，SYBR Green I或Pico Green，隨著產(chǎn)物的增加可觀察到熒光的強(qiáng)度增加。通過監(jiān)測(cè)它，就可能在封閉系統(tǒng)中跟蹤實(shí)時(shí)(real-time)合成反應(yīng)。也可考慮在PCR方法中應(yīng)用該類型的檢測(cè)系統(tǒng)，但是認(rèn)為有許多問題，因?yàn)椴荒軈^(qū)分產(chǎn)物信號(hào)和引物二聚物的信號(hào)等。然而，當(dāng)本發(fā)明應(yīng)用該系統(tǒng)時(shí)，增加非特異堿基配對(duì)的能力非常低，因此，預(yù)計(jì)高靈敏度和低干擾可能同時(shí)能獲得，與應(yīng)用雙鏈特異性嵌入劑(double-specific intercalater)相似，在同一系統(tǒng)中可利用熒光能量的轉(zhuǎn)移用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的方法。
本發(fā)明合成核酸的方法通過DNA聚合酶催化合成鏈置換型的互補(bǔ)鏈反應(yīng)而得到支持。上述反應(yīng)期間，也包含不必需鏈置換型聚合酶的反應(yīng)步驟。然而，為了組成試劑的簡單化及經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)，使用一種DNA聚合酶有利，該種DNA聚合酶，下列的酶是已知的。此外，本發(fā)明范圍中可利用這些酶的各種突變體，它們都具有用于互補(bǔ)鏈合成的序列-依賴活性和鏈置換活性。其中突變體指的是包括那些僅具有導(dǎo)致酶所需的催化活性的結(jié)構(gòu)或那些通過例如氨基酸中突變對(duì)催化活性，穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性所進(jìn)行的修飾的突變體。
Bst DNA聚合酶Bca(exo-)DNA聚合酶DNA聚合酶I克列諾(Klenow)片段Vent DNA聚合酶Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Vent DNA聚合酶)Deep Vent DNA聚合酶Deep Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Deep Vent DNA聚合酶)Φ29 phage DNA聚合酶MS-2 phage DNA聚合酶Z-Taq DNA聚合酶(寶酒造)KOD DNA聚合酶(東洋紡績)這些酶中，Bst DNA聚合酶和Bca(exo-)DNA聚合酶是特別所需的酶，因?yàn)樗鼈兙哂心撤N程度的熱穩(wěn)定性和高催化活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)可等溫的實(shí)現(xiàn)，但由于解鏈溫度的調(diào)節(jié)(Tm)等，不可能總是能利用所需溫度條件來維持酶的穩(wěn)定。因此，它是酶的熱穩(wěn)定所需的條件之一。盡管等溫反應(yīng)是可行的，熱變性可提供核酸作為最初的模板，在這方面，熱穩(wěn)定酶的使用拓寬了試驗(yàn)方案的選擇。
Vent(Exo-)DNA聚合酶是既有鏈置換活性又有高度熱穩(wěn)定性的酶。已知涉及通過DNA聚合酶鏈置換的互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)通過加入單鏈結(jié)合蛋白得到促進(jìn)(Paul M.Lizardi et al.，Nature Genetics，19，225-232，July，1998)。本發(fā)明中應(yīng)用該反應(yīng)，并且通過加入單鏈結(jié)合蛋白，可以預(yù)計(jì)促進(jìn)合成互補(bǔ)鏈的所需效果。例如，T4基因32作為Vent(Exo-)DNA聚合酶單鏈結(jié)合蛋白是有效的。
由于DNA聚合酶沒有3’-5’核酸外切酶活性，互補(bǔ)鏈的合成不能在模板5’-末端停止，導(dǎo)致產(chǎn)生一堿基的突出，這是已知的現(xiàn)象。本發(fā)明該現(xiàn)象并不是優(yōu)選的，因?yàn)楫?dāng)互補(bǔ)鏈的合成到達(dá)末端時(shí)，3’-末端導(dǎo)致啟動(dòng)下一互補(bǔ)鏈的合成。然而，通過DNA聚合酶的高幾率添加堿基“A”到3’-末端，選擇序列以使從3’-末端的合成從“A”開始，如果通過dATP添加錯(cuò)誤的額外堿基，也不會(huì)產(chǎn)生問題。此外，在互補(bǔ)鏈合成的期間甚至3’-末端被突出，利用3’→5’核酸外切酶的活性消化突出使其成為鈍末端。例如，因?yàn)閂ent DNA聚合酶有這樣的活性，該酶可與(Exo-)DNA聚合酶混合使用以解決所述的問題。
本發(fā)明合成或擴(kuò)增核酸所必需的各種試劑可被預(yù)先包裝，并以試劑盒的形式提供，具體地，本發(fā)明所提供的試劑盒包含作為合成互補(bǔ)鏈合成的引物和用于置換反應(yīng)的外引物所必需的各種寡核苷酸，用于互補(bǔ)鏈合成的底物dNTP，用于實(shí)現(xiàn)鏈置換型互補(bǔ)鏈合成的DNA聚合酶，為酶反應(yīng)提供合適條件的緩沖液，和用于檢測(cè)合成反應(yīng)產(chǎn)物所必需的介質(zhì)。具體地，本發(fā)明優(yōu)選的模式中，反應(yīng)期間無需加入的試劑，并由此對(duì)于移入反應(yīng)容器后一個(gè)反應(yīng)所必需供給的試劑，其中僅通過加入樣品就可啟動(dòng)該反應(yīng)。通過利用發(fā)光信號(hào)或熒光信號(hào)可在容器內(nèi)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的系統(tǒng)。反應(yīng)后不必打開和關(guān)閉容器。這對(duì)于預(yù)防污染是非?？扇〉?。
本發(fā)明合成具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈內(nèi)的核酸。該核酸具有例如下面的用途第一特征是利用一分子中具有互補(bǔ)序列的特定結(jié)構(gòu)帶來的優(yōu)勢(shì)，該特征預(yù)計(jì)有利于檢測(cè)，即有已知用于檢測(cè)核酸的系統(tǒng)，其中其變化的信號(hào)取決于與互補(bǔ)核苷酸序列堿基配對(duì)。例如，通過結(jié)合使用雙鏈特異性嵌入劑作為如上所述的檢測(cè)試劑的方法，充分利用本發(fā)明合成產(chǎn)物特征的檢測(cè)系統(tǒng)可得以實(shí)現(xiàn)。如果本發(fā)明合成反應(yīng)的產(chǎn)物在所述檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)生一次熱變性，并且返回到原始溫度，分子內(nèi)退火優(yōu)先發(fā)生，并因此容許互補(bǔ)序列之間快速堿基配對(duì)。如果存在非特異性產(chǎn)物，分子中它們沒有互補(bǔ)序列從而使通過熱變性分離成2或更多的分子后，它們不能立刻就返回到原始雙鏈。通過在檢測(cè)前提供的熱變性步驟，伴隨非特異反應(yīng)的干擾得以降低。如果所用的DNA聚合酶不抗熱，熱變性步驟有反應(yīng)終止的意思，并因此有利于控制反應(yīng)溫度。
