專利名稱：巖藻糖苷酶診斷試劑盒及巖藻糖苷酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種巖藻糖苷酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定巖藻糖 苷酶活性的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1980年法國學(xué)者Deugnier等研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者血清巖藻糖苷 酶升高，并被眾多的研究所證實。故有人提出巖藻糖苷酶可作為原發(fā)性肝癌 的腫瘤標(biāo)志物，與甲胎蛋白聯(lián)合或參照應(yīng)用大大提高了診療價值。近年來研 究發(fā)現(xiàn)，巖藻糖苷酶對某些疾病的發(fā)生、發(fā)展均具有重要意義。
血清巖藻糖苷酶測定主要有熒光法和比色法。比色法以4-硝基苯a -L-巖 藻吡喃糖苷或4-硝基苯(i-L-巖藻糖苷為底物顯色，本法簡便，設(shè)備要求不 高，國內(nèi)外廣泛采用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶促反應(yīng)(Enzymatic Catalytic Reaction)技術(shù)及偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)顯色技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測455nm波長處 吸光度的變化，得以測定巖藻糖苷酶活性的方法，同時，本發(fā)明還將給出用 以實現(xiàn)該方法的巖藻糖苷酶診斷試劑盒,釆用該試劑盒不僅可以在紫外/可見 光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行巖藻糖苷酶活性測定，而且測定速 度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明巖藻糖苷酶活性測定方法原理如下
巖藻糖苷巖藻糖苷酶巖藻糖+相應(yīng)醇類
巖藻糖+輔酶巖藻糖脫氫酶巖藻酮糖+還原型輔酶
還原型輔酶+ Cu2+--^輔酶+Cu+
Cu+ +新銅試劑--^ Cu+ -新銅試劑復(fù)合物
巖藻酮糖Fuculose 新銅試齊U: Neocuproine 這種方法應(yīng)用巖藻糖苷酶酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法，巖藻糖苷酶酶解巖藻糖 苷釋放巖藻糖，通過巖藻糖脫氫酶的作用產(chǎn)生還原型輔酶，為了增加反應(yīng)靈 敏度，還原型輔酶還原二價銅離子生成一價銅離子， 一價銅離子和新銅試劑 (Neocuproine)形成黃色復(fù)合物。將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀下，檢測Cu+ -新銅試劑復(fù)合物在主波長455nm吸光度上升 的速度，測算出巖藻糖苷酶的活性大小測定結(jié)果。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑或雙劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明巖藻糖苷酶診斷試劑盒較為理 想
緩沖液pH8.5 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 20 mmol/L
巖藻糖脫氫酶 200 U/L
巖藻糖苷 5 mmol/L
輔酶(氧化型) 4 mmol/L
硫酸銅 50 mmol/L
新銅試劑 100 mmol/L
本發(fā)明的巖藻糖苷酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、巖藻糖脫氫酶、巖藻糖苷、輔酶、硫酸銅、新銅試劑。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、硫酸銅、新銅試劑。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、巖藻糖脫氫酶、巖藻糖苷。 巖藻糖脫氫酶、巖藻糖苷、輔酶、硫酸銅、新銅試劑在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、硫酸銅、新銅試劑。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、巖藻糖脫氫酶、巖藻糖苷。 巖藻糖脫氫酶、巖藻糖苷、輔酶、硫酸銅、新銅試劑在試劑l、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是千粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定巖藻糖苷酶活性的方法，其
氧化型輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例一
本實施例的巖藻糖苷酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
巖藻糖脫氫酶 200 U/L
巖藻糖苷 5 mmol/L
輔酶(氧化型) 4mmol/L
硫酸銅 50 mmol/L
新銅試劑 100mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 測試主波長455nm，測試副波長660nm，被測巖藻糖苷酶樣品與 試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長455nm吸光度上升的速度，從而測算出巖藻糖苷酶的活性 實施例」
本實施例的巖藻糖苷酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶(氧化型) 4mmol/L
硫酸銅
新銅試劑
50 mmol/L
層mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
巖藻糖脫氫酶 巖藻糖苷
100 mmol/L 50 mmol/L 200 U/L 5 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長455nm，測試副波長660nm，被測巖藻糖苷酶樣品與試
劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時
間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長455nm吸光度上升的速度，從而測算出巖藻糖苷酶的 活性大小。
實施例三
本實施例的巖藻糖苷酶診斷試劑為三試劑，包括: 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
輔酶(氧化型)
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
硫酸銅
新銅試劑
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
巖藻糖苷
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L
100mmol/L 50 mmol/L 50 mmol/L
100 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 200 U/L 5 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定巖藻糖苷酶活性時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)
時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長455nm,測試副波長660nm， 被測巖藻糖苷酶樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左 右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢測主波長455nm吸光度上升的速度，從而測算出巖藻糖苷酶的活性 大小。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染， 便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種巖藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)活性測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972150002C1.gif" wi="123" he="37" top= "38" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>巖藻酮糖Fuculose新銅試劑Neocuproine將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測Cu+-新銅試劑復(fù)合物主波長455nm吸光度上升的速度，測算出巖藻糖苷酶的活性大小測定結(jié)果。
2. —種巖藻糖苷酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——50 mmol/L巖藻糖脫氫酶 50——10000 U/L巖藻糖苷 2——30 mmol/L輔酶(氧化型) 0.5——9.0mmol/L硫酸銅 10-100mmol/L新銅試劑 20-200 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述巖藻糖苷酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、巖藻糖脫氫酶(L-fiicose dehydrogenase EC 1.1.1.122、 EC1丄1.116)、巖藻糖苷、輔酶、硫酸銅(CuS04)、新銅試劑(2，9-二甲 基-1， 10-菲羅啉；Neocuproine)組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述巖藻糖苷酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、巖藻糖脫氫酶(L-focose dehydrogenase EC 1丄1.122、 EC 1丄1.U6)、巖藻糖苷、輔酶、硫酸銅(CuS()4)、新銅試劑(2，9-二 甲基-1，10-菲羅啉；Neocuproine)組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、 輔酶、硫酸銅、新銅試劑組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、巖藻糖脫氫 酶、巖藻糖苷組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述巖藻糖苷酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、巖藻糖脫氫酶(L-fiicose dehydrogenase EC 1丄1.122、 EC 1丄U16)、巖藻糖苷、輔酶、硫酸銅(CuS04)、新銅試劑(2,9-二 甲基-1,10-菲羅啉；Neocuproine)組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、硫酸銅、新銅試劑組成； 試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、巖藻糖脫氫酶、巖藻糖苷組成。巖藻糖脫氫 酶、巖藻糖苷、輔酶、硫酸銅、新銅試劑在試劑1、試劑2或試劑3中的 位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述巖藻糖苷酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 劑1~^000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種巖藻糖苷酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定巖藻糖苷酶活性的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、巖藻糖脫氫酶、巖藻糖苷、輔酶、硫酸銅、新銅試劑及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促及化學(xué)反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測主波長455nm處吸光度上升的速度，從而測算出巖藻糖苷酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N21/25GK101169367SQ20061009721
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司