巖藻糖作為腸道免疫性的生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一般涉及生物標(biāo)志物領(lǐng)域。例如,本發(fā)明涉及可以用于評(píng)估受試者具有FUT2分泌基因型的可能性的生物標(biāo)志物。本發(fā)明還涉及可以用于評(píng)估腸道健康的生物標(biāo)志物。巖藻糖被鑒定為可以用于這些目的的生物標(biāo)志物。
【專利說(shuō)明】巖藻糖作為腸道免疫性的生物標(biāo)志物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一般涉及生物標(biāo)志物領(lǐng)域。例如,本發(fā)明涉及可以用于評(píng)估受試者具有FUT2分泌基因型的可能性的生物標(biāo)志物。本發(fā)明還涉及可以用于評(píng)估腸道健康的生物標(biāo)志物。巖藻糖被鑒定為可以用于這些目的的生物標(biāo)志物。
【背景技術(shù)】
[0002]消化道健康和舒適度與定居在消化道的微生物物種的恰當(dāng)平衡緊密相關(guān)[RoundJL, Mazmanian SK(2009)Nat Rev Tmmunol 9:313-323]。該平衡的破壞已經(jīng)與從不適到衰弱性疾病(例如克羅恩氏病)的多種病況聯(lián)系起來(lái)。腸道微生物的組成又取決于多種因素,包括膳食和生活方式,而遺傳素質(zhì)越來(lái)越多地被認(rèn)識(shí)到是一個(gè)至為重要的因素。在遺傳因素中,F(xiàn)UT2基因起著核心作用[McGovern DP, et al., (2010)Hum Mol Genet 19:3468-3476]。
[0003]FUT2基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶催化巖藻糖基結(jié)合到生長(zhǎng)中的IH型抗原上,這是ABO抗原組裝和隨后分泌至粘膜層的一個(gè)關(guān)鍵步驟[Lindesmith L, et al.(2003)NatMed 9:548-553] ο FUT2基因以兩種基本形式一一活性形式(所謂的“分泌”形式)和非活性形式(所謂的“非分泌”形式)一一存在。帶有至少一個(gè)拷貝的分泌形式的個(gè)體分泌ABO抗原,并將其展示在粘膜表面(包括腸道的粘膜襯里)上。在僅帶有非分泌形式的FUT2基因的個(gè)體中,ABO抗原的產(chǎn)生和分泌被阻斷,無(wú)ABO抗原出現(xiàn)在粘膜層中。
[0004]分泌基因型的主要分子決定因子被追溯到FUT2基因蛋白編碼區(qū)中的C/T單核苷酸多態(tài)性(rs601338)。(:到1的轉(zhuǎn)變將143位氨基酸的密碼子從色氨酸轉(zhuǎn)化成終止密碼子,這導(dǎo)致 T 變體的非功能蛋白[Lindesmith L, et al.(2003) Nat Med 9:548-553]。由此,帶有兩拷貝的非分泌FUT2基因變體的個(gè)體不產(chǎn)生功能性巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,不能在粘膜表面上呈遞ABO抗原。
[0005]由于ABO抗原的寡糖結(jié)構(gòu)充當(dāng)著多種微生物的附著點(diǎn),由此該FUT2多態(tài)性被認(rèn)為對(duì)胃腸道健康造成影響。一方面,ABO抗原的存在表現(xiàn)出有利于有益細(xì)菌在人消化道的建群[McGovern DP,et al., (2010)Hum Mol Genet 19:3468-3476,Rausch P, et al., (2011)Proc Natl Acad Sci U S A 108:19030-19035],并由此減少過(guò)度炎癥反應(yīng)的危險(xiǎn)性。在此情況下FUT2基因的分泌形式具有保護(hù)性功能,帶有至少一個(gè)拷貝的分泌形式的FUT2的個(gè)體較低可能出現(xiàn)涉及腸道炎性反應(yīng)的問(wèn)題。另一方面,同樣的ABO抗原也可以充當(dāng)致病性病毒(包括諾沃克病毒)的附著點(diǎn)[Lindesmith L, et al.(2003)Nat Med 9:548-553]。在易感性個(gè)體中,該病毒造成嚴(yán)重胃腸道痛苦,在老年人和免疫受損個(gè)體中有引起嚴(yán)重健康問(wèn)題的可能性。在此情況下FUT2基因的非分泌形式是有益的。帶有兩個(gè)拷貝的非分泌形式的FUT2的個(gè)體不提供該病毒的附著點(diǎn),因此對(duì)諾沃克病毒感染具有實(shí)際免疫力。
[0006]在任一情況下,知曉個(gè)體是具有分泌FUT2基因型還是非分泌基因型都可以在胃腸道問(wèn)題的診斷中提供重要信息,更重要地這使得可以通過(guò)膳食或生活方式調(diào)整以前瞻性地管理潛在的危險(xiǎn)。