第二特征是常常形成能堿基配對(duì)的環(huán)。能堿基配對(duì)的環(huán)的結(jié)構(gòu)在圖4中顯示。如圖4中看到的該環(huán)由核苷酸序列F2c(X2c)和插入F2c-F1c(X1c)之間的核苷酸序列構(gòu)成，F(xiàn)2c(X2c)可進(jìn)行引物退火。F2c-F1c間序列(或更普遍的形式X2c-X1c間)是源于模板的核苷酸衍生序列。因此，如果具有互補(bǔ)核苷酸序列的探針與該區(qū)雜交，模板的特異性檢測(cè)是可行的。此外，該區(qū)常?？蓧A基配對(duì)，因此，熱變性不必先于雜交進(jìn)行。組成本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中的環(huán)的核苷酸可能有任意的長度。因此，如果希望與探針雜交，通過引物要被退火的區(qū)和通過探針要被雜交的區(qū)分別設(shè)計(jì)以阻止它們的競(jìng)爭，其中可能得到理想反應(yīng)條件。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的模式，在單鏈核酸中供給大量能堿基配對(duì)的環(huán)。這意味著大量的探針可與一分子核酸雜交以容許高靈敏度的檢測(cè)。因此不僅可能實(shí)現(xiàn)改進(jìn)靈敏度還可能實(shí)現(xiàn)基于特殊反應(yīng)原理例如聚集作用來檢測(cè)核酸的方法。例如，將固定在精細(xì)顆粒例如聚苯乙烯乳膠上的探針加入到本發(fā)明反應(yīng)產(chǎn)物中，觀察乳膠顆粒的聚集作用為產(chǎn)物與探針雜交。聚集作用的強(qiáng)度通過光學(xué)測(cè)定就可進(jìn)行高靈敏度和定量觀察?；蛘哌€可通過裸眼觀察聚集作用，所以還可建立不用光學(xué)的測(cè)定裝置的反應(yīng)系統(tǒng)。
此外，本發(fā)明反應(yīng)產(chǎn)物容許許多要結(jié)合的標(biāo)記，其中每核酸分子能進(jìn)行層析檢測(cè)。在免疫測(cè)定領(lǐng)域里，實(shí)際所應(yīng)用是利用可見的檢測(cè)標(biāo)記使用層析介質(zhì)的分析方法(免疫層析)。該方法基于分析物夾在固定在層析介質(zhì)上的抗體和標(biāo)記抗體間的原理，未反應(yīng)的標(biāo)記成分被洗脫。本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物使該原理應(yīng)用到核酸分析上。也就是，制備針對(duì)環(huán)部分的標(biāo)記探針并固定在層析介質(zhì)上為捕獲準(zhǔn)備捕獲探針，以容許在層析介質(zhì)里進(jìn)行分析。序列與環(huán)部分互補(bǔ)的捕獲探針得以利用，由于本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物具有大量的環(huán)，產(chǎn)物與大量標(biāo)記的探針結(jié)合以給出肉眼可識(shí)別信號(hào)。
本發(fā)明反應(yīng)產(chǎn)物常常能供給堿基配對(duì)的環(huán)區(qū)，能拓寬其它各種檢測(cè)系統(tǒng)。例如，利用表面胞質(zhì)基因組使用固定探針檢測(cè)該環(huán)部分的系統(tǒng)是可行的。此外，如果用雙鏈特異嵌入物標(biāo)記該環(huán)部分的探針，就可進(jìn)行更靈敏的熒光分析?；蚍e極利用本發(fā)明合成核酸的能力在3’-和5’-側(cè)以形成能堿基配對(duì)的環(huán)。例如，設(shè)計(jì)一個(gè)環(huán)使其在正常型和不正常型間有共同的核苷酸序列，而設(shè)計(jì)其它環(huán)使其在其中產(chǎn)生差異。通過探針證實(shí)共同部分存在基因，而在其它區(qū)證實(shí)有不正常存在時(shí)，有可能組成特征分析系統(tǒng)。因?yàn)楸景l(fā)明合成核酸的反應(yīng)也能等溫的進(jìn)行，值得一提的優(yōu)點(diǎn)是，通過一般熒光光度計(jì)可進(jìn)行實(shí)時(shí)(real-time)分析。直到此時(shí)，同一鏈中要退火的核酸的結(jié)構(gòu)是已知的。然而，通過本發(fā)明獲得的具有核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸是新的，因?yàn)樗罅康哪芘c其它堿基配對(duì)的環(huán)。
另一方面，通過本發(fā)明反應(yīng)產(chǎn)物所給的大量的環(huán)自身能被用作探針，例如，在DNA芯片里，探針在有限的區(qū)域內(nèi)高密度堆積，而該技術(shù)中可固定在某區(qū)域寡核苷酸數(shù)量有限，因此通過利用本發(fā)明產(chǎn)物大量能退火的探針可被高密度固定，即本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物在DNA芯片上可用作固定的探針，擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物可通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)得以固定，或用固定的寡核苷酸作為本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)的寡核苷酸，導(dǎo)致生成固定反應(yīng)產(chǎn)物。因此通過使用固定的探針，大量樣品DNA在有限的區(qū)域內(nèi)得以雜交，結(jié)果預(yù)計(jì)可得到高信號(hào)。
附圖簡述圖1是本發(fā)明優(yōu)選的模式中反應(yīng)原理(1)-(4)部分的圖解。
圖2是本發(fā)明優(yōu)選的模式中反應(yīng)原理(5)-(7)部分的圖解。
圖3是本發(fā)明優(yōu)選的模式中反應(yīng)原理(8)-(10)部分的圖解。
圖4是通過本發(fā)明單鏈核酸所形成的環(huán)結(jié)構(gòu)的圖解。
圖5是本發(fā)明基本的模式中(A)-(B)部分的圖解。
圖6是本發(fā)明基本的模式中(C)-(D)部分的圖解。
圖7是顯示M13mp18靶核苷酸序列中組成寡核苷酸的每個(gè)核苷酸序列的位置關(guān)系。
圖8是顯示通過以M13mp18為模板合成本發(fā)明單鏈核酸的方法獲得的產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果的照片。
泳道1XIV分子量標(biāo)記泳道21 fmol M13mp18 dsDNA泳道3沒有靶圖9是顯示限制酶消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，其中所述產(chǎn)物通過本發(fā)明核酸合成反應(yīng)在實(shí)施例1中得到的。
泳道1XIV分子量標(biāo)記泳道2純化產(chǎn)物的BamHI消化泳道3純化產(chǎn)物的PvuII消化泳道4純化產(chǎn)物的HindIII消化圖10是顯示產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，所述產(chǎn)物是在甜菜堿存在下以M13mp18為模板通過本發(fā)明合成單鏈核酸的方法獲得的，0，0.5，1和2是指加入反應(yīng)溶液中的甜菜堿的濃度(M)，N為陰性對(duì)照，-21是指模板DNA的濃度為10-21mol。
