專利名稱：5＇核苷酸酶診斷試劑盒及5＇核苷酸酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5'核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測 定5'核苷酸酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5'-核苷酸酶(5' NT)增高主要見于阻塞性黃膽， 也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁 性肝硬化和慢性肝炎時，5' NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝 肉芽腫時5' NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因為5'-核苷酸酶活 性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性 磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5'-核苷酸酶的活性對于 疾病的診斷具有重要意義。
5'-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué) 強酸測磷法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素 底物測試法，方法為5'-核苷酸酶作用于tf-dUMP，終止反應(yīng)后，通 過離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5'-核苷酸酶活性?；蛘呃?'-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機磷，再用化學(xué)強酸法分析無機 磷含量得以計算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀， 因此難以切實推廣應(yīng)用。無機磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準確度 不好，強酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法
(Enzymatic Recycling Method)、 酶比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測通過酶聯(lián)反應(yīng) 生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)， 所導(dǎo)致在400——700nm波長處吸光度的上升，得以測定5'核苷酸酶 活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的5'核苷 酸酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自 動生化分析儀上進行5'核苷酸酶活性濃度測定，而且測定速度快、 靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明5'核苷酸酶酶活性濃度測定方法原理如下 腺苷單磷酸+水5'核苷酸酶腺苷+磷酸根 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子 氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+
過氧化氫
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶噴嗒胺色原或
醌亞胺色原+水
5'核苷酸酶(5，nucleotidase ; EC3丄3.5)、腺苷脫氨酶(adenosine deaminase ; EC 3.5.4.4)及丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4丄1)作為作用酶，功能為將腺苷單磷酸經(jīng)三步酶解產(chǎn)生丙氨酸。 甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)作為循環(huán)酶甘氨酸氧
化酶的酶促作用將丙氨酸再次變回氨離子及丙酮酸，使氨離子及丙酮 酸不斷地被重復(fù)循環(huán)利用，并不斷地循環(huán)產(chǎn)生過氧化氫。過氧化物酶
(peroxidase ; EC 1.1L1.7)作為顯色酶，最終通過和過氧化氫的作用 將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光 分析儀器，在400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長 處，測定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通過測量400—700nm (根據(jù)還原型色 原體組合的不同而定)處吸光度上升的速度，可以測算5'核苷酸酶 的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，如下成分關(guān)系的本發(fā)明5'核苷酸酶診斷試劑盒較為理想
緩沖液
穩(wěn)定劑
過氧化物酶
還原型輔酶
腺苷脫氨酶
甘氨酸氧化酶 腺苷單磷酸
丙酮酸
還原型色原體組合
腦mmol/L 50 mmol/L 30000 U/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 12000U/L 8 mmol/L 16 mmol/L 0.1——20 mmol/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任一
個組合配對
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基^N. G-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4-雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻嘩-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
]^乙基^>^- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻啤-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺。 本發(fā)明的5'核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶、
丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液
體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、還原型 色原體組合。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶。
過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮 酸、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、丙酮酸、腺苷單磷酸。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶。過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮 酸、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或
試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為單試劑， 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 過氧化物酶 腺苷脫氨酶 丙氨酸脫氫酶 甘氨酸氧化酶 腺苷單磷酸 丙酮酸 4-氨基抗砒 石碳酸
包括 100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 30000 U/L 6000 U/L 8000 U/L 12000U/L 8 mmol/L 16 mmol/L 2 mmol/L 10 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑; 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應(yīng)時間10分鐘，壩
試主波長505nm，測試副波長600nm，被測5'核苷酸酶樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約l 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核 苷酸酶的活性濃度大小。 實施例二
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 腺苷單磷酸 丙酮酸
2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
0.25 mmol/L 6 mmol/L 20 mmol/L 0.2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
過氧化物酶
腺苷脫氨酶
甘氨酸氧化酶
100 mmol/L 50 mmol/L 30000 U/L 8000 U/L 8000 U/L 16000U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，測試
主波長546nm，測試副波長600nm，被測5'核苷酸酶樣品與試劑的
體積比例為1/20，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約l分
鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化
分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核
苷酸酶的活性濃度大小。
實施例三
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
雙甲基苯胺
50 mmol/L 0.25 mmol/L 2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
腺苷單磷酸
丙酮酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
100 mmol/L 50 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L 0.6 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
過氧化物酶 30000 U/L
腺苷脫氨酶 8000 U/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
甘氨酸氧化酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，測試 主波長578nm，測試副波長660nm，被測5'核苷酸酶樣品與試劑的 體積比例為1/30，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約l分 鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核 苷酸酶的活性濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源 物質(zhì)量污染。
權(quán)利要求
1.一種酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5′核苷酸酶活性濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972540002C1.gif" wi="133" he="81" top= "49" left = "38" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收大小，得出5′核苷酸酶活性濃度大小測定結(jié)果。
2. 一種5'核苷酸酶診斷試劑盒, 主要成分包括:緩沖液 20-50 mmol/L穩(wěn)定劑 1-50 mmol/L還原型輔酶 0.1-0.35 mmol/L腺苷脫氨酶 1000-80000 U/L丙氨酸脫氫酶 1000-80000 U/L甘氨酸氧化酶 1000-80000 U/L過氧化物酶 500-80000 U/L腺苷單磷酸 1——16mmol/L丙酮酸 1- 50mmol/L還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨 酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組 合組成單劑試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨 酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組 合雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷單磷 酸、丙酮酸、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶組成。過 氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、 腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨 酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組 合組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、腺苷單磷酸、丙 酮酸、還原型色原體組合組成；試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、腺苷 脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶組成。過氧化 物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺 苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑l、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于還 包括穩(wěn)定劑l"4000mmol/L或0.1。/Q-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻哞-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽 4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻嘩-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5′核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定5′核苷酸酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，從而測算出5′核苷酸酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/77GK101169376SQ20061009725
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月26日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司