[0007]目前,通過(guò)遺傳試驗(yàn)確定FUT2分泌狀態(tài)。盡管基因分型技術(shù)方面的進(jìn)展,遺傳試驗(yàn)仍要求專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和相當(dāng)大量的時(shí)間。因此,遺傳試驗(yàn)通常在地方診斷實(shí)驗(yàn)室中是不可行的,要求將樣品郵寄到中心實(shí)驗(yàn)室。該過(guò)程在樣品采集和獲得結(jié)果之間造成相當(dāng)大的時(shí)間延遲。更重要地,遺傳試驗(yàn)會(huì)對(duì)許多個(gè)體造成高情緒障礙。結(jié)果是,個(gè)體可能會(huì)避免進(jìn)行FUT2分泌狀態(tài)的測(cè)定,即使他們可能從該信息獲益。
[0008]相應(yīng)地,本發(fā)明的目的是改善現(xiàn)有技術(shù)狀況,尤其是提供一種可以在個(gè)體中評(píng)估FUT2分泌或非分泌狀態(tài)的可能性的、簡(jiǎn)單、快速、低成本方法,理想地,該方法應(yīng)當(dāng)是非侵入性的和/或可以自我施用。
[0009]本發(fā)明人解決了該需求,令人驚奇地通過(guò)本發(fā)明的獨(dú)立權(quán)利要求的主題能夠?qū)崿F(xiàn)該目的。從屬權(quán)利要求是對(duì)本發(fā)明構(gòu)思的進(jìn)一步發(fā)展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明人一直致力于可以確定個(gè)體在胃腸道問(wèn)題方面的遺傳素質(zhì)的方法,并驚奇地發(fā)現(xiàn)總巖藻糖水平(例如尿中)與FUT2分泌狀態(tài)強(qiáng)相關(guān)。對(duì)于FUT2分泌狀態(tài)和尿巖藻糖水平之間的該相關(guān)性,并不存在先驗(yàn)性預(yù)期。在本發(fā)明人的觀察之前,F(xiàn)UT2被認(rèn)為參與含巖藻糖的H抗原向粘膜的分泌,但不涉及巖藻糖的尿代謝。
[0011]本發(fā)明使得現(xiàn)在可以例如,通過(guò)在個(gè)體尿液中測(cè)量生物標(biāo)志物巖藻糖的濃度,確定受試者具有FUT2分泌基因型的可能性。本發(fā)明避免了對(duì)基于基因的試驗(yàn)的需要,提供了一種可以通過(guò)快速、低廉和/或自施用試驗(yàn)評(píng)估FUT2分泌狀態(tài)的快速簡(jiǎn)單途徑。
[0012]尤其是,本發(fā)明提供了一種可以確定個(gè)體攜帶FUT-2變體的可能性的非侵入性(基于尿的)技術(shù),其中所述FUT-2變體增加個(gè)體對(duì)特定胃腸道健康危險(xiǎn)的易感性。
[0013]本發(fā)明人對(duì)人尿代謝物組進(jìn)行了非靶向的基因組范圍相關(guān)性研宄,鑒定到與FUT2分泌基因型極為強(qiáng)相關(guān)的生物標(biāo)志物。
[0014]該標(biāo)志物是巖藻糖。FUT2分泌基因型又表現(xiàn)出與人腸道微生物區(qū)系組成(WacklinP, et al.(2011)PLoS ONE 6 (5),e20113)、以及與例如 I 型糖尿病的發(fā)生率(Yang eta.(2011)DIABETES, VOL.60,2685)具有強(qiáng)相關(guān)性。
[0015]鑒于新生物標(biāo)志物巖藻糖和FUT2分泌基因型之間以及該FUT2分泌基因型和腸道微生物區(qū)系之間相關(guān)性的強(qiáng)度,本發(fā)明人提出了使用巖藻糖作為生物標(biāo)志物(例如尿中),例如用于指示腸道微生物的組成。
[0016]因此,使用巖藻糖作為生物標(biāo)志物(例如尿中)可以提供一種簡(jiǎn)單廉價(jià)試驗(yàn)以評(píng)估待測(cè)受試個(gè)體的腸道微生物狀態(tài)。
[0017]相應(yīng)地,本發(fā)明部分地涉及腸道健康的生物標(biāo)志物,其中該生物標(biāo)志物是巖藻糖。
[0018]本發(fā)明還包括巖藻糖作為腸道健康的生物標(biāo)志物的用途。
[0019]該診斷方法可以在人體或動(dòng)物體之外實(shí)施。
[0020]本發(fā)明還包括將巖藻糖用于診斷方法中確定受試者具有FUT2分泌基因型的可能性和/或發(fā)生與之相關(guān)的疾病的危險(xiǎn)性。
[0021]無(wú)論選擇何種體液,本發(fā)明主題都具有如下優(yōu)勢(shì):從受試者獲得這些體液是已成熟建立的方法。
[0022]然后,實(shí)際的診斷可以在體外在體液樣品中進(jìn)行。
[0023]典型地,生物標(biāo)志物的檢測(cè)和/或定量步驟在事先從待測(cè)受試者獲得的體液樣品中進(jìn)行。