圖11是顯示從HVB衍生來的靶核苷酸序列中組成寡核苷酸的每個(gè)核苷酸序列的位置關(guān)系。
圖12是顯示通過本發(fā)明合成單鏈核酸的方法獲得的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，其中結(jié)合在M13mp18中的HBV-M13mp18為模板。
泳道1XIV分子量標(biāo)記泳道21 fmol HBV-M13mp18 dsDNA泳道3沒有靶圖13是顯示通過本發(fā)明合成單鏈核酸的方法獲得的堿變性產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，泳道1來自λ-噬菌體的HindIII-消化片段泳道2實(shí)施例1中的反應(yīng)產(chǎn)物泳道3實(shí)施例3中的反應(yīng)產(chǎn)物圖14是顯示通過本發(fā)明合成單鏈核酸的方法獲得的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片，其中靶M13mp18的濃度是變化的，上面和下面的照片分別顯示反應(yīng)1和3小時(shí)的結(jié)果。
泳道1M13mp18 dsDNA 1×10-15mol/管泳道2M13mp18 dsDNA 1×10-16mol/管泳道3M13mp18 dsDNA 1×10-17mol/管泳道4M13mp18 dsDNA 1×10-18mol/管泳道5M13mp18 dsDNA 1×10-19mol/管泳道6M13mp18 dsDNA 1×10-20mol/管泳道7M13mp18 dsDNA 1×10-21mol/管泳道8M13mp18 dsDNA 1×10-22mol/管泳道9沒有靶泳道10XIV分子量標(biāo)記圖15是顯示突變位置以及每一區(qū)相對(duì)于靶核苷酸序列(靶)的位置關(guān)系，突變中下劃線的鳥嘌呤被腺嘌呤所替換。
圖16是顯示本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片。
M100bp序列梯(New England Biolabs)N沒有模板(純化水)WT1 fmol野生型模板M13mp18
MT1 fmol突變模板M13mp18FM圖17是顯示編碼靶mRNA的核苷酸序列中組成寡核苷酸的每個(gè)核苷酸序列的位置關(guān)系。
圖18是顯示以mRNA為模板通過本發(fā)明合成單鏈核酸的方法獲得的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的照片。
實(shí)施本發(fā)明最好的模式實(shí)施例1 對(duì)M13mp18中的區(qū)域的擴(kuò)增本發(fā)明合成具有互補(bǔ)鏈交替地連接到單鏈里的核酸的方法是利用M13mp18為模板嘗試的，實(shí)驗(yàn)中用到四種引物即M13FA，M13RA，M13F3，和M13R3，M13F3和M13R3是置換分別以M13FA和M13RA為合成起點(diǎn)獲得的第一條核酸的外引物。因?yàn)橐訫13FA(或M13RA)合成后外引物為互補(bǔ)鏈合成起點(diǎn)的引物。通過利用臨近堆積現(xiàn)象將這些設(shè)計(jì)成退火至臨近M13FA(或M13RA)的區(qū)。此外，將這些引物設(shè)置為高濃度使M13FA(或M13RA)的退火優(yōu)先發(fā)生。
組成每個(gè)引物的核苷酸序列如序列表所示，引物的結(jié)構(gòu)特征在下面概括。此外，針對(duì)靶核苷酸序列(靶)每個(gè)區(qū)的位置關(guān)系在圖7中顯示。
引物 5’-側(cè)的區(qū)/3’-側(cè)的區(qū)M13FA與通過M13FA合成的互補(bǔ)鏈中F1c區(qū)相同/與M13mp18中F2c區(qū)互補(bǔ)M13RA與通過M13RA合成的互補(bǔ)鏈中R1c區(qū)相同/與通過M13FA合成的互補(bǔ)鏈中R2c區(qū)互補(bǔ)M13F3與M13mp18中F2c區(qū)3’-側(cè)臨近的F3c互補(bǔ)M13R3通過M13FA合成的互補(bǔ)鏈中F2c區(qū)3’-側(cè)臨近的R3c互補(bǔ)通過所述引物，合成核酸，其中M13mp18中從F1c延伸到R1c的區(qū)，及其互補(bǔ)核苷酸序列是交替地通過含F(xiàn)2c的成環(huán)序列連接在單鏈里。通過這些引物合成本發(fā)明核酸的方法的反應(yīng)溶液的組合在下面所示。
反應(yīng)溶液組合(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO4
6mM MgSO40.1％ Triton X-1005％二甲基亞砜(DMSO)0.4mM dNTP引物800nM M13FA/SEQ ID NO1800nM M13RA/SEQ ID NO2200nM M13F3/SEQ ID NO3200nM M13R3/SEQ ID NO4靶M13mp18 dsDNA/SEQ ID NO5反應(yīng)上述反應(yīng)溶液在95℃加熱5分鐘，該靶變性成單鏈，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到用冰預(yù)冷的水中，加入4U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLANDBiolabs)，混合物于65℃反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)后，于80℃10分鐘終止該反應(yīng)，然后重新轉(zhuǎn)到用冰預(yù)冷的水中。
反應(yīng)的證實(shí)將1μl上樣緩沖液加到5μl上面的反應(yīng)溶液中，樣品于80mV在2％瓊脂糖凝膠(0.5％TBE)上電泳1小時(shí)。用XIV(100bp梯，Boehringer Mannheim)作為分子量標(biāo)記，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色電泳后的凝膠以驗(yàn)證核酸。結(jié)果在圖8中顯示，各泳道分別相對(duì)于下面的樣品。
1.XIV分子量標(biāo)記2.1 fmol M13mp18 dsDNA3.沒有靶泳道3中，除了未反應(yīng)的引物被染色得到證實(shí)外，沒有帶被證實(shí)。泳道2中存在靶，證實(shí)產(chǎn)物為低分子量的梯狀帶，在高分子量處染色為不清晰的成片條帶，并且?guī)Ш茈y在膠中電泳。低分子量帶中，290bp和450bp附近的帶與本發(fā)明合成反應(yīng)中所期望的產(chǎn)物一致，即雙鏈SEQ ID NO11和12(相當(dāng)于圖2-(7)和2-(10)中所示形成的雙鏈)與單鏈SEQ ID NO13(相當(dāng)于圖3-(9)長單鏈)。因此證實(shí)反應(yīng)按照預(yù)計(jì)的進(jìn)行。因?yàn)樵摲磻?yīng)基本上是連續(xù)反應(yīng)以允許變化反應(yīng)產(chǎn)物的分子量，進(jìn)一步因?yàn)樵摦a(chǎn)物具有部分單鏈和雙鏈復(fù)合的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，所以預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致在高分子量處產(chǎn)生不清晰成片條帶模式和未被電泳的帶的結(jié)果。
