專利名稱：5＇核苷酸酶診斷試劑盒及5＇核苷酸酶活性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5'核苷酸酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè) 定5'核苷酸酶活性的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5'-核苷酸酶(5' NT)增高主要見于阻塞性黃膽， 也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁 性肝硬化和慢性肝炎時(shí)，5' NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝 肉芽腫時(shí)5' NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因?yàn)?'-核苷酸酶活 性無(wú)生理性升高，對(duì)于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性 磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測(cè)定5'-核苷酸酶的活性對(duì)于 疾病的診斷具有重要意義。
5'-核苷酸酶的活性測(cè)定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強(qiáng) 酸測(cè)磷法(1925年)。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用同位素底 物測(cè)試法，方法為5' _核苷酸酶作用于^-dUMP，終止反應(yīng)后，通過(guò) 離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5'-核苷酸酶活性?；蛘呃?' -核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷，再用化學(xué)強(qiáng)酸法分析無(wú)機(jī) 磷含量得以計(jì)算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測(cè)定儀， 因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。無(wú)機(jī)磷測(cè)定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度 不好，強(qiáng)酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù) 監(jiān)測(cè)煙酰胺輔酶(氧化型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以 測(cè)定5'核苷酸酶活性的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方 法的5'核苷酸瞎診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光 分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行5'核苷酸酶活性測(cè)定，而且 測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明5'核苷酸酶活性測(cè)定方法原理如下 核苷單磷酸+水5'核苷酸酶核苷+磷酸根 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l，3-雙磷酸+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用5'核苷酸酶偶聯(lián)甘油醛-3-磷酸脫氫酶酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān) 測(cè)法。5'核苷酸酶酶解核苷單磷酸反應(yīng)產(chǎn)生磷酸根，再通過(guò)(偶)聯(lián) 合甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將氧化型輔酶(在340nm處沒有 吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè) 定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光 度上升的速度，可以測(cè)算5'核苷酸酶的活性大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合 考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明5'核苷 酸酶診斷試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶(氧化型) 3.0mmol/L 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 6000 U/L
核苷單磷酸 6 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 1 mmol/L
本發(fā)明的5'核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶(氧化型)、核苷單磷酸(核苷單磷 酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸或尿苷單磷酸)、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(EC1.2丄12、 EC1.2丄13或 EC1.2丄59)。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑，更有利于消除內(nèi)外源磷 酸根污染
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶(氧化型)、甘油醛-3-磷酸、甘油醛 -3-磷酸脫氫酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、核苷單磷酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑，不但有利于消除內(nèi)外 源磷酸根污染，還有利于試劑的穩(wěn)定
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶(氧化型)。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、核苷單磷酸。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定5'核苷酸酶活性的方 法，其氧化型輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的5'核苷酸酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶(氧化型) 3mmol/L 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 5000 U/L
核苷單磷酸 5mmol/L 甘油醛-3-磷酸 1 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑; 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)5'核苷 酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約1.5分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5'核 苷酸酶的活性大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的5'核苷酸酶診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
輔酶(氧化型) 甘油醛-3-磷酸脫氫f
甘油醛-3-磷酸
50 mmol/L 3 mmol/L 8000 U/L 1.2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
50 mmol/L
7 mmol/L
核苷單磷酸
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)5'核苷
酸酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上 升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K 值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出 5'核苷酸酶的活性大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的5'核苷酸酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
輔酶(氧化型)
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油醛-3-磷j
試劑
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
核苷單磷酸
勵(lì)mmol/L 50 mmol/L 卯OO U/L 0.8 mmol/L
100 mmol/L
50 mmol/L
4 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定5'核苷酸酶活性時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，
反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波 長(zhǎng)405nm，被測(cè)5'核苷酸酶樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比 例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘 左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5'核 苷酸酶的活性大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源 物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種5′核苷酸酶活性測(cè)定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972550002C1.gif" wi="133" he="27" top= "38" left = "27" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出5′核苷酸酶的活性大小測(cè)定結(jié)果。輔酶(氧化型)可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
2. —種5'核苷酸酶診斷試劑盒，主要成分包括:緩沖液 40-200 mmol/L穩(wěn)定劑 0.50 mmol/L輔酶 9.0 mmol/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶 200-500000 U/L核苷單磷酸 1-10 mmol/L甘油醛-3-磷酸 0.2-3 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、核苷單磷酸(核苷單磷酸可以是腺苷單 磷酸、肌苷單磷酸或尿苷單磷酸)、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸 脫氫酶(EC1.2.1.12、 EC1.2.1.13、或EC1.2.1.59)、組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、氧化型輔酶、核苷單磷酸(核苷單磷酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸或尿苷單磷酸)、甘油醛-3-磷酸、甘油醛 -3-磷酸脫氫酶(EC1.2丄12、 EC1.2丄13、或EC1.2丄59)、組成雙 劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氧化型輔酶、甘油醛-3-磷酸、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶、組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、核苷單 磷酸組成。核苷單磷酸、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在 試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、氧化型輔酶、核苷單磷酸(核苷單磷酸可以是 腺苷單磷酸、肌苷單磷酸或尿苷單磷酸)、甘油醛-3-磷酸、甘油醛 -3-磷酸脫氫酶(EC1.2丄12、 EC1.2丄13、或EC1.2丄59)組成多劑 試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氧化型輔酶組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成；試 劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、核苷單磷酸組成。核苷單磷酸、甘油醛 -3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1 、試劑2或試劑3中的位置 可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種5′核苷酸酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定5′核苷酸酶活性的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、核苷單磷酸(核苷單磷酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸或尿苷單磷酸)、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、氧化型輔酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′核苷酸酶的活性大小。
文檔編號(hào)G01N21/77GK101169377SQ20061009725
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2006年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月26日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司