[0024]巖藻糖可以是結(jié)合型巖藻糖。因?yàn)樵谧匀唤缰袔r藻糖常常被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞表面的糖蛋白共價(jià)連接,故巖藻糖常常呈現(xiàn)為結(jié)合型巖藻糖。相應(yīng)地,“結(jié)合型巖藻糖”是與蛋白或糖殘基連接的巖藻糖。該連接可以是共價(jià)的。
[0025]巖藻糖也可以是游離巖藻糖。
[0026]無(wú)論是評(píng)估結(jié)合型巖藻糖還是游離巖藻糖,本發(fā)明主題均可行。
[0027]例如,也可以檢測(cè)總巖藻糖濃度,即游離和結(jié)合型巖藻糖濃度的和。
[0028]巖藻糖可以是L-巖藻糖。L-巖藻糖(也稱為鼠李糖)是廣泛存在于自然界中的巖藻糖對(duì)映異構(gòu)體。
[0029]可以在任何體液中進(jìn)行生物標(biāo)志物巖藻糖的檢測(cè)和/或定量。對(duì)于本發(fā)明的主題,體液可以是血液、血漿、血清或尿液,等等。
[0030]尿液具有如下優(yōu)點(diǎn):該體液樣品可以非侵入性地獲得。因此,可以在尿中檢測(cè)生物標(biāo)志物。
[0031]本發(fā)明延及確定受試者具有FUT2分泌基因型的可能性的方法,包括在事先獲自待測(cè)受試者的體液樣品中確定巖藻糖的水平,和將受試者的巖藻糖水平與預(yù)先確定的參考值進(jìn)行比較。預(yù)定的參考值可以基于對(duì)照群體中的平均體液巖藻糖水平。相對(duì)于預(yù)定參考值,樣品中較低的體液巖藻糖水平指示增加的非分泌FUT2基因型可能性;相對(duì)于預(yù)定參考值,增加的體液巖藻糖水平指示增加的分泌FUT2基因型可能性。
[0032]樣品中的巖藻糖水平可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式進(jìn)行檢測(cè)和定量。例如,可以使用質(zhì)譜,例如UPLC-ES1-MS/MS、或NMR光譜,例如1H-NMR光譜。也可以使用其他方法,例如其他光譜方法、色譜方法、標(biāo)記技術(shù)、抗體基方法例如ELISA、或定量化學(xué)方法。
[0033]理想地,樣品中的巖藻糖水平和參考值使用相同方法確定。
[0034]進(jìn)一步優(yōu)選地,樣品中的巖藻糖水平和參考值在相同的體液中確定。
[0035]該體液可以是例如尿。
[0036]預(yù)定參考值可以基于對(duì)照群體中所測(cè)體液中的平均巖藻糖水平。對(duì)照群體可以是具有至少3個(gè)、優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選地至少50個(gè)具有相似年齡和/或平均健康狀況的個(gè)體的組。
[0037]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是:在所述的相關(guān)性研宄中,F(xiàn)UT2基因型之外的遺傳背景似乎不造成顯著的影響。類似地性別似乎不具有顯著影響。這使得可以將預(yù)定參考值應(yīng)用于大數(shù)量的個(gè)體上。
[0038]對(duì)照群體也可以是相同個(gè)體,由此事先從相同個(gè)體獲得預(yù)定參考值。這使得可以直接比較目前生活方式相對(duì)于以前的生活方式對(duì)例如內(nèi)臟脂肪過(guò)多的影響,以及可以直接評(píng)估改善。
[0039]任選地,可以相對(duì)于一個(gè)或多個(gè)潛在的協(xié)變量例如年齡、性別、BM1、尿稀釋度、或酒精消費(fèi)等等,校正獲得的巖藻糖水平。該校正將進(jìn)一步增加所提出的方法的預(yù)測(cè)力。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┖线m的校正。
[0040]預(yù)定參考值可以從具有非分泌FUT2基因型的對(duì)照群體獲得。在此情況下,相對(duì)于預(yù)定參考值,樣品中更高的巖藻糖水平指示分泌FUT2基因型,而相等或較低的巖藻糖水平指示非分泌FUT2基因型。
[0041]備選地,預(yù)定參考值可以從具有分泌FUT2基因型的對(duì)照群體獲得。在此情況下,相對(duì)于預(yù)定參考值,樣品中較低的巖藻糖水平指示非分泌FUT2基因型,而相等或較高的巖藻糖水平指示分泌FUT2基因型。
[0042]直接使用分泌基因型或非分泌基因型作為預(yù)定參考值具有優(yōu)點(diǎn):具有相對(duì)基因型的受試者的體液巖藻糖濃度,相對(duì)于該參考值比相對(duì)于從所有FUT2基因型混合物獲得的參考值,具有更顯著的差異。這將增加本發(fā)明診斷方法的預(yù)測(cè)力。
[0043]優(yōu)選,用于度量巖藻糖參考值的單位與用于表征從受試者獲得的巖藻糖水平的單位相同。由此,如果巖藻糖水平是絕對(duì)值例如按ιιπι01/1(μΜ)計(jì)的巖藻糖單位數(shù),參考值也將基于在一般群體的個(gè)體或所選對(duì)照群體的個(gè)體中按umol/1 ( μΜ)計(jì)的巖藻糖單位數(shù)。