實(shí)施例2 通過限制酶的消化證實(shí)反應(yīng)產(chǎn)物為了闡清具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈內(nèi)的本發(fā)明實(shí)施例1獲得的核酸結(jié)構(gòu)，用限制酶消化產(chǎn)物。如果通過消化能生成理論上的片段，同時(shí)不存在(disappear)如實(shí)施例1中觀察到的高分子量處產(chǎn)生不清晰成片條帶模式和未被電泳的帶，就可預(yù)計(jì)任何這些產(chǎn)物為本發(fā)明具有互補(bǔ)序列交替地連接在單鏈內(nèi)的核酸。
實(shí)施例1中8管反應(yīng)溶液(200μl)通過用酚處理及乙醇的沉淀作用得以沉積和純化，回收產(chǎn)生的沉淀并重新溶于200μl TE緩沖液中，分別用限制酶BamHI，PvuII，和HindIII于37℃消化10μl等分試樣2小時(shí)，消化物于80mV在2％瓊脂糖凝膠(0.5％TBE)上電泳1小時(shí)。用Super Ladder-Low(100bp梯)(Gensura Laboratories，Inc.)作為分子量標(biāo)記，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色電泳后的凝膠以驗(yàn)證核酸。結(jié)果在圖9中顯示，各泳道分別相對(duì)于下面的樣品。
1XIV分子量標(biāo)記2純化產(chǎn)物的BamHI消化3純化產(chǎn)物的PvuII消化4純化產(chǎn)物的HindIII消化預(yù)計(jì)組成相關(guān)短擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列是那些SEQ ID NO13，14，15和16，從這些核苷酸序列，預(yù)計(jì)用限制酶消化的各片段的大小如表1所示，表中“L”是指由于L是含環(huán)的片段(單鏈)因此沒有確定電泳位置。
表1.本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物限制酶消化后的片段序列編號(hào) BamHI PvuII HindIII13 177+L 56+L 147+L14 15+101+L- 142+L15 171+101+L 56+L 147+161+L16 11+101+230+L237+L 142+170+L總計(jì) 101,177,230 56,237142,147,161,170(11，15；未證實(shí))因?yàn)橄皫缀跛械膸П晦D(zhuǎn)化為所需的帶，這就證實(shí)目標(biāo)反應(yīng)產(chǎn)物得到了擴(kuò)增，此外還顯示沒有或很少有非特異性產(chǎn)物。
實(shí)施例3添加甜菜堿對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的促進(jìn)作用進(jìn)行檢測(cè)添加到反應(yīng)溶液中的甜菜堿(N，N，N-三甲基甘氨酸，Sigma)對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)。與實(shí)施例1相似，在存在各種濃度甜菜堿的情況下，用M13mp18為模板進(jìn)行合成本發(fā)明具有互補(bǔ)鏈交替地連接在單鏈內(nèi)的核酸。該實(shí)驗(yàn)所用的引物與實(shí)施例1中的相同，模板DNA的量為10-21mol(M13mp18)，水作為陰性對(duì)照。向反應(yīng)溶液中添加濃度為0，0.5，1和2M甜菜堿，反應(yīng)溶液的組合如下所示。
反應(yīng)溶液的組成(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.84mM MgSO40.4mM dNTPs10mM KCl10mM(NH4)2SO40.1％Triton X-100引物800nM M13FA/SEQ ID NO1800nM M13RA/SEQ ID NO2200nM M13F3/SEQ ID NO3200nM M13R3/SEQ ID NO4靶M13mp18 dsDNA/SEQ ID NO5聚合酶，反應(yīng)條件，及反應(yīng)后的電泳條件與實(shí)施例1中所述相同。
結(jié)果在圖10中顯示，反應(yīng)中甜菜堿的濃度為0.5或1.0M，擴(kuò)增產(chǎn)物的量得到增加。而且，如果其濃度增加到2.0M，則觀察不到擴(kuò)增。由此所示合適濃度的甜菜堿促進(jìn)擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物量降低的原因估計(jì)為當(dāng)甜菜堿的濃度為2.0M時(shí)，Tm被降的太多。
實(shí)施例4 HBV基因序列的擴(kuò)增嘗試合成本發(fā)明核酸的方法，其中具有HBV基因的部分序列與其結(jié)合的M13mp18用作模板。實(shí)驗(yàn)中所用4種引物HB65FA(SEQ ID NO6)，HB65RA(SEQ ID NO7)，HBF3(SEQ ID NO8)和HBR3(SEQ ID NO9)。HBF3和HBR3是置換分別以HB65FA和HB65RA為合成起點(diǎn)獲得的第一條核酸的外引物。因?yàn)橐訦B65FA(或HB65RA)合成后外引物為互補(bǔ)鏈合成起點(diǎn)的引物。通過利用臨近堆積現(xiàn)象將這些設(shè)計(jì)成退火至臨近HB65FA(或HB65RA)的區(qū)。此外，將這些引物設(shè)置為高濃度使HB65FA(或HB65RA)的退火優(yōu)先發(fā)生。該實(shí)施例中靶序列(430bp)由結(jié)合在M13mp18中HBV衍生而來，在SEQ ID NO10中顯示。
組成每個(gè)引物的核苷酸序列如序列表所示，每個(gè)引物的結(jié)構(gòu)特征在下面概括。此外，針對(duì)靶核苷酸序列(靶)每個(gè)區(qū)的位置關(guān)系在圖11中顯示引物5’-側(cè)的區(qū)/3’-側(cè)的區(qū)HB65FA 與通過HB65FA合成的互補(bǔ)鏈中F1c區(qū)相同/與HBV-M13mp18中F2c區(qū)互補(bǔ)HB65RA 與通過HB65RA合成的互補(bǔ)鏈中R1c區(qū)相同/與通過HB65FA合成的互補(bǔ)鏈中R2c區(qū)互補(bǔ)HBF3與HBV-M13mp18中F2c區(qū)3’-側(cè)臨近的F3c互補(bǔ)HBR3通過HB65FA合成的互補(bǔ)鏈中F2c區(qū)3’-側(cè)臨近的R3c互補(bǔ)通過所述引物，合成核酸，其中具有部分HBV基因與其結(jié)合的M13mp18HBV-M13mp18)中從F1c延伸到R1c的區(qū)，及其互補(bǔ)核苷酸序列是交替地通過插入含F(xiàn)2c的成環(huán)序列交替地連接在單鏈里。除了上述所用引物，該反應(yīng)在與實(shí)施例1中相同的條件下得以進(jìn)行。反應(yīng)溶液通過瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果在圖12中顯示。各泳道分別相對(duì)于下面的樣品。
1.XIV分子量標(biāo)記2.1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA.
