一種復(fù)合型熒光納米探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分析及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)ATP的復(fù)合型熒光納米 探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 三磷酸腺苷（ATP)是廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)的一種輔酶，由腺苷和三個(gè)磷酸基組 成。自1929年Lohmann首次發(fā)現(xiàn)并提取ATP以來(lái)，它已被證實(shí)在生命細(xì)胞的新陳代謝以及 各種生化反應(yīng)的能量供應(yīng)中扮演著極其重要的角色。作為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的"分子通貨"， ATP儲(chǔ)存和傳遞化學(xué)能，是體內(nèi)組織細(xì)胞所需能量的主要來(lái)源，參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核苷 酸的合成，對(duì)細(xì)胞許多代謝過(guò)程均有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，ATP不但在惡性腫瘤的治 療中得到了廣泛的應(yīng)用，而且還作為重大疾病的標(biāo)志物之一得到了廣泛的研究和關(guān)注。由 于ATP是活細(xì)胞賴(lài)以生存的能量來(lái)源，當(dāng)細(xì)胞受損或死亡后，細(xì)胞內(nèi)的ATP含量明顯降低。 因此，ATP的含量變化可以反映細(xì)胞的變異和損傷。通過(guò)檢測(cè)惡性腫瘤ATP濃度變化，可以 了解其細(xì)胞代謝情況，常被用于抗腫瘤藥物的體外藥敏檢測(cè)，為惡性腫瘤藥敏的異質(zhì)性和 個(gè)體化療提供可行性治療方案。另外，作為活細(xì)胞最基本的能量來(lái)源，ATP水平與活細(xì)胞數(shù) 值呈正相關(guān)線性關(guān)系，因此，ATP也常作為微生物污染的一個(gè)指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定ATP含量的多 少，可以直接反映細(xì)胞活性、微生物的數(shù)量。因此，建立快速、靈敏和準(zhǔn)確的ATP分析方法不 僅有助于癌癥等重大疾病的早期診斷及治療，同時(shí)對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、食品衛(wèi)生、環(huán) 境監(jiān)測(cè)、醫(yī)藥及化妝品等諸多領(lǐng)域也有著重要的實(shí)際意義。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外ATP的檢測(cè)方法除了作為主流技術(shù)的高效液相色譜法以外，其它還 有電泳法、分光光度法和生物發(fā)光法等。這些方法在儀器設(shè)備、時(shí)間、靈敏度、準(zhǔn)確性等方面 都或多或少地存在不足，尤其是靈敏度和選擇性尚待提高。為此，迫切需要開(kāi)發(fā)高靈敏、高 選擇性的檢測(cè)技術(shù)用于ATP的檢測(cè)。
[0004] 近幾年來(lái)，金納米籠作為一種新興的納米材料得到了廣泛的關(guān)注。該納米材料是 一種中空多孔的結(jié)構(gòu)，即籠狀顆粒的內(nèi)部為空心結(jié)構(gòu)，光滑的籠壁表面上分布著小孔。與傳 統(tǒng)的球型金納米顆粒相比，金納米籠的局域表面等離子共振峰位于近紅外區(qū)700~900nm， 該波段對(duì)于生物醫(yī)學(xué)意義重大，尤其是對(duì)于活體研究。將金納米籠與DNA分子開(kāi)關(guān)和DNA 放大技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，同時(shí)，也為了更加有效地利用具有特殊結(jié)構(gòu)的納 米材料的顯著優(yōu)點(diǎn)，針對(duì)檢測(cè)ATP的熒光納米探針少有報(bào)道，因此，本發(fā)明的第一目的：構(gòu) 建并制備一種新型的可用于檢測(cè)ATP的復(fù)合型熒光納米探針，將具有DNA分子開(kāi)關(guān)的金納 米籠材料與DNA放大技術(shù)結(jié)合在一起，使該復(fù)合型熒光納米探針不但具有可控的分子開(kāi) 關(guān)，而且能夠在解鏈反應(yīng)后，釋放出大量熒光分子，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的高 靈敏檢測(cè)；本發(fā)明的第二目的：提供一種該復(fù)合型熒光納米探針的制備方法；本發(fā)明的第 三目的：提供一種應(yīng)用該復(fù)合型熒光納米探針檢測(cè)ATP的方法。將本發(fā)明提出的復(fù)合型熒 光納米探針用于ATP的熒光檢測(cè)，能夠有效提高ATP檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，顯著降低樣品 用量。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的的。本發(fā)明的復(fù)合型熒光納米探針是以 金納米籠作為載體，利用其空心多孔的結(jié)構(gòu)特性，在其內(nèi)部裝載熒光分子，為了防止熒光分 子的外泄，通過(guò)在其表面組裝DNA分子開(kāi)關(guān)，將金納米籠表面的孔封堵；其中，所述的DNA分 子開(kāi)關(guān)由3種DNA組成，其中DNAUDNA2分別與DNA3互補(bǔ)，而DNA3不但含有切口酶識(shí)別序 列還含有與引物鏈DNA4互補(bǔ)的序列。
[0007] 優(yōu)選地，上述復(fù)合型熒光納米探針，其中所述的DNAl的部分序列為：5' -GGT CCA GCT GGC TTT TTTSH-3' ；
[0008] 所述的 DNA2 的部分序列為：5' -SHTTT TTT CCG TCG CAC GCT TTT-3' ；
[0009] 所述的 DNA3 的部分序列為：5'-GCC AGC TGG ACC TG GCT AAG GCA GCG TGC GAC GGT GGG GGA-3,；
[0010] 所述的引物鏈DNA4的部分序列為：5' -AAT ACT CCC CCA CCG-3'。
[0011] 優(yōu)選地，上述復(fù)合型熒光納米探針，所述的熒光分子是羅丹明B。
[0012] 一種制備上述復(fù)合型熒光納米探針的制備方法，包括如下步驟：