[0044]此外,參考值可以是單截?cái)嘀?,例如中值或平均值。在獲得的體液樣品中巖藻糖的參考值,例如平均值、中值水平、或“截?cái)嘀怠彼?,可以通過(guò)如下建立:在一般群體或所選群體中分析大個(gè)體樣本;使用統(tǒng)計(jì)學(xué)模型,例如預(yù)測(cè)值方法(用于選擇陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn))、或接受者操作特性曲線(確定最佳特異性(最高真陰性率)和靈敏度(最高真陽(yáng)性率),見(jiàn)例如 Knapp, R.G.,和 Miller, Μ.C.(1992).Clinical Epidem1logy and B1statistics.William and Wilkins, Harual Publishing C0.Malvern, Pa.(并入此處作為參考)中所述。
[0045]本領(lǐng)域技術(shù)人員明了如何指定正確的參考值,其將隨性別、種族、基因遺傳、健康狀況、尿稀釋度、或年齡等變化。
[0046]FUT2分泌基因型近來(lái)在科學(xué)界引起了顯著的關(guān)注。例如,在Nature ReviewsGastroentero logy&Hepato logy 9,2(2012)中,F(xiàn)ranks 述及,F(xiàn)UT2 (分泌)基因型被認(rèn)為在維持宿主-微生物穩(wěn)態(tài)中具有普遍作用,并與多種多樣病原體的易感性相關(guān)。此外,功能喪失性突變W143X(G428A)與增加的克羅恩氏病易感性相關(guān)。
[0047]本發(fā)明主題使得可以例如,通過(guò)使用體液中的巖藻糖濃度作為生物標(biāo)志物,以簡(jiǎn)單的方式檢測(cè)FUT2分泌基因型。
[0048]非分泌FUT2基因型被發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于增加的受損腸道健康危險(xiǎn),例如,增加的炎性腸病、克羅恩氏病、或其它慢性腸道炎性進(jìn)程的易感性。
[0049]所述其它慢性腸道炎性進(jìn)程可以例如選自:炎性腸病、胃炎、結(jié)腸炎、腹水、或激惹性結(jié)腸、或其組合。
[0050]非分泌FUT2基因型也被發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于增加的I型糖尿病易感性。
[0051]此外,發(fā)現(xiàn),非分泌FUT2基因型對(duì)應(yīng)于改變的腸道功能生態(tài)和/或增加的腸道生態(tài)失調(diào)危險(xiǎn)。
[0052]改變的腸道功能生態(tài)包括例如減少的雙歧桿菌多樣性、減少的雙歧桿菌豐富性、和/或減少的雙歧桿菌豐度。
[0053]還發(fā)現(xiàn),非分泌FUT2基因型對(duì)應(yīng)于降低的胃腸道病毒感染危險(xiǎn)。Thorven等在JOURNAL OF VIROLOGY, 2005, p.15351 - 15355中報(bào)道,非分泌FUT2基因型可以提供對(duì)抗癥狀性諾沃克病毒感染的抗性。因此,非分泌FUT2基因型對(duì)應(yīng)于降低的諾沃克病毒感染危險(xiǎn)。
[0054]本發(fā)明主題也可以用于鑒定有代謝失調(diào)危險(xiǎn)的個(gè)體。具有非分泌FUT2基因型的個(gè)體更可能有代謝失調(diào)的危險(xiǎn)。該代謝失調(diào)可以是例如I型糖尿病。
[0055]本發(fā)明主題可以進(jìn)一步用于根據(jù)受試者的腸道雙歧桿菌群體對(duì)受試者進(jìn)行分層。具有非分泌FUT2基因型的受試者,比具有分泌FUT2基因型的受試者,更可能在腸道中具有較不豐富的雙歧桿菌培養(yǎng)物。因此,對(duì)于具有非分泌FUT2基因型的受試者,可能有利是,注意在其營(yíng)養(yǎng)方案中攝取充足的雙歧桿菌。因此,本發(fā)明還涉及根據(jù)受試者腸道中的雙歧桿菌群體來(lái)分層受試者的方法,包括在事先從待測(cè)受試者獲得的體液樣品中確定巖藻糖的水平,比較受試者巖藻糖水平和預(yù)定的參考值,其中預(yù)定參考值基于對(duì)照群體中平均的體液巖藻糖水平,并且其中與預(yù)定參考值相比,樣品中相等或更高的體液巖藻糖水平指示腸道中豐富的雙歧桿菌群體;而與預(yù)定參考值相比,樣品中較低的體液巖藻糖水平指示腸道中受損的雙歧桿菌群體。
[0056]盡管不希望受理論的束縛,本發(fā)明人現(xiàn)認(rèn)為,在具有分泌FUT2基因型的受試者中觀察到的增加的體液巖藻糖水平可能至少部分地由這些受試者腸道中更豐富的雙歧桿菌區(qū)系引起。腸道微生物組的改變將影響體液中的巖藻糖水平,改善的腸道微生物組可以由增加的體液巖藻糖水平反映。因此,本發(fā)明主題可以用于測(cè)試膳食、營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品、藥物、或新的營(yíng)養(yǎng)方案在改善腸道區(qū)系中的有效性。