3.沒有靶與實(shí)施例1相似，在靶存在的情況下僅證實(shí)產(chǎn)物為低分子量的梯狀帶，在高分子量處染色為不清晰的成片條帶和很難在膠中電泳的帶(泳道2中)低分子量帶中，310bp和480bp附近的帶與本發(fā)明合成反應(yīng)中所期望的產(chǎn)物一致，即雙鏈SEQ ID NO17和18。因此證實(shí)反應(yīng)按照預(yù)計(jì)的進(jìn)行。如實(shí)施例1中所述的結(jié)果，預(yù)計(jì)本發(fā)明合成產(chǎn)物的特征結(jié)構(gòu)導(dǎo)致在高分子量處產(chǎn)生不清晰成片條帶模式和未被電泳的帶。從該實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)甚至在用不同序列(靶)來擴(kuò)增，本發(fā)明能得以利用。
實(shí)施例5證實(shí)合成反應(yīng)產(chǎn)物的大小為了證實(shí)本發(fā)明合成的核酸結(jié)構(gòu)通過堿變性條件下電泳分析其長度，在實(shí)施例1或4中靶存在下向5μl每個(gè)反應(yīng)溶液中加入1μl上樣緩沖液，樣品于50mA在0.7％瓊脂糖凝膠(50mM NaOH，1mM EDTA)上電泳14小時(shí)。用的HindIII-消化的λ-噬菌體片段作為分子量標(biāo)記，電泳后的凝膠用1M Tris，pH8中和并用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色以驗(yàn)證核酸。結(jié)果在圖13中顯示，各泳道分別相對(duì)于下面的樣品。
1來自λ-噬菌體的HindIII-消化片段2實(shí)施例1中的反應(yīng)產(chǎn)物3實(shí)施例4中的反應(yīng)產(chǎn)物當(dāng)堿變性條件下電泳反應(yīng)產(chǎn)物，可以證實(shí)單鏈狀態(tài)中的大小。證實(shí)實(shí)施例1(泳道2)和實(shí)施例4(泳道3)主要產(chǎn)物的大小在2 kbase之內(nèi)，而且，通過該分析顯示出本發(fā)明產(chǎn)物在可分析證實(shí)的范圍內(nèi)已被延伸到至少不小于6kbase的大小。另外，未變性條件下實(shí)施例1和實(shí)施例4中未被電泳的帶在變性狀態(tài)下被分離成單個(gè)更小的單鏈。
實(shí)施例6 對(duì)擴(kuò)增M-13mp13中的區(qū)域的反應(yīng)中依賴于靶濃度的擴(kuò)增的證實(shí)可觀察濃度變化的靶對(duì)合成本發(fā)明核酸的影響。除了作為靶的M13mp18 dsDNA的量為0-1 fmol和反應(yīng)時(shí)間為1或3小時(shí)外在與實(shí)施例1相同的條件下本發(fā)明合成核酸的方法得以實(shí)施。與實(shí)施例1相似，樣品在2％瓊脂糖凝膠(0.5％TBE)上電泳，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色以驗(yàn)證核酸。用XIV(100bp梯，Boehringer Mannheim)作為分子量標(biāo)記，結(jié)果在圖14中(上面反應(yīng)1小時(shí)，下面反應(yīng)3小時(shí))顯示，各泳道分別相對(duì)于下面的樣品1.M13mp18 dsDNA 1×10-15mol/管。
2.M13mp18 dsDNA 1×10-16mol/管。
3.M13mp18 dsDNA 1×10-17mol/管。
4.M13mp18 dsDNA 1×10-18mol/管。
5.M13mp18 dsDNA 1×10-19mol/管。
6.M13mp18 dsDNA 1×10-20mol/管。
7.M13mp18 dsDNA 1×10-21mol/管。
8.M13mp18 dsDNA 1×10-22mol/管。
9.沒有靶。
10.XIV分子量標(biāo)記。
各泳道中共同帶在電泳圖里較低部分顯示，為未反應(yīng)的染過色的引物。不考慮反應(yīng)時(shí)間，在缺少靶時(shí)則不能觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。染色模式取決于靶的濃度，僅在靶存在下才能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的染色模式。此外，增加反應(yīng)時(shí)間時(shí)能證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度較低。
實(shí)施例7 點(diǎn)突變的檢測(cè)(1)M13mp18FM(突變型)的制備所用靶DNA為M13mp18(野生型)和M13mp18FM(突變型)，為了制備突變型M13mp18FM，用LA PCRTM體外誘變?cè)噭┖?酒寶造)替換一核苷酸得到突變。此后，通過測(cè)序證實(shí)該序列。F1區(qū)的序列如下所示野生型CCGGGGATCCTCTAGAGTCG(SEQ ID NO19)突變型CCGGGGATCCTCTAGAGTCA(SEQ ID NO20)(2)引物設(shè)計(jì)野生型和突變型所用FA引物分別在F1c區(qū)5’-末端提供不同的核苷酸序列，突變的位置和針對(duì)靶核苷酸序列(靶)的每區(qū)位置關(guān)系在圖15中顯示。
(3)擴(kuò)增反應(yīng)如下所示通過利用M13mp18(野生型)和M13mp18FM(突變型)為模板應(yīng)用結(jié)合特異性引物進(jìn)行檢測(cè)特異性模板擴(kuò)增反應(yīng)是否發(fā)生的實(shí)驗(yàn)。
野生型擴(kuò)增所用引物FAd4，RAd4，F(xiàn)3，R3突變型擴(kuò)增所用引物FAMd4，RAd4，F(xiàn)3，R3每個(gè)引物核苷酸序列如下FAd4CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(SEQ ID NO21)FAMd4TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(SEQ ID NO22)RAd4CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC(SEQ ID NO23)F3ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA(SEQ ID NO24)R3GTTGGGAAGGGCGATCG(SEQ ID NO25)(4)檢測(cè)M13mp18中點(diǎn)突變反應(yīng)溶液組合如下終濃度D2W 3.75μL10X Thermo pol buffer(NEB)2.5μL20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO46mM MgSO40.1％TritonX-1002.5mM dNTP4μL 400μM100mM MgSO40.5μL4M Betaine6.25μL 1MM13FAd4引物(10pmol/μL)或M13FAMd4引物(10pmol/μL) 2μL 800nMM13RAd4引物(10pmol/μL) 2μL 800nMM13F3引物(10pmol/μL) 0.5μL200nMM13R3引物(10pmol/μL) 0.5μL200nM總量22μL將1 fmol(2μl)靶M13mp18或M13mp18FM加入到反應(yīng)溶液中于95℃加熱5分鐘，其中所述靶變性成單鏈。將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到用冰預(yù)冷的水中，加入1μl(8U)Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)于68℃或68.5℃反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)后，于80℃10分鐘終止該反應(yīng)，反應(yīng)溶液重新轉(zhuǎn)到用冰預(yù)冷的水中。
如圖16所示，當(dāng)對(duì)于野生型FAd4被用作FA引物時(shí)，僅在野生型模板情況下觀察到有效擴(kuò)增。另一方面，當(dāng)對(duì)于突變型FAMd4被用作FA引物，僅在野生型模板情況下觀察到有效擴(kuò)增。
從上述結(jié)果顯示通過利用本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)，可有效地檢測(cè)點(diǎn)突變。
實(shí)施例8 以mRNA為靶的擴(kuò)增反應(yīng)通過利用以mRNA為靶核酸合成本發(fā)明核酸的方法得以嘗試。為制備靶mRNA，將表達(dá)前列腺特異抗原(PSA)的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP細(xì)胞(ATCC No.CRL-1740)與非表達(dá)細(xì)胞慢性骨髓白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞(ATCC No.CCL-243)在1∶106到100∶106范圍混合，接著通過利用來自Qiagen(Germany)的RNeasy Mini試劑盒，提取總RNA，實(shí)驗(yàn)中所用4種引物即PSAFA，PSARA，PSAF3和PSAR3。PSAF3和PSAR3是替換分別以PSAFA和PSARA為合成起點(diǎn)獲得的第一核酸的外引物。此外，將這些引物的濃度設(shè)置高使PSAFA(或PSARA)的退火優(yōu)先發(fā)生。組成各個(gè)引物的核苷酸序列如下，引物PSAFATGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG(SEQ ID NO26)PSARATGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG(SEQ ID NO27)PSAF3TGCTTGTGGCCTCTCGTG(SEQ ID NO28)PSAR3GGGTGTGGGAAGCTGTG(SEQ ID NO29)引物的結(jié)構(gòu)特征在下面概括。此外，針對(duì)編碼對(duì)于靶mRNA的DNA核苷酸序列每個(gè)引物的位置關(guān)系和限制酶Sau3AI識(shí)別位點(diǎn)在圖17中顯示。
