專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定 腺苷脫氨酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關(guān)系 的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，
腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝 硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標志。
腺苷脫氨酶的活扭測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化
法。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是
腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H20 )腺苷脫氨酶肌苷(Inosine ) + 氨離子(NH/)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現(xiàn)，因 此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大 小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院的可見光分析儀測定，而需要使用 專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法 (Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型 煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定
腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法 的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，釆用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析 儀或半、全自動生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而且測 定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法原理如下-腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子
氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+
過氧化氫
腺苷脫氨酶(adenosine deaminase ; EC 3.5.4.4)作為作用酶，功 能為將腺苷酶解產(chǎn)生氨離子。丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC1.4丄1)作為顯色酶，利用氨離子和丙酮酸使還原型輔酶變成為輔 酶，在340nm波長下發(fā)生吸光度下降，從而可以測算出5'核苷酸酶的 活性濃度，同時丙氨酸脫氫酶的酶促反應產(chǎn)生丙氨酸。甘氨酸氧化酶 (glycineoxidase ; EC 1.4.3.19)作為循環(huán)酶甘氨酸氧化酶的酶促作 用將丙氨酸再次變回氨離子，使氨離子不斷地被重復循環(huán)利用。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶 診斷試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
甘氨酸氧化酶 12000 U/L
腺苷 6 mmol/L
丙酮酸 12mmol/L 本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、
甘氨酸氧化酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑 1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、腺苷、丙酮酸。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定腺苷脫氨酶活性濃度的方 法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的腺苷脫氨酶診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
甘氨酸氧化酶 12000 U/L
腺苷 6 mmol/L
丙酮酸 12mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷 脫氨酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)， 延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫 氨酶的活性濃度大小。 實施例二
本實施例的腺苷脫氨酶診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔i
腺苷 丙酮酸
0.25 mmol/L 8 mmol/L 16 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
丙氨酸脫氫酶
12000 U/L
甘氨酸氧化酶 16000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37T〕，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應 (下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論 K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫 氨酶的活性濃度大小。 實施例三
本實施例的腺苷脫氨酶診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 腺苷 丙酮酸 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙氨酸脫氫酶
100腿ol/L 50 mmol/L 0.25畫ol/L
100mmol/L 50 mmol/L 4 mmol/L 20 mmol/L
100mmol/L 50 mmol/L 8000 U/L
甘氨酸氧化酶
12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定腺苷脫氨酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度
37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm， 測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的 體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約 l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫 氨酶的活性濃度大小。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應 用。
權(quán)利要求
1.一種酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶活性濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972330002C1.gif" wi="132" he="48" top= "48" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小測定結(jié)果。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——50 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L丙氨酸脫氫酶 1000——80000 U/L甘氨酸氧化酶 1000——80000 U/L腺苷 1——12mmol/L丙酮酸 1——25 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型 輔酶、腺苷、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶組成。還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶組成多劑試劑；試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型 輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、腺苷、丙酮酸組成；試劑 3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成。還原 型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、甘氮酸氧化酶在試劑l、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1。/。-100M體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N21/78GK101169374SQ20061009723
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司