[0057]本發(fā)明主題具有優(yōu)點(diǎn):允許監(jiān)測(cè)生活方式改變對(duì)腸道健康、改變的腸道功能生態(tài)、和/或?qū)ο嚓P(guān)疾病危險(xiǎn)性的影響。
[0058]生活方式的改變可以是任何改變,例如新工作、不同的壓力水平、新關(guān)系、增加或降低的身體活動(dòng)、和/或整體幸福感的改變。
[0059]例如,生活方式的改變可以是膳食的改變。
[0060]膳食的改變可以是糖、脂質(zhì)和/或蛋白含量的增加或減少。其可以是向不同的地區(qū)性膳食例如地中海膳食的轉(zhuǎn)移,等等。也可以是總卡路里攝入的改變。
[0061]由此,本發(fā)明方法可以用于測(cè)試新?tīng)I(yíng)養(yǎng)方案、營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品和/或藥物的有效性。
[0062]營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品可以是例如聲稱對(duì)腸道健康、改變的腸道功能生態(tài)、和/或相關(guān)疾病危險(xiǎn)性具有影響的產(chǎn)品。
[0063]典型地,營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品可以是食物產(chǎn)品、飲料、寵物食品、食物增補(bǔ)物、營(yíng)養(yǎng)藥、食物添加劑或營(yíng)養(yǎng)配方產(chǎn)品。
[0064]例如,膳食的改變可以是使用至少一種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品,該營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品先前不曾被服用過(guò)、或先前以不同的量服用。
[0065]由此,本發(fā)明方法可以用于測(cè)試新?tīng)I(yíng)養(yǎng)方案和/或營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的有效性。
[0066]相應(yīng)地,本發(fā)明還涉及測(cè)試藥物或營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品在改善腸道微生物組方面,尤其是在改善受試者的雙歧桿菌腸道群體方面的有效性,包括:在事先從待測(cè)受試者獲得的體液樣品中確定巖藻糖的水平,比較受試者巖藻糖水平與預(yù)定參考值,其中預(yù)定參考值基于對(duì)照群體中的平均體液巖藻糖水平,且其中與預(yù)定的參考值相比,樣品中更高的體液巖藻糖水平指示腸道微生物組的改善,尤其是雙歧桿菌腸道群體的改善。
[0067]對(duì)于測(cè)量相對(duì)改善的上述應(yīng)用,為了增加測(cè)量的準(zhǔn)確性,可能優(yōu)選的是,使預(yù)定參考值基于在膳食、營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品、藥物或新?tīng)I(yíng)養(yǎng)方案開(kāi)始施用前從該受試者獲得的體液巖藻糖水平。
[0068]本發(fā)明主題可以應(yīng)用于所有有此需要的受試者,例如人或動(dòng)物。典型的動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物,例如陪伴動(dòng)物,例如貓或狗。受試者可以是嬰、幼、青年、成年、或年老受試者,等等。
[0069]本領(lǐng)域技術(shù)人員明了,他們可以自由地組合在此描述的所有本發(fā)明特征而不偏離所公開(kāi)的本發(fā)明范圍。尤其是,針對(duì)本發(fā)明方法描述的特征可以應(yīng)用于其他方法和本發(fā)明的用途,反之亦然。
[0070]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特征從以下實(shí)施例和附圖中將是顯而易見(jiàn)的。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0071]圖1顯示由GWAS獲得的Manhattan圖,其中,GWAS涉及1.256ppm化學(xué)位移處(已確定為L(zhǎng)-巖藻糖)的標(biāo)化尿1H-NMR信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度。該圖顯示與染色體19上FUT2座位的單個(gè)高度顯著相關(guān)性。