引物 5’-側(cè)的區(qū)/3’-側(cè)的區(qū)PSAFA與通過PSAFA合成的互補(bǔ)鏈中F1c區(qū)相同/與靶核苷酸序列中F2c區(qū)互補(bǔ)PSARA與通過PSARA合成的互補(bǔ)鏈中R1c區(qū)相同/與通過PSAFA合成的互補(bǔ)鏈中R2c區(qū)互補(bǔ)PSAF3與靶核苷酸序列中F2c區(qū)3’-側(cè)臨近的F3c互補(bǔ)PSAR3通過PSAFA合成的互補(bǔ)鏈中F2c區(qū)3’-側(cè)臨近的R3c互補(bǔ)本發(fā)明合成核酸方法的反應(yīng)溶液的組合如下反應(yīng)溶液的組成(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.84mM MgSO40.4mM dNTPs10mM KCl10mM (NH4)2SO40.1％ Triton X-1000.8M betaine5mM DTT
1600nM PSAFA & PSARA引物200nM PSAF3 & PSAR3引物8U Bst DNA聚合酶100U Rever Tra Ace(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)5μg總RNA所用成分在冰上混合，該實(shí)驗(yàn)中以mRNA(單鏈)為靶序列，因此不必通過熱變性獲得單鏈的步驟。于65℃進(jìn)行反應(yīng)45分鐘，于85℃5分鐘終止該反應(yīng)，反應(yīng)后，5μl反應(yīng)溶液在2％瓊脂糖凝膠上電泳，用SYBR Green I染色。
結(jié)果在圖18中顯示，各泳道分別相對(duì)于下面的樣品泳道 Bst RT LNCaP細(xì)胞數(shù)/106K562細(xì)胞數(shù)1 -+02 -+103 +-04 +-105 ++06 ++17 ++108泳道6中為Sau3AI消化1μL等份反應(yīng)溶液9泳道7中為Sau3AI消化1μL等份反應(yīng)溶液10分子量標(biāo)記，100bp ladder(New England Biolabs)在缺少Bst DNA聚合酶或Rever Tra Ace時(shí)，不能得到擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道1-4)。所述兩種酶都存在情況下，如果存在從LNCaP衍生的RNA，則能檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道5-7)。能檢測(cè)到從一個(gè)LNCaP細(xì)胞/一百萬個(gè)K562細(xì)胞提取的RNA(泳道6)。當(dāng)在位于靶內(nèi)部的Sau3AI限制酶位點(diǎn)消化擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，該產(chǎn)物被消化成所估計(jì)大小的片段(泳道8和9)。
從上述結(jié)果中，證實(shí)在本發(fā)明合成核酸的方法中甚至以RNA為靶時(shí)可得到所需的反應(yīng)產(chǎn)物。
工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明新寡核苷酸和利用所述寡核苷酸合成核酸的方法，提供了合成具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸的方法，而不需要任何復(fù)雜的溫度控制?；诒景l(fā)明以寡核苷酸為引物合成的互補(bǔ)鏈以所述模板鏈3’-末端作為合成新互補(bǔ)鏈的起點(diǎn)，伴隨有導(dǎo)致新引物退火的環(huán)的合成及以先合成的鏈為模板合成互補(bǔ)鏈反應(yīng)產(chǎn)物，被再次通過從環(huán)開始的合成的互補(bǔ)鏈所替換并可堿基配對(duì)。由此得到的以自身為模板合成的核酸與已知的核酸合成方法例如SDA結(jié)合，有益于改進(jìn)核酸的合成效率。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選模式，提供合成核酸的新方法，該方法可改進(jìn)已知方法合成核酸的效率，不需要復(fù)雜的溫度控制，而且預(yù)計(jì)可達(dá)到高效率擴(kuò)增，并可獲得高特異性，即將基于本發(fā)明的寡核苷酸用作模板鏈，和其互補(bǔ)鏈，其中具有互補(bǔ)核苷酸序列交替地連接在單鏈里的核酸可得以連續(xù)合成。理論上該反應(yīng)可以繼續(xù)到合成所必須的初始產(chǎn)物的耗盡。在繼續(xù)合成從環(huán)開始合成的新核酸期間，從能退火為環(huán)的寡核苷酸的延伸進(jìn)行鏈的置換為長單鏈核酸的延伸(即具有多對(duì)互補(bǔ)鏈連接在此的核酸)提供3’-OH。另一方面，長的單鏈核酸的3’-OH以自身為模板進(jìn)行合成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)，由此得到延伸，從環(huán)開始的合成的新互補(bǔ)鏈被替換，該擴(kuò)增反應(yīng)步驟在等溫條件下進(jìn)行并維持高的特異性。
當(dāng)兩臨近區(qū)按照所設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)時(shí)使本發(fā)明寡核苷酸可作為合成核酸反應(yīng)的引物，這明顯有助于特異性的保守，通過與非特異性誤退火啟動(dòng)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)的與e.g.PCR相比較，不管所需2引物的位置關(guān)系如何就可容易地對(duì)本發(fā)明所需高特異性作出解釋，能利用該特異性高靈敏度及精確地檢測(cè)SNPs。
本發(fā)明的特征在于通過組成簡單的試劑就可容易地獲得該反應(yīng)，例如本發(fā)明寡核苷酸具有特定結(jié)構(gòu)，但這是核苷酸序列選擇的物質(zhì)，是簡單的寡核苷酸物質(zhì)。此外，在優(yōu)選的模型中，僅通過催化合成置換型的互補(bǔ)鏈反應(yīng)的DNA聚合酶反應(yīng)，可得以進(jìn)行。而且，如果本發(fā)明以RNA為模板，利用DNA聚合酶例如Bca DNA聚合酶，既具有反轉(zhuǎn)錄酶活性又有鏈置換型DNA聚合酶活性使所有酶反應(yīng)可通過單酶得以進(jìn)行，通過簡單酶實(shí)現(xiàn)高度擴(kuò)增核酸的反應(yīng)原理尚不清楚。甚至對(duì)于將本發(fā)明應(yīng)用到已知的核酸合成反應(yīng)例如SDA中對(duì)于它們的結(jié)合不必需要額外酶。并且該與基于本發(fā)明的寡核苷酸的簡單結(jié)合可被用于各種反應(yīng)系統(tǒng)中，因此本發(fā)明合成核酸的方法在費(fèi)用方面也是有利的。
如上所述，本發(fā)明合成核酸的方法和其中的寡核苷酸提供了一種新的原理同時(shí)解決了許多問題例如操作(不必需要溫度控制)，改進(jìn)合成效率，經(jīng)濟(jì)化和高特異性。
序 列 表<110> 榮研化學(xué)株式會(huì)社(Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha)<120> 合成核酸的方法<130> E2-001PCT2<140><141><150> PCT/JP99/06213<151> 1999-11-08<160> 29<170> PatentIn Ver.2.0<210> 1<211> 52<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 1cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg at 52<210> 2<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 2acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta c 51<210> 3<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 3actttatgct tccggctcgt a 21<210> 4<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 4gttgggaagg gcgatcg17<210> 5<211> 600<212> DNA<213> 噬菌體M13mp18<400> 5gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 240cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg 300ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 360atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 420agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc 480cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac ggtcgtcgtc ccctcaaact 540ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca 600<210> 6<211> 63<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 6ctcttccaaa agtaaggcag gaaatgtgaa accagatcgt aatttggaag acccagcatc 60cag 63<210> 7<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 7gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgt 43<210> 8<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 8gccacctggg tgggaa 16<210> 9<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 9ggcgagggag ttcttcttct ag 22<210> 10<211> 430<212> DNA<213> 乙型肝炎病毒<400> 10ctccttgaca ccgcctctgc tctgtatcgg gaggccttag agtctccgga acattgttca 60cctcaccata cagcactcag gcaagctatt ctgtgttggg gtgagttaat gaatctggcc 120acctgggtgg gaagtaattt ggaagaccca gcatccaggg aattagtagt cagctatgtc 180aatgttaata tgggcctaaa aatcagacaa ctattgtggt ttcacatttc ctgccttact 240tttggaagag