[0013] (1)分別在DNAl、DNA2中加入DTT溶液進(jìn)行活化處理Ih ;
[0014] (2)在磁珠 -金納米籠的復(fù)合物中加入活化好的DNA1、DNA2溶液，室溫振蕩過(guò)夜， 使DNAl、DNA2組裝到金納米籠表面；
[0015] (3)磁分離上述溶液，用PBS緩沖溶液清洗后加入羅丹明B溶液，室溫振蕩過(guò)夜；
[0016] (4)向上述溶液中加入DNA3溶液，室溫下反應(yīng)2h，使DNA3與DNA1、DNA2雜交，在 金納米籠表面形成DNA分子開(kāi)關(guān)，磁分離，用PBS緩沖溶液清洗后重新分散，即制得復(fù)合型 熒光納米探針；
[0017] 其中，所述的磁珠-金納米籠的復(fù)合物按如下方法制備而成：將磁珠與金納米籠 的混合溶液置于室溫振蕩反應(yīng)l〇h，磁分離，用PBS緩沖溶液清洗，移除上清夜，即得。
[0018] 一種利用本發(fā)明的復(fù)合型熒光納米探針用于ATP的檢測(cè)，方法如下：
[0019] (1)在ATP適體復(fù)合物中加入ATP樣品溶液，37°C恒溫振蕩反應(yīng)lh，ATP與ATP適 體特異性結(jié)合，將引物DNA4競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)；
[0020] (2)磁分離上述溶液，取上清液加入到本發(fā)明的復(fù)合型熒光納米探針的PBS懸浮 液中，使被競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)的引物DNA4與DNA3雜交，室溫下反應(yīng)后再加入Klenow聚合酶、dNTPs、 Nb. BpulOI切口酶及PBS緩沖溶液，37°C條件下反應(yīng)2h，發(fā)生鏈增長(zhǎng)、鏈取代及鏈剪切的循 環(huán)反應(yīng)，使DNA分子開(kāi)關(guān)不斷被打開(kāi)，釋放出熒光分子；
[0021] (3)磁分離上述溶液，收集上清液，檢測(cè)其熒光信號(hào)；
[0022] 其中，所述的ATP適體復(fù)合物按如下方法制備而成：將羧基磁珠與氨基修飾的ATP 適體溶液混合，室溫振蕩過(guò)夜，磁分離，移除上清液，加入引物DNA4, 37°C恒溫振蕩反應(yīng)lh， 生成由引物DNA4和ATP適體雜交而成的雙鏈結(jié)構(gòu)，磁分離，即得。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提出的復(fù)合型熒光納米探針將納米技術(shù)與分子生物技 術(shù)相結(jié)合，通過(guò)分子識(shí)別及特異性反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP高靈敏、高選擇性的檢測(cè)。利用該復(fù) 合型熒光納米探針檢測(cè)ATP，通過(guò)生物酶的作用引發(fā)鏈增長(zhǎng)、鏈取代及鏈剪切的循環(huán)反應(yīng)， 使DNA分子開(kāi)關(guān)不斷被打開(kāi)，釋放出熒光分子，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的放大，使ATP的檢測(cè)靈敏 度得到顯著提高。
[0024] 本發(fā)明的復(fù)合型熒光納米探針結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，可控性強(qiáng)，熒光信號(hào)靈敏，同 時(shí)，不受其它常見(jiàn)干擾物質(zhì)影響，具有高的選擇性，可應(yīng)用于生物體系中ATP的熒光檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明提出的復(fù)合型熒光納米探針可在5. 0 X 10_8~I. 0 X KT6M范圍內(nèi) 實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的高靈敏、高選擇性檢測(cè)。該探針及其檢測(cè)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域具 有較大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景，可用于ATP的特異性檢測(cè)，為癌癥等重大疾病的早 期診斷及治療提供新的途徑和方法。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)原理圖。
[0026] 圖2不同ATP濃度的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
[0027] 圖3ATP濃度與熒光信號(hào)強(qiáng)度的線性關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下是本發(fā)明涉及的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但是本發(fā) 明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡事不背離本發(fā)明的改變或等同替代均包括在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0029] 下面通過(guò)實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限定。
[0030] 實(shí)驗(yàn)儀器：磁性分離架（天津倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心）；F-4600熒光分光光度 計(jì)（日立，日本）；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器（金壇市醫(yī)療器械廠）。
[0031] 實(shí)驗(yàn)試劑：3_4 μ m羧基修飾磁珠，巰基修飾磁珠（天津市倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中 心）；羅丹明B (阿拉丁）；三磷酸腺苷（ATP);二硫蘇糖醇（DTT，阿拉?。籏len〇w聚合酶及 其 buffer(Thermo Scientific，美國(guó)）；Nb. BpulOI 切口酶及其 buffer(Thermo Scientific， 美國(guó)）；dNTPs (北京賽百盛基因技術(shù)有限公司），所用人工合成DNA序列均由北京賽百盛生 物工程有限公司購(gòu)得，PBS溶液為(λ OlM(ρΗ7· 4, Na2HPO4