[0072]圖2顯示從圖1顯示的Manhattan圖獲得的QQ圖。該圖突顯了觀察到的相關(guān)性的強(qiáng)度,證實(shí)沒(méi)有觀察到P值的不適當(dāng)總體膨脹。
[0073]圖3顯示在SNP rs601338基因型和1.256ppm化學(xué)位移處的標(biāo)化NMR信號(hào)之間的回歸圖。該圖顯示,指示分泌狀態(tài)(T/C和C/C)的基因型與增加的NMR信號(hào)相關(guān)。在此,更高的NMR信號(hào)對(duì)應(yīng)于尿中更高的L-巖藻糖水平。
[0074]圖4顯示rs601338的p值譜(對(duì)于進(jìn)一步的信息,見(jiàn)主文)。該P(yáng)值譜主要描繪了針對(duì)在尿矩陣中測(cè)量的L巖藻糖參考樣品觀察到的關(guān)鍵光譜線。
實(shí)施例
[0075]受試者組
[0076]受試者組由從巴西圣保羅一般群體招募的600名健康個(gè)體組成,年齡18-45歲。選擇受試者,以包括相等數(shù)量的男性和女性、以及體現(xiàn)圣保羅群體所特征性的明顯種族混合--非洲人、歐洲人、中東人和亞洲后裔。在試驗(yàn)進(jìn)行時(shí),所有過(guò)程均獲得Sir1 Libanes
醫(yī)院Institut1nal Review Board的批準(zhǔn),并獲得巴西健康部的國(guó)家倫理研宄委員會(huì)的批準(zhǔn)(HSL2007/25Process n0.25000.114841/2007-17)。
[0077]樣品采集
[0078]每個(gè)受試者供給3個(gè)尿樣,每次樣品供給之間為3-5天。尿樣從早晨禁食狀態(tài)(早餐前)的受試者收集。受試者被教導(dǎo)收集中間流出的樣品。在收集的尿液中加入疊氮化鈉(3mM)作為抗微生物劑。攪動(dòng)尿樣,在Iml抗凍Eppendorf管中等分試樣,然后保存在-80。。。
[0079]受試者也供給血液樣品,用于提取DNA用于基因分型目的。
[0080]基因分型
[0081]基因分型外包給Express1n Analysis公司(Durham, NC, USA)。簡(jiǎn)言之,基因組DNA從全血中被提取出來(lái),在Illumina Human Omn1-Quadl平臺(tái)上按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行基因分型。使用Beadstud1軟件(Illumina)進(jìn)行基因型呼叫(genotype calling)。進(jìn)一步分析中排除基因分型分值低于0.2的呼叫。具有低于90%呼叫率的單核苷酸多態(tài)性(SNP)和具有低于95%呼叫率的個(gè)體也被排除。
[0082]基因分型數(shù)據(jù)具有高質(zhì)量,其中對(duì)于所有SNP,平均呼叫率為99.8%。99.4%的SNP具有高于截?cái)嘀?95% )的呼叫率,所述截?cái)嘀翟O(shè)定用于排出SNP個(gè)體。所有SNP的平均Q值為0.71 ;對(duì)于99.6%呼叫的SNP,Q值通過(guò)用于納入的截?cái)嘀?0.2)。
[0083]尿樣品準(zhǔn)備和1H NMR光譜分析
[0084]在5mm NMR管中,使用含有ImM 3-(三甲基硅烷基)-(2,2,3,3_2H4)-1-丙酸鈉(TSP)的400 μ L氚化的磷酸緩沖溶液(KH2PO4, 0.2Μ終濃度),將尿樣品(200 μ L)調(diào)整至 ρΗ6.8。在 300Κ 使用 fcuker Avance II 600MHz 光譜儀(BrukerB1spin, Rheinstetten, Germany),收集數(shù)據(jù),所述光譜儀配備有5mm逆向探針。使用標(biāo)準(zhǔn)1H檢測(cè)脈沖序列和水峰壓制,使用2.5s的弛豫延遲和10ms的混合時(shí)間,如先前報(bào)道的[Rezzi S,et al., (2007) Journal of Proteome Research 6:4469-4477],獲取尿 1H NMR譜。對(duì)于每個(gè)尿樣,使用12019.2Hz的譜寬和2.7s的獲取時(shí)間,將128個(gè)自由感應(yīng)衰減信號(hào)(free induct1n decay, FID)收集為64K數(shù)據(jù)點(diǎn)。以自由感應(yīng)衰減信號(hào)乘以指數(shù)權(quán)重函數(shù),相應(yīng)于0.3Hz的線增寬,之后進(jìn)行傅里葉轉(zhuǎn)化。相對(duì)于相和基線變形,人工校正獲取的 NMR 譜,并使用 T0PSPIN 軟件包(2.1 版,Bruker B1spin, Rheinstetten,德國(guó))參照δ 0.0的TSP化學(xué)位移。