aaactgtttt ggagtatttg gtatcttttg gagtgtggat tcgcactcct 300cccgcttaca gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 360agacgacgag gcaggtcccc tagaagaaga actccctcgc ctcgcagacg aaggtctcaa 420tcgccgcgtc430<210> 11<211> 293<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 11acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcg293<210> 12<211> 293<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 12cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgt293<210> 13<211> 459<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 13acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcgacctgca 300ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 360ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 420aggcccgcac aaaaagggtt ttcccagtca cgacgttgt459<210> 14<211> 458<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 14cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 300cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc 360tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 420ccacacaaca aaaagtaccc ggggatcctc tagagtcg 458<210> 15<211> 790<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 15acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcgacctgca 300ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 360ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 420aggcccgcac aaaaagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag 480cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta ctttttgttg tgtggaattg 540tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcgagctcg 600gtacccgggg atcctctaga gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt 660ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 720ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca caaaaagggt tttcccagtc 780acgacgttgt790<210> 16<211> 789<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 16cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 300cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc 360tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 420ccacacaaca aaaagtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg 480cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tttttgtgcg ggcctcttcg 540ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 600gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag 660gtcgactcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt catagctgtt 720tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac aaaaagtacc cggggatcct 780ctagagtcg 789<210> 17<211> 310<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 17gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgtctaacaa cagtagtttc 60cggaagtgtt gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcgggaggag tgcgaatcca 120cactccaaaa gataccaaat actccaaaac agtttctctt ccaaaagtaa ggcaggaaat 180gtgaaaccac aatagttgtc tgatttttag gcccatatta acattgacat agctgactac 240taattccctg gatgctgggt cttccaaatt acgatctggt ttcacatttc ctgccttact 300tttggaagag310<210> 18<211> 465<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 18gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgtctaacaa cagtagtttc 60cggaagtgtt gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcgggaggag tgcgaatcca 120cactccaaaa gataccaaat actccaaaac agtttctctt ccaaaagtaa ggcaggaaat 180gtgaaaccac aatagttgtc tgatttttag gcccatatta acattgacat agctgactac 240taattccctg gatgctgggt cttccaaatt acgatctggt ttcacatttc ctgccttact 300tttggaagag aaactgtttt ggagtatttg gtatcttttg gagtgtggat tcgcactcct 360cccgcttaca gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 420agacgacgag gcaggtcccg atcagcggga ggagtgcgaa tccac 465<210> 19<211> 20<212> DNA<213> M13mp18<400> 19ccggggatcc tctagagtcg 20<210> 20<211> 20<212> DNA<213> M13mp18突變體<400> 20ccggggatcc tctagagtca 20<210> 21<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 21cgactctaga ggatccccgg tttttgttgt gtggaattgt gagcggat48<210> 22<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 22tgactctaga ggatccccgg tttttgttgt gtggaattgt gagcggat 48<210> 23<211> 47<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 23cgtcgtgact gggaaaaccc tttttgtgcg ggcctcttcg ctattac 47<210> 24<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 24actttatgct tccggctcgt a 21<210> 25<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 25gttgggaagg gcgatcg 17<210> 26<211> 44<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 26tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg 44<210> 27<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 27tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg 45<210> 28<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 28tgcttgtggc ctctcgtg18<210> 29<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 29gggtgtggga agctgtg 1權(quán)利要求