[0085]NMR 譜轉(zhuǎn)化為跨 δ 0.4-10.0 的 12Κ 數(shù)據(jù)點(diǎn),輸入 MATLAB 環(huán)境(The MathfforksInc.,Natick, MA,USA),排除δ 4.7000-4.9992中的水殘基信號(hào)。NMR譜也相對(duì)于在規(guī)定范圍內(nèi)的所有強(qiáng)度的和進(jìn)行標(biāo)化。在數(shù)據(jù)分析之前,按0.0032ppm的區(qū)段分箱,校正峰的偏斜。該程序?yàn)?將每個(gè)譜中每個(gè)區(qū)段的強(qiáng)度值替代為在該譜范圍上的強(qiáng)度積分,由此每個(gè)樣品的NMR譜由2400個(gè)譜箱(bin)代表。
[0086]使用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[Nicholson(1995) Analytical Chemistry 67:793-811],進(jìn)行代謝物鑒定,通過(guò)在所選樣品上進(jìn)行的2D 1H NMR光譜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
[0087]基因組寬度的相關(guān)度研宄(GWAS)
[0088]通過(guò)如下方式,預(yù)備分箱的NMR譜,用于基因型-代謝型相關(guān)性分析:跨在每個(gè)受試者上收集的三個(gè)樣品,針對(duì)2400個(gè)譜箱的每一個(gè),進(jìn)行強(qiáng)度值的log平均。原始強(qiáng)度值指數(shù)式分布,因此在平均之前進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)化。NMR譜收集在兩個(gè)分開(kāi)的批中,每批各300個(gè)受試者。為了最小化批的影響,將NMR強(qiáng)度值在其相應(yīng)批中進(jìn)行標(biāo)化,合并z-prime值,用作GWAS分析的輸入表型。
[0089]使用受試者的給定譜箱的z-prime值作為輸入表型,以2400個(gè)平行GWAS研宄,進(jìn)行基因型-代謝型分析。使用多線性回歸,針對(duì)2400個(gè)輸入表型之每一個(gè)(即,每個(gè)譜箱),分開(kāi)地鑒定和校正顯著性協(xié)變量(年齡、BM1、性別、和遺傳祖先PCA分析的前10個(gè)主成分)。
[0090]使用線性等位基因劑量模型(以內(nèi)部代碼在NATLAB環(huán)境(The MathfforksInc.,Natick, MA, USA)中執(zhí)行),之后進(jìn)行基因組對(duì)照,實(shí)施各GWAS。
[0091]如果相關(guān)性達(dá)到低于1.3xl0_n的P值,相關(guān)性被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,所述低于1.3xl(Tn的P值相應(yīng)于就平行GWAS的數(shù)量(2400)進(jìn)行Bonferroni校正后的標(biāo)準(zhǔn)基因組寬度顯著性標(biāo)準(zhǔn)(P值〈10_7 5))。
[0092]圖1顯示來(lái)自GWAS的Manhattan圖,其中以1.256ppm化學(xué)位移處的NMR信號(hào)進(jìn)行所述GWAS。染色體19上的強(qiáng)相關(guān)信號(hào)(P值〈10_22)筆直地落在FUT2座位上。圖2顯示的QQ圖指出,該相關(guān)信號(hào)具有高度顯著性,對(duì)于非相關(guān)SNP沒(méi)有觀察到不適當(dāng)?shù)腜值得分的膨脹。QQ圖和Manhattan圖也指出,相關(guān)信號(hào)延及主相關(guān)峰兩側(cè)的大量SNP。位于該相關(guān)峰的極頂端附近的是造成FUT2基因功能性改變的SNP (rs601338p值2.98x 10_23)。圖3顯示1.256ppm的1H-NMR信號(hào)如何隨SNP rs601338基因型而變化的。
[0093]產(chǎn)生P值譜用于鑒定造成基因型-尿NMR信號(hào)相關(guān)性的化學(xué)化合物。
[0094]對(duì)不同譜箱的相關(guān)性模式的分析表明,某些遺傳座位表現(xiàn)出了與不僅僅一個(gè)而是多個(gè)譜箱的強(qiáng)相關(guān)性。該多重相關(guān)性并非意料之外的??梢灶A(yù)期,造成特定遺傳座位與特定譜箱中的信號(hào)強(qiáng)度之間的相關(guān)性的化學(xué)化合物也可能在其它譜箱中引起NMR信號(hào)。事實(shí)上,對(duì)于給定的遺傳座位,相關(guān)性信號(hào)(即-log P值)跨不同譜箱的模式應(yīng)當(dāng)類似于隨著該基因座位的基因型而改變濃度的那些化合物的NMR譜。為了追蹤與給定遺傳座位相關(guān)的化合物中哪些會(huì)隨著給定基因型而增加、以及哪些化合物會(huì)減少,將相關(guān)性的-log P值乘以基因型-表型相關(guān)性信號(hào)的斜率(即,β )。圖4顯示FUT2座位(rs601338)的p值譜。該鑒定的P值譜總結(jié)了在相同樣品矩陣中針對(duì)純L-巖藻糖發(fā)現(xiàn)的主要譜線(1.2Ippm(d),1.256ppm(d), 4.57ppm(d) 5.2Ippm (d))。