1.合成在其一條鏈上具有交替連接之互補(bǔ)核苷酸序列的核酸的方法，所述方法包括a)提供一種核酸，其3′末端具有可與同一條鏈上的部分F1c退火的F1區(qū)，并且通過所述F1區(qū)與F1c的退火可形成包含了可進(jìn)行堿基配對(duì)的F2c區(qū)在內(nèi)的環(huán)；b)以與F1c退火的F1 3′末端為起點(diǎn)合成互補(bǔ)鏈；c)使在其3′末端包含與F2c區(qū)互補(bǔ)的F2序列的寡核苷酸退火并以該寡核苷酸為合成起點(diǎn)，通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)而進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成，以置換步驟b)中所合成的互補(bǔ)鏈；d)使一種多核苷酸退火并以其3′末端為合成起點(diǎn)，通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)而進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成，以置換步驟c)中所合成的互補(bǔ)鏈，其中所述多核苷酸在其3′末端包含一種與步驟c)中合成的互補(bǔ)鏈的任意區(qū)域互補(bǔ)的序列；
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)中所述合成起點(diǎn)為同一鏈上3′末端的可與R1c區(qū)退火的R1區(qū)，通過R1與R1c的退火可形成包含了可進(jìn)行堿基配對(duì)的R2c區(qū)在內(nèi)的環(huán)。
3.一種寡核苷酸，其至少由以下兩個(gè)區(qū)域X2及X1c構(gòu)成，且X1c連接至X2的5′側(cè)，X2區(qū)具有與含特定核苷酸序列的核酸中任意X2c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列；X1c區(qū)具有與含特定核苷酸序列的核酸中X2c區(qū)5′側(cè)的X1c區(qū)基本相同的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)所述的核酸是通過以下步驟產(chǎn)生的第二核酸i)使權(quán)利要求3所述寡核苷酸的F2區(qū)與作為模板的核酸中的F2c區(qū)退火，其中所述寡核苷酸中，X2區(qū)為F2區(qū)，X1c區(qū)為F1c區(qū)；ii)以所述寡核苷酸中的F2為起點(diǎn)合成具有與所述模板互補(bǔ)之核苷酸序列的第一核酸；iii)使步驟ii)中合成的第一核酸的任意區(qū)處于可進(jìn)行堿基配對(duì)的狀態(tài)；iv)使一種寡核苷酸退火并以該寡核苷酸為合成起點(diǎn)，合成第二核酸，并使該核酸3′末端的F1處于可進(jìn)行堿基配對(duì)的狀態(tài)，其中所述寡核苷酸具有與步驟iii)中的第一核酸中可進(jìn)行堿基配對(duì)的區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求4的方法，其中步驟iii)中可進(jìn)行堿基配對(duì)的區(qū)域?yàn)镽2c，且步驟iv)中的寡核苷酸為權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，其中X2c區(qū)為R2c區(qū)，X1c區(qū)為R1c區(qū)。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中步驟iii)及iv)中可進(jìn)行堿基配對(duì)的狀態(tài)通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)而產(chǎn)生，該反應(yīng)的合成起點(diǎn)啟用兩種外引物一種是與模板中F2c的3′側(cè)退火的外引物，另一種是與作為步驟iv)中第一核酸合成起點(diǎn)的區(qū)域的3′側(cè)退火的外引物。
7.權(quán)利要求6的方法，所述反應(yīng)中所用的每種寡核苷酸與其在模板中的互補(bǔ)區(qū)之間的解鏈溫度在相同嚴(yán)謹(jǐn)條件下存在以下的關(guān)系(外引物/模板3′側(cè)區(qū))≤(F2c/F2及R2c/R2)≤(F1c/F1及R1c/R1)。
8.權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述作為模板的核酸為RNA，且步驟ii)中的互補(bǔ)鏈通過具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的酶來合成。
9.擴(kuò)增在其一條鏈上具有交替連接之互補(bǔ)核苷酸序列的核酸的方法，所述方法通過重復(fù)以下步驟完成A)提供一種模板，使其3′末端和5′末端具有由互補(bǔ)于相同鏈上每一末端區(qū)的核苷酸序列組成的區(qū)，當(dāng)這些互補(bǔ)核苷酸序列退火時(shí)，形成可在兩者之間進(jìn)行堿基配對(duì)的環(huán)；B)以與同一鏈退火的上述模板的3′末端為合成起點(diǎn)合成互補(bǔ)鏈；C)使3′末端互補(bǔ)于3′末端側(cè)的環(huán)內(nèi)核苷酸序列的寡核苷酸與環(huán)部退火，并以該寡核苷酸為合成起點(diǎn)，通過聚合酶催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)而合成互補(bǔ)鏈，以置換步驟B)中合成的互補(bǔ)鏈，使其3′末端處于可進(jìn)行堿基配對(duì)的狀態(tài)；D)使步驟C)中具有能進(jìn)行堿基配對(duì)的3′末端的鏈作為(A)中的新模板。
10.權(quán)利要求9的擴(kuò)增方法，其中步驟C)中寡核苷酸的5′末端具有一段與作為步驟B)之合成起始點(diǎn)的3末端互補(bǔ)的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求10的擴(kuò)增方法，進(jìn)一步包含這樣的步驟以步驟C)中的寡核苷酸作為合成起始點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈用做步驟A)中的模板。
12.權(quán)利要求9的擴(kuò)增方法，其中步驟A)的模板是通過權(quán)利要求5所述方法合成的。
13.權(quán)利要求1或9的方法，其中鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)是在解鏈溫度調(diào)節(jié)劑的存在下實(shí)施的。
14.權(quán)利要求13的方法，其中解鏈溫度調(diào)節(jié)劑為甜菜堿。
15.權(quán)利要求14的方法，其中允許反應(yīng)溶液中甜菜堿的濃度為0.2-3.0M。
16.一種檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法，包括實(shí)施權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法并觀察是否生成擴(kuò)增產(chǎn)物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入包含與所述環(huán)互補(bǔ)的核苷酸序列的探針，進(jìn)而觀察兩者之間的雜交。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述探針被標(biāo)記在顆粒上，并觀察通過雜交而發(fā)生的聚集反應(yīng)。
19.權(quán)利要求16的方法，其中權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法在核酸檢測(cè)試劑的存在下實(shí)施，并根據(jù)該檢測(cè)試劑的信號(hào)變化來觀察是否生成擴(kuò)增產(chǎn)物。
20.用權(quán)利要求16所述方法檢測(cè)靶核苷酸序列中的突變的方法，其中核苷酸序列中作為擴(kuò)增對(duì)象的突變阻礙了組成該擴(kuò)增方法的任一互補(bǔ)鏈的合成。
21.合成在其一條鏈上具有交替連接之互補(bǔ)核苷酸序列的核酸的試劑盒，其包括以下組分i)權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，其中作為模板的核酸中F2c區(qū)域是X2c，位于F2c 5′端的F1c是X1c；ii)一種寡核苷酸，其包含互補(bǔ)于以i)的寡核苷酸為引物而合成的互補(bǔ)鏈中任意區(qū)域的核苷酸序列；iii)一種寡核苷酸，其具有與作為模板的核酸中F2c區(qū)3′側(cè)的F3c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列；iv)一種用于催化鏈置換型互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的DNA聚合酶，和，v)一種核苷酸，其作為組分iv)的底物。
22.權(quán)利要求21的試劑盒，其中ii)的寡核苷酸為權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，以i)的寡核苷酸為合成起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈中任意R2c區(qū)為X2c，位于R2c 5′側(cè)的R1c為X1c。
23.權(quán)利要求22所述的試劑盒，進(jìn)一步包含以下組分vi)一種寡核苷酸，其具有與用i)的寡核苷酸作為起點(diǎn)合成的互補(bǔ)鏈中任意R2c區(qū)3′側(cè)的R3c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列。
24.一種用于檢測(cè)靶核苷酸序列的試劑盒，其中在權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)所述試劑盒的基礎(chǔ)上，還進(jìn)一步包含用于檢測(cè)核酸合成反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有新結(jié)構(gòu)的寡核苷酸和通過其用作引物合成核酸的方法。該寡核苷酸在引物的5’－側(cè)所提供的核苷酸序列，基本上與以該引物為合成起點(diǎn)而合成的區(qū)域相同。本發(fā)明在單純?cè)噭┑慕M成上實(shí)現(xiàn)了基于等溫反應(yīng)的核酸合成。此外，本發(fā)明根據(jù)該核酸合成的方法又提供了合成高特異性核酸的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1420928SQ00818262
公開日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月8日
發(fā)明者納富繼宣, 長谷哲 申請(qǐng)人:榮研化學(xué)株式會(huì)社