【權(quán)利要求】
1.腸道健康的生物標(biāo)志物,其中該生物標(biāo)志物是巖藻糖,任選地結(jié)合型巖藻糖,例如與蛋白或糖殘基共價(jià)連接的巖藻糖。
2.權(quán)利要求1的生物標(biāo)志物,其中巖藻糖是L-巖藻糖。
3.前述權(quán)利要求之一的生物標(biāo)志物,其中巖藻糖是游離巖藻糖。
4.前述權(quán)利要求之一的生物標(biāo)志物,其中在尿中檢測(cè)該生物標(biāo)志物。
5.確定受試者具有FUT2分泌基因型的可能性的方法,包括: -在事先從待測(cè)受試者獲得的體液樣品中測(cè)定巖澡糖水平;和 -比較受試者的巖藻糖水平與預(yù)定參考值, 其中預(yù)定參考值基于對(duì)照群體中的平均體液巖藻糖水平,并且其中與預(yù)定參考值相比,樣品中較低的體液巖藻糖水平指示增加的非分泌FUT2基因型可能性,而增加的體液巖藻糖水平指示增加的分泌FUT2基因型可能性。
6.權(quán)利要求5的方法,其中預(yù)定參考值從具有非分泌FUT2基因型的對(duì)照群體獲得,并且相比于該預(yù)定參考值,樣品中較高的巖藻糖水平指示分泌FUT2基因型,而相等或較低的巖藻糖水平指示非分泌FUT2基因型。
7.權(quán)利要求5或6的方法,其中預(yù)定參考值從具有分泌FUT2基因型的對(duì)照群體獲得,并且相比于該預(yù)定參考值,樣品中較低的巖藻糖水平指示非分泌FUT2基因型,而相等或較高的巖藻糖水平指示分泌FUT2基因型。
8.權(quán)利要求5-7之一的方法,其中非分泌FUT2基因型對(duì)應(yīng)于增加的受損腸道健康危險(xiǎn),例如增加的炎性腸病、克羅恩氏病、或其它慢性腸道炎性進(jìn)程的易感性。
9.權(quán)利要求5-8之一的方法,其中非分泌FUT2基因型對(duì)應(yīng)于增加的I型糖尿病易感性和/或增加的代謝失調(diào)危險(xiǎn)。
10.權(quán)利要求5-9之一的方法,其中非分泌基因型對(duì)應(yīng)于減少的胃腸道病毒感染危險(xiǎn)。
11.權(quán)利要求5-10之一的方法,其中非分泌FUT2基因型對(duì)應(yīng)于改變的腸道功能生態(tài)和/或增加的腸道生態(tài)失調(diào)危險(xiǎn)。
12.權(quán)利要求10的方法,其中改變的腸道功能生態(tài)包括減少的雙歧桿菌多樣性、減少的雙歧桿菌豐富性、和/或減少的雙歧桿菌豐度。
13.根據(jù)受試者腸道雙歧桿菌群體對(duì)受試者進(jìn)行分層的方法,包括: -在事先從待測(cè)受試者獲得的體液樣品中確定巖澡糖的水平,和 -比較受試者的巖藻糖水平和預(yù)定的參考值, 其中預(yù)定參考值基于對(duì)照群體中的平均體液巖藻糖水平,并且其中與預(yù)定參考值相比,樣品中相等或較高的體液巖藻糖水平指示腸道中豐富的雙歧桿菌群體,而與預(yù)定參考值相比,樣品中較低的體液巖藻糖水平指示腸道中受損的雙歧桿菌群體。
14.測(cè)試藥物或營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品在受試者中改善腸道微生物組、尤其是改善雙歧桿菌腸道群體的有效性的方法,包括 -在事先從待測(cè)受試者獲得的體液樣品中確定巖澡糖的水平,和 -比較受試者的巖藻糖水平和預(yù)定的參考值, 其中預(yù)定參考值基于對(duì)照群體中的平均體液巖藻糖水平,并且其中與預(yù)定參考值相比,樣品中較高的體液巖藻糖水平指示腸道微生物組的改善,尤其是雙歧桿菌腸道群體的改善。
15.權(quán)利要求14的方法,其中預(yù)定的參考值基于在藥物或營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品開(kāi)始施用前從受試者獲得的體液水平。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104508482SQ201380037871
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月20日
【發(fā)明者】U·K·杰尼克, M·A·萊達(dá), 魯拉 I·蒙托柳, 庫(kù)特 J·勒, S·A·D·萊茲, S·科里諾, F-P·馬丁, L·達(dá)席爾